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CN101578296A - 结合btla的人类单克隆抗体及使用方法 - Google Patents

结合btla的人类单克隆抗体及使用方法 Download PDF

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CN101578296A
CN101578296A CNA2007800494156A CN200780049415A CN101578296A CN 101578296 A CN101578296 A CN 101578296A CN A2007800494156 A CNA2007800494156 A CN A2007800494156A CN 200780049415 A CN200780049415 A CN 200780049415A CN 101578296 A CN101578296 A CN 101578296A
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E·哈尔克
M·斯里尼瓦桑
D·B·帕斯莫尔
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Abstract

本公开提供了分离的单克隆抗体，特别是以高亲和性与BTLA特异性结合的人类单克隆抗体。还提供了编码本公开抗体的核酸分子、表达载体、宿主细胞、以及用于表达本公开抗体的方法。还提供了免疫缀合物、双特异性分子、以及包含本公开的抗体的药物组合物。本公开也提供了用于检测BTLA的方法以及使用抗－BTLA抗体治疗多种疾病，包括癌和感染性疾病的方法。

Description

结合BTLA的人类单克隆抗体及使用方法
背景技术
正性及负性共刺激信号在调节B细胞及T细胞活性方面起决定性的作用，并且已经证明介导这些信号的分子是免疫调制剂的有效靶标。正性共刺激，除接合T细胞受体(TCR)之外，也是幼稚T细胞的最理想活化所需要的，然而负性共刺激被认为是获得自身免疫耐受性、及效应T细胞功能的终止所需要的。CD28，即原型T细胞共刺激分子，当在抗原呈递细胞(APC)表面与B7.1或B7.2相互作用时，发出信号促进响应于TCR接合的T细胞增殖和分化，而CD28同源物细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)介导对T细胞增殖以及效应物功能的抑制作用(Chambers etal.，Ann.Rev.Immunol.，19：565-594，2001；Egen et al.，Nature Immunol.，3：611-618，2002)。
已经发现了几种与B7家族同源的新分子(Abbas et al.，Nat.Med.，5：1345-6，1999；Coyle et al.，Nat.Immunol.，2：203-9，2001；Carreno et al.，Annu.Rev.Immunol.，20：29-53，2002；Liang et al.，Curr.Opin.Immunol.，14：384-90，2002)，并且开始阐明它们在T细胞活化中的作用。这些新的共刺激配体包括B7h、PD-L1、PD-L2、以及B7-H3。
B7h(Swallow et al.，Immunity，11：423-32，1999)、又名B7RP-1(Yoshinaga et al.，Nature，402：827-32，1999)、GL50(Ling，et al.，J.Immunol.，164：1653-7，2000)、B7H2(Wang et al.，Blood，96：2808-13，2000)、以及LICOS(Brodie et al.，Curr.Biol.，10：333-6，2000)，结合活化的T细胞上一种可诱导的共刺激体(ICOS)，并且共刺激T细胞增殖并产生诸如白细胞介素4(IL-4)及IL-10的细胞因子。
PD-L1(Freeman et al.，J.Exp.Med.，192：1027-34，2000)，又名B7-H1(Dong et al.，Nat.Med.，5，1365-9，1999)、以及PD-L2(Latchman et al.，Nat.Immunol.，2：261-8，2001)，也称为B7-DC(Tseng et al.，J.Exp.Med.，193，839-46，2001)结合至T细胞和B细胞上的程序性死亡1(PD-1)受体上。
最后，B7-H3结合一种至今仍未知的、活化的T细胞上的反-受体，并且有报告称B7-H3提高CD4+T辅助(Th)细胞及CD8阳性的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs或Tcs)的增殖，并选择性提高IFN-γ的表达(Chapovalet al.，Nat.Immunol.，2，269-74，2001；Sun et al.，J.Immunol.，168，6294-7，2002)。已有报道称B7-H3是一种负性调节物(Suh et al.，Nat.Immunol.，4，899-906，2003；Prasad et al.，J.Immunol.，173，2500-2506，2004)。已有报道称B7-H3是一种负性调节物(Suh et al.，Nat.Immunol.，4，899-906，2003；Prasad et al.，J.Immunol.，173，2500-2506，2004)。
因为具有T细胞共刺激活性的附加分子的基本生物学的重要性以及能够影响它们的活性的试剂的治疗潜力，所以人们对这些附加分子的鉴定具有强烈的兴趣。能够调整共刺激信号、并且从而能够调整CD8+CTL及CD4+Th细胞的活化和/或效应功能的试剂可在免疫应答的调节中使用，并且是非常理想的。
特别是已知许多自身免疫性病症涉及自体反应性T细胞及自身抗体。能够抑制或消除自身反应性淋巴细胞而不影响免疫系统抵抗病原体能力的试剂是非常理想的。
