CN101678050A - 用于治疗失禁的人脐带组织源细胞组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于治疗失禁的组合物。更具体地讲，本发明公开了人脐带组织源细胞与载体的组合物。所述组合物可用于治疗尿失禁和大便失禁。

Description

用于治疗失禁的人脐带组织源细胞组合物

技术领域

本发明涉及用于治疗失禁的组合物。更具体地讲，本发明涉及用于治疗失禁的包含源自人脐带组织的细胞和载体的组合物。

背景技术

软组织(例如，血管、皮肤或肌肉骨骼组织)损伤十分常见。许多这类疾病发生在没有系统性疾病的情况下，并且是慢性复发性低度损伤和使用过度的结果。

一个非常常见的软组织损伤的例子是失禁。失禁是指任何类型的尿液或粪便不自主流出的疾病。失禁会造成窘迫并导致社交孤立、抑郁和生活质量丧失，并且是老年人群养老院化的主要原因。失禁有几种类型，包括急迫性失禁或急迫性尿失禁、压力性失禁或压力性尿失禁、满溢性失禁，以及混合性失禁或混合性尿失禁。混合性失禁或混合性尿失禁是指患者患有不止一种形式的尿失禁(如压力性失禁和急迫性失禁)的情形。

患者对有效的药物治疗，尤其是对混合性失禁和压力性尿失禁(SUI)的医疗需求很强烈。这种强烈的医疗需求是缺乏有效的药物治疗和患者人数众多的共同结果。最近的评估报告显示，美国患有SUI的人数达1800万，其中妇女占绝大多数。

在没有膀胱收缩或膀胱过度膨胀的情况下，压力性失禁可通过在腹压增加时观察尿液流出来确定。压力性失禁的情况可以归类为尿道过度活动或固有括约肌缺陷。在尿道过度活动的情况下，膀胱颈和尿道在咳嗽或紧张时下垂，同时尿道口张开，并有明显的尿液漏出(漏尿点压力为60-120cm H₂O)。在固有括约肌缺陷的情况下，膀胱颈在膀胱充满而不收缩期间会张开。出现明显漏尿时压力极小或没有压力。膀胱颈和尿道下垂反复不定，很多情况下甚至不下垂，并且漏尿点压力较低(＜60cmH₂O)。(J.G.Blaivas，1985，Urol.Clin.N.Amer.，12：215-224；D.R.Staskin等人，1985，Urol.Clin.N.Amer.，12：271-278)。

急迫性失禁的定义是与急迫而强烈的排尿欲望有关的尿液不自主流失。虽然膀胱不自主收缩可能与神经系统疾病有关，但它们也可能发生在神经系统表现正常的个体身上(P.Abrams等人，1987，Neurol.&Urodynam.，7：403-427)。与急迫性失禁相关的常见神经系统障碍有中风、糖尿病和多发性硬化症(E.J.McGuire等人，1981，J.Urol.，126：205-209)。急迫性失禁是由逼尿肌不自主收缩引起，逼尿肌不自主收缩也可能是由于膀胱炎症和逼尿肌收缩性减弱所引起，逼尿肌收缩性减弱时，膀胱不能完全排空。

满溢性失禁的特征在于尿液流失与膀胱过度膨胀有关。满溢性失禁可能是由于膀胱收缩性减弱或导致过度膨胀和溢流的膀胱出口阻塞所引起。膀胱可能会因诸如糖尿病或脊髓损伤之类的神经系统病症或在接受盆腔根治性手术后处于继发性活跃状态。

尿失禁(急迫性和满溢性尿失禁)的另一个常见的重要原因是膀胱收缩性减弱。这是一种在老年人群和神经系统疾病(尤其是糖尿病)患者中越来越常见的病症。(N.M.Resnick等人，1989，New Engl.J.Med.，320：1-7；M.B.Chancellor和J.G.Blaivas，1996，Atlas of Urodynamics，Williams and Wilkins，Philadelphia，Pa.)。收缩性不足时，膀胱无法排空其中的尿液；这不仅会导致失禁，而且还会造成尿路感染和肾功能不全。目前，临床医师在治疗逼尿肌收缩能力减弱方面的能力非常有限。还没有有效的药物能够改善逼尿肌的收缩性。虽然乌拉胆碱可以略微增加膀胱内压，但在对照研究中还没有显示出该物质可以帮助膀胱有效排空(A.Wein等人，1980，J.Urol.，123：302)。最常见的治疗方法是通过间歇导尿或留置导尿回避这个问题。

针对压力性尿失禁有很多治疗手段。目前最常见的治疗压力性失禁的方法包括下列几种：吸收性产品；留置导尿；子宫托(即设置用以支撑膀胱颈的阴道环)；以及药物(Agency for Health Care Policy andResearch.Public Health Service：Urinary Incontinence Guideline Panel.Urinary Incontinence in Adults：Clinical Practice Guideline.AHCPR Pub.No.92-0038.Rockville，Md.U.S.Department of Health and HumanServices，March 1992；M.B.Chancellor，Evaluation and Outcome.In：TheHealth of Women With Physical Disabilities：Setting a Research Agenda forthe 90′s.Eds.Krotoski D.M.，Nosek，M.，Turk，M.，Brooks PublishingCompany，Baltimore，Md.，Chapter 24，309-332，1996)(美国公共卫生署卫生保健政策研究所尿失禁指导小组，《成人尿失禁：临床实践指南》，AHCPR出版号No.92-0038，马里兰州罗克维尔，美国卫生及公共服务部，1992年3月；M.B.Chancellor，《“残疾妇女的健康：为90年代设定研究方向”研讨会评价与收获》，编者：Krotoski D.M.、Nosek，M.和Turk，M.，布鲁克斯出版社，第24章第309-332页，1996年)。运动是另一种压力性尿失禁治疗方式。例如，凯格尔运动(Kegel exercise)是一种常见的治疗压力性失禁的流行方法。对于在3-6个月内每日进行四次这项运动的患者来说，他们中有一半会受益于该运动。虽然50％的患者声称通过凯格尔运动病情有所改善，但采用凯格尔运动的失禁治愈率只有5％。此外，由于疗程时间太长，并且需要每日坚持，大多数患者都会停止这项运动并放弃该方案。

