CN101608172B - 一种用于减肥降脂的转化体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于减肥降脂的转化体，该转化体由人胃泌酸调节素基因的重组表达质粒转化人或动物的益生菌获得，其中，所述的人胃泌酸调节素基因的重组表达质粒是将编码人胃泌酸调节素的基因片段克隆到以阿拉伯糖操纵子为启动子的原核表达质粒的表达区得到；所述的人或动物的益生菌为双歧杆菌或乳酸菌。本发明转化体可通过诱导剂L-阿拉伯糖或低聚木糖在肠道内、外诱导表达和分泌胃泌酸调节素，起到减肥降脂的作用，因此可制成用于减肥降脂的口服活菌制剂。

Description

一种用于减肥降脂的转化体及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及以胃泌酸调节素基因为外源基因的转化体。

背景技术

肥胖是当今世界倍受关注的一个健康问题。欧美发达国家，超过半数的人体重超标，其中20～30％的人是肥胖患者。肥胖不仅影响行动和生活质量，并且可引发心血管疾病、2型糠尿病和肾脏疾病等一系列疾病，对人体健康危害极大。有统计表明，体重指数(body massindex，BMI)每增加1个单位，高血压病的发病风险就增加10％。

虽然肥胖的发病原因有多种，遗传、内分泌失调、饮食结构和生活方式等因素都可以诱发肥胖。但是绝大多数肥胖患者都是由于不良的饮食结构和生活习惯所致的单纯性肥胖。目前，肥胖症的治疗方法主要有饮食行为疗法、药物治疗和手术治疗等。节食和增加运动量等饮食行为疗法减肥效果不好，容易反复，一般人难于长期坚持。手术治疗创伤大，风险高，不易为人接受。因此，多数肥胖患者倾向于接受药物治疗。

目前的减肥药物有化学药物和中草药。其中化学药物一般是通过作用于神经中枢抑制食欲来达到减肥的目的，如芬特明(Phentermine)、芬氟拉明(Dexfenfluramine)和盐酸西布曲明(Sibntramine)等，但是这些药物有导致5-羟色胺综合征，出现精神状态改变(如焦虑不安、躁狂等)副作用，甚至会引发高血压和心绞痛。胰脂肪酶抑制剂奥利司他(orlistat，商品名xenical，赛尼可)也是一种化学减肥药物，可阻断脂肪酶对三酰甘油的水解，抑制脂肪吸收，但有引起脂肪腹泻和导致脂溶性维生素缺乏的副作用。减肥中草药多以植物提取物和膳食纤维为主，主要通过润肠通便、限食促排来达到减肥目的，长期服用会引起营养失衡、水电解质紊乱和乏力等症状。

胃泌酸调节素(OXM)是肠上皮L-细胞分泌的一种短肽肠激素。它由胰高血糖素原(proglucagon)基因编码，转录产物经过多种不同的剪接，可以形成肠高血糖素(licentin)、OXM、胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)和GLP-2等多种活性肠肽激素。人OXM含37个氨基酸残基，具有抑制食物吸收和食欲、动员脂肪的作用。OXM的表达与肥胖发病有密切的关系。肥胖患者OXM分泌下降，而厌食症(如热带腹泻，空肠切除术后)OXM的分泌则增加。OXM可以通过三条途径调节食欲和能量摄取：一是直接作用于胃肠道粘膜上皮细胞GLP-1受体，抑制糖和脂肪的吸收；二是作用于迷走神经，下调胃生长素的分泌，抑制食欲；研究显示，皮下注射OXM可使啮齿动物血液中的胃生长素下降20％，而人类可下降到44％；三是通过甲状腺途径刺激甲状腺素的合成分泌，增加能量消耗，动员脂肪。啮齿动物脑室注射或皮下注射OXM可降低食物吸收和体重，减少脂肪。在英国对26名肥胖患者进行双盲试验，受试者餐前30分钟皮下注射OXM，为期4周。结果显示，治疗组体重减轻了2.3kg，而对照组只减轻了0.5kg，对受试者食性和味觉没有影响。英国的菲亚克斯(Thiakis)公司化学合成了OXM类似肽TKS1225，已进入到临床III期研究阶段，美国的惠氏(Wyeth)医药公司出资购买了TKS1225的独占使用权，有望近年内将TKS1225开发成减肥新药。目前，TKS1225等OXM类似肽一般通过化学合成或生物工程生产，产品多为粉针剂，通过注射途径给药。这种生产和给药方式存在生产成本高、体内半衰期短和用药不便的缺点，不易被肥胖患者接受。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种胃泌酸调节素基因转化体。