反之，许多癌症免疫疗法、例如过继性免疫疗法，扩大肿瘤特异的T细胞群并且指导它们去攻击并杀死肿瘤细胞(Dudley et al.，Science298：850-854，2002；Pardoll，Nature Biotech.，20：1207-1208，2002；Egen etal.，Nature Immunol.，3：611-618，2002)。能够增强对肿瘤攻击的试剂是非常理想的。
另外，对许多不同的抗原(例如微生物抗原或肿瘤抗原)的免疫应答尽管可以检测到，但强度不足以提供对抗由表达那些抗原的媒介(例如传染性微生物或肿瘤细胞)所介导的疾病进程的保护。将抗原连同佐剂(该佐剂在受试者体内提高针对抗原的免疫反应)一起给予受试者经常是理想的。
在某些情况下抑制针对抗原的正常免疫应答也是理想的。例如，抑制接受移植的患者的正常免疫应答是理想的，并且显示这种免疫抑制活性的试剂是非常理想的。
共刺激信号，特别是正性共刺激信号，在B细胞活性的调节中也起一定作用。例如，除由抗原刺激之外，B细胞活化以及生发中心B细胞的存活还需要源于T细胞的信号。存在于辅助性T细胞表面上的CD40配体与B细胞表面上的CD40相互作用，并且在B细胞中介导许多此类T细胞依赖性效应。
蛋白质BTLA(B及T淋巴细胞衰减子)是CD28受体家族的一员，CD28受体家族也包括CD28、CTLA-4、ICOS、以及PD-1。通过加入单克隆抗体后增大T细胞增殖的功能效应，发现了该家族的初始成员CD28及ICOS(Hutloff et al.(1999)Nature 397：263-266；Hansen et al.(1980)Immunogenics 10：247-260)。通过在TH1细胞内筛查差异性表达发现了BTLA。另外，已经将BTLA描述为提供负性刺激信号，类似于CTLA-4。激动剂抗-BTLA mAb存在时，被抗-CD3及抗-CD28活化的T细胞显示IL-2的产量及增殖降低(Kreig et al.，J.Immunol.，175，6420-6472，2005)。缺乏完整BTLA基因的小鼠显示出对DNP-KLH免疫作用后的较高的效价并且对EAE的敏感性增加(Watanabe et al.，Nat.Immunol.，4，670-679，2003)。HVEM(疱疹病毒进入介体)被认为是BTLA的配体(Scully et al.(2005)Nat.Immunol.6：90-98；Gonzalez et al.(2005)Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.102：1116-1121)。
因此，识别BTLA的试剂，及使用这种试剂的方法是理想的。
概述
本公开提供了分离的单克隆抗体，特别是结合BTLA、并且表现出多种理想特性的人类单克隆抗体。这些特性包括，例如高亲合力结合人类BTLA，但是缺乏基本的与人类CD28、CTLA-4、PD-1、或ICOS的交叉反应。更进一步，已经发现本公开的抗体调节免疫应答。因此，本公开的另一个方面涉及使用抗-BTLA抗体调节免疫应答的方法。特别是本公开提供了刺激T细胞应答的方法。本公开还提供了使用抗-BTLA抗体在体内抑制肿瘤细胞生长的方法。
在一个方面，本公开涉及分离的单克隆抗体，或该抗体的抗原结合部分，其中该抗体表现以下特性中的至少一种：
(a)以1×10-7M或更小的KD与人类BTLA相结合；
(b)基本上不与人类TrkB、CD28、CTLA-4、PD-1或ICOS相结合。
(c)抑制HVEM与BTLA的结合。
在一些实施方案中，该抗体进一步：
(a)刺激T细胞应答；
(b)刺激抗体应答；
(c)在体内抑制肿瘤细胞生长。
抗体优选是人类抗体，尽管在可替代的实施方案中，该抗体可以是，例如，鼠类抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
在更优选的实施方案中，该抗体以5×10-8M或更小的KD与人类BTLA相结合，以1×10-8M或更小的KD与人类BTLA相结合，以5×10-9M或更小的KD与人类BTLA相结合，或以1×10-8M与1×10-10M之间的KD与人类BTLA相结合。
在另一个实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体与参照抗体交叉竞争结合BTLA，该参照抗体包含：
(a)人类重链可变区，其包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、74、以及85的氨基酸序列；和
(b)人类轻链可变区，其包含选自SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、75、76、以及86的氨基酸序列。
在不同的实施方案中，该参照抗体包含：
(a)重链可变区，含有氨基酸序列SEQ ID NO：1；以及
(b)轻链可变区，含有氨基酸序列SEQ ID NO：7；
或者，该参照抗体包含：
(a)重链可变区，含有氨基酸序列SEQ ID NO：2；以及
(b)轻链可变区，含有氨基酸序列SEQ ID NO：8；
或者，该参照抗体包含：
(a)重链可变区，含有氨基酸序列SEQ ID NO：3；以及
(b)轻链可变区，含有氨基酸序列SEQ ID NO：9；
或者，该参照抗体包含：
(a)重链可变区，含有氨基酸序列SEQ ID NO：3；以及
(b)轻链可变区，含有氨基酸序列SEQ ID NO：10；
或者，该参照抗体包含：
(a)重链可变区，含有氨基酸序列SEQ ID NO：4；以及
(b)轻链可变区，含有氨基酸序列SEQ ID NO：11；
或者，该参照抗体包含：
(a)重链可变区，含有氨基酸序列SEQ ID NO：5；以及
(b)轻链可变区，含有氨基酸序列SEQ ID NO：12；
或者，该参照抗体包含：
(a)重链可变区，含有氨基酸序列SEQ ID NO：6；以及
(b)轻链可变区，含有氨基酸序列SEQ ID NO：13；
或者，该参照抗体包含：
(a)重链可变区，含有氨基酸序列SEQ ID NO：74；以及
(b)轻链可变区，含有氨基酸序列SEQ ID NO：75；
或者，该参照抗体包含：
(a)重链可变区，含有氨基酸序列SEQ ID NO：74；以及
(b)轻链可变区，它含有氨基酸序列SEQ ID NO：76；
