CN101625366B - 高灵敏免疫定量胶乳测定试剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高灵敏免疫定量胶乳测定试剂的制备方法。其组成：微球粒浓度为0.2～0.4％(w/w)，0.12M甘氨酸缓冲液pH7.2，乙二醇30％(V/V)，2mM EDTA·2Na乙二胺四乙酸二钠盐，0.1％NaN3。制备包括以下步骤：载体免疫定量胶乳微颗粒的制备，抗体、抗原的制备，常温下加入EDC，pH＜6.5条件下让羧基活化，行待一定时间后，将反应pH上调，减慢反应速度。与现有技术相比，由于采用了本发明提出的高灵敏免疫定量胶乳测定试剂的制备方法，提高了载体微颗粒直径的均匀度及抗原或抗体在颗粒表面分布的均匀度，同时还使包被的抗原或抗体在均相条件下的自由度增加，减少空间结合位阻，增加二级免疫反应速率，提高反应灵敏度，其检测的灵敏度比以往文献报道可提高100倍。
Description
技术领域：
本发明涉及一种高灵敏免疫胶乳定量比浊测定试剂，尤其是涉及该试剂的制备方法。
背景技术：
自上世纪80年代开发出直径小于200纳米的颗粒可作为免疫载体的均相化试剂以来，已开发出许多免疫测定项目，其优点如下：一是由于颗粒直径小于光波长的2/5，既可作为免疫物质载体，又不失为均相化试剂，在自动化定量操作上具备明显的优势；二是免疫物质的固相化，降低被载物质抗原或抗体的自由能，明显延长该物质免疫抗原或抗体活性，由于上述优势，目前已经有多个免疫检测项目利用该技术成功研制出相当优秀的诊断试剂产品。但其不足之处是在灵敏度上不及酶标记和荧光标记方法，对于含量甚低的蛋白原分子不能该方法所检测，对于激素、药物类型小分子不能形成有效的免疫结合网络，故也不能用该方法检测。同样，在使用单克隆抗体上也有一定困难，需要多个单克隆抗体配组使用。
发明内容：
本发明的目的是针对现有技术不足之处而提供一种能对含量甚低的蛋白原分子作检测的、对于激素、药物类型小分子能形成有效的反向免疫结合网络的高灵敏免疫定量胶乳测定试剂的制备方法。
本发明的目的是通过以下措施来实现：一种高灵敏免疫定量胶乳测定试剂的制备方法方法，其特殊之处在于：
高灵敏免疫定量胶乳测定试剂的组成：
R2：微球粒浓度按重量百分比计0.2～0.4％，0.12M甘氨酸缓冲液pH7.2，乙二醇按体积百分比计30％，2mM EDTA·2Na乙二胺四乙酸二钠盐，0.1％NaN3
其制备经过下列步骤制备：
(1)载体免疫定量胶乳微颗粒的的制备纯水，经加热至沸腾后除去水中绝大部分氧气，经冷却后取750ml加入1.0g十二烷基磺酸钠SDS在65℃恒温10分钟，待SDS呈悬浮溶液状态后加入含量大于98％的苯乙烯单体30ml，再将温度上调至75℃，平衡15分钟后加入丙烯酸5.2ml pH调节至5.5-6.5，平衡后加入过硫酸钾，开始计时并逐渐升温至84℃，反应时间为30分钟，按微颗粒球大小表面羧基量的4倍分二次加入已中和的丙烯酸使微球表面全羧化为止，在84℃老化两小时，自然冷却；
(2)抗体、抗原的制备：由市购采得，按重量体积百分比计33％硫酸铵饱和沉淀纯化抗体；
(3)常温下在前述微颗粒球液中按1％浓度含有效羧基量为0.005mM计加入水溶碳化二亚胺EDC，0.005*192*40％mg量，在pH＜6.5条件下活化20分钟，将pH上调至7.0-7.2，加入正氨基己酸0.005*132*60％mg量，在室温下作用2小时将pH上调至7.5，在4℃过夜，次日对0.025M，pH7.0的NaCL溶液透析两次，备用；
