CN101613672A - 一种不对称转化制备(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种不对称转化制备(S)－4－氯－3－羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌，它是导入羰酰还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的大肠杆菌。本发明还公开了上述重组大肠杆菌的构建方法。利用上述重组大肠杆菌制备(S)－4－氯－3－羟基丁酸乙酯的方法：以4－氯乙酰乙酸乙酯为底物，以葡萄糖为辅助底物，以氧化型辅酶II为辅因子，由上述重组大肠杆菌进行转化反应得到(S)－4－氯－3－羟基丁酸乙酯。本发明构建的重组大肠杆菌中PsCR酶活为18U/mg，BmGDH酶活为9U/mg，避免了添加昂贵的纯酶GDH和辅酶NADPH，只需添加辅酶NADP便可以使得辅酶NADPH高效再生，大大降低了生产成本。

Description

一种不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌及其构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌及其构建方法与其在不对称生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

背景技术

(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate，(S)-CHBE)是一种重要的有机中间体，可用于很多活性药物的合成，如他汀类药物——羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂和4-羟基吡啶烷酮(4-hydroxypyrrolidone)等^[1]。

以4-氯乙酰乙酸乙酯(4-chloroacetoacetate Ethyl COBE)作为还原反应的潜手性底物，易于合成且价格低廉，以其为底物进行不对称还原反应获取(S)-CHBE是非常经济有效的制备途径。

迄今为止关于COBE不对称还原制备手性CHBE已有许多有关研究报道。概括起来主要有化学法和生物法。化学法合成的COBE产率低，并且污染大，相比之下生物法具有更好的发展前景。

Shimizu等^[2，3]用来自Sporobolomyces salmonicolorAKU 4429的NADPH依赖的醛基还原酶分别在单一水相体系和水/有机溶剂两相体系催化还原COBE制备手性CHBE，由于应用酶催化还原反应所用的酶要从微生物细胞中分离纯化得到，过程操作繁琐且酶容易失活，与全细胞催化相比，应用较少。Yasohara等^[4]从400株酵母菌中筛选得到了一株Candida magnoliae，在水/乙酸正丁酯体系中，在添加葡萄糖、NADP和葡萄糖脱氢酶以及反应过程中控制pH值的条件下，产物(S)-CHBE在有机相的积累浓度可达90g/L，产物的光学纯度对映体过量值(enantiomeric excess e.e)达到96％。由于采用野生酵母中往往含有多种能够催化COBE为不同构型CHBE的还原酶，因此催化所获得的产物的光学活性往往很低，所以近来的研究着重集中于运用重组大肠杆菌不对称合成具有高立体选择性的(S)-CHBE。

本发明人在微生物法生产(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯领域做了大量的研究，现已通过基因组探矿的方式从毕赤酵母中获得了一条新的能够催化底物COBE的还原酶基因(PsCR)，并成功在大肠杆菌(pET-22b-PsCR)中进行高活性表达，经过发酵和催化反应研究，证实了该羰酰还原酶能够催化COBE生成(S)-CHBE，并具有高催化活性和严格的手性选择性，其酶活高达32U/mg，是文献报道的两倍(日本专利中S1酶活为13.7U/mg)，水相催化体系中的光学纯度超过99％^[5，6]。通过硫酸铵沉淀和DEAE-Sephadex离子交换树脂对该酶进行分离纯化，并对其生化性质进行系统地研究，结果表明：来源于毕赤酵母的PsCR属于氧化还原酶中的短链脱氢酶家族，仅依赖于还原型辅酶II(NADPH)。其米氏常数为4.9mg/mL，对应的最大反应速率为337μmol/mg protein/min，高于已报道来源于其它酵母的还原酶。同时，PsCR对酮和醛都具有较高的催化活性，特别是在2或4的位置有氯原子取代基的乙酰乙酸乙酯或者α，β-二酮等^[7]。

然而，以重组的还原酶进行催化反应，须按化学剂量添加大量昂贵的辅酶，反应方能持续进行，因此，为了获得高产量、高纯度的(S)-CHBE，需要克隆脱氢酶基因实现辅酶的高效原位再生，以提供高效的辅酶再生循环体系。

【参考文献】：

[1]Karanewsky DS，Badia MC，Ciosek CP Jr，Robl JF，Sofia MJ，Simpkins LM，DeLange B，Harrity TW，Biller SA，Gorden EM(1990)Phosphorus-containing inhibitors of HMG-CoAreductase.1.4-[2-arylethyl]-hydroxyphosphinyl-3-hydroxybutanoic acids：a new class ofcell-selective inhibitors of cholesterol biosynthesis.Journal of Medicinal Chemistry33：2925-2956.