或者，该参照抗体包含：
(a)重链可变区，含有氨基酸序列SEQ ID NO：85；以及
(b)轻链可变区，含有氨基酸序列SEQ ID NO：86。
在另一方面，本公开涉及分离的单克隆抗体，或该抗体的抗原结合部分，包含作为人类VH 2-05基因的产物或由其衍生的重链可变区，其中该抗体与BTLA特异地结合。本公开进一步提供了分离的单克隆抗体，或该抗体的抗原结合部分，包含作为人类VH 2-70基因的产物或由其衍生的重链可变区，其中该抗体与BTLA特异地结合。本公开进一步提供了分离的单克隆抗体，或该抗体的抗原结合部分，包含作为人类VH 4-59基因的产物或由其衍生的重链可变区，其中该抗体与BTLA特异地结合。本公开进一步提供了分离的单克隆抗体，或该抗体的抗原结合部分，包括作为人VH3-20基因的产物或由其衍生的重链可变区，其中该抗体与BTLA特异地结合。本公开进一步提供了分离的单克隆抗体，或该抗体的抗原结合部分，包括作为人类VH 3-33基因的产物或由其衍生的重链可变区，其中该抗体与BTLA特异地结合。本公开进一步提供了分离的单克隆抗体，或该抗体的抗原结合部分，包括作为人Vk A27基因的产物或由其衍生的轻链可变区，其中该抗体与BTLA特异地结合。本公开进一步提供了分离的单克隆抗体，或该抗体的抗原结合部分，包括作为人Vk L18基因的产物或由其衍生的轻链可变区，其中该抗体与BTLA特异地结合。本公开进一步提供分离的单克隆抗体，或该抗体的抗原结合部分，包括作为人Vk L15基因的产物或由其衍生的轻链可变区，其中该抗体与BTLA特异地结合。本公开进一步提供了分离的单克隆抗体，或该抗体的抗原结合部分，包括作为人VK04基因的产物或由其衍生的轻链可变区，其中该抗体与BTLA特异地结合。
在一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体，或该抗体的抗原结合部分，包括：
(a)人类VH 2-05基因的重链可变区；以及
(b)人类VK A27基因的轻链可变区；
其中该抗体特异地结合BTLA。
在另一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体、或该抗体的抗原结合部分，包括：
(a)人类VH 2-70基因的重链可变区；以及
(b)人类VK A27基因的轻链可变区；
其中该抗体特异地结合BTLA。
在另一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体、或该抗体的抗原结合部分，包括：
(a)人类VH 4-59基因的重链可变区；以及
(b)人类VK L18基因的轻链可变区；
其中该抗体特异地结合BTLA。
在另一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体、或该抗体的抗原结合部分，包括：
(a)人类VH 4-59基因的重链可变区；以及
(b)人类VK A27基因的轻链可变区；
其中该抗体特异地结合BTLA。
在另一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体、或该抗体的抗原结合部分，包括：
(a)人类VH 3-20基因的重链可变区；以及
(b)人类VK L15基因的轻链可变区；
其中该抗体特异地结合BTLA。
在另一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体、或该抗体的抗原结合部分，包括：
(a)人类VH 3-33基因的重链可变区；以及
(b)人类VK 04基因的轻链可变区；
其中该抗体特异地结合BTLA。
在另一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体、或该抗体的抗原结合部分，包括：
(a)人类VH 3-33基因的重链可变区；以及
(b)人类VK A27基因的轻链可变区；
其中该抗体特异地结合BTLA。
在另一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体、或该抗体的抗原结合部分，包括：
(a)人类VH 2-05基因的重链可变区；以及
(b)人类VK A27基因的轻链可变区；
其中该抗体特异地结合BTLA。
在另一方面，本公开提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括：
重链可变区，该重链可变区包括CDR1、CDR2、以及CDR3序列；以及
轻链可变区，该轻链可变区包括CDR1、CDR2、以及CDR3序列，
其中：
(a)该重链可变区CDR3序列包括选自SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、79、以及89，以及它们的保守性修饰的氨基酸序列；
(b)该轻链可变区CDR3序列包括选自SEQ ID NO：46、47、48、49、50、51、52、82、92、以及97，以及它们的保守性修饰的氨基酸序列；并且
(c)该抗体特异地结合人类BTLA。
优选地，重链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO：20、21、22、23、24、25、78、及88，以及它们的保守性修饰的氨基酸序列；并且轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、81、91、及96，以及它们的保守性修饰的氨基酸序列。优选地，重链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO：14、15、16、17、18、19、77、及87，以及它们的保守性修饰的氨基酸序列：并且轻链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO：32、33、34、35、36、37、38、80、90、及95，以及它们的保守性修饰的氨基酸序列。
而在另一个方面，本公开提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括重链可变区及轻链可变区，其中：