(4)将上述已伸手臂的微球液按0.005*192*15％mg量加入EDC，活化20分钟后，加入50％体积的乙二醇，并将pH上调至7.0-7.2，平衡后快速倒入抗体液，在室温下作用2小时，同时控制pH不低于7.0，置于4℃平衡过夜；次日，将pH调至7.0，再置于4℃平衡过夜；48小时后，按2.0mg/1％·ml的比例加入牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白溶于0.025M，NaCl，pH6.8，封闭过夜，最后补加甘氨酸，乙二醇，NaCl，使其最终浓度达到0.12M，30％，0.1％，pH7.4；在4℃中储存3日后待用。
(5)完成制备。
与现有技术相比，由于采用了本发明提出的高灵敏免疫定量胶乳测定试剂的制备方法，提高了载体微颗粒直径的均匀度及抗原或抗体在颗粒表面分布的均匀度，同时还使包被的抗原或抗体在均相条件下的自由度增加，减少空间结合位阻，增加二级免疫反应速率，提高反应灵敏度，其检测的灵敏度比以往文献报道可提高100倍。
具体实施方式
本发明制备的高灵敏免疫定量胶乳测定试剂用下列步骤制备：
(1)载体免疫定量胶乳微颗粒的的制备纯水，经加热至沸腾后除去水中绝大部分氧气，经冷却后取750ml加入1.0g十二烷基磺酸钠SDS在65℃恒温10分钟，待SDS呈悬浮溶液状态后加入含量大于98％的苯乙烯单体30ml，再将温度上调至75℃，平衡15分钟后加入丙烯酸5.2ml pH调节至5.5-6.5，平衡后加入过硫酸钾，开始计时并逐渐升温至84℃，反应时间为30分钟，按微颗粒球大小表面羧基量的4倍分二次加入已中和的丙烯酸使微球表面全羧化为止，在84℃老化两小时，自然冷却。根据反应加入的有效量与反应总体积计算该反应的浓度，并根据标准浓度在波长550nm采用比浊法测定OD值换算成平均直径，亦可用电子显微镜直接测量微球的直径，按此操作合成的微球直径均匀度大于98％。
(2)抗体、抗原的制备：由市购采得，按33％(W/V)硫酸铵饱和沉淀纯化抗体，这种方法对于抗体比较温和，抗体不易变性。
(3)常温下在前述微颗粒球液中按1％浓度含有效羧基量为0.005mM计加入水溶碳化二亚胺EDC，0.005*192*40％mg量，在pH＜6.5条件下活化20分钟，将pH上调至7.0-7.2，加入正氨基己酸0.005*132*60％mg量，在室温下作用2小时将pH上调至7.5，在4℃过夜，次日0.025M，pH7.0的确NaCL溶液透析两次，备用。在此反应中羧基的活化pH条件必须控制在4.5-6.5之间，当pH＞6.5时，EDC活化羧基将失败。但是当羧基活化之后，pH＞6.5时反应速度明显减慢但不终止反应。这样操作将使抗体抗原的分布均匀度大大提高，可使检测的灵敏度提高一个数量级。
(4)将上述已伸手臂的微球液按0.005*192*15％mg量加入EDC，活化20分钟后，加入50％体积的乙二醇，并将pH上调至7.0-7.2，平衡后快速倒入抗体液，在室温下作用2小时，同时控制pH不低于7.0，置于4℃平衡过夜；次日，将pH调至7.0，再置于4℃平衡过夜；48小时后，按2.0mg/1％·ml的比例加入牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白溶于0.025M，NaCl，pH6.8，封闭过夜，最后补加甘氨酸，乙二醇，NaCl，使其最终浓度达到0.12M，30％，0.1％，pH7.4；在4℃中储存3日后标定。为了增加包被抗体的自由度，由于在微球颗粒的表面适当增加一定量的手臂，以提高抗体在空间的自由度，减少位阻。通过微球表面增加手臂的方法又可以使反应灵敏度提高一个数量级。