[2]Shimizu S，Kataoka M，Morishita A Katoh M，Morikawa T，Miyoshi T，Yamada H(1990a)Microbial asymmetric reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutaoate to optically active ethyl4-4-chloro-3-hydroxybutanoate.Biotechnol lett 12：593-596.

[3]Shimizu S，Kataoka M，Katoh M，Morikawa T，Miyoshi T，Yamada H(1990b)Stereoselective reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutaoate by a microbial aldehyde reductasein an organic solvent-water diphasic system.Appl Environ Microbiol 56：2374-2377。

[4]Yasohara Y，Kizaki N，Hasegawa J，Takahashi S，Wada M，Kataoka M，Shimizu S(1999)Synthesis of optically activeethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate by microbial reduction.ApplMicrobiol Biotechnol 51：847-851.

[5]应汉杰，严明，叶齐，许琳，熊健，柏建新，陈勇，李振江。一种羰酰还原酶在生产(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用。CN 101372699A.

[6]Qi Ye，Ming Yan，Lin Xu，Hou Cao.A novel carbonyl reductase from Pichia stipitis for theproduction of ethyl(S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate.[J].Biotechnology Letters，2009，(31)：537-542.

[7]Qi Ye，Ming Yan，Lin Xu，Hou Cao.A new member of the short-chaindehydrogenases/reductases superfamily：purification，characterization and substratespecificity of a recombinant carbonyl reductase from Pichia stipitis.[J].BioresourceTechnology，2009(DOI：10.1016/j.biortech.2009.06.014).

发明内容

本发明所要解决的技术问题，是提供一种不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌，该菌株在生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯过程中不需要外加辅酶。

本发明还要解决的一个技术问题，是提供上述重组大肠杆菌的构建方法。

本发明还要解决的一个技术问题，是提供上述重组大肠杆菌在不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌，它是导入羰酰还原酶PsCR(carbonyl reductase from Pichia stipitis，PsCR)基因和葡萄糖脱氢酶GDH(Glucosedehydrogenase from Bacillus megaterium，GDH)基因的大肠杆菌。

上述羰酰还原酶PsCR基因含有849bp碱基，其在Genbank中的收录号为XM_001387250(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？val＝XM_001387250.1)，其基因序列如SEQ ID NO：1所示。由该基因编码的羰酰还原酶，包含282个氨基酸，其在Genbank中的收录号为XP_001387287(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝protein&id＝126273732)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

上述葡萄糖脱氢酶GDH基因含有783bp碱基，其在Genbank中的收录号为142974(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nuccore&id＝142974)，其基因序列如SEQ ID NO：3所示。由该基因编码的葡萄糖脱氢酶，包含261个氨基酸，其在Genbank中的收录号为729328(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝protein&id＝729328)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

上述重组大肠杆菌的构建方法方法为：克隆羰酰还原酶PsCR基因与葡萄糖脱氢酶GDH基因，构建双酶耦合表达载体，并在大肠杆菌中进行共表达，获得不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌。

利用上述重组大肠杆菌不对称还原制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法如下：

以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以葡萄糖为辅助底物，以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸磷酸(氧化型辅酶II，NADP)为辅因子，由导入了羰酰还原酶PsCR基因和葡萄糖脱氢酶GDH基因的重组大肠杆菌进行转化反应制备得到(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

其中，加入NADP即由葡萄糖脱氢酶还原生成NADPH，并使反应循环进行，避免连续投加NADPH以降低生产成本。

其中，底物4-氯乙酰乙酸乙酯的初始反应浓度为1.5～300g/L，葡萄糖的初始反应浓度为0.2～2mol/L，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸磷酸(氧化型辅酶II，NADP)初始反应浓度为0.05～0.5mmol/L，重组大肠杆菌的用量以湿菌计为20～200g/L。

其中，所述的反应温度为20～30℃，反应时间为16～32h。

其中，所述的转化反应采用水相体系转化法或有机溶剂/水双相体系转化法。所述的水相体系转化法为：湿重组大肠杆菌在pH 6～7.5的磷酸缓冲溶液中进行生物转化；所述的有机溶剂/水双相体系转化法为：湿重组大肠杆菌在含有pH6～7.5的磷酸缓冲/乙酸正丁酯的双相体系中进行生物转化。