(a)该重链可变区包括氨基酸序列，该序列与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、74、以及85的氨基酸序列具有至少80％的同源性；
(b)该轻链可变区包括氨基酸序列，该序列与选自SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、75、76、以及86的氨基酸序列具有至少80％的同源性；
(c)该抗体以1×10-7M或更小的KD与人类BTLA相结合；并且
(d)该抗体基本上不与人类TrkB、PD-1、CD28、CTLA-4或ICOS相结合。
在一个优选的实施方案中，抗体额外还抑制一种或多种BTLA配体(例如HVEM)与BTLA的结合。
额外地或备选地，该抗体可以包括以上所列特征中的一种或多种特征。
在优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括：
(a)重链可变区CDR1，包括选自SEQ ID NO：14、15、16、17、18、19、77、以及87的氨基酸序列；
(b)重链可变区CDR2，包括选自SEQ ID NO：20、21、22、23、24、25、78、以及88的氨基酸序列；
(c)重链可变区CDR3，包括选自SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、79、以及89的氨基酸序列；
(d)轻链可变区CDR1，包括选自SEQ ID NO：32、33、34、35、36、37、38、80、90、以及95的氨基酸序列；
(e)轻链可变区CDR2，包括选自SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、81、91、以及96的氨基酸序列；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括选自SEQ ID NO：46、47、48、49、50、51、52、82、92、以及97的氨基酸序列；
其中该抗体特异地结合BTLA。
一种优选的组合包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：14；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：20；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：26；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：32；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：39；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：46。
另一种优选的组合包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：15；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：21；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：27；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：33；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：40；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：47。
另一种优选的组合包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：16；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：22；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：28；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：34；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：41；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：48。
另一种优选的组合包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：16；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：22；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：28；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：35；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：42；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：49。
另一种优选的组合包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：17；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：23；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：29；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：36；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：43；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：50。