本发明解决上述问题的技术方案是：

一种用于减肥降脂的转化体，该转化体由人胃泌酸调节素基因的重组表达质粒转化益生菌获得，其中，

所述的人胃泌酸调节素基因的重组表达质粒是将编码人胃泌酸调节素的基因片段克隆到以阿拉伯糖操纵子为启动子的原核表达质粒的表达区得到；

所述的益生菌是指能改善人或动物肠道微生态平衡，有利于健康的非致病菌，如双歧杆菌(包括长型、短型、两歧型、婴儿型、青春型等各种亚型双歧杆菌)或乳酸菌(包括各种亚型乳杆菌、嗜热乳酸链球菌、粪肠球菌和屎肠球菌等)，其中优选双歧杆菌。

本发明所述转化体，其中所述的人胃泌酸调节素基因的核酸序列可在不改变其编码的氨基酸序列的前提下，根据所选宿主的偏好密码子对其核酸序列进行优化调整，使人胃泌酸调节素基因在本发明转化体中更好地表达人胃泌酸调节素，这是本领域的惯用手段。

本发明所述转化体可由以下方法制备得到：

(1)将编码人胃泌酸调节素的基因片段插入到以阿拉伯糖操纵子为启动子的原核表达质粒的表达区构建重组表达质粒；

(2)将所得重组表达质粒用电穿孔方法或PEG、氯化钙等化学转化法转化到双歧杆菌、乳酸菌等益生菌中，再用含氨苄青霉素的选择培养基筛选转化子，挑选出具有氨苄青霉素抗性的菌落即可。

上述方法中，所述的重组表达质粒的构建方法为本领域常用的分子克隆技术，所用的原核表达质粒可以是原本含有阿拉伯糖操纵子启动子的质粒(如pBAD/gIIIA、B、C系列质粒、pBAD系列质粒)，也可以是其他原核表达质粒(如pET系列质粒、pQE系列质粒、pUC系列质粒、pGEM系列质粒和pTrc系列质粒等)，但需要将其原有启动子序列用阿拉伯糖操纵子序列替换。

在众多原核表达质粒中，优选pBAD/gIII质粒，用其构建本发明重组表达质粒可参考以下方法(构建流程见图1)：用SEQ NO.1所示核酸片段置换gIII信号肽核酸序列，在SEQ NO.1所示核酸片段的下游表达区插入SEQ NO.3所示核酸片段，在非编码区插入SEQ NO.2所示核酸片段，即得重组质粒(结构如图2所示)，其中，

SEQ NO.1是胞外外切木聚糖分泌性信号肽的DNA片段Xs的核酸序列，其3’端为Bpi I(反向)和Nco I内切酶位点，5’端为与pBAD/gIII质粒阿拉伯糖pBDA启动子3’端互补的一段序列；SEQ NO.2是作为质粒复制元件的双歧杆菌质粒复制子及复制启动蛋白RepB核酸序列BRP；SEQ NO.3是编码人胃泌酸调节素基因(简写为OXM)的核酸序列，其5’端设有Bpi I内切酶位点，3’端设有Xba I内切酶位点；通过在信号肽Xs核酸序列3’端和OXM序列5’端设计独特的内切酶Bpi I(酶切方式GAAGACNN↓NNNN↑)，使得Xs信号肽序列与OXM序列通过Bpi I酶切连接后形成的融合基因Xs-OXM不带有其他多余的核酸序列。

本发明转化体中的表达载体是以阿拉伯糖操纵子pBDA为启动子，在诱导剂L-阿拉伯糖或低聚木糖的诱导下能在肠道内、外表达并分泌胃泌酸调节素，起到调节食欲和能量吸收、减肥降脂的生物学作用，因此可以制成各种用于减肥的制剂。本发明所述转化体制成制剂可参考以下两种方式：

(1)体内诱导表达型：

本发明所述转化体在大量培养增殖过程中不加诱导剂诱导表达，直接离心干燥后，加入终浓度为2％(w/v)的L-阿拉伯糖或终浓度为20％(w/v)的低聚木糖作为诱导剂，按常规方法添加药用级或食品级辅料制备成口服液、活菌粉剂、片剂或胶囊直接服用，服用方法如下：每天服用1～2次，每次服用量为10⁸～10¹²cfu，一个月为一个疗程，可以连续服用3～6个疗程。