治疗尿失禁的另一种方法是使用尿道栓。尿道栓是一种用于治疗妇女压力性失禁的一次性塞状物。遗憾的是，尿道栓与超过20％的尿路感染有关；更为遗憾的是，尿道栓不能治愈失禁。

使用阴道探头的生物反馈和功能性电刺激方法也可用于治疗急迫性和压力性尿失禁。然而，这些方法耗时且昂贵，并且结果也只是略好于凯格尔运动。外科手术也可用于治疗压力性尿失禁，例如腹腔镜膀胱颈悬吊术或开腹膀胱颈悬吊术；经阴道膀胱颈悬吊术；人工尿道括约肌手术(复杂而昂贵的外科手术，二次手术率为40％)。

其他治疗方法包括采用外源可注射物质(例如硅氧烷、碳涂敷颗粒、特氟隆、胶原)和自体同源脂肪的尿道内注射方法。这些可注射物质中的每一种都有其缺点。授予Berg的美国专利No.5,007,940、No.5,158,573和No.5,116,387报道了包含离散的聚合物本体和硅橡胶本体的生物相容性组合物，此类组合物可以注射到尿道组织内，用以通过组织填充治疗尿失禁。此外，授予Lawin的美国专利No.5,451,406报道了包含碳涂敷颗粒基底的生物相容性组合物，此类组合物可以注射到组织(例如尿道组织和膀胱颈组织以及覆盖尿道和膀胱颈的组织)内，用以通过组织填充治疗尿失禁。与组织填充方法或治疗有关的一种担忧或不良后果涉及填充剂内的固体颗粒从原始置入位置迁移至身体各个器官内的可贮藏部位，以及随后组织对过小颗粒的慢性炎性反应。这些不利影响在泌尿学文献，具体地讲在下列文献中有所报道：Malizia，A.A.等人，“Migrationand Granulomatous Reaction After Periurethral Injection of Polytef(Teflon)(尿道周注射聚四氟乙烯(特氟隆)后的迁移和肉芽肿性反应)”，JAMA，251：3277-3281(1984)和Claes，H.、Stroobants，D.等人，“PulmonaryMigration Following Periurethral Polytetrafluoroethylene Injection ForUrinary Incontinence(尿道周注射聚四氟乙烯治疗尿失禁后的肺部迁移)”，J.Urol.，142：821-822(1989)。确保不会发生迁移的重要因素是植入适当尺寸的颗粒。如果颗粒太小，则它们可能会被身体的白细胞(吞噬细胞)吞噬并携带到远处的器官，或者可能会在血管系统中运送直至它们到达具有更大约束作用的部位。颗粒沉积的靶器官包括肺、肝脏、脾、脑、肾和淋巴结。授予Wallace等人的美国专利No.4,803,075中公开了在具有生物相容性润滑剂的含水介质中使用小直径球状颗粒和细长原纤维的情况。虽然这些材料显示了积极的短期增大效果，但这些效果是短暂的，因为这些材料往往会迁移和/或被宿主组织吸收。

胶原注射通常采用牛胶原，这种材料的吸收时间为4-6个月，因此需要反复注射。胶原的另一个缺点是大约5％的患者对牛胶原过敏，并且还会产生抗体。

作为可注射填充剂的自体同源脂肪移植物具有明显的缺点，因为注射的大部分脂肪会被再吸收。此外，人们对自体同源脂肪移植物的存活范围和时间存在争议。移植处通常会出现炎性反应。脂肪移植术的并发症包括脂肪再吸收、结瘤和组织不对称。

最近提出的采用工程肌源细胞的肌肉细胞注射疗法可能会提供用于治疗失禁(尤其是压力性尿失禁)和改善排尿节制的备选疗法。优选地，肌源细胞注射可以是自体同源的，以使得过敏反应非常小或无过敏反应。肌纤维的前体即成肌细胞为单核肌细胞，其在许多方面不同于其他类型的细胞。成肌细胞自然融合后形成有丝分裂后多核肌管，导致可以长时间表达和递送生物活性蛋白质(T.A.Partridge和K.E.Davies，1995，Brit.Med.Bulletin，51：123-137；J.Dhawan等人，1992，Science，254：1509-1512；A.D.Grinnell，1994，In：Myology.第2版，Engel AG和Armstrong CF编著，McGraw-Hill，Inc，303-304；S.Jiao和J.A.Wolff，1992，Brain Research，575：143-147；H.Vandenburgh，1996，Human GeneTherapy，7：2195-2200)。