另一种优选的组合包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：18；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：24；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：30；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：37；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：44；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：51。
另一种优选的组合包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：19；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：25；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：31；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：38；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：45；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：52。
另一种优选的组合包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：77；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：78；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：79；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：80；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：81；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：82。
另一种优选的组合包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：87；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：88；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：89；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：90；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：91；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：92。
另一种优选的组合包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：77；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：78；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：79；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：95；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：96；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：97。
本公开的其他的优选的抗体，或它们的抗原结合部分包括：
(a)重链可变区，包括选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、74、以及85的氨基酸序列；
(b)轻链可变区，包括选自SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、75、76、以及86的氨基酸序列；
其中该抗体特异地结合BTLA。
一种优选的组合包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：1；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：7。
另一种优选的组合包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：2；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：8。
另一种优选的组合包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：3；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：9。
另一种优选的组合，包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：3；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：10。
另一种优选的组合包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：4；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：11。
另一种优选的组合包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：5；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：12。
另一种优选的组合包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：6；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：13。
另一种优选的组合包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：74；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：75。
另一种优选的组合包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：74；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：76。
另一种优选的组合包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：85；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：86。
本公开的抗体可以是，例如全长抗体，例如IgG1、IgG2或IgG4同种型。作为替代，该抗体可以是诸如Fab或Fab’2片段的抗体片段，或单链抗体。
本公开还提供了一种免疫连接物，该免疫连接物包括连接到治疗剂(如细胞毒素或放射性同位素)上的本公开的抗体，或其抗原结合部分。本公开还提供了包括本公开的抗体，或其抗原结合部分的双特异性分子，该抗体或其抗原结合部分与具有不同于所述抗体，或其抗原结合部分的结合特异性的第二功能部分相连接。
还提供了包括本公开的抗体，或其抗原结合部分、或免疫连接物或双特异性分子，以及药学上可接受的载体的组合物。
本公开还包括编码本公开的抗体，或这些抗体的抗原结合部分的核酸分子、以及含有这种核酸的表达载体及包括此类表达载体的宿主细胞。此外，本公开提供了含有人类免疫球蛋白的重链和轻链转基因的转基因小鼠，其中该小鼠表达本公开的抗体，还提供了由这种小鼠制备的杂交瘤，其中该杂交瘤产生本公开的抗体。
在另一方面，本公开提供了调节受试者体内免疫应答的方法，该方法包括给予受试者本公开的抗体、或其抗原结合部分，使得该受试者体内的免疫应答得到调节。优选地，本公开的抗体增强、刺激、或增加受试者的免疫应答。在一些实施方案中，本发明的抗体抑制、降低或阻遏受试者的免疫反应。
在另一方面，本公开提供了在受试者体内抑制肿瘤细胞生长的方法，该方法包括对受试者给予治疗有效量的抗-BTLA抗体，或其抗原结合部分。本公开的抗体优选用于该方法，尽管可以替代使用其他抗-BTLA抗体(或与本公开的抗-BTLA抗体联合)，例如，嵌合、人源化、或全长人类抗-BTLA抗体可用于抑制肿瘤生长的方法。
在另一方面，本公开提供了一种在受试者体内治疗感染性疾病的方法，包括对受试者给予治疗有效量的抗-BTLA抗体，或其抗原结合部分。本公开的抗体优选用于该方法，尽管其他抗-BTLA抗体能被替换使用(或与本公开的抗-BTLA抗体联合)。例如，嵌合、人源化、或全长人类抗-BTLA抗体可用于治疗感染性疾病的方法。
更进一步地，本公开提供了一种在受试者体内增强针对抗原的免疫应答的方法，包括给予受试者：(i)抗原；以及(ii)抗-BTLA抗体，或其抗原结合部分，使得在受试者体内对该抗原的免疫应答得以增强。该抗原可以是，例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。本公开的抗体优选用于该方法，尽管其他抗-BTLA抗体能被替换使用(或与本公开的抗-BTLA抗体相组合)。例如，嵌合、人源化、或全长人类抗-BTLA抗体可用于在受试者体内增强对抗原的免疫应答的方法。
基于在此提供的抗-BTLA抗体的序列，本公开也提供了制造“第二代”抗-BTLA抗体的方法。例如，本公开提供了一种制备抗-BTLA抗体的方法，包括：
(a)提供(i)重链可变区抗体序列，包括选自SEQ ID NO：14、15、16、17、18、19、77、以及87的CDR1序列，和/或选自SEQ ID NO：20、21、22、23、24、25、78、以及88的CDR2序列，和/或选自SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、79、以及89的CDR3序列，或(ii)轻链可变区抗体序列，包括选自SEQ ID NO：32、33、34、35、36、37、38、80、90、以及95的CDR1序列，和/或选自SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、81、91、以及96的CDR2序列，和/或选自SEQ ID NO：46、47、48、49、50、51、52、82、92、以及97的CDR3序列；
(b)在至少一个可变区抗体序列内改变至少一个氨基酸残基，所述序列选自该重链可变区抗体序列以及轻链可变区抗体序列，以产生至少一个被改变的抗体序列；并且
(c)将被改变的抗体序列表达成蛋白质。
根据下文的详细说明及实例，本公开的其他特征及优点将变得显而易见。本申请全文引用的所有参考文献、Genbank登录号、专利、以及已公开的专利申请的内容都明确地引入本文作为参考。
附图简要说明
图1A示出了1B4人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：53)与氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：14)、CDR2(SEQ ID NO：20)以及CDR3(SEQ ID NO：26)区域，并指明了V、D及J的种系来源。
图1B示出了1B4人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：59)及氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：32)、CDR2(SEQ ID NO：39)以及CDR3(SEQ ID NO：46)区域，并指明了V与J的种系来源。