有益效果：本发明从pET-22b-PsCR和pET-22b-BmGDH载体中克隆带有SD序列的基因片段SD-PsCR和SD-BmGDH，构建双酶耦合表达载体，将其应用于COBE不对称还原制备(S)-CHBE中，取得很好的效果，重组菌(pET-22b-BmGDH-PsCR)中PsCR的酶活为18U/mg，BmGDH酶活为9U/mg，避免了添加昂贵的纯酶和辅酶NADPH，只需添加辅酶NADP便可以使得辅酶NADPH高效再生，大大降低了生产成本。

附图说明

图1为重组质粒pET-22b-BmGDH-PsCR构建示意图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：重组大肠杆菌的构建。

1、羰酰还原酶基因的获取：

毕赤酵母Pichia Stipitis CBS 6054(购于Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)Fungal Biodiversiry Centre)，培养基YPD(g·L^-1)：酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，补蒸馏水至1L。

将毕赤酵母Pichia Stipitis CBS 6054接种于5mLYPD液体培养基中30℃培养至对数生长期，使用基因组DNA提取试剂盒(北京天为生物工程有限公司酵母基因组提取试剂盒)提取基因组。

构建表达载体所用的引物加设酶切位点，引物序列如下：

上游引物(PsCR-sense含Nde I)为：GGATCCTAAGGAGGATATACATATGACCAACAAC，

下游引物(PsCR-anti含BamH I)为：CCGCTCGAGTTACTATGGCGCACAGT，

所有引物均由上海申能博彩公司合成。

基因的PCR条件：

94℃变性7min，按如下参数循环30次：94℃变性1min，60℃退火50s，72℃延伸1.5min。最后72℃延伸10min。

凝胶电泳分离纯化PCR产物，胶回收PsCR目的基因。将CR目的基因连接到PMD18T-vector上，成为克隆质粒PMD 18 T-PsCR，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于氨苄抗性平板。

挑取LB平板上PMD18 T-PsCR重组菌的单菌落，接种到装有5mLLB液体培养基的50mL离心管中，37℃，220rpm下培养8-12小时。利用博大泰克有限公司的试剂盒按照其公司提供的操作手册进行质粒抽提。

将构建在simple T中的PMD18 T-PsCR分别进行BamH I/Xho I双酶切，胶回收已双酶切的目的片段

用BamH I和Xho I对表达载体pET-22b进行双酶切，胶回收已双酶切的目的片段。

将已经双酶切的表达载体与目的基因GDH用T4连接酶进行连接过夜，连接产物pET-22b-PsCR转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用质粒电泳和酶切筛选鉴定阳性克隆。

2、葡萄糖脱氢酶基因的获取：

巨大芽孢杆菌DSMZ2894(购于German Collection of Microorganisms and CellCultures)，培养基LB(g·L^-1)：酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl 5g/L，补蒸馏水至1L。

将巨大芽孢杆菌接种于接种于5mLLB液体培养基中37℃培养至对数生长期，使用基因组DNA提取试剂盒(北京天为生物工程有限公司细菌基因组提取试剂盒)提取基因组。

构建表达载体所用的引物加设酶切位点，引物序列如下：

上游引物(GDH-sense含Nde I)为：AATTCCATATGTATACAGATTTAAAAGAT，

下游引物(GDH-anti含BamH I)为：TATGGATCCCTATTAGCCTCTTC。

基因的PCR条件：

94℃变性7min，按如下参数循环30次：94℃变性1min，60℃退火50s，72℃延伸1.5min。最后72℃延伸10min。

凝胶电泳分离纯化PCR产物，胶回收BmGDH目的基因。将GDH目的基因连接到PMD18 T-vector上，成为克隆质粒PMD18 T-BmGDH，连接产物分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于氨苄抗性平板。

挑取LB平板上PMD18 T-GDH重组菌的单菌落，接种到装有5mLLB液体培养基的50mL离心管中，37℃，220rpm下培养8-12小时。利用博大泰克有限公司的试剂盒按照其公司提供的操作手册进行质粒抽提。

将构建在simple T中的PMD18 T-BmGDH分别进行BamH I/Xho I双酶切，胶回收已双酶切的目的片段

用BamH I和Xho I对表达载体pET-22b进行双酶切，胶回收已双酶切的目的片段。

将已经双酶切的表达载体与目的基因BmGDH用T4连接酶进行连接过夜，连接产物pET-22b-BmGDH转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，用质粒电泳和酶切筛选鉴定阳克隆。