使用成肌细胞来治疗肌肉退变以修复组织损伤或治疗疾病在美国专利No.5,130,141和No.5,538,722中有所公开。此外，成肌细胞移植也已经被用于修复心肌功能障碍(S.W.Robinson等人，1995，CellTransplantation，5：77-91；C.E.Murry等人，1996，J.Clin.Invest.，98：2512-2523；S.Gojo等人，1996，Cell Transplantation，5：581-584；A.Zibaitis等人，1994，Transplantation Proceedings，26：3294)。使用成肌细胞来治疗尿失禁在美国专利No.6,866,842以及下列文献中有所公开：Transplantation.2003 Oct 15；76(7)：1053-60；J Urol.2001 Jan；165(1)：271.和Yokoyama T.J，.Urology，165：271-276，2001。专利申请WO2004055174公开了培养基组合物、培养方法和获得的成肌细胞及其用途。利用肌源祖细胞进行的软组织和骨骼扩增与填充、组合物以及治疗方法在WO0178754中有所公开。对哺乳类动物疾病进行成肌细胞疗法在US9909451中有所公开。

虽然细胞疗法具有优于其他注射法的优点，但也存在较大缺点。与使用成肌细胞治疗压力性尿失禁有关的最大局限性之一是：成肌细胞需要3-4周的冗长体外培养才能获得注射所需的细胞数量，这使得这种疗法非常昂贵并且令许多患者难以承担。

鉴于治疗尿失禁及膀胱收缩性问题的上述局限性和并发症，本领域需要在这方面提供新的有效的替代疗法。

发明内容

本发明是用于治疗失禁的组合物，该组合物包含源自人脐带组织的细胞(本文中称为人脐带组织源细胞(hUTC))和载体。该组合物包含至少一种hUTC，该hUTC可从载体迁移至移植位点，以形成新的组织。hUTC可从异源组织获得。载体包括但不限于生理缓冲溶液、可注射凝胶溶液、生理盐水和水。该组合物可用于治疗失禁，方法是：将组合物注入泌尿生殖组织(例如尿道、尿道括约肌和膀胱)内以治疗尿失禁，以及将其注入结直肠组织(例如结肠、直肠和结直肠括约肌)内以治疗大便失禁。

具体实施方式

分离和收集人脐带组织源细胞(hUTC)(也称为脐带源细胞(UDC))的方法在共同未决的美国专利No.10/877,012中有所描述，将其全文以引用方式并入本文中。为了收集产后脐带进行细胞分离和培养，应在分娩后立即取脐带。例如，但并不限于，取下脐带(流干血液)或脐带的一部分后，将其从产房转移至实验室的无菌容器中，例如包含盐溶液或培养基(例如达尔伯克改良型伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′sMedium，DMEM)的烧瓶、烧杯或培养皿。在组织收集之前或组织收集过程中，优选在无菌条件下维持和处理脐带，并且可另外通过用(例如)70体积％的乙醇水溶液对脐带进行简单的表面处理，然后用无菌蒸馏水或等渗盐溶液冲洗来对脐带进行表面消毒。脐带可以在约3℃至约50℃下短暂保存约1至24小时。在细胞提取前，优选将组织保持在4℃至10℃下，但不要冷冻。培养基中可添加抗生素或抗真菌药，以减少微生物污染。可通过本领域已知的任何适当方法，在无菌条件下从脐带收集细胞。这些例子包括用酶如中性蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶进行消化或剖分或切碎。可使用分离出来的细胞或细胞在其中生长的组织块开始细胞培养。

脐带组织可用抗凝血剂溶液如肝素进行冲洗。组织可在用于运送移植器官的溶液如威斯康星大学溶液或全氟化化合物溶液中进行转移。

将分离出来的细胞转移至未涂覆或涂覆有细胞外基质或配体(例如层粘连蛋白、胶原蛋白、明胶)的无菌组织培养容器中。为了使细胞生长，加入培养基，例如，DMEM(高糖或低糖)、McCoy′s 5A培养基、伊格尔基础培养基、CMRL培养基、格拉斯哥极限必需培养基、Ham′sF-12培养基(F12)、IMDM培养基(Iscove′s modified Dulbecco′s medium)、Liebovitz L-15培养基、MCDB和RPMI 1640等等。可以单独或组合方式向培养基中补充一种或多种组分，包括(例如)胎牛血清(FBS)、马血清(ES)、人血清(HS)、生长因子如PDGF、FGF、促红细胞生成素，以及一种或多种控制微生物污染的抗生素和/或抗真菌药，例如青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素等等。

将以允许细胞生长的密度处于培养容器中的细胞放置在培养箱中，培养箱中的空气含0至5体积％的CO₂和2％至25％的O₂，温度为25至40℃。培养容器中的培养基可以是静止的，也可以例如用生物反应器搅动。细胞可在低氧化应激反应下生长(例如，加入谷胱甘肽、维生素C、过氧化氢酶、维生素E、N-乙酰半胱氨酸)。如本文所用，“低氧化应激反应”是指对培养的细胞不产生或产生很小自由基损伤的条件。细胞也可在交替的条件下生长，例如，一段常氧期紧接一段缺氧期。

最适合的培养基的选择方法、培养基的制备方法和细胞培养技术是本领域熟知的，并且在许多资料中有所描述，包括Doyle等人(编辑)，1995，Cell&Tissue Culture：Laboratory Procedures，John Wiley&Sons，Chichester；以及Ho和Wang(编辑)，1991，Animal Cell Bioreactors，Butterworth-Heinemann，Boston，将它们的全文以引用方式并入本文中。

