CN101613414B - 两种夹竹桃寡糖及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了两种从夹竹桃花中获得的寡糖及其制备方法和用途。具体而言，这两种寡糖是首先从夹竹桃花中提取多糖，再经水解、分离和柱层析纯化制得的。经体外实验证明，这两种寡糖具有明显的抗血管生成作用，有望成为抗肿瘤药物。

Description

两种夹竹桃寡糖及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及糖类及其在制备药物中的应用，具体涉及两种夹竹桃寡糖及其制备方法和用途。

背景技术

糖是构成生命体的三大基本要素，在诸多生命过程中起到重要的作用。除了成熟的抗凝血药物肝素、治疗糖尿病的阿卡波糖等之外，现处于第I-III期临床试验的糖类药物共有34种。糖类药物的最大特点是低毒或无毒，因此其具有巨大的应用前景。

源于夹竹桃花的多糖具有抗肿瘤、抗氧化、免疫促进和神经保护作用。但是，遇到的问题是：这些大分子如果采用口服给药，其生物药效率将是非常低的。寡糖具有各种生物活性，是一种较新的功能性产物，被用于保健食品和药物中。例如，新的抗血管生成试剂PI-88就是一种高度硫酸化的寡糖，现处于第III期临床阶段。因此，寻找具有高活性的寡糖是一项很有意义的工作。我们试验发现，两种源于夹竹桃花的寡糖，具有显著的抗血管生成作用。

发明内容

为此，本发明一个目的是提供两种具有抗血管生成作用的夹竹桃寡糖，其化学结构式分别为：

β-D-Galp-(1→[4)β-D-Galp(1→]₈4)-β-D-Galp

↑

^*Galp

JZTOA-1和

β-D-Galp-(1→[4)β-D-Galp(1→]24)-β-D-Galp

↑

^*Galp

JZTOA-2

其中，^*Galp为具有还原末端的半乳糖，所述夹竹桃寡糖的分子量分别为1800Da和828Da。

本发明的另一目的是提供本发明的夹竹桃寡糖的制备方法，该方法是首先从夹竹桃花中提取多糖，再经水解、分离、纯化而制得所述夹竹桃寡糖的。

本发明的又一目的是提供本发明的夹竹桃寡糖在制备抗肿瘤药物中的用途。

本发明提供的夹竹桃寡糖的制备方法包括以下步骤：

a.多糖提取：干燥的夹竹桃花经乙醇脱脂，风干，加入去离子水，加热条件下提取，过滤，残渣再次用去离子水提取，如此反复提取2-6次，滤液合并，加热浓缩，浓缩液经15％三氯乙酸在4℃下脱蛋白，离心，上清液经中和，透析，再浓缩，加入3倍于浓缩液体积的乙醇，离心得沉淀，沉淀经真空干燥得水提夹竹桃粗多糖JZTP；

b.多糖水解：向水提夹竹桃粗多糖JZTP中加入酸，如三氟乙酸，在100℃条件下水解4小时，反应完毕后加入甲醇，减压浓缩，蒸馏水溶解，再加入乙醇，离心除去沉淀，上清液经减压浓缩得夹竹桃粗寡糖JZTO；

c.寡糖分离：将夹竹桃粗寡糖JZTO用水溶解、离心，用DEAE-纤维素(Cl-型)为载体进行柱层析初步分离，以蒸馏水洗脱，硫酸-苯酚检测，洗脱液再次浓缩、冷冻干燥、溶解和离心，上清液用1∶1(质量比)的活性炭与硅藻土为载体进行柱层析分离，逐步以蒸馏水以及有机溶剂与水的混合液，如5％乙醇溶液，50％乙醇溶液依次洗脱，其中50％乙醇洗脱液经浓缩以及冷冻干燥得到中性夹竹桃粗寡糖JZTOA；和

d.寡糖纯化：取中性夹竹桃粗寡糖JZTOA，水溶解，离心，上清液通过SephadexG-25柱进行分离，以蒸馏水洗脱，硫酸-苯酚检测，收取合并洗脱液，如此反复分离得到夹竹桃寡糖纯产物JZTOA-1；

