CN101670103A - 一种复方人参总皂甙和左旋咪唑纳米乳佐剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复方人参皂甙和左旋咪唑纳米乳佐剂，该佐剂的粒径在1～100nm之间，由人参皂甙、左旋咪唑、表面活性剂、助表面活性剂、油和蒸馏水组成。该产品外观呈透明淡黄色液体，粒径小于100nm；粘度较低，满足乳剂作为疫苗佐剂的粘度要求；稳定性较好，可以在室温或者4℃长期保存；配苗时无须特殊乳化，对设备要求低，产品质量容易控制。以卵清白蛋白OVA为模式抗原，证明本发明的复方人参皂甙和左旋咪唑纳米乳佐剂在一定剂量上比使用铝佐剂能诱导较好的免疫反应，产生较高的抗体滴度，减少佐剂或者抗原的使用量，刺激Th1和Th2反应，增强机体的体液和细胞免疫作用，起到全面的免疫保护作用。

Description

一种复方人参总皂甙和左旋咪唑纳米乳佐剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及疫苗佐剂领域，具体涉及一种可以和抗原形成组合物的复方人参皂甙和左旋咪唑水包油纳米乳佐剂，具有增强抗原的免疫效果，用于动物疾病的预防和治疗。

背景技术

近年来，随着一些动物疾病或者人畜共患疾病的发生，新的疫苗研制工作非常窘迫。科学技术的发展使疫苗生产从完整的微生物苗转向了仅含微生物特异性组份的亚单位苗或人工合成肽苗，但后者的免疫原性相对弱些，难以诱导机体产生有效的免疫应答。为增强疫苗的免疫原性，常在病毒性疫苗、DNA疫苗和多肽疫苗的研制中加入免疫佐剂。免疫佐剂是一种免疫调节剂，可以先于抗原或与抗原混合或同时注入动物体内，能非特异性地增强抗原的免疫原性，提高免疫效果。

我国兽用疫苗佐剂主要有油佐剂和铝胶。虽然两者在临床上能有效的用于增强疫苗的免疫作用，但它们在使用中仍存在一些不足。铝佐剂主要促进体液免疫，刺激产生Th2型反应，产生的抗体以IgG1为主，而对细胞免疫应答几乎无作用，使得疫苗的免疫保护不全面，不持久，并且也有一些副作用，如轻度局部反应形成肉芽肿，甚至发生局部无菌性脓肿。油佐剂是目前在动物用灭活疫苗中使用较广的佐剂，但这类佐剂通常为油包水乳剂，不稳定，较粘稠，注射时需要用力，且矿物油在机体内不易分散和代谢，容易产生红斑、脓疱等局部副反应，影响动物外形和肉类的品质。我国目前采用灭活疫苗的为油佐剂，主要是国产矿物油和进口的油佐剂。国产矿物油虽然价格便宜(0.01～0.02元/毫升)，但质量不稳定、副作用较大，引起过敏而导致动物死亡；进口油佐剂虽然副作用较小，但价格高(约0.15～0.2元/毫升)，导致疫苗价格偏高。油佐剂今后的发展方向是用植物油或动物油取代不可代谢的矿物油，筛选性质良好的表面活性剂，采用更先进的乳化工艺，制备出粘稠度低，毒副小、便于使用的新型佐剂苗。水包油包水乳剂既降低了黏度又有很好的免疫原性，但该体系的稳定性较差，在制备技术上难度较大。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明发的目的在于提供一种复方人参总皂甙和左旋咪唑纳米乳佐剂，该纳米乳佐剂生产工艺简单、黏度合适、稳定性好、高效和副作用小的水包油佐剂。

实现上述发明目的技术方案是，一种复方人参皂甙和左旋咪唑纳米乳佐剂，该纳米乳佐剂的粒径在1～100nm之间，由下述重量百分比的原料组成：人参皂甙0.10％～2.00％、左旋咪唑0.10％～9.00％、表面活性剂15.00％～40.00％、助表面活性剂1.00％～20.00％、油1.64％～12.40％和蒸馏水42.00％～82.16％，上述原料的总重量为100％。