在对分离出来的细胞或组织块进行足够长时间(例如，约10至约12天)的培养后，存在于移植的组织中的脐带细胞往往会由于迁移或细胞分裂或这两者而从组织中生长出来。然后将脐带细胞转移至单独的培养容器中，该培养容器中包含与最初使用的培养基相同或不同类型的新鲜培养基，细胞群能够在该培养容器中以有丝分裂方式生长。

作为另外一种选择，可以将存在于产后组织中的细胞分解成亚群，并可从亚群中分离产后细胞。这可使用用于细胞分离的标准技术完成，包括(但不限于)使用酶处理将产后组织分解为其组分细胞然后克隆和选择特定细胞类型，使用形态标记或生化标记，选择性破坏不需要的细胞(负选择)，用例如大豆凝集素根据混合群中不同的细胞凝集性进行分离，冻融方法，利用混合群中的不同的细胞粘附性，过滤，常规离心和区带离心，离心淘析(逆流离心淘析)，单位重力分离，逆流分布，电泳，以及荧光激活细胞分选(FACS)。要了解克隆选择和细胞分离技术，请参阅Freshney，1994，Culture of Animal Cells；A Manual of BasicTechniques，第3版，Wiley-Liss，Inc.，New York，将其全文以引用方式并入本文中。

如果需要，可通过(例如)用吸液管小心地从培养皿中抽吸出培养基并补充新鲜培养基来更换培养基。如上所述继续培养，直到培养皿中聚集足够数量或密度的细胞，例如汇集了大约70％。移除最初移植的组织部分，使用标准技术或细胞刮刀将剩下的细胞进行胰蛋白酶化。胰蛋白酶化后，收集细胞，并转移至新鲜培养基中，并如上所述进行培养。胰蛋白酶化后，至少24小时更换一次培养基，以除去漂浮的细胞。剩余在培养基中的细胞为脐带组织源细胞。

脐带组织源细胞可通过流式细胞仪、免疫组织化学法、基因阵列、PCR、蛋白质阵列或本领域已知的其他方法来进行表征。

脐带组织源细胞可进行至少10次群体倍增。本领域的技术人员应该能确定细胞何时完成群体倍增(Freshney，R.I.Culture of Animal Cells：A Manual of Basic 15 Techniques New York，Wiley-Liss 1994)。

虽然可以分离脐带组织源细胞，但优选其处于细胞群中。本发明提供确定的脐带组织源细胞群。在一个实施例中，该群是异质群。在另一个实施例中，该群为同质群。

脐带组织源细胞已被表型定性出以下一种或多种标记：CD10、CD13、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD117、CD141、PDGFr-a、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ。在一个实施例中，已将hUTC描述为具有包括以下的显型：CD10+、CD13+、CD31-、CD34-、CD44+、CD45-、CD73+、CD90+、CD117-、CD141-、PDGFr-a+、HLA-A+、HLA-B+、HLA-C+、HLA-DR-、HLA-DP-以及HLA-DQ-和端粒酶-。在另一个实施例中，hUTC被表型定性为CD13+、CD90+、CD34-和CD117-。在又一个实施例中，hUTC被表型定性为CD10+、CD13+、CD44+、CD73+、CD90+、PDGFr-a+、PD-L2+、HLA-A+、HLA-B+、HLA-C+、以及CD31-、CD34-、CD45-、CD80-、CD86-、CD117-、CD141-、CD178-、B7-H2-、HLA-G-、HLA-DR-、HLA-DP-和HLA-DQ-。

hUTC表达多种神经营养因子，包括MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES和TIMP1，说明它能够为软组织显型细胞提供营养支持。反之，这些细胞不会分泌TGF-β2、ANG2、PDGFbb、MIP1b、I309、MDC和VEGF中的至少一种。

本发明的组合物还包含载体。载体具有生物相容性，易于消毒，并且具有足以方便注射的物理特性。载体包括但不限于生理缓冲溶液、可注射凝胶溶液、生理盐水和水。生理缓冲溶液包括但不限于缓冲盐水、磷酸盐缓冲溶液、Hank平衡盐溶液、Tris缓冲盐水和Hepes缓冲盐水。在一个实施例中，生理缓冲溶液为Hank平衡盐溶液。可注射的凝胶溶液可以在注射前以凝胶形式存在，或者可以在施用后凝为胶体并保持位置不变。

可注射的凝胶溶液由水、生理盐水或生理缓冲溶液和胶凝材料构成。胶凝材料包括但不限于蛋白质，例如胶原、弹性蛋白、凝血酶、纤粘蛋白、明胶、纤维蛋白、弹性蛋白原、多肽、层粘连蛋白、蛋白聚糖、纤维蛋白胶、纤维蛋白凝块、富血小板血浆(PRP)凝块、贫血小板血浆(PPP)凝块、自组装肽水凝胶和去端肽胶原；多糖，例如果胶、纤维素、氧化纤维素、甲壳质、脱乙酰壳多糖、琼脂糖、透明质酸；多核苷酸，例如核糖核酸、脱氧核糖核酸；以及其他物质，例如海藻酸盐、交联海藻酸盐、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(氧化烯)、聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)共聚物、聚(乙烯醇)、聚丙烯酸酯、单硬脂酸甘油-共-琥珀酸酯/聚乙二醇(MGSA/PEG)共聚物以及它们的组合。