图2A示出了E4H9人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：54)及氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：15)、CDR2(SEQ ID NO：21)以及CDR3(SEQ ID NO：27)区域，并指明了V与J的种系来源。
图2B示出了E4H9人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：60)及氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：33)、CDR2(SEQ ID NO：40)以及CDR3(SEQ ID NO：46)区域，并指明了V与J的种系来源。
图3A示出了3C2人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：55)及氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：16)、CDR2(SEQ ID NO：22)以及CDR3(SEQ ID NO：28)区域，并指明了V与J的种系来源。
图3B示出了3C2人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：61)及氨基酸序列(SEQ ID NO：9)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：34)、CDR2(SEQ ID NO：41)以及CDR3(SEQ ID NO：48)区域，并指明了V与J的种系来源。
图3C示出了3C2人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：62)及氨基酸序列(SEQ ID NO：19)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：35)、CDR2(SEQ ID NO：42)以及CDR3(SEQ ID NO：49)区域，并指明了V与J的种系来源。
图4A示出了6A5人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：56)及氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：17)、CDR2(SEQ ID NO：23)以及CDR3(SEQ ID NO：29)区域，并指明了V与J的种系来源。
图4B示出了6A5人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：63)及氨基酸序列(SEQ ID NO：11)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：36)、CDR2(SEQ ID NO：43)以及CDR3(SEQ ID NO：50)区域，并指明了V与J的种系来源。
图5A示出了11E2人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：57)及氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：18)、CDR2(SEQ ID NO：24)以及CDR3(SEQ ID NO：30)区域，并指明了V与J的种系来源。
图5B示出了11E2人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：64)及氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：37)、CDR2(SEQ ID NO：44)以及CDR3(SEQ ID NO：51)区域，并指明了V与J的种系来源。
图6A示出了E8D9人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：58)及氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：19)、CDR2(SEQ ID NO：25)以及CDR3(SEQ ID NO：31)区域，并指明了V与J的种系来源。
图6B示出了E8D9人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：65)及氨基酸序列(SEQ ID NO：13)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：38)、CDR2(SEQ ID NO：45)以及CDR3(SEQ ID NO：52)区域，并指明了V与J的种系来源。
图7示出了1B4的重链可变区的氨基酸序列与人类种系VH 2-05氨基酸序列(SEQ ID NO：66)的比对。
图8示出了1B4的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系VK A27的氨基酸序列(SEQ ID NO：70)的比对。
图9示出了E4H9的重链可变区的氨基酸序列与人类种系VH 2-70氨基酸序列(SEQ ID NO：67)的比对。
图10示出了E4H9的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系VK A27氨基酸序列(SEQ ID NO：70)的比对。
图11示出了3C2的重链可变区的氨基酸序列与人类种系VH 4-59氨基酸序列(SEQ ID NO：68)的比对。
图12示出了3C2的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系VK L18氨基酸序列(SEQ ID NO：71)的比对。
图13示出了3C2的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系VK L15氨基酸序列(SEQ ID NO：72)的比对。