或者将离心干燥后的菌体直接添加到固体食品或饮料中，同时加入终浓度为2％(w/v)的L-阿拉伯糖或终浓度为20％(w/v)的低聚木糖作为诱导剂即可。食用方法为每天服用1～2次，每次食用量为10⁸～10¹²cfu，一个月为一个疗程，可以连续服用3～6个疗程。

(2)体外诱导表达型：本发明所述转化体在大量培养增殖到菌液OD₆₉₅吸光度值达0.6，加入诱导剂L-阿拉伯糖至终浓度为0.2％(w/v)或低聚木糖至终浓度2.0％(w/v)诱导OXM表达分泌，然后按常规方法制备成口服液、活菌粉剂、片剂或胶囊。服用方法：每天服用1～2次，每次服用量为10⁸～10¹²cfu，一个月为一个疗程，可以连续服用3～6个疗程。

或者将胃泌酸调节素转化体诱导表达后的菌液添加到固体食品或饮料中，每天食用1～2次，每次食用量为10⁸～10¹²cfu，一个月为一个疗程，可以连续服用3～6个疗程。

本发明转化体可以按常规的活菌制剂工艺制成活菌口服液、粉剂及胶囊等多种形式的剂型。由于本发明转化体活菌制剂的制备和保存都需在低温环境中进行，因此在制成各种制剂时需要添加甘油、碳水化合物、奶粉和淀粉等防冻保护剂保护菌体。本发明转化体活菌制剂可以单独形成产品，也可以作为食品添加剂或发酵剂、饲料添加剂等加入其他食品或药品中用于减肥、降脂。

本发明的突出特点是利用双歧杆菌和乳酸菌等益生菌能在肠道内长期生长、定植的特性，通过构建原核表达质粒，筛选获得胃泌酸调节素基因转化双歧杆菌或乳酸菌，使胃泌酸调节素在肠道内、外表达和分泌，发挥胃泌酸调节素调节食欲和能量吸收、减肥降脂的生物学作用。此法不需要进行胃泌酸调节素多肽的分离和纯化，生产工艺简单、成本低，可以口服，用药方便，克服了化学合成或基因工程生产胃泌酸调节素类似肽生产成本高、用药不便的缺点。此外，本发明转化体采用诱导表达的方式，其诱导剂阿拉伯糖或低聚木糖是可以促进双歧杆菌/乳酸菌增殖的益生元，只能被双歧杆菌/乳酸菌分解利用，不能被人体及其他细菌消化分解；且阿拉伯糖或低聚木糖与双歧杆菌/乳酸菌都具有减肥降脂的作用，与胃泌酸调节素有协同作用，有利于提高减肥降脂的疗效。

附图说明

图1是本发明重组质粒构建流程示意图。

图2是本发明重组质粒的结构示意图。

图3是OXM转基因双歧杆菌体外诱导表达产物免疫印迹检测结果，其中，1为诱导前的培养上清，2为经0.2％阿拉伯糖诱导48hr后的培养上清；3～5分别为经0.2％低聚糖诱导12hr、24hr、48hr后的菌体。

图4是OXM转基因双歧杆菌喂食治疗肥胖小鼠1月后体重的变化。

图5是OXM转基因双歧杆菌喂食治疗肥胖小鼠1月后血清甘油三酯含量的变化。

图6是OXM转基因双歧杆菌喂食正常小鼠1周后血清饥饿素(Ghrelin)含量的变化。

具体实施方式

例1OXM基因转化双歧杆菌的制备

1.OXM双歧杆菌-大肠杆菌重组表达质粒的构建方法：

1.1化学合成胞外外切木聚糖酶(extracellular exo-xylanase)分泌性信号肽核酸序列Xs(SEQ NO.1)；以pBAD/gIII质粒DNA为模板用引物1(SEQ NO.4)和2(SEQ NO.5)扩增pBDA启动子DNA片段，扩增条件为94℃变性45秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，重复30个循环，72℃再延伸5分钟。将所得pBDA DNA片段与分泌性信号肽核酸序列Xs混合，加高保真DNA聚合酶和dNTP，94℃ 1分钟变性，60℃ 2分钟退火补平，重复8-10个循环，再用引物1和引物3(SEQ NO.6)PCR法扩增pBDA/Xs融合基因全长核酸片段，扩增条件为94℃变性45秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，重复30个循环，72℃再延伸5分钟。将所得扩增产物插入到pBAD/gIII质粒的Mph1103 I和Nco I酶切位点之间，替换该质粒原有的pBAD/gIII核酸序列，构建成质粒pBAD/Xs。