本发明复方人参皂甙和左旋咪唑纳米乳佐剂的优选配比为：人参皂甙1.00％～1.50％、左旋咪唑2.00％～5.00％、表面活性剂17.50％～25.00％、助表面活性剂10.70％～17.50％、油5.00％～8.80％和蒸馏水50.00％～60.00％，上述原料的总重量为100％。

本发明所述的人参皂甙是人参总皂甙或人参皂甙单体；

本发明所述的左旋咪唑是左旋咪唑盐类；

本发明所述的表面活性剂是HLB＞8的非离子表面活性剂，优先选用聚氧乙烯醚氢化蓖麻油、聚氧乙烯醚蓖麻油、吐温-80和吐温-60中的一种或几种的混合物。

本发明所述的助表面活性剂优先选用聚乙二醇200、聚乙二醇400、甘油、丙二醇一种或几种的混合物。

本发明所述的油选自矿物油和植物油，如花生油、橄榄油、肉豆蔻酸异丙酯、维生素E油、液体石蜡和麦芽油等。

本发明的另一目的是提供上述复方人参皂甙和左旋咪唑水包油型纳米乳佐剂的制备方法，包括以下步骤：

1)称取人参皂甙、左旋咪唑、表面活性剂、助表面活性剂、油和蒸馏水，备用；

2)在37℃将人参皂甙溶于表面活性剂、助表面活性剂和油所形成的油相中，搅拌使人参皂甙完全溶解，所得即为油相；

3)室温下，将左旋咪唑溶于蒸馏水中，搅拌使其完全溶解，过滤，所得即为水相；

4)室温下，将水相缓慢滴加到油相中，滴加的同时不断搅拌，直至形成透明的体系，过滤，即得。

本发明复方人参皂甙和左旋咪唑水包油型纳米乳佐剂的组成原理：

1.自从QuilA皂甙用作疫苗佐剂后，人们发现许多皂甙具有佐剂的活性。国内外研究表明人参皂甙作为疫苗的佐剂，兼具铝佐剂和QuilA的优点，其安全性明显优于QuilA，是值得开发用于人或者畜禽的中药佐剂。专利号ZL02110578.2公布了人参总皂甙或者单体人参皂甙Rb1用于制备疫苗免疫佐剂的用途，将其和传统免疫佐剂氢氧化铝佐剂相比，具有许多优点，很适合作为免疫佐剂。

2、左旋咪唑是一种广谱抗线虫药，同时又是一种免疫调节剂，能提高细胞免疫功能，具有高效、药源充足、性质稳定等优点，也被广泛的用于增强动物的免疫能力。

3.人参总皂甙富含十八种人参单体皂甙，溶于80℃的水，易溶解于乙醇。研究表明，室温下当溶液pH6.03时，人参总皂甙溶液最稳定。盐酸左旋咪唑在水中极易溶解，在酸性溶液中较稳定。本发明的纳米乳可以实现对溶解性不同的两种药物增溶作用，并且纳米乳体系呈弱酸性，满足了两者对酸性环境的要求。

4.人参皂甙和左旋咪唑都是较好的免疫调节剂。人参皂甙是人参的主要成分，能同时增强体液免疫和细胞免疫，对机体的安全性较高；左旋咪唑是化药，能提高细胞免疫功能。左旋咪唑和某些中药的复方也能取得很好的免疫效果。刘瑞生等将中药多糖与左旋咪唑结合，制成的缓释复方免疫增强剂，发挥中西药免疫增强剂的各自优势，投服方便，在鸡体内缓慢稳定释放，作用时间长，可以增强鸡体液免疫功能和细胞免疫功能。目前有关人参皂甙和左旋咪唑合用的研究不多见。但远大生物科技公司生产的兽用黄芪多糖注射液就含有人参皂甙和左旋咪唑，主要用于动物病毒病防治。

