CN101603011B - 制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷的方法及其专用菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷的方法及其专用菌株。该菌株为寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)TEQB，其保藏号为CGMCC No.3116。本发明的菌株可以用于制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷。本发明的制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷的方法具有操作简单、成本低廉、易操作、生产周期短的优点。本发明方法为制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷提供了新途径，避免了现有技术中其它各种制备方法的局限性，具有很强的可操作性，适合于工业化大规模生产，同时又对保护植物生态多样性具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷的方法及其专用菌株。
背景技术
鬼臼毒素(podophyllotoxin)主要存在于小檗科鬼臼属及其近缘植物中，是一类具有广泛生物学活性的天然化合物，有拟雌激素样、抗雌激素样、抗癌、抗病毒、抗真菌、镇静、抑制植物生长、抗氧化等作用。特别是其具有较强的抗癌活性，其作用机制是抑制微管蛋白的解聚作用以阻止细胞分裂，及抑制DNA拓扑异构酶的活性。其糖苷衍生物etoposide和teniposide毒性较低，对小细胞肺癌、淋巴癌等多种肿瘤疾病均有很好的疗效，成为现在临床应用的广谱抗肿瘤药物。
目前鬼臼毒素主要是从野生鬼臼类植物的根茎中提取，而这类植物在全世界仅有4属15种，我国有3属12种，主要生长在秦岭、西藏等高海拔地区。野生鬼臼类植物生长缓慢，且其中鬼臼毒素类物质的含量较低。随着医学和农林防治方面对鬼臼毒素类物质需求量日益增加，对野生鬼臼类植物原料的采集也加剧，已使其资源遭到严重破坏；造成生物多样性和生态环境的不可逆的损失，因此解决鬼臼毒素类物质的来源问题具有重要意义。
野生鬼臼类植物生长环境复杂、难以模拟，生长周期长，所以很难进行大规模的人工栽培，而组织培养技术对于鬼臼类植物也不适用；鬼臼毒素类物质化学结构复杂，化学合成虽可进行，但成本太高；基因工程学手段构建工程菌也由于参与形成该类物质的酶数量过多而无法进行。所以需要寻找有效可行的制备鬼臼毒素类物质的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种可产表鬼臼毒素双葡萄糖苷的菌株及其培养方法。
本发明所提供的菌株为寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)TEQB。该菌株已于2009年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.3116。
本发明所提供的培养寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)TEQB CGMCC No.3116的方法，是用马铃薯葡萄糖培养基培养寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)TEQBCGMCC No.3116。
所述培养方法中，所述培养的条件可包括温度为26-30℃、振荡速度为100-150rpm。所述温度具体可为28℃；所述振荡速度具体可为120rpm。
本发明的另一个目的是提供一种制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷的方法。
本发明所提供的制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷的方法，包括如下步骤：发酵培养寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)TEQB CGMCC No.3116，得到表鬼臼毒素双葡萄糖苷。
所述发酵培养中用到的培养基可以是马铃薯葡萄糖培养基。
所述发酵培养的条件包括温度为26-30℃、振荡速度为100-150rpm。所述发酵培养的时间可为5-9天。所述温度具体可为28℃；所述振荡速度具体可为120rpm；所述时间具体可为7天。
所述制备方法中在所述发酵后，还可包括萃取的步骤。
所述萃取溶剂为氯仿。
所述萃取具体可以是对所述发酵得到的发酵产物滤去菌丝体后的发酵液进行萃取。
寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)TEQB CGMCC No.3116在制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的菌株可以用于制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷。本发明的制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷的方法具有操作简单、成本低廉、易操作、生产周期短的优点。本发明方法为制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷提供了新途径，避免了现有技术中其它各种制备方法的局限性，具有很强的可操作性，适合于工业化大规模生产，同时又对保护植物生态多样性具有重要意义。
附图说明
图1为寄生曲霉的菌落。
图2为寄生曲霉孢子头和孢子形态。A(10×40)和B(10×100)为孢子头形态，C(10×100)为孢子形态。
图3为表鬼臼毒素双葡萄糖苷标准品HPLC谱图。
图4为寄生曲霉发酵液氯仿提取物的HPLC谱图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、菌株的分离与鉴定
一、分离
从甘肃省漳县大草滩(海拔2700m)采集新鲜植物桃儿七(Sinopodophyllumhexandrum(Royle)Ying)的根及根状茎。取新鲜植物桃儿七的根及根状茎，将表面做粗处理，用自来水洗净。在超净工作台中，用75％乙醇处理5min，无菌水冲洗3-5次，而后用2.5％次氯酸钠处理10min，再用无菌水冲洗3-5次。用灭菌的镊子和刀片将材料外皮剥去，再切成0.5cm×0.5cm大小的小片种植于PDA固体培养基上，28℃培养3-7天。同时将同样灭菌处理过的材料不做剥皮及切割，在PDA培养基上滚动一周，同条件培养，作为对照观察。