1.2参照人OXM氨基酸及核酸序列，根据双歧杆菌密码子使用频率优化OXM核酸序列，工化学合成OXM核酸片段(SEQ NO.3)，并在5’端引入Bpi I内切酶序列，3’端引入Xba I内切酶序列，插入到构建好的pBDA/Xs质粒的Bpi I和Xba I酶切位点之间，构建成OXM广泛宿主表达质粒载体pBDA/Xs-OXM。

1.3以引物4(SEQ NO.7)和引物5(SEQ NO.8)从克隆好的pBluscriptSK-BRP质粒中PCR法扩增双歧杆菌质粒复制子及复制启动蛋白(BRP)DNA片段(SEQ NO.2)，扩增条件为94℃变性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸2分钟，重复30个循环，72℃再延伸5分钟。扩增的BRP片段平端插入到原核表达载体pBAD/gIII的Bst1107 I位点，DNA测序鉴定OXM双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体。

上述的OXM双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体构建过程中所用的技术方法皆为分子生物学通用的分子克隆技术方法，有一定分子生物学基础的技术人员都可按照上述方法构建成功。所用的pBAD/gIII载体由美国Invitrogen公司提供，Bpi I内切酶由立陶宛MBI Fermentas公司提供，其他的内切酶、连接酶等工具酶国内外的多个生化、生物公司皆可提供。

2.OXM转化双歧杆菌的制备和筛选

2.1双歧杆菌感受态细胞的制备

2.1.1选双歧杆菌单菌落接种到5ml改良MRS液体培养基(每升含胰蛋白胨10g，大豆蛋白胨2g，牛肉浸出粉10g，酵母浸出粉5g，葡萄糖20g，柠檬酸铵2g，K₂HPO₄ 2g，MgSO₃·7H₂O2g，醋酸钠3g，吐温801ml，高压灭菌后加无菌半胱氨酸至终浓度0.05％，调节PH至6.8)中，放入厌氧培养箱，37℃恒温厌氧培养48小时；

2.1.2待菌液变混浊，测定OD₆₉₅吸光度值达0.6时，吸取菌液50μl加入5ml改良MRSS培养基中，置于厌氧盒中37℃过夜培养24小时；

2.1.3取上述菌液以1∶25稀释在新鲜的改良MRS培养基中，37℃厌氧培养至OD695值为0.6；

2.1.4将菌液置冰上预冷，转移至高压灭菌的离心管中，于4℃4500转/分钟离心5分钟收获细菌，弃去上清液，保留沉淀；

2.1.5用0.5M浓度的无菌蔗糖溶液重悬细菌，混匀后4℃4500转/分钟离心5分钟，弃去上清液，用0.5M蔗糖溶液重复洗涤1次；

2.1.6用1/250原始菌液体积的预冷电击缓冲液(0.1M醋酸铵，0.5M蔗糖，PH 6.0)重悬细菌，加入甘油至15％配成感受态细菌，置-70℃冰箱保存备用。

3.OXM基因转化双歧杆菌的筛选

3.1取0.5～1.5μg的pBDA/Xs-OXM质粒，加入到80μl解冻双歧杆菌感受态细菌悬液中混匀，置冰上5分钟，然后转移到2mm电击杯中；

3.2将电击杯置电穿孔仪的电击盒中，启动电源进行电转化。电击条件：电压2.5kV，电容25μF，电阻200Ω，电击时间约3-4.5毫秒。

3.3电击完成后，迅速取出菌液，涂布在改良MRS选择琼脂培养基平板(含1.5％琼脂，0.05％半胱氨酸，100μg/ml氨苄青霉素(AMP)上，置于厌氧盒内，37℃厌氧培养48-72小时。

挑选6-8个单菌落于5ml AMP⁺的MRS液体培养基中培养24-48小时，即得OXM基因转化双歧杆菌。

4.OXM基因转化双歧杆菌的鉴定

4.1革兰氏染色鉴定：取一滴菌液涂布在载玻片上，空气晾干后，依次用结晶紫染液、革兰氏碘染液各染色1分钟，脱色液脱色约半分钟，沙黄复染液染色1分钟，细水冲洗，晾干或用吸水纸吸干镜下观察。