与现有技术相比，本发明复方人参皂甙和左旋咪唑水包油型纳米乳佐剂具以下优点：

1)人参皂甙和左旋咪唑有不同的溶解性，左旋咪唑溶液呈酸性，对人参皂甙在纳米乳中的存在有较大影响，通过本发明的纳米乳载体，可以实现两者同时溶解于同一体系。另外，纳米乳内相油相可以溶解脂溶性成分，外相可以溶解水溶性成分，同样可以实现多种单体的同时溶解，并且无药物析出。

2)左旋咪唑是一种化药，其使用剂量只有在一定范围内才能发挥其免疫效果，并且左旋咪唑主要调节细胞免疫，作用单一，剂量过大会对动物产生副作用；而人参皂甙可以增强体液和细胞免疫，将人参皂甙和左旋咪唑复配，在一定程度上可以发挥中西药互补的优势，刺激Th1和Th2反应，增强机体的体液和细胞免疫作用，起到全面的免疫保护作用。

3)本发明制备方法简单、不需特殊设备；所制的复方纳米乳佐剂黏度低、方便注射，于4～8℃或者室温存放保持透明态，不会出现药物析出、分层等现象。

4)本发明原料易获得，具有较好的生物相容性；复方纳米乳佐剂在不降低疗效的条件下，可以降低药物的使用量，或者抗原的使用量，在一定程度上降低了免疫成本。

5)本发明复方纳米乳佐剂配苗时无须特殊乳化，只需简单混合，对设备要求低，操作简单，产品质量容易控制。

附图说明

图1为纳米乳佐剂的透射电镜照片(×100000)。

图2为纳米乳佐剂的粒径分布图。

具体实施方式

下面通过实施例来进一步介绍本发明的产品和制备方法。

实施例1

1)精确称取组分聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油40.00g、甘油1.00g、肉豆蔻酸异丙酯1.64g、人参总皂甙1.00g、盐酸左旋咪唑0.10g和蒸馏水56.26g，备用；

2)在37℃将聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油、甘油和肉豆蔻酸异丙酯搅拌混匀，然后将人参皂甙加入其中，使其溶解，所得即为油相；

3)室温条件下，将左旋咪唑完全溶解于蒸馏水中，静置1h，过滤，所得即为水相。

4)室温下，将水相缓慢滴加到油相中，滴加的同时不断搅拌，直至形成透明的体系，过滤，即得本发明的外观为淡黄色的纳米乳佐剂。

实施例2

组分                                            含量

人参总皂甙                                      1.50％

磷酸左旋咪唑                                    5.00％

聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油                        17.50％

甘油                                            17.50％

肉豆蔻酸异丙酯                                  5.00％

蒸馏水                                          53.50％

实施例3

组分                                            含量

人参皂甙Rb1                                     1.00％

盐酸左旋咪唑                                    2.00％

聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油                        15.00％

甘油                                  15.00％

花生油                                8.80％

蒸馏水                                58.20％

实施例4

组分                                  含量

人参皂甙Rg1                           0.10％

盐酸左旋咪唑                          0.10％

聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油              25.00％

聚乙二醇200                           20.00％

肉豆蔻酸异丙酯                        12.40％

蒸馏水                                42.40％

实施例5

组分                                  含量

人参皂甙Rg1                           0.10％

磷酸左旋咪唑                          0.10％

聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油              15.00％

聚乙二醇400                           1.00％

橄榄油                                1.64％

蒸馏水                                82.16％

实施例6

组分                                  含量

人参皂甙Rb1                           2.00％

磷酸左旋咪唑                                9.00％

聚氧乙烯醚(35)氢化蓖麻油                    31.30％

聚乙二醇400                                 10.70％

液体石蜡                                    5.00％

蒸馏水                                      42.00％

实施例7

组分                                        含量

人参总皂甙                                  2.00％

盐酸左旋咪唑                                4.00％

吐温80                                      28.30％

丙二醇                                      10.70％

麦芽油                                      5.00％

蒸馏水                                      50.00％

实施例8

组分                                        含量

人参皂甙Rb1                                 2.00％

盐酸左旋咪唑                                3.00％

聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油                    22.30％