在一个实施例中，组合物还包括微粒。本领域的技术人员也把微粒称为微珠或微球。微粒既提供临时的填充作用，又提供活肌肉组织块可以在其上粘附和生长的基底。微粒必须足够大，以避免注射后在局部或向远处迁移，同时又要足够小，以使得可通过皮下注射针施用。因此，微粒具有大体上为圆形的形状，其平均横截面尺寸在约100至约1,000微米的范围内，优选在约200至约500微米的范围内。微粒优选由生物相容性聚合物形成。生物相容性聚合物可以为合成聚合物、天然聚合物或它们的组合。如本文所用，术语“合成聚合物”是指自然界中不存在的聚合物，即使该聚合物是由天然存在的生物材料制成。术语“天然聚合物”是指天然存在的聚合物。生物相容性聚合物也可以是可生物降解的。可生物降解的聚合物在接触潮湿的身体组织时容易分解成小片段。这些片段随后会被身体吸收或排泄。更具体地讲，由于可生物降解的片段被身体吸收或排泄，使得体内不会永久性保留痕量或残余片段，因此不会引起永久性的慢性异物反应。

在一个实施例中，微粒由至少一种合成聚合物构成。合适的生物相容性合成聚合物包括但不限于下列聚合物以及它们的共混物和共聚物：脂族聚酯、聚氨基酸、共聚醚酯、聚亚烷基草酸酯、聚酰胺、酪氨酸衍生的聚碳酸酯、聚(亚胺碳酸酯)、聚原酸酯、聚氧杂酯、聚酰胺酯、含有胺基团的聚氧杂酯、聚酸酐、聚磷腈、聚富马酸二羟丙酯、聚氨酯、聚酯型聚氨酯、聚醚型聚氨酯。用于本发明的合适的合成聚合物还可以包括基于在下列物质中发现的序列的生物合成聚合物：胶原、层粘连蛋白、糖胺聚糖、弹性蛋白、凝血酶、纤粘蛋白、淀粉、聚氨基酸、明胶、海藻酸盐、果胶、纤维蛋白、氧化纤维素、甲壳质、脱乙酰壳多糖、弹性蛋白原、透明质酸、丝绸、核糖核酸、脱氧核糖核酸、多肽、蛋白质、多糖、多核苷酸以及它们的组合。

为了本发明的目的，脂族聚酯包括但不限于如下单体的均聚物和共聚物：丙交酯(其包括乳酸、D-丙交酯、L-丙交酯和内消旋丙交酯)；乙交酯(包括乙醇酸)；ε-己内酯；对二氧杂环己酮(1，4-二氧六环-2-酮)；三亚甲基碳酸酯(1，3-二氧杂环己烷-2-酮)；三亚甲基碳酸酯的烷基衍生物；以及它们的共混物。本发明所用的脂族聚酯可以为具有直链、支链或星型结构的均聚物或共聚物(无规、嵌段、片段、锥形嵌段、接枝、三嵌段等)。

在骨骼包括至少一种天然聚合物的实施例中，合适的天然聚合物的例子包括但不限于：纤维蛋白基材料、胶原基材料、透明质酸基材料、糖蛋白基材料、纤维素基材料、丝绸以及它们的组合。

本领域技术人员将会知道，选择合适的材料来形成生物相容性微粒取决于多个因素。这些因素包括体内机械属性；细胞对材料在细胞附着、增殖、迁移和分化方面的响应；以及任选地生物降解动力学。其他相关因素包括化学组成、组分的空间分布、聚合物的分子量以及结晶度。

在另一个实施例中，可以在本发明的组合物中掺入生物效应物。生物效应物会促进受影响组织的愈合和/或再生(如生长因子和细胞因子)、防止感染(如抗微生物剂和抗生素)、减轻炎症(如抗炎剂)、防止或最大限度减少粘结的形成(如氧化再生纤维素(例如得自Ethicon，Inc.的INTERCEED和Surgicel)和透明质酸)以及抑制免疫系统(如免疫抑制剂)。

生物效应物包括但不限于异源或自体同源的生长因子、基质蛋白、肽、抗体、酶、糖蛋白、激素、细胞因子、糖胺聚糖、核酸、镇痛剂。应当理解，可以在组合物内掺入一种或多种相同或不同功能的生物效应物。

人们已经知道，异源或自体同源的生长因子可以促进受伤或受损组织的愈合和/或再生。示例的生长因子包括但不限于：TGF-β、骨形态发生蛋白质、生长分化因子-5(GDF-5)、软骨源性形态发生蛋白质、成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子、血管内皮细胞源生长因子(VEGF)、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、肝细胞生长因子以及它们的片段。合适的效应物同样包括上述药剂的激动剂和拮抗剂。

糖胺聚糖是带多电荷的多糖，其在细胞粘附方面起作用。可用作生物效应物的示例性糖胺聚糖包括但不限于硫酸肝素、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、透明质素(也称为透明质酸)以及它们的组合。

生物效应物也可以为酶，例如基质消化酶，这种酶有利于细胞突破细胞外基质的包围向外迁移。合适的基质消化酶包括但不限于胶原酶、软骨素酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、肽酶、嗜热菌蛋白酶、基质金属蛋白酶和蛋白酶。

本领域的普通技术人员将会知道，合适的生物效应物可以由外科医生根据医学原理和适用的治疗对象来确定。组合物中的生物效应物的量会根据多种因素而变化，其中包括给定专利申请中的因素，例如促进细胞存活、增殖、分化或有利于和/或加速组织愈合。生物效应物可以在将由活肌肉组织块和载体组成的组合物施用至组织伤口区域之前或之后掺入到该组合物中。