4.2OXM基因聚合酶链反应(PCR)检测：

4.2.1OXM基因转化双歧杆菌质粒DNA的提取：取1ml菌液，6000转/分钟离心5分钟，弃上清液；加入100ul酶裂解液(含40mg/ml的溶菌酶，20u/L变溶菌素的25％蔗糖溶液)，重悬菌体，37℃孵育15min；加入200ul碱性SDS裂解液(3％SDS，0.2N NaOH)，充分混匀，室温孵育7分钟；加入150ul预冷的3M乙酸钠(pH 5.2)中和液，立即振荡混匀，4℃ 12000r/分钟，离心10分钟；上清转移至新的EP管，加入1ml无水乙醇，4℃ 12000r/分钟离心10分钟，弃去上清；用70％的乙醇洗涤沉淀，离心弃上清，空气干燥后，加50ul TER液(10mMTris，1mM EDTA，20ug/ml Rnase A)溶解，-20℃保存备用。

4.2.2OXM基因PCR检测：以OXMF2(碱基序列为SEQ NO.9)和OXMR2(碱基序列为SEQNO.10)为上下游引物，以上述提取的转化双歧杆菌质粒为模板DNA，PCR法检测OXM核酸序列。反应条件是：94℃ 2分钟预变性，94℃ 30秒变性，55℃ 40秒退火，72℃ 45秒延伸，共30个循环，72℃延伸5分钟。将上述PCR产物加入到1.5％琼脂糖凝胶中电泳。能扩增出150bp目的OXM核酸条带的菌液可认为OXM基因转化双歧杆菌，继续进行稳定性实验和诱导表达分析。

结果：OXM基因转化的双歧杆菌经革兰氏染色观察显示，转化双歧杆菌在外观形态方面与野生型双歧杆菌无明显区别。以其基因组DNA为模板，以OXMF2和OXMR2为上下游引物扩增可得大小为150bp的DNA片段。

5.质粒稳定性实验

5.1细菌增殖传代：取PCR鉴定正确的OXM基因转化双歧杆菌液按1∶100接种到MRS培养基中，37℃厌氧培养24小时。接着再1∶100接种到新MRS培养基中，37℃厌氧培养24小时。如此反复传代接种15次。

5.2OXM基因PCR检测：按步骤4方法提取转化双歧杆菌质粒，以OXMF2(碱基序列为SEQ NO.9)和OXMR2(碱基序列为SEQ NO.10)为上、下游引物，PCR检测OXM核酸序列，实验阳性者可认为OXM基因稳定转化双歧杆菌。可用于OXM诱导表达实验。

结果：OXM基因转化的双歧杆菌经连续传代接种15次后，PCR法仍然可以在提取的菌液质粒DNA中检测到OXM基因序列。

6.OXM诱导表达与鉴定实验：

6.1诱导表达：取OXM基因稳定转化双歧杆菌菌液，按1∶100接种于3ml改良MRS培养基(含0.05％半胱氨酸，100ug/ml氨苄青霉素)中，37℃厌氧培养；待细菌悬液OD₆₉₅吸光度值达0.6时，转接种到5ml新的改良MRS培养基(含0.05％半胱氨酸，100ug/ml氨苄青霉素)中，37℃厌氧培养至OD₆₉₅吸光度值达0.6；加入诱导剂L-阿拉伯糖至终浓度为0.2％，设置不加诱导剂的菌液为阴性对照，37℃厌氧培养24-48小时；6000转/分钟离心5分钟收获细菌，培养上清液和沉淀细菌分别冻存备用。

6.2免疫印迹(Western bloting)检测

6.2.1样品处理：

6.2.1.1细菌沉淀样品处理：用500ul预冷的去离子水重悬细菌沉淀，12000转/分钟离心10分钟，弃上清；加入75ul裂解液(含1/100细菌蛋白酶抑制剂，40mg/ml的溶菌酶，20u/L变溶菌素20u/L变溶菌素)重悬沉淀，超声粉碎仪超声破碎细菌10min，加入25ul 4×SDS凝胶加样缓冲液并混匀；

6.2.1.2上清样品处理：上清样品中加入1/3体积的100三氯醋酸(TCA)混匀，冰上静置20-30分钟，12000转/分钟离心10分钟沉淀蛋白，弃上清；加原样品三倍体积的丙酮，室温静置10分钟溶解TCA，12000转/分钟离心10分钟沉淀蛋白，弃上清；加入100ul 1×SDS上样缓冲液溶解蛋白。

6.2.1.3所有样品于100℃煮5分钟，12000转/分钟离心10min，冰上静置备用。

6.2.2聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳：用小电泳槽配制1.2％PAGE；取20ul样品上清上样电泳。电泳条件：积层胶80V恒压，分离胶100V恒压电泳，指示剂溴酚蓝泳动至胶底结束电泳。