3、羰酰还原酶基因与葡萄糖脱氢酶基因的共表达：

PCR扩增带有酶切位点和SD序列的PsCR基因SD-PsCR，引物序列如下：

上游引物(GDH-sense含Bam I)为：GGATCCTAAGGAGGATATACATATGACCAACAAC，

下游引物(GDH-anti含Xho I)为：CCGCTCGAGTTACTATGGCGCACAGT。

基因的PCR条件：

94℃变性7min，按如下参数循环30次：94℃变性1min，60℃退火50s，72℃延伸1.5min。最后72℃延伸10min。

用BamH及Xho I分别酶切SD-PsCR和pET-22b-BmGDH(pET-22b-BmGDH为已构建好的羰酰还原酶载体)，分别胶回收已双酶切的表达载体和目的片段，将已双酶切的表达载体pET-22b-BmGDH与SD-PsCR用T4连接酶进行连接过夜，将10uL的连接产物pET-22b-BmGDH-PsCR加入100uL的Rosetta(DE3)感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激90sec，冰上放置2min。加入预热的900uLLB培养基。220rpm 37℃1h。将200uL菌液涂布在含有100μg/mL的氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，37℃过夜培养12-16h。构建图谱见附图。

实施例2：酶活的测定。

挑取重组菌E.coli Rosseta(pET-22b-BmGDH-PsCR)及出发大肠杆菌Rosseta(DE3)至含抗生素氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。然后按2％接种量分别接种到新鲜培养液中，37℃培养至OD₆₀₀约为0.6时，加入IPTG至终浓度0.8mmol·L^-1，25℃，220rpm，诱导表达10h后，离心(4℃，5000rpm，15min)，菌泥用100mM磷酸钾缓冲(pH7.0)重悬，超声破碎细胞(功率300W，超声5s，间歇5s，共5min)，离心(4℃，12000rpm，15min)，测定上清中的酶活。

测定PsCR的酶活，酶反应体系包括100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，5mM NADPH，20mM COBE，30℃，340nm处测定吸光值的下降。酶活定义为每分钟内氧化1μmolNADPH所需要的酶量为一个酶活单位U。

测定BmGDH的酶活，酶反应体系包括100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，5mM NADP，2M葡萄糖，30℃，340nm处测定吸光值的上升。酶活定义为每分钟内还原1μmol NADP所需要的酶量为一个酶活单位U。蛋白采用Brandford法进行测定。

结果显示，重组菌(pET-22b-BmGDH-PsCR)中PsCR的酶活为18U/mg，BmGDH酶活为9U/mg。

实施例3：重组大肠杆菌E.coli Rosseta(pET22b-BmGDH-PsCR)的发酵。

挑取重组菌E.coli Rosseta(pET-22b-BmGDH-PsCR)至含抗生素的LB培养液，37℃振荡培养过夜。然后按2％接种量分别接种到新鲜培养液中，37℃培养至OD₆₀₀约为0.6时，加入IPTG至终浓度0.8mmol·L^-1，25℃，220rpm，诱导表达10h后，8000rpm，4℃离心10min，弃上清，沉淀备用。

实施例4：

取实施例3的沉淀用磷酸钾缓冲(100mmol·L-1，pH 6.5)洗涤两次，称取1g(干重)的大肠杆菌菌泥，悬浮于15mL的pH 6.5磷酸钾缓冲中。超声处理细胞(功率300W，超声5s，间歇5s，共5min)，加入葡萄糖200mmol/L，COBE 1.5g/L，NADP 0.005mmol/L，20℃，200rpm，16h。产物(S)-CHBE的产量为1.47g/L，产物的得率为：98％，光学纯度e.e％为100％。辅酶的再生效率TN为1765。

(S)-CHBE的检测方法如下，以下实施例中产物的检测方法相同：

对于水相反应：反应结束后，加入等体积乙酸乙酯，剧烈振荡10min然后放置两小时，8000rpm离心10min分离有机层和水层。小心吸取上层乙酸乙酯过有机膜，加入内标，保存测样。