(5)据此制成高灵敏免疫定量胶乳测定试剂。
应用例1.以β微球蛋白检测为例，将正常人血清稀释100倍后，在500nm波长检测的ΔOD＞0.1；5倍稀释人血清后在波长检测的ΔOD2001.4。β微球蛋白是一个分子量仅11800的小蛋白分子且抗原决簇只有2个。
测试条件如下：
R1(Tris缓冲液)800μl，其组成：(20mM Tris三羟甲基氨基甲烷pH7.4内含7％(w/w)尿素，7％(w/w)二甲基甲酰胺，5mM EDTA·2Na乙二胺四乙酸二钠盐，0.5‰TWeen-20，3.6％(w/w)聚乙二醇(FW6000)0.1％NaN3，0.12MNaCL)；
R2(乳胶抗体液)150μl，其组成如前述；
S(样本)20μl；
λ(波长)500nm，T°37℃；
R1加S混合5分钟再加R210分钟后比色。
检测结果：
应用例2.Alpha-fetoprotein(AFP)甲胎蛋白，对诊断肝肿瘤上有重要意义。过去利用高灵敏放免测定，酶标记免疫测定检测。正常人血清浓度平均为5.8μg/L。当》100μg/L对肝癌确诊有明确意义。利用本发明将灵敏度提高到2.5μg/L，线性测定区间0-200μg/L。为保证＞200μg/L的超量诊断，在≥50μg/L的样本作1∶10或20的稀释，将测定值*10或20，即为该样本的实际测定值。测试中R1(Tris缓冲液)、R2(乳胶抗体液)与例1相同。
Claims (1)
1.一种高灵敏免疫定量胶乳测定试剂的制备方法，其特征是：
高灵敏免疫定量胶乳测定试剂的组成：
R2：微球粒浓度按重量百分比计0.2～0.4％，0.12M甘氨酸缓冲液pH7.2，乙二醇按体积百分比计30％，2mM EDTA·2Na乙二胺四乙酸二钠盐，0.1％NaN3
其制备经过下列步骤制备：
(1)载体免疫定量胶乳微颗粒的制备纯水，经加热至沸腾后除去水中绝大部分氧气，经冷却后取750ml加入1.0g十二烷基磺酸钠SDS在65℃恒温10分钟，待SDS呈悬浮溶液状态后加入含量大于98％的苯乙烯单体30ml，再将温度上调至75℃，平衡15分钟后加入丙烯酸5.2ml，pH调节至5.5-6.5，平衡后加入过硫酸钾，开始计时并逐渐升温至84℃，反应时间为30分钟，按微颗粒球大小表面羧基量的4倍分二次加入已中和的丙烯酸使微球表面全羧化为止，在84℃老化两小时，自然冷却；
(2)抗体、抗原的制备：由市购采得，按重量体积百分比计33％硫酸铵饱和沉淀纯化抗体；
(3)常温下在前述微颗粒球液中按1％浓度含有效羧基量为0.005mM计加入水溶碳化二亚胺EDC，0.005*192*40％mg量，在pH＜6.5条件下活化20分钟，将pH上调至7.0-7.2，加入正氨基己酸0.005*132*60％mg量，在室温下作用2小时将pH上调至7.5，在4℃过夜，次日对0.025M，pH7.0的NaCl溶液透析两次，备用；
(4)将已伸手臂的微球液按0.005*192*15％mg量加入EDC，活化20分钟后，加入50％体积的乙二醇，并将pH上调至7.0-7.2，平衡后快速倒入抗体液，在室温下作用2小时，同时控制pH不低于7.0，置于4℃平衡过夜；次日，将 pH调至7.0，再置于4℃平衡过夜；48小时后，按2.0mg/1％·ml的比例加入牛血清白蛋白，所述牛清白蛋白溶于0.025M，NaCl，pH6.8，封闭过夜，最后补加甘氨酸，乙二醇，NaCl，使其最终浓度达到0.12M，30％，0.1％，pH7.4；在4℃中储存3日后待用；
(5)完成制备。
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