6.2.3电转移：电泳结束后，取下凝胶，切去未加样多余凝胶，并切一小角作标记，移至0.2um孔径PVDF膜上。

6.2.4封闭：电转结束后，取出PVDF膜，放在封闭液(含5％脱脂奶粉的TBST)中，室温振摇封闭1小时；

6.2.5抗体孵育：封闭结束后，TBST液简单洗膜，取兔抗人OXM抗体，按1∶2000比例加入到封闭液中，室温孵育2小时；TBST洗膜3次；取羊抗兔二抗，按1∶2500比例加入到封闭液中，室温孵育30分钟；TBST洗膜5次。

6.2.6曝光：将膜置化学发光显色液中充分浸润1min，在滤纸上吸干，用保鲜膜包好，放暗盒中曝光。根据条带发光强度，曝光30秒至10分钟不等；

6.2.7显影：暗室中取出底片，放入显影液显影2分钟，定影液中定影2-5min取出，水洗后观察。目的成熟OXM多肽大小应为4-5KDa。

6.3酶联免疫吸附法(ELISA)测定培养上清、肠道内容物和血清中OXM含量

6.3.1样品处理：培养上清和血清冻存液解冻后，4℃12000转/分钟离心10分钟，冰上静置备用；回盲肠道内容物解冻后，按每克湿重加100ul样品稀释液(OXM ELISA试剂盒提供)悬浮混匀，4℃12000转/分钟离心10分钟，冰上静置备用。

6.3.2ELISA检测：在微孔板上每孔加入80-90ul样品稀释液，10-20ul样品，总体积100ul，再加入50ul酶标二抗，37℃温育1小时；甩去孔内液体，每孔加250ul磷酸缓冲液(PBS)洗涤液洗涤5次，每次2-3分钟；甩去液体，在吸水纸上拍干；每孔加入显色底物100ul，4℃温育10分钟，加入2M硫酸终止反应。在450nm波长处测定各孔吸光度值(OD)。

结果：OXM基因转化双歧杆菌经诱导剂L-阿拉伯糖诱导后的6-72小时内，免疫印迹法可以检测到培养上清液和沉淀细菌中有特异性OXM多肽表达(图3)；ELISA法定量检测OXM表达水平显示，OXM在培养上清的表达水平可达到1-5ng/ml，培养上清OXM含量高于沉淀细菌含量1-3倍。说明OXM在转化的双歧杆菌中主要以分泌型方式表达。

例2本发明转化体口服液的制备

1.种子菌的制备

1.1扩增培养：取经过PCR检测、革兰氏染色及诱导表达实验鉴定的OXM基因稳定转化双歧杆菌菌液，按1∶100接种于10ml改良MRS培养基(含0.05％半胱氨酸，100ug/ml氨苄青霉素)中，37℃厌氧培养；待细菌悬液OD695吸光度值达0.6时，4500转/分钟离心5分钟收获细菌；

1.2冻存：

1.2.1冻存方法1：加入适量的含15-50％甘油或10-20％二甲亚砜(DMSO)防冻剂的MRS培养液，分装后于-20至-80℃冻存作为种子菌。

1.2.2冻存方法2：加入终浓度为15％(w/v)的甘油、10％(w/v)的脱脂奶粉、3％(w/v)的乳糖和3％(w/v)的海藻糖等常用冷冻干燥保护剂成分的防冻保护剂冷冻干燥，分装后于4℃或-20℃冻存作为种子菌。

2.OXM基因转化双歧杆菌口服液的制备

2.1取OXM转化双歧杆菌种子菌，接种于适合于厌氧菌生长的液体培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)中，37℃厌氧培养48-72小时，4500转/分钟离心5分钟收获细菌，用生理盐水洗涤2次，离心收集菌体沉淀。

2.2口服液

取2.1方法收获的细菌沉淀，加终浓度为2％(w/v)的L-阿拉伯糖溶液重悬细菌，配制成每毫升不低于10⁸活菌的新鲜菌液，分装后于4至10℃冰箱冷藏。

例3冻干粉剂

取例2中2.1方法收获的细菌沉淀，加终浓度为20％(w/v)的低聚木糖溶液重悬细菌，再加入终浓度为15％(w/v)的甘油、10％(w/v)的脱脂奶粉、3％(w/v)的乳糖和3％(w/v)的海藻糖，配制成每克不低于10⁸活菌的混合液，分装后置冷冻干燥仪上冻干，封口后于4-8℃或-20℃保存。