对于水/有机两相反应：反应结束后8000rpm离心10min分离有机层和水层。小心吸取上层乙酸乙酯过有机膜，加入内标，保存测样。

PEG-20M毛细管柱，内标物为萘。程序为：检测器FID，温度210℃，汽化室温度210℃，柱温150℃，柱头压0.03MPa，氢气0.05MPa，空气0.1MPa，尾吹0.08MPa。用HPLC对(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的旋光性进行分析(手性柱Chiralcel OB，4.6×250mm；Daicel Chemical Industries，日本)，检测条件：流动相为正己烷∶正己烷(9∶1)，波长214nm，流量为0.8mL/min，，R型和S型CHBE的出峰时间分别为：10.5min和11.6min。

实施例5：

取实施例3的沉淀用磷酸钾缓冲(100mmol·L-1，pH 7.5)洗涤两次，称取2g(干重)的大肠杆菌菌泥，悬浮于15mL的pH 7.5磷酸钾缓冲液中。超声处理细胞(功率300W，超声5s，间歇5s，共5min)，加入葡萄糖500mmol/L，COBE 20g/L(0、2、6、12h各5g/L)，NADP 0.05mmol/L，25℃，220rpm，24h。产物(S)-CHBE的产量为16.8g/L，产物的得率为：84％，e.e大于＞99％，辅酶的再生效率TN为2017。

实施例6：

取实施例3的沉淀用磷酸钾缓冲(100mmol·L-1，pH 7.0)洗涤两次，称取4g(干重)的大肠杆菌菌泥，悬浮于50mL的pH 7.0磷酸钾缓冲液中。超声处理细胞(功率300W，超声5s，间歇5s，共5min)，加入葡萄糖600mmol/L，COBE 35g/L(0、1、2、8、14h各7g/L)，NADP 0.08mmol/L，30℃，240rpm，28h。产物(S)-CHBE的产量为33.8g/L，产物的得率为：96.6％，光学纯度e.e％为100％。辅酶的再生效率TN为2536。

实施例7：

取实施例3的沉淀用磷酸钾缓冲(100mmol·L-1，pH 6.0)洗涤两次，称取10g(干重)的大肠杆菌菌泥，悬浮于50mL的pH 6.0磷酸钾缓冲液中。超声处理细胞(功率300W，超声5s，间歇5s，共5min)，加入葡萄糖1.5mol/L，50mL乙酸正丁酯(可促进COBE的溶解并解除底物和产物对酶和细胞的抑制作用)，加入COBE 100g/L(0、2、4、6、10各20g/L)，NADP 0.12mmol/L，20℃，240rpm，28h。产物(S)-CHBE的产量为97.5g/L，产物的得率为：97.5％，光学纯度e.e％为100％。辅酶的再生效率TN为4877。

实施例8：

取实施例3的沉淀用磷酸钾缓冲(100mmol·L-1，pH 6.5)洗涤两次，称取5g(干重)的大肠杆菌菌泥，悬浮于15mL的pH 6.5磷酸钾缓冲液中。超声处理细胞(功率300W，超声5s，间歇5s，共5min)，加入15mL乙酸正丁酯(可促进COBE的溶解并解除底物和产物对酶和细胞的抑制作用)，加入葡萄糖1mol/L，COBE 50g/L(0、2、4、6、10各10g/L)，NADP 0.09mmol/L，20℃，240rpm，28h。产物(S)-CHBE的产量为47.5g/L，产物的得率为：95.0％，光学纯度e.e％为100％。辅酶的再生效率TN为3168。

实施例9：

取实施例3的沉淀用磷酸钾缓冲(100mmol·L-1，pH 6.5)洗涤两次，称取20g(干重)的大肠杆菌菌泥，悬浮于200mL的pH 6.5磷酸钾缓冲液中。超声处理细胞(功率300W，超声5s，间歇5s，共5min)，加入200mL乙酸正丁酯(可促进COBE的溶解并解除底物和产物对酶和细胞的抑制作用)，加入葡萄糖2mol/L，COBE 300g/L(0、2、4、6、10各60g/L)，NADP 0.18mmol/L，25℃，280rpm，32h。产物(S)-CHBE的产量为292.7g/L，产物的得率为：97.5％，光学纯度e.e％为100％。辅酶的再生效率TN为9760。

序列表

<110>南京工业大学

     南京同凯兆业生物技术有限责任公司

<120>一种不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌及其构建方法

<130>njut090709

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>849

<212>DNA

<213>毕赤酵母(Pichia stipitis CBS 6054)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(849)