本文所述用于治疗失禁的组合物可通过上述方法首先获得的同种异体hUTC来制备。hUTC与本文所述载体(任选与微粒)混合，并且通过注射递送到需进行组织修复的部位。此外，在注射到需进行组织修复的部位之前，可以将生物效应物添加至含有或不含有微粒的组合物中。

可以使用套件来辅助制备组合物。该套件包括无菌容器(其盛放用于维持细胞活力的试剂)、载体和递送装置。细胞可以置于装有用于维持活力的试剂的无菌容器内。用于维持活力的合适试剂包括但不限于生理盐水、磷酸盐缓冲溶液、Hank平衡盐水、标准细胞培养基、达尔伯克改良型伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s Medium)、抗坏血酸、HEPES、非必需氨基酸、L-脯氨酸、自体同源血清以及它们的组合。如本文所述，载体可以为生理缓冲溶液、可注射凝胶溶液、生理盐水或水，并且也可以任选包括微粒。递送装置使得载体内的组合物沉积到患病组织中，例如尿道括约肌附近或周围的组织。

本文所述组合物可用于软组织治疗。软组织通常是指在整个身体上发现的骨外结构，包括但不限于：牙周组织、皮肤组织、血管组织、肌肉组织、筋膜组织、眼组织、心包组织、肺组织、滑膜组织、神经组织、肾组织、食道组织、泌尿生殖组织、肠组织、结直肠组织、肝组织、胰腺组织、脾组织、脂肪组织以及它们的组合。优选地，本文所述组合物可用于处理泌尿生殖组织(例如尿道、尿道括约肌和膀胱)、食道组织(例如食道和食道括约肌)以及结直肠组织(例如结肠、直肠和结直肠括约肌)。该组合物还可以用于组织填充、组织增大、美容处理、治疗处理和组织封闭。

实例1

在压力性尿失禁(SUI)大鼠模型中，检测了基于施用hUTC组合物的新型疗法对恢复漏尿点压力(LPP)的功效。将hUTC从液氮中解冻。将共24只雌性Lewis大鼠随机分配到3组(每组8只动物)中的1组，即无失禁动物、注射载体的失禁动物和注射载体和hUTC的失禁动物。对后两组施行双侧阴部神经切断术(PNT)，以导致SUI。术后一周，通过尿道内注射对每组动物进行治疗。5周后，对每只大鼠的LPP测量5次或6次，并确定平均值。

动物护理

本研究所用动物按照“Final Rules of the Animal Welfare Actregulations(9CFR)(动物福利法规最终条例(CFR第9篇))”、PublicHealth Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals(关于人性化护理和使用实验动物的公共卫生服务政策)和Guide for theCare and Use of Laboratory Animals(实验动物护理和使用指南)中的所有适用章节进行处理和饲养。在开始上述手术前，由Testing FacilityInstitutional Animal Care and Use Committee(实验室机构动物护理和使用委员会)对本研究中涉及动物护理或使用的实验方案和任何修订部分或程序进行了审批。

选择Lewis大鼠是因为其具有同基因表型。这使得能在不使用免疫抑制剂的情况下评估源自一只大鼠而被植入另一只大鼠的组合物的SUI治疗。动物被单独关养在微型隔离器内。通过设定环境控制器将温度保持在18℃至26℃(64°F至79°F)，相对湿度为30％至70％。除了偶尔中断以进行研究步骤外，保持12小时光照、12小时黑暗的交替循环。动物房内保持用100％新鲜空气每小时换气10次或以上(不进行空气再循环)。为动物随意供应Purina认证的饲粮和过滤后自来水。

材料和方法

动物。用先前确定的双侧阴部神经切断术(PNT)导致SUI。所有操作都在无菌条件下进行。使用2.5％-4％的异氟烷对大鼠诱发麻醉，并做好无菌手术准备工作。诱发之后，经鼻锥输入0.5-2.5％的异氟烷以保持麻醉。为了进行PNT手术，将臀部到尾基、尾部以上和后腿内侧以下区域的毛发刮掉，并让动物保持趴卧姿势。通过背侧纵向切割，将坐骨直肠窝向两侧切开。利用头戴式手术放大镜，将阴部神经分离并切断。使用Nexaband

液体局部组织粘结剂将切口合上。对无失禁动物组施行相同外科手术，不同的是实际上并不切断神经。

组合物的制备和施用。将hUTC(按美国专利申请公布No.20050054098A1中的实例1所述进行分离)从液氮中解冻。将细胞从液氮中取出，迅速在37℃的水浴中通过缓慢搅拌进行解冻。将瓶中的内容物转移至包含HBSS的15mL离心管中。将细胞在临床离心机中，在4℃下以150×g离心5分钟。轻轻抽吸出上清液，通过轻微移液使细胞重新悬浮于5mL HBSS中。将细胞置于冰块上，用血球计进行计数。使细胞停止旋转并以每20微升1.5×10⁶个细胞重新悬浮于HBSS中。将HBSS中悬浮的hUTC装入100微升Hamilton注射器内，并用皮下注射针注入大鼠尿道内。在SUI致伤手术后一周，对动物进行治疗。将雌性大鼠麻醉，然后在每只大鼠尿道的2点钟和10点钟位置共注射两剂(每剂10微升)。对用载体治疗的动物以相同方式单独注射HBSS。