例4干燥粉剂

取例2中2.1方法收获的细菌沉淀，加终浓度为20％(w/v)的低聚木糖溶液重悬细菌，再加入终浓度为10％(w/v)的脱脂奶粉、3％(w/v)的乳糖和3％(w/v)的海藻糖，配制成每克不低于10⁸活菌的混合液，分装后置真空干燥仪上烘干，最高温度不超过42℃，封口后于4-8℃或-20℃保存。

例5OXM转化双歧杆菌减肥降脂药效学实验

1.准备成年高脂、高糖饮食肥胖小鼠(或大鼠)，将动物分成4组，每组不少于10只，继续高脂、高糖饮食喂饲在洁净场所。

2.实验组用OXM转化双歧杆菌口服液喂饲肥胖动物，每只喂饲0.1-0.2ml，每2天1次。阴性对照组喂饲报告基因绿色荧光蛋白(GFP)转化双歧杆菌；空白对照组喂饲无菌低聚糖、单糖溶液；阳性对照组按1g/kg体重喂饲脂肪酶抑制剂赛尼可。连续喂饲1个月。跟踪观测受试动物食量、体重及其他生命体征。

3.处死小鼠前测试受试动物食量、体重，眼球采血，处死后采取肠道回盲部内容物，肝、肾、血管等组织固定并切片，测定血脂等生化指标，测定血清OXM、肠道内容物OXM含量，血清饥饿素(ghrelin)含量。

4.比较实验组与阴性对照组及空白对照组之间食量、体重和血液、肠道生化、免疫指标。

结果：药效学实验显示，OXM转化双歧杆菌口服液喂饲肥胖小鼠1个月后，实验组食量和体重接近正常小鼠，显著低于阴性对照组(P＜0.001)，与正常组无显著差异(P＞0.05)，效果与减肥新药塞可尼(一种脂肪酶抑制剂)相当(结果见图4)；实验组甘油三酯含量显著低于阴性对照组(P＜0.001)，甚至低于正常组小鼠(P＜0.05)，效果与减肥新药塞可尼相当，二者无显著差异(P＞0.05)(结果见图5)；实验组肠道回盲部内容物OXM含量显著高于阴性对照组和空白对照组；受试小鼠血清OXM含量略高于对照组，但与阴性对照组之间无统计学差异；实验组血清饥饿素(ghrelin)含量显著低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.001)(结果见图6)。上述结果表明，OXM转化双歧杆菌可在小鼠肠道内诱导表达分泌OXM，表达的OXM可通过作用于肠道内膜相应的受体，下调血清饥饿素(ghrelin)含量，抑制食欲和能量吸收。