<400>1

atg acc aac aac ccg agc atc acc tct cat atc aac gct gcc gtg ggt    48

Met Thr Asn Asn Pro Ser Ile Thr Ser His Ile Asn Ala Ala Val Gly

1               5                   10                  15

cct ctc cct act aag gct ccc aaa ctt gcg tct aac gtg ttg gat tta    96

Pro Leu Pro Thr Lys Ala Pro Lys Leu Ala Ser Asn Val Leu Asp Leu

            20                  25                  30

ttt tct ctc aag ggt aag gta gct tcc att act ggc tct tca gcc ggg    144

Phe Ser Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser Ile Thr Gly Ser Ser Ala Gly

        35                  40                  45

ata ggt ctt gct gta gcc gag gca tac gct cag gct ggt gct gat gtt    192

Ile Gly Leu Ala Val Ala Glu Ala Tyr Ala Gln Ala Gly Ala Asp Val

    50                  55                  60

gca atc tgg tac aac tcc cag cct gct aag gaa aag gcc gac aag ata    240

Ala Ile Trp Tyr Asn Ser Gln Pro Ala Lys Glu Lys Ala Asp Lys Ile

65                  70                  75                  80

gcc aag acg tat ggt gta cgt tgc aga gct tat aag tgt aat gtt tca    288

Ala Lys Thr Tyr Gly Val Arg Cys Arg Ala Tyr Lys Cys Asn Val Ser

                85                  90                  95

gat cag cag gat gtt gaa acc act gtg gct cag atc gag gct gac ttt    336

Asp Gln Gln Asp Val Glu Thr Thr Val Ala Gln Ile Glu Ala Asp Phe

            100                 105                 110

ggc acc ata gat atc ttt gtt gcc aat gcc ggt gtt ccc tgg act gaa    384

Gly Thr Ile Asp Ile Phe Val Ala Asn Ala Gly Val Pro Trp Thr Glu

        115                 120                 125

ggc gaa agt gta gaa att gac aac ttt gac tcc tgg aaa aag gtc ata    432

Gly Glu Ser Val Glu Ile Asp Asn Phe Asp Ser Trp Lys Lys Val Ile

    130                 135                 140

gac tta gac ttg tct ggg gct tac tac tgt gca cat gcg gct ggt aag    480

Asp Leu Asp Leu Ser Gly Ala Tyr Tyr Cys Ala His Ala Ala Gly Lys

145                 150                 155                 160

atc ttt aag aaa aac ggc aag ggc tcc atg att ttc acc gct tct atg    528

Ile Phe Lys Lys Asn Gly Lys Gly Ser Met Ile Phe Thr Ala Ser Met

                165                 170                 175

tct ggt cac att gtg aat att cct caa ttc cag gct cct tac aac gct    576

Ser Gly His Ile Val Asn Ile Pro Gln Phe Gln Ala Pro Tyr Asn Ala

            180                 185                 190

gcc aag gct gcg gtg ttg cac ttg agc aaa tcg ttg gct ata gaa tgg    624

Ala Lys Ala Ala Val Leu His Leu Ser Lys Ser Leu Ala Ile Glu Trp

        195                 200                 205

gct cct ttt gcc aga gtc aat acg att tcg cca gga tac att gtc acc    672

Ala Pro Phe Ala Arg Val Asn Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ile Val Thr

    210                 215                 220

gag atc tcg gac ttt gtc tca gac gac atc aag tcc aag tgg tgg cag    720

Glu Ile Ser Asp Phe Val Ser Asp Asp Ile Lys Ser Lys Trp Trp Gln

225                 230                 235                 240

ttt att cct ctt ggt aga gag gga gtc aca caa gag ttg gtt ggt gcc    768

Phe Ile Pro Leu Gly Arg Glu Gly Val Thr Gln Glu Leu Val Gly Ala

                245                 250                 255

tac ttg tac ttt gct tct gat gcc tct aca tat act acg gga tca gat    816

Tyr Leu Tyr Phe Ala Ser Asp Ala Ser Thr Tyr Thr Thr Gly Ser Asp

            260                 265                 270

ctt atc gtc gat gga ggc tac tgt gcg cca tag                        849

Leu Ile Val Asp Gly Gly Tyr Cys Ala Pro

        275                 280

<210>2

<211>282

<212>PRT

<213>毕赤酵母(Pichia stipitis CBS 6054)