漏尿点压力(LPP)测试。术后第5周，将大鼠麻醉并仰卧放置，手动排空膀胱，并使压力为零。随后在室温下通过耻骨上导尿管将膀胱充满生理盐水溶液(每小时5ml)。将耻骨上导尿管连接至注射器泵和压力传感器。所有膀胱压力均以膀胱水平处的空气压力为基准。将压力传感器信号放大并转化为数字信号，以便用AD Instruments的计算机软件PowerLab以每秒10个样本的速率采集计算机数据。

手动缓慢增加腹压，直到出现漏尿为止，以达到膀胱峰值压力，这时迅速释放外部腹压。对每只大鼠进行至少四次LPP测试。使用Credé方法排空膀胱，并在两次LPP测量间隔期间将其重新注满。使用ADInstruments压力传感器采集LPP数值，并且使用计算机软件PowerLab Chart^TM进行分析。经定性分析，将每只动物在LPP测试周期内的各个异常值确认为压力失真，并从研究中排除。压力结果失真的定义是，相比同一LPP测试周期内的其他压力结果，被视为人为偏高或偏低的压力值(mmHg)。在LPP测试过程中，可能会由多种方式产生压力失真，包括：不小心用导尿管尖阻塞了膀胱粘膜壁或尿道；膀胱内的尿和/或生理盐水没有完全排空；测试时动物麻醉不够充分，导致其收缩膀胱。

结果与讨论

平均LPP和标准偏差在下面有报道。

治疗组	动物数量	平均LPP(mm Hg)	标准偏差
				无失禁动物	4	42.6	5.4
注射载体的失禁动物	8	22.9	3.1
				注射载体和hUTC的失禁动物	8	34.5	3.1

结论

数据显示，相比只注射载体的失禁动物，用hUTC治疗的失禁动物在4周后观察到功能得到改善。大约81％的无失禁动物的功能得到改善，表明比只注射载体的失禁动物的改善率高55％。数据表明，hUTC产生了明显优于仅用载体治疗的改善，因而可以作为治疗压力性尿失禁的手段。

实例2

在2种压力性尿失禁(SUI)大鼠模型中，对照检测了基于施用hUTC组合物的新型疗法对恢复漏尿点压力(LPP)的功效。将hUTC从液氮中解冻。2种可以对照的不同大鼠模型分别为通过双侧阴部神经切断术和尿道松解术导致失禁的大鼠。尿道松解术模型由之前确定的方法形成。简而言之，将通过腹膜内注射开他敏(60mg/kg体重)和甲苯噻嗪(5mg/kg体重)使动物麻醉。将动物仰卧置于水循环热敷垫上。按照标准手术程序在腹部做好手术准备，并盖上消毒盖布。沿下腹部中线切开，并识别膀胱和尿道。切割盆内筋膜，将尿道近端和远端沿四周分离，同时通过锐器解剖法将尿道从前阴道壁和耻骨上分离。应当小心别损坏输尿管或下膀胱血管。在阴道内插入棉签以帮助解剖。分别用4-0薇乔(Vicryl)缝线和4-0尼龙缝线缝合腹直肌筋膜和皮肤。

每种损伤模型有3组，大鼠可随机分配到3组中的1组，即无失禁动物、注射载体的失禁动物和注射载体和hUTC的失禁动物。术后一周，通过尿道内注射对每组动物施用治疗剂。5周后，对每只大鼠测量5或6次LPP，并确定平均值。

实例3

关于将组合物施用至尿道内的各种路线的描述

注射组织糜的环尿道路线。将包含微粒的hUTC组合物分配进连接17GA针头的高压注射器内。将针头慢慢插入尿道口旁边的粘膜下组织内。确定针头的正确位置后，将悬浮液注射到尿道周围3个位置处：2点钟、6点钟和10点钟位置。注射过程中，可以观察到尿道腔逐渐闭合，随后开口消失。为了确信成功，操作结束时应看到尿道粘膜完全附着(即接触)。可以注射1或2针管，以使尿道完全闭合。

经尿道路线。直视下，使用特制针头从尿道粘膜下方注射hUTC组合物。将膀胱镜插入尿道中段。借助膀胱镜观察，将针尖小心插入到尿道粘膜之下。将hUTC准确植入粘膜下组织内，直到可以看见尿道粘膜完全接合。

顺行路线。顺行路线专供前列腺切除术后失禁的雄性使用。在充分麻醉下制作耻骨上导管。优选进行全身麻醉。将柔性膀胱镜经耻骨上导管插入膀胱内。确定膀胱颈。借助膀胱镜观察，将针尖小心插入到膀胱颈粘膜之下。将hUTC制剂准确植入粘膜下组织内，直到可以看见膀胱颈完全接合。

实例4

从液氮中解冻hUTC。hUTC可与所需体积的载体混合，这些载体例如为磷酸盐缓冲盐水(PBS)或HBSS或其他载体(例如胶原水溶液、透明质酸水溶液)和微载体(例如聚乙醇酸(PGA)或聚乳酸(PLA))。混合之后立即注射到失禁动物的尿道中段或膀胱颈内。在基线期和术后3-4周，对所有动物进行尿动力学测试。采集尿道组织进行器官浴槽等容研究，以测试尿道功能和免疫化学。

实例5

目的是表明，在猪中hUTC可与载体(PBS、HBSS、胶原水溶液、HA水溶液)混合并在超声控制下注射到尿道内。此外，该手术可用于评价作为治疗途经治疗尿失禁(尤其是压力性尿失禁)的本文所述组合物。将hUTC与载体和/或微粒混合。在经尿道超声探针和注射系统的帮助下，将样本注射到横纹括约肌和尿道粘膜内。可在注射前后测量尿道压力分布，以确定术后尿道闭合压力变化。术后还可以对获取自猪的样本进行组织学实验。