说明OXM转化双歧杆菌有显著的减肥、降脂生物学作用。

例6OXM基因转化乳杆菌

1、OXM基因转化乳杆菌的制备：用乳杆菌代替双歧杆菌作为宿主，其余方法步骤与例1相同。

2、OXM基因转化乳杆菌的筛选：方法与例1相同。

3、OXM基因转化乳杆菌的鉴定：方法与例1相同。

例7OXM基因转化嗜热乳酸链球菌

1、OXM基因转化嗜热乳酸链球菌的制备：用嗜热乳酸链球菌代替双歧杆菌作为宿主，其培养增殖温度为40-45℃，其他的方法与例1相同。

2、OXM基因转化嗜热乳酸链球菌的筛选：除嗜热乳酸链球菌的培养增殖温度为40-45℃外，其他的方法与例1相同。

3、OXM基因转化嗜热乳酸链球菌的鉴定：方法与例1相同。

例8OXM基因转化粪肠球菌

1、OXM基因转化粪肠球菌的制备：用粪肠球菌代替双歧杆菌作为宿主，其余方法步骤与例1相同。

2、OXM基因转化粪肠球菌的筛选：方法与例1相同。

3、OXM基因转化粪肠球菌鉴定：方法与例1相同。

例9OXM基因转化屎肠球菌

1、OXM基因转化屎肠球菌的制备：用屎肠球菌代替双歧杆菌作为宿主，其余方法步骤与例1相同。

2、OXM基因转化屎肠球菌的筛选：方法与例1相同。

3、OXM基因转化屎肠球菌鉴定：方法与例1相同。

序列表

<110>南方医科大学

<120>一种用于减肥降脂的转化体及其制备方法

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>109

<212>DNA

<213>双歧杆菌

<400>1

atgaattatt tacgacaaaa aatttcggct agtgctatcg cggtgttgtc gacttgtggg    60

ttgattttgg cgccaatgcc ggtctttgcg gagtcttcca tggaacaac               109

<210>2

<211>1963

<212>DNA

<213>双歧杆菌

<400>2

cctgatgcag accatgtaag gagccgtttc gatggtgaag agcctggatg agcagatcaa    60

gtccctgcag gagaggcagg cccagctcaa ggcccgcgag gacgacctca aggcgcggcg    120

cagggaacgc gaacgcaagg cccgaaccaa gcgcctgatc gaggtcggcg cgatggccga    180

gtcggccgcc ggcttcgagg gaggcgacga gagggccaag gaacacatcg cccgcctcgt    240

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acggccacgg tggagttctc gttcgaggag ctgcgcggcc tcatgcggct gaagcagaac     960

ctgaccaaca agcagctggc cgacaagatc gtgcagacga acgcccgcct gctggcattg    1020

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accgacccgg cgaaccagac gcttgaggtg agcgtgaacg agcgattcgc gttcctgctc    1140

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gtcagccgcg acgagttctg ccgactgctc aacgtgtcca agtccacgtc tgactcggtc    1320

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cgtgaaaccc cgcctgtgat cgatgccagg ccggtgaagg ccaaggaaga gcaagattcc    1500

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ccgtggccgc gcctctgggg cggttgtgcg ctccatgggt cgatctgccg ctgttcggct  1740

tcctgacggc ctgtgcgcct gtctgcgcgc tgtttgagtt ccccgagcag gtcggccttg  1800

gtcttggggg tggcgcgctg ctcgaacggg ctggattccc cccagtcctc gggttcgctc  1860

agatccagcg gctcgtcgcc ggacggctcg ggccggttcgctccccgcgc ctgtccctcg   1920

gcccgttccc gctgttcggc catgcgcaat gcgaggtctt agg                    1963

<210>3

<211>141

<212>DNA

<213>人

<400>3

ggtggtgaag actctgcgca ttcacagggc acattcacca gtgactacag caagtatctg     60

gactccaggc gtgcccaaga ttttgtgcag tggttgatga ataccaagag gaacaggaat    120

aacattgcct aatgatctag a                                              141

<210>4

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ggtggtatgc atatgctact ccgtcaagcc gt    32

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gttaattcct cctgttagcc                  20

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ggtggttcta gatcattagg caatgttatt c     31

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

cctgatgcag accatgtaag        20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

cctaagacct cgcattgcgc        20

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

cgcattcaca gggcacattc ac     22

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

tctagatcat taggcaatgt tattc    25

Claims (3)

1.一种用于减肥降脂的转化体在制备减肥降脂口服液、活菌粉剂、片剂或胶囊口服药物以及在制备减肥降脂食品或饮料中的应用；

该转化体由人胃泌酸调节素基因的重组表达质粒转化益生菌获得，

其中，

所述的人胃泌酸调节素基因的重组表达质粒是将编码人胃泌酸调节素的基因片段克隆到以阿拉伯糖操纵子为启动子的原核表达质粒的表达区得到；

所述的原核表达质粒是pBAD/gIII；

所述的人胃泌酸调节素基因的重组表达质粒是用SEQ NO.1所示核酸片段置换gIII信号肽核酸序列，在SEQ NO.1所示核酸片段的下游表达区插入SEQ NO.3所示核酸片段，在pBAD/gIII的非编码区插入SEQ NO.2所示核酸片段得到；

所述的益生菌为双歧杆菌或乳酸菌。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的益生菌是双歧杆菌。

3.权利要求1～2之一所述的应用，其特征在于所述的转化体的制备方法由以下步骤组成：

(1)将编码人胃泌酸调节素的基因片段克隆到以阿拉伯糖操纵子为启动子的原核表达质粒的表达区构建重组表达质粒；

(2)将所得重组表达质粒用电穿孔方法或PEG、氯化钙化学转化法转化到所述益生菌中，再用含氨苄青霉素的选择培养基筛选转化子，挑选出具有氨苄青霉素抗性的菌落即可；

当所用原核表达质粒为pBAD/gIII时，步骤(1)所述构建重组表达质粒的方法是：用SEQNO.1所示核酸片段置换gIII信号肽核酸序列，在SEQ NO.1所示核酸片段的下游表达区插入SEQ NO.3所示核酸片段，在pBAD/gIII的非编码区插入SEQ NO.2所示核酸片段。

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