培养几天后发现在材料切口处有菌丝长出，取切口处新长出的菌丝，及时转接到新鲜PDA培养基上培养，待菌落出现后，根据菌落形态，颜色的差异及长出时间的不同，分别挑取各培养基上的菌落边缘的菌丝接于新的培养基上进行分离培养，直至培养为单一菌株。
将单一菌株分别培养，提取产物，对提取的产物进行高效液相色谱检测，得到产表鬼臼毒素双葡萄糖苷的菌株，将此菌株命名为TEQB。
二、鉴定
将上述菌株进行如下生理生化、菌形态的鉴定：
(1)菌落特征：
菌落形态如图1所示。
由明显的致密的厚的基质菌丝组成。平坦，边缘几乎不结孢子，呈茸毛状，白色，反面浅褐色。分生孢子穗幼时呈黄色，老时呈黄绿色。分泌物很少，无特殊气味。
(2)菌丝形态特征：
孢子头和孢子形态如图2所示。
分生孢子头初为球形，后呈辐射形，直径84-210微米；分生孢子梗生自基质，孢梗茎(140-420)×(6-12)微米(因为生长时期的不同，孢梗茎会有差异)，壁现粗糙，也有近于光滑者；顶囊为杵形或烧瓶形，直径17-31微米，大部表面可育；产孢结构单层，瓶梗(6.2-10.6)微米×(2.4-4.2)微米，偶尔可观察到较长者可达15微米，中间具一隔壁；分生孢子球形或近球形，4.2-5.5微米，壁极粗糙，具粗疏小刺；未见菌核。
综合上述特征，依据《真菌鉴定手册》、《中国真菌志》，本发明菌株为寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)，其分类属半知菌纲，丛梗孢目，丛梗孢科，曲霉属。
该菌株已于2009年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.3116。
实施例2、制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷
一、培养菌株
将100ml制备好的马铃薯葡萄糖液体培养基装于250ml三角瓶中，灭菌，挑菌丝或孢子接种于三角瓶中，28℃，120r/min摇床培养7天，得到发酵液。
马铃薯葡萄糖液体培养基是按照如下方法配制的：称取马铃薯200g(去皮、切成约2cm2的小块)，放入水中煮沸30min，然后用双层纱布过滤，取其滤液加20g葡萄糖，再补足水至1000mL，自然pH。
实验设3次重复。
二、产物的提取：
用抽滤器将发酵液抽滤两次，分别收集菌丝体与发酵液；发酵液用等体积的氯仿萃取，氯仿萃取液用TLC检测，随时取萃取液于紫外检测仪下检测，直至萃取液在紫外检测器下无荧光，收集萃取液，减压蒸馏回收浓缩。得到发酵液的氯仿提取物，提取物样品进行如下步骤三的检测。
三、产物的高效液相色谱(HPLC)检测
标准品表鬼臼毒素双葡萄糖苷(L-picropodophillotpxin 7’-O-(β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside)按照文献(Changqi ZHAO，Akito NAGATSU，Keiichiro HATANO，Naohiro SHIRAI，Setsuko KATO，and YukioOGIHARA New Lignan Glycosides from Chinese Medicinal Plant，Sinopodophillum emodi Chem.Pharm.Bull.51(3)：55-261(2003))中所述方法制备并采用核磁共振(NMR)、质谱(MS)等方法进行分子结构鉴定，其分子结构式如下：
检测前，用甲醇分别溶解标准品和氯仿提取物，0.45μm微孔滤膜过滤；采用外标法对样品进行HPLC分析。
仪器：Aglient 1100型高效液相色谱仪；
色谱柱：Aglient 1100Eclipse XDB-C18(5μm，4.6×150mm)；
检测器：紫外检测器；检测波长：254nm；
色谱条件：
流动相：甲醇∶水＝60∶40(体积比)
流速：0.5ml/min
进样量：5μl
柱温：室温
标准品：表鬼臼毒素双葡萄糖苷
实验设3次重复。
表鬼臼毒素双葡萄糖苷标准品的色谱图如图3所示，表鬼臼毒素双葡萄糖苷的保留时间为3.400分钟。提取物样品的色谱图如图4所示，表鬼臼毒素双葡萄糖苷的保留时间为3.420分钟。
将提取物的检测图谱与标准品的图谱进行对照，氯仿提取物与标准品表鬼臼毒素双葡萄糖苷具有保留时间相同的峰，表明氯仿提取物中含有表鬼臼毒素双葡萄糖苷。
实验研究证明：寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)TEQB CGMCC No.3116具有产生表鬼臼毒素双葡萄糖苷的能力。
Claims (7)
1.寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)TEQB，其保藏号为CGMCC No.3116。
2.培养寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)TEQB CGMCC No.3116的方法，是用马铃薯葡萄糖培养基培养寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)TEQB CGMCCNo.3116。
3.一种制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷的方法，包括如下步骤：发酵培养寄生曲霉(Asperggillus parasiticus)TEQB CGMCC No.3116，得到表鬼臼毒素双葡萄糖苷。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵培养中用到的培养基是马铃薯葡萄糖培养基。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述制备方法中在所述发酵后，还包括萃取的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述萃取的步骤中所用的萃取剂为氯仿。
7.寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)TEQB CGMCC No.3116在制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷中的应用。
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