聚乙二醇200                                 10.70％

麦芽油                                      2.00％

蒸馏水                                      60.00％

实施例9

组分                                   含量

人参皂甙Rg1                            1.00％

盐酸左旋咪唑                           1.00％

聚氧乙烯醚(40)蓖麻油                   22.30％

甘油                                   10.70％

维生素E                                2.00％

蒸馏水                                 63.00％

实施例10

组分                                   含量

人参总皂甙                             2.00％

磷酸左旋咪唑                           2.00％

吐温60                                 28.00％

甘油                                   10.00％

肉豆蔻酸异丙酯                         5.00％

蒸馏水                                 53.00％

试验例1纳米乳佐剂的理化性质

1.1外观和pH值本发明的纳米乳佐剂为淡黄色透明液体，流动性良好，pH为6.02。

1.2黏度取出口内径为1.2mm玻璃吸管，吸取1mL样品，室温条件下记录流出0.4mL样品所需要的时间(s)，即为其黏度。本发明的纳米乳佐剂黏度为4.20s。

1.3形态观察纳米乳佐剂用蒸馏水适当稀释后，滴在覆有支持膜的铜网上，静置10min，再滴加3％的磷钨酸溶液于铜网上负染5min，自然挥干，透射电子镜下纳米乳呈圆球形，见附图1。

1.4粒径及其分布Zetasizer Nano ZS纳米粒度仪测得纳米乳佐剂的粒径分布，见附图2。其平均粒径为72.2nm，多分散指数为(PDI)0.052。粒径在43.8～78.8nm的粒子占97.7％，大于78.8nm的粒子仅占2.3％。本发明的纳米乳佐剂的粒径分布范围窄，粒径比较均匀。

1.5稳定性考察

纳米乳佐剂于10000rpm速度离心10min，仍保持透明均一的外观，未出现分层和药物析出等现象。

将纳米乳佐剂分装于西林瓶中，密封包装后，分别于4、25、37、40、60℃及强光(4500±500)lx条件下放置，于第15天和第30天取样，测定pH值、乳滴粒径和含量等各指标，见表1。纳米乳佐剂在4、25、37、40℃和光照条件下放置30d，液体保持澄清透明状态，未见分层、絮凝和破乳，pH值、乳滴粒径和药物含量未见明显变化。但在60℃条件下，纳米乳佐剂变浑浊，置室温下又恢复澄清透明态。表明本发明纳米乳佐剂在室温或4℃较为稳定。

表1纳米乳佐剂的稳定性

试验例2纳米乳佐剂的免疫佐剂效应试验

将ICR雌性小鼠随机分成9组，每组5只。其中两组分别用生理盐水和OVA抗原(100μg/只)来免疫小鼠。其余各组在OVA抗原(100μg/只)基础上，分别加入铝胶(Alum 50μg/只)，人参皂甙(GS)和左旋咪唑(LMS)生理盐水溶液(GS 10μg+LMS 250μg/只、GS 50μg+LMS 250μg/只、GS 250μg+LMS 250μg/只)和人参皂甙(GS)和左旋咪唑(LMS)纳米乳(GS-NE 10μg+LMS 250μg/只、GS-NE 50μg+LMS 250μg/只、GS-NE 250μg+LMS 250μg/只)。小鼠首免后21d进行二次免疫，二免后2周采血，分离血清，ELISA检测血清OVA诱导特异性抗体水平，实验数据用X±S表示，用SAS8.02软件中最小变异二乘法，检查各组间的差异性。观察免疫前后小鼠行为和体重变化。

第一次免疫后各组小鼠出现怕冷应激反应和体重有所下降外，但应激反应很快消失，体重逐渐恢复就呈增重趋势；二免后各组小鼠体重没有发生明显变化，小鼠在食欲和行动能力等方面均无异常变化。各组OVA受免小鼠血清特异性抗体水平的影响见表2。