取中性夹竹桃粗寡糖JZTOA，水溶解，离心，上清液通过Bio-GelP-2柱进行分离，以蒸馏水洗脱，硫酸-苯酚检测，收取合并洗脱液，如此反复分离得到夹竹桃寡糖纯产物JZTOA-2。

两种寡糖纯产物JZTOA-1和JZTOA-2经ESI-MS分析表明其分子量分别为1800Da和828Da。将其进行糖组成分析，即将寡糖完全水解、还原、乙酰化、萃取、浓缩后送入GC分析。糖组成分析结果显示，这两种寡糖为半乳寡聚糖。然后用碘甲烷进行反应至寡糖完全甲基化，再完全酸水解、还原、乙酰化、萃取、浓缩后用GC-MS分析。结合核磁共振分析(参见图1和2)和甲基化结果，确定这两种寡糖是以β(1→4)连接的直链半乳糖。

本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的内容。

附图说明：

图1为夹竹桃寡糖JZTOA-1的¹³C NMR谱图；

图2为夹竹桃寡糖JZTOA-2的¹³C NMR谱图；

图3为夹竹桃寡糖JZTOA-1与JZTOA-2对HMEC-1细胞生长的抑制作用的示意图，其中，图3A表示正常HMEC-1细胞；图3B表示加入JZTOA-1(20μM)后的HMEC-1细胞；且图3C表示加入JZTOA-2(200μM)后的HMEC-1细胞。

具体实施方式

实施例1：

a.多糖提取：

干燥的夹竹桃花，用95％的乙醇脱脂一周，然后室温自然干燥。干燥后的夹竹桃花961g用沸水20升提取5次，每次6小时。硫酸-苯酚检测至无明显反应，过滤，将每次的提取液合并后加热浓缩至3升，冷却后加入约500g三氯乙酸使其最终浓度为15％，在4℃下脱蛋白，1mol/L NaOH中和至pH值为7.0，然后对流动水透析72小时，透析袋内部的溶液浓缩至2升体积，在搅拌下加入三倍体积6升的95％乙醇，静置过夜，倾去上清液，离心分离，所得沉淀用2倍体积的无水乙醇洗涤，离心分离，沉淀置40℃下真空干燥，得水提夹竹桃粗多糖JZTP 65g。

b.多糖水解：

取上述制备的水提夹竹桃粗多糖JZTP 5g，加入100mL的0.2M的三氟乙酸(TFA)，100℃条件下水解4小时。反应完毕后3次加入甲醇，每次约60mL，减压浓缩至干，以完全去除TFA。加入500mL蒸馏水溶解，再加入3倍体积的95％乙醇，静置过夜，离心分离，上清液经减压浓缩得夹竹桃粗寡糖JZTO 2.4g。

c.寡糖分离：

取上述制备的夹竹桃粗寡糖JZTO 2.4g，30mL水溶解，离心除去不溶物，上清液通过Cl-型DEAE-纤维素柱进行初步分离。以蒸馏水洗脱，硫酸-苯酚法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收取合并洗脱液。洗脱液经浓缩以及冷冻干燥后1.66g，加入25mL蒸馏水溶解并离心，上清液用1∶1(质量比)的活性炭与硅藻土为载体进行柱层析分离，逐步以蒸馏水，5％乙醇溶液，50％乙醇溶液洗脱，硫酸-苯酚法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收取合并洗脱液，其中50％乙醇洗脱液经浓缩以及冷冻干燥得到中性夹竹桃粗寡糖JZTOA 803mg。

d.寡糖纯化：

取上述制备的中性夹竹桃粗寡糖JZTOA 0.4g，10mL水溶解，离心除去不溶物，上清液通过Sephadex G-25柱进行分离。以蒸馏水洗脱，硫酸-苯酚检测，画出洗脱曲线，依据洗脱曲线分别收取合并洗脱液，如此反复分离得到夹竹桃寡糖纯产物JZTOA-1 29.1mg；