<400>2

Met Thr Asn Asn Pro Ser Ile Thr Ser His Ile Asn Ala Ala Val Gly

1               5                   10                  15

Pro Leu Pro Thr Lys Ala Pro Lys Leu Ala Ser Asn Val Leu Asp Leu

            20                  25                  30

Phe Ser Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser Ile Thr Gly Ser Ser Ala Gly

        35                  40                  45

Ile Gly Leu Ala Val Ala Glu Ala Tyr Ala Gln Ala Gly Ala Asp Val

    50                  55                  60

Ala Ile Trp Tyr Asn Ser Gln Pro Ala Lys Glu Lys Ala Asp Lys Ile

65                  70                  75                  80

Ala Lys Thr Tyr Gly Val Arg Cys Arg Ala Tyr Lys Cys Asn Val Ser

                85                  90                  95

Asp Gln Gln Asp Val Glu Thr Thr Val Ala Gln Ile Glu Ala Asp Phe

            100                 105                 110

Gly Thr Ile Asp Ile Phe Val Ala Asn Ala Gly Val Pro Trp Thr Glu

        115                 120                 125

Gly Glu Ser Val Glu Ile Asp Asn Phe Asp Ser Trp Lys Lys Val Ile

    130                 135                 140

Asp Leu Asp Leu Ser Gly Ala Tyr Tyr Cys Ala His Ala Ala Gly Lys

145                 150                 155                 160

Ile Phe Lys Lys Asn Gly Lys Gly Ser Met Ile Phe Thr Ala Ser Met

                165                 170                 175

Ser Gly His Ile Val Asn Ile Pro Gln Phe Gln Ala Pro Tyr Asn Ala

            180                 185                 190

Ala Lys Ala Ala Val Leu His Leu Ser Lys Ser Leu Ala Ile Glu Trp

        195                 200                 205

Ala Pro Phe Ala Arg Val Asn Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ile Val Thr

    210                 215                 220

Glu Ile Ser Asp Phe Val Ser Asp Asp Ile Lys Ser Lys Trp Trp Gln

225                 230                 235                 240

Phe Ile Pro Leu Gly Arg Glu Gly Val Thr Gln Glu Leu Val Gly Ala

                245                 250                 255

Tyr Leu Tyr Phe Ala Ser Asp Ala Ser Thr Tyr Thr Thr Gly Ser Asp

            260                 265                 270

Leu Ile Val Asp Gly Gly Tyr Cys Ala Pro

        275                 280

<210>3

<211>783

<212>DNA

<213>巨大芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(783)

<400>3

atg tat aca gat tta aaa gat aaa gta gtt gta att aca ggt gga tca    48

Met Tyr Thr Asp Leu Lys Asp Lys Val Val Val Ile Thr Gly Gly Ser

1               5                   10                  15

aca ggt tta gga cgc gca atg gct gtt cgt ttc ggt caa gaa gaa gca    96

Thr Gly Leu Gly Arg Ala Met Ala Val Arg Phe Gly Gln Glu Glu Ala

            20                  25                  30

aaa gtt gtt att aac tat tac aac aat gaa gaa gaa gct tta gat gcg    144

Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Asn Asn Glu Glu Glu Ala Leu Asp Ala

        35                  40                  45

aaa aaa gaa gta gaa gaa gca ggc gga caa gca atc atc gtt caa ggc    192

Lys Lys Glu Val Glu Glu Ala Gly Gly Gln Ala Ile Ile Val Gln Gly

    50                  55                  60

gac gta aca aaa gaa gaa gac gtt gta aat ctt gtt cag aca gct act    240

Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Val Asn Leu Val Gln Thr Ala Thr

65                  70                  75                  80

aaa gaa ttc ggt aca tta gac gtt atg att aac aac gct ggt gtt gaa    288

Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Val Met Ile Asn Asn Ala Gly Val Glu