表2各组受免小鼠血清OVA诱导特异性抗体水平的影响(n＝5，x±S)

注：与OVA抗原组比较，¹⁾P＜0.05；与Alum佐剂组比较，²⁾P＜0.05；与GS 250μg+LMS 250μg比较，³⁾P＜0.05。

小鼠二次免疫后，GS-NE+LMS 250μg各实验组(10、50和250μg)血清OVA特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体水平均显著高于OVA抗原对照组和GS+LMS 250μg各实验组(10、50和250μg)(P＜0.05)；GS-NE+LMS 250μg各实验组的IgG和IgG1抗体水平与Alum佐剂组在统计上无显著性差异，但GS-NE 50μg+LMS 250μg组的IgG和IgG1抗体水平高于Alum佐剂组，GS-NE+LMS 250μg各实验组(10、50和250μg)IgG2a抗体水平均显著高于Alum佐剂组(P＜0.05)；GS-NE+LMS 250μg各实验组(10、50和250μg)内IgG、IgG1和IgG2a抗体水平无显著性差异，其中GS-NE 50μg+LMS 250μg的三种抗体水平最高。

人参皂甙能促进Th1型和Th2型抗体反应。Th1型免疫应答主要产生IgG2a等抗体，Th2型主要产生IgG1等抗体。Rivera等人报道人参皂甙在剂量160μg时无佐剂作用，在830μg时有佐剂作用。本实验发现，纳米乳佐剂在10～250μg时产生特异性抗体水平与铝胶的相当，明显优于人参皂甙生理盐水溶液的。纳米乳可以增强人参皂甙的免疫活性，促进Th1和Th2免疫应答，减少人参皂甙剂量，一方面可能纳米乳粒径小，将人参皂甙富集于乳滴内；另一方面，可能起到吸附抗原的作用，从而增加了药物和抗原作用的表面积，能很好与抗原递呈细胞和抗体形成细胞作用，刺激抗体的产生。

Claims (3)

1.一种复方人参皂甙和左旋咪唑纳米乳佐剂，其特征在于，该纳米乳佐剂的粒径在1～100nm之间，由下述重量百分比的原料制成：

人参皂甙            0.10％～2.00％

左旋咪唑            0.10％～9.00％

表面活性剂          15.00％～40.00％

助表面活性剂        1.00％～20.00％

油                  1.64％～12.40％

蒸馏水              42.00％～82.16％

上述原料的总重量为100％；

所述的人参皂甙是人参总皂甙或人参皂甙单体；

所述的左旋咪唑是左旋咪唑盐类；

所述的表面活性剂是聚氧乙烯醚氢化蓖麻油、聚氧乙烯醚蓖麻油、吐温-80和吐温-60中的一种或几种；

所述的助表面活性剂选自：聚乙二醇200、聚乙二醇400、甘油和丙二醇一种或几种；

所述的油选自花生油、橄榄油、肉豆蔻酸异丙酯、维生素E油、液体石蜡和麦芽油中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的复方人参皂甙和左旋咪唑纳米乳佐剂，其特征在于，由下述重量百分比的原料制成：

人参皂甙            1.00％～1.50％

左旋咪唑                2.00％～5.00％

表面活性剂              17.50％～25.00％

助表面活性剂            10.70％～17.50％

油                      5.00％～8.80％

蒸馏水                  50.00％～60.00％

上述原料的总重量为100％。

3.权利要求1所述的复方人参皂甙和左旋咪唑纳米乳佐剂的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)称取人参皂甙、左旋咪唑、表面活性剂、助表面活性剂、油和蒸馏水，备用；

2)在37℃将人参皂甙溶于表面活性剂、助表面活性剂和油所形成的油相中，搅拌使人参皂甙完全溶解，所得即为油相；

3)室温下，将左旋咪唑溶于蒸馏水中，搅拌使其完全溶解，过滤，所得即为水相；

4)室温下，将水相缓慢滴加到油相中，滴加的同时不断搅拌，直至形成透明的体系，过滤，即得。

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