取中性夹竹桃粗寡糖JZTOA 0.3g，10mL水溶解，离心除去不溶物，上清液通过Bio-GelP-2柱进行分离。以蒸馏水洗脱，硫酸-苯酚检测，画出洗脱曲线，依据洗脱曲线分别收取合并洗脱液，如此反复分离得到夹竹桃寡糖纯产物JZTOA-2 28.2mg。

试验实施例1：

抗血管生成试验

试验采用HMEC-1细胞(人微血管内皮细胞，Human MicrovascularEndothelial Cell)，在含10％胎牛血清的MDCB131(Gibico公司)完全培养液(内含2mM谷氨酸，10ng/mL表皮生长因子EGF，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中，于37℃，5％CO₂培养箱中常规培养。

将Matrigel基质膜(BD Biosciencs，MA，U.S.A.)、枪头和96孔微量培养板放于4℃预冷，过夜。次日加入融化的Matrigel 50μl/孔，37℃放置45分钟至1小时将其凝固。取处于对数生长期的HMEC-1细胞(4×10⁵/mL)接种于96孔培养板，每孔90μL，并加入夹竹桃寡糖ZJTOA-1和2样品，每孔10μL，JZTOA-1的最终浓度分别为2μM，20μM，200μM，JZTOA-2的最终浓度200μM，并设定空白对照(即未加入任何抑制剂，只加入等量培养基)，每个浓度设三复孔。细胞于37℃，5％CO₂潮湿条件下培养16小时后，观察比较微管形成，并用Olympus DP-70(日本)荧光倒置显微镜拍照，分辨率1360×1024。

由图3可见，HMEC-1细胞在空白对照中，已形成管腔。当JZTOA-1浓度为20μM时管腔形成完全抑制，而JZTOA-2浓度为200μM时部分抑制管腔形成。因此结果表明本发明的夹竹桃寡糖对HMEC-1细胞具有明显抑制作用。

在肿瘤的转移或生长过程中，存在新血管生成现象。新生成的血管为肿瘤细胞提供充分的氧气和营养，因此抑制新血管的生成可以切断肿瘤细胞的营养供应，从而起到抑制肿瘤细胞生长的作用。因此本发明的夹竹桃寡糖可用于制备抗肿瘤药物。

Claims (3)

1.两种夹竹桃寡糖，其化学结构式分别为：

β-D-Galp-(1→[4)β-D-Galp(1→]₈4)-β-D-Galp

                                        ↑

                                       *Galp

                 JZTOA-1和

β-D-Galp-(1→[4)β-D-Galp(1→]₂4)-β-D-Galp

                                        ↑

                                       *Galp

                 JZTOA-2

其中，*Galp为具有还原末端的半乳糖，所述夹竹桃寡糖的分子量分别为1800Da和828Da。

2.一种制备如权利要求1所述的夹竹桃寡糖的方法，该方法是首先从夹竹桃花中提取多糖，再经水解、分离、纯化而制得所述夹竹桃寡糖的；具体地，该方法包括以下步骤：

a.多糖提取：干燥的夹竹桃花经乙醇脱脂、水提，过滤并将所得滤液浓缩，再经15％三氯乙酸脱蛋白，中和，透析，浓缩，醇沉，离心，真空干燥得水提夹竹桃粗多糖；

b.多糖水解：向所述水提夹竹桃粗多糖中加入酸，在100℃条件下水解，然后加入甲醇，减压浓缩，蒸馏水溶解，醇沉，离心，上清液经减压浓缩得夹竹桃粗寡糖；

c.寡糖分离：将所述夹竹桃粗寡糖用水溶解、离心，用Cl-型DEAE-纤维素为载体进行柱层析初步分离，再用质量比1∶1的活性炭与硅藻土为载体进行柱层析分离，用蒸馏水以及有机溶剂与水的混合液依次洗脱，洗脱液经浓缩及冷冻干燥得到中性夹竹桃粗寡糖；和

d.寡糖纯化：所述中性夹竹桃粗寡糖通过下述层析：

经SephadexG-25柱反复分离得到夹竹桃寡糖纯产物JZTOA-1；经Bio-GelP-2柱反复分离得到夹竹桃寡糖纯产物JZTOA-2。

3.如权利要求1所述的夹竹桃寡糖在制备抗肿瘤药物中的用途。

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