实例6

如上述实例所述，将hUTC与所需体积的载体(任选与微粒)混合，并使用本领域已知的技术将其注射到肛门内括约肌或肛门外括约肌内，以治疗大便失禁。

实例7

如上述实例所述，将hUTC与所需体积的载体(任选与微粒)混合，并使用本领域已知的技术将其注射到下食道括约肌和/或幽门括约肌内，以治疗酸反流和其他消化系统相关疾病。

实例8

猪尿道细胞分离

从Farm-to-Pharm(Warren，NJ)采购了猪尿道。用一对手术刀去除尿道的脂肪和结缔组织，并将尿道切碎。记录组织的重量(13.1g)，并将组织放入50ml圆锥管内的消化酶(见下文)与DMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)、10％FBS(Hyclone，Logan，UT)、青霉素/链霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)的混合物中。

用Parafilm M

膜裹住锥形管以密封。将锥形管转移至37℃培养箱内以225RPM的速度振荡2小时。每培养1小时，都要把锥形管从培养箱内取出，管口朝上直立1-2分钟，以查看消化是否彻底。彻底消化时(不超过2小时)，将管口朝上直立1-2分钟，让大块沉淀。将细胞悬浮液(不含大块)转移至新的锥形管内，并用新鲜的DMEM、10％FBS、青霉素/链霉素稀释。将细胞悬浮液以150*g离心5分钟，并抽吸出上清液。加入新鲜培养基(总体积最多50ml)并重新悬浮。将细胞悬浮液以150*g离心5分钟，取出上清液。加入新鲜培养基(总体积最多30ml)，用移液管上下吸液以将细胞重新悬浮。将重新悬浮的细胞粒料通过100μm过滤器过滤。将细胞悬浮液以150*g离心5分钟，抽吸出上清液，并将细胞粒料在PBS中重新悬浮。使用GUAVA

细胞计数器(GuavaTechnologies，Inc，Hayward，CA)对细胞计数。共获得约6×10⁶个细胞。将细胞以5,000个细胞/cm²的密度覆盖在EGM-2(Lonza，Walkersville，MD)内，并置于37℃的培养箱内。

消化酶

0.25U/ml胶原酶(Serva Electrophoresis，GmbH，Heidelberg，Germany)、2.5U/ml分散酶(Dispase II 165859，Ruche DiagnosticsCorporation，Indianapolis，IN)和1U/ml透明质酸酶(Vitrase，ISTAPharmaceuticals，Irvine，CA)。

增殖检测分析

目的是评估hUTC对从猪尿道分离出的细胞的增殖作用。将按照上述方法分离的尿道细胞以10,000个细胞/孔的密度种植在24孔培养皿上。实验条件为：

-低血清(请填写)

-低血清(请填写)+不同量的hUTC(6600、3300或1650和825个细胞/孔)

将hUTC添加至穿透孔(0.4微米孔径)内的EGM-2/Hayflick(20/80)培养基中。在第3天和第7天，使用Guava仪器(Guava Technologies，Inc，CA)采集尿道上皮细胞以获得细胞数量和活性。

结果：

从猪尿道分离的细胞在与hUTC一起培养三天和七天后，表现出比在基础培养基(EGM-2/Hayflick)内培养时更快的增殖率。增殖速率取决于穿透孔中存在的hUTC的量。在培养7天时作用最为明显。观察到6600个细胞/孔的hUTC的效果最佳，经过7天培养后可使尿道源细胞的增殖率提高35％。

结论

以上提供的数据明显反映出，hUTC对猪尿道源细胞的增殖率有着积极的体外作用。这表明，这些负责恢复失禁大鼠(实例1中提供)漏尿点压力(LPP)的细胞的作用机制在健康细胞中至少部分地增强，因而可以使尿道组织再生。这也说明，这些细胞的疗效不仅仅在于填充作用，而且还在于营养作用，这可促进真正的长期再生响应。

Claims (11)

1.一种用于治疗失禁的组合物，所述组合物包括人脐带组织源细胞和载体。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述人脐带组织源细胞是同种异体的。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体选自由下列组成的组：生理缓冲溶液、可注射凝胶溶液、生理盐水和水。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述载体为生理缓冲溶液。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述生理缓冲溶液为缓冲盐水、磷酸盐缓冲溶液、Hank平衡盐溶液、Tris缓冲盐水和Hepes缓冲盐水。

6.根据权利要求3所述的组合物，其中所述载体为包含生理缓冲液和胶凝材料的可注射凝胶溶液。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述胶凝材料选自由下列组成的组：蛋白质、多糖、多核苷酸、海藻酸盐、交联海藻酸盐、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(氧化烯)、聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)共聚物、聚(乙烯醇)、聚丙烯酸酯、单硬脂酸甘油co-琥珀酸酯/聚乙二醇(MGSA/PEG)共聚物以及它们的组合。

8.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包括至少一种微粒。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述微粒由生物相容性聚合物构成，所述生物相容性聚合物选自由下列组成的组：合成聚合物、天然聚合物以及它们的组合。

10.一种治疗失禁的方法，所述方法包括将根据权利要求1所述的组合物注射进泌尿生殖组织内。

11.一种治疗失禁的方法，所述方法包括将根据权利要求1所述的组合物注射进结直肠组织内。