                85                  90                  95

aat cca gtt cct tct cat gag tta tct cta gat aac tgg aac aaa gtt    336

Asn Pro Val Pro Ser His Glu Leu Ser Leu Asp Asn Trp Asn Lys Val

            100                 105                 110

att gat aca aac tta aca ggt gca ttc tta gga agc cgt gaa gca att    384

Ile Asp Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile

        115                 120                 125

aaa tat ttc gtt gaa aac gat att aaa gga aat gtt atc aac atg tct    432

Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser

    130                 135                 140

agc gtt cac gaa atg att cct tgg cca tta ttt gtt cac tat gca gca    480

Ser Val His Glu Met Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala

145                 150                 155                 160

agt aaa ggc ggc atg aaa cta atg acg gaa aca ttg gct ctt gaa tat    528

Ser Lys Gly Gly Met Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr

                165                 170                 175

gcg cca aaa ggt atc cgc gta aat aac att gga cca ggt gcg atg aac    576

Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Met Asn

            180                 185                 190

aca cca att aac gca gag aaa ttt gca gat cca gaa caa cgt gca gac    624

Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Glu Gln Arg Ala Asp

        195                 200                 205

gta gaa agc atg att cca atg ggc tac atc ggt aaa cca gaa gaa gta    672

Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Lys Pro Glu Glu Val

    210                 215                 220

gca gca gtt gca gca ttc tta gca tca tca caa gca agc tat gta aca    720

Ala Ala Val Ala Ala Phe Leu Ala Ser Ser Gln Ala Ser Tyr Val Thr

225                 230                 235                 240

ggt att aca tta ttt gct gat ggt ggt atg acg aaa tac cct tct ttc    768

Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Lys Tyr Pro Ser Phe

                245                 250                 255

caa gca gga aga ggc                                                783

Gln Ala Gly Arg Gly

            260

<210>4

<211>261

<212>PRT

<213>巨大芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>4

Met Tyr Thr Asp Leu Lys Asp Lys Val Val Val Ile Thr Gly Gly Ser

1               5                   10                  15

Thr Gly Leu Gly Arg Ala Met Ala Val Arg Phe Gly Gln Glu Glu Ala

            20                  25                  30

Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Asn Asn Glu Glu Glu Ala Leu Asp Ala

        35                  40                  45

Lys Lys Glu Val Glu Glu Ala Gly Gly Gln Ala Ile Ile Val Gln Gly

    50                  55                  60

Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Val Asn Leu Val Gln Thr Ala Thr

65                  70                  75                  80

Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Val Met Ile Asn Asn Ala Gly Val Glu

                85                  90                  95

Asn Pro Val Pro Ser His Glu Leu Ser Leu Asp Asn Trp Asn Lys Val

            100                 105                 110

Ile Asp Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile

        115                 120                 125

Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser

    130                 135                 140

Ser Val His Glu Met Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala

145                 150                 155                 160

Ser Lys Gly Gly Met Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr

                165                 170                 175

Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Met Asn

            180                 185                 190

Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Glu Gln Arg Ala Asp

        195                 200                 205

Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Lys Pro Glu Glu Val

    210                 215                 220

Ala Ala Val Ala Ala Phe Leu Ala Ser Ser Gln Ala Ser Tyr Val Thr

225                 230                 235                 240

Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Lys Tyr Pro Ser Phe

                245                 250                 255

Gln Ala Gly Arg Gly

            260

Claims (9)

1、一种不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌，其特征在于它是导入羰酰还原酶PsCR基因和葡萄糖脱氢酶GDH基因的大肠杆菌。

2、根据权利要求1所述的不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌，其特征在于所述的羰酰还原酶PsCR基因序列如SEQ ID NO：1所示。

3、构建权利要求1所述的重组大肠杆菌的方法，其特征在于该方法为：克隆羰酰还原酶PsCR基因与葡萄糖脱氢酶GDH基因，构建双酶耦合表达载体，并在大肠杆菌中进行共表达，获得可不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌。

4、权利要求1所述的可不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌在4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

5、一种生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于该方法以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以葡萄糖为辅助底物，以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸磷酸为辅因子，由导入了羰酰还原酶PsCR基因和葡萄糖脱氢酶GDH基因的重组大肠杆菌进行转化反应制备得到(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

6、根据权利要求5所述的生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于底物4-氯乙酰乙酸乙酯的初始反应浓度为1.5～300g/L，葡萄糖的初始反应浓度为0.2～2mol/L，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸磷酸初始反应浓度为0.05～0.5mmol/L，重组大肠杆菌的用量以湿菌计为20～200g/L。

7、根据权利要求5所述的生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述的反应温度为20～30℃，反应时间为16～32h。

8、根据权利要求5所述的生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述的转化反应采用水相体系转化法或有机溶剂/水双相体系转化法。

9、根据权利要求8所述的生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述的水相体系转化法为：湿重组大肠杆菌在pH 6～7.5的磷酸缓冲溶液中进行生物转化；所述的有机溶剂/水双相体系转化法为：湿重组大肠杆菌在含有pH 6～7.5的磷酸缓冲/乙酸正丁酯的双相体系中进行生物转化。