图14示出了6A5的重链可变区的氨基酸序列与人类种系VH 2-05氨基酸序列(SEQ ID NO：66)的比对。
图15示出了6A5的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系VK A27氨基酸序列(SEQ ID NO：70)的比对。
图16示出了11E2的重链可变区的氨基酸序列与人类种系VH 3-20氨基酸序列(SEQ ID NO：69)的比对。
图17示出了11E2的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系VK L15氨基酸序列(SEQ ID NO：72)的比对。
图18示出了E8D9的重链可变区的氨基酸序列与人类种系VH 2-05氨基酸序列(SEQ ID NO：66)的比对。
图19示出了E8D9的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系VK A27氨基酸序列(SEQ ID NO：70)的比对。
图20示出了人类BTLA的序列(SEQ ID NO：73)。
图21A示出了10H6人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：83)及氨基酸序列(SEQ ID NO：74)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：77)、CDR2(SEQ ID NO：78)以及CDR3(SEQ ID NO：79)区域，并指明了V、D、以及J的种系来源。
图21B示出了10H6人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：84)及氨基酸序列(SEQ ID NO：75)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：80)、CDR2(SEQ ID NO：81)以及CDR3(SEQ ID NO：82)区域，并指明了V与J的种系来源。
图21C示出了10H6a人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：98)及氨基酸序列(SEQ ID NO：76)。描绘了CDR1(SEQID NO：95)、CDR2(SEQ ID NO：96)以及CDR3(SEQ ID NO：97)区域，并指明了V与J的种系来源。
图22示出了10H6的重链可变区的氨基酸序列与人类种系VH 3-33氨基酸序列(SEQ ID NO：99)的比对。
图23示出了10H6的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系VK 04氨基酸序列(SEQ ID NO：100)的比对。
图24示出了10H6a的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系VK A27氨基酸序列(SEQ ID NO：70)的比对。
图25A示出了4C9人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：93)及氨基酸序列(SEQ ID NO：85)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：87)、CDR2(SEQ ID NO：88)以及CDR3(SEQ ID NO：89)区域，并指明了V、D、及J的种系来源。
图25B示出了4C9人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：94)及氨基酸序列(SEQ ID NO：86)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：90)、CDR2(SEQ ID NO：91)以及CDR3(SEQ ID NO：92)区域，并指明了V与J的种系来源。
图26示出了4C9的重链可变区的氨基酸序列与人类种系VH 2-05氨基酸序列(SEQ ID NO：66)的比对。
图27示出了4C9的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系VK A27氨基酸序列(SEQ ID NO：70)的比对。
图28A证明抗-BTLA抗体与BTLA-CHO细胞的结合是浓度依赖性的。图28B与图28C证明抗-BTLA抗体以浓度依赖的方式阻止HVEM与BTLA-CHO细胞的结合。
图29证明抗-BTLA抗体的抗原专一性。A描绘了将不同的抗-BTLA抗体与其他CD28分子的结合进行比较，不同的抗-BTLA抗体的结合专一性。B描绘了抗原特异性对照。
详述
一方面，本公开涉及分离的单克隆抗体，特别是特异地结合BTLA的人类单克隆抗体。在某些实施方案中，本公开的抗体展现出一种或多种理想的功能特性，例如高亲和力结合BTLA、缺乏与其他CD28家族成员的交叉反应、刺激T和/或B细胞增殖的能力、抑制一种或更多BTLA配体(例如，HVEM)与BTLA结合的能力、在体内抑制肿瘤细胞生长的能力、刺激抗原特异性记忆应答的能力、和/或刺激抗体应答的能力。在一些实施方案中，本公开的抗体抑制免疫应答。额外地或可替代地，本公开的抗体衍生于特定的重链及轻链种系序列和/或包括特定的结构特征，例如包括特定氨基酸序列的CDR区域。
本公开提供了，例如分离的抗体、制备此类抗体的方法、包含此类抗体的免疫连接物及双特异性分子以及含有本公开的抗体、免疫连接物或双特异性分子的药物组合物。
另一方面，本公开涉及使用抗-BTLA抗体在受试者体内抑制肿瘤细胞生长的方法。抗-BTLA抗体能够在体内抑制肿瘤细胞生长。本公开也涉及一些方法，这些方法使用抗体修饰免疫应答、治疗疾病(例如癌症或感染性疾病)、或刺激保护性自身免疫反应或刺激抗原特异的免疫应答(例如，将目的抗原与抗-BTLA同时给药)。
为了更容易地理解本公开，首先定义了某些术语。其他定义在整个详细说明中给出。
术语“B与T淋巴细胞衰减子”及“BTLA”，基因/蛋白质是可互换地使用的，它包括变体、同种型、同源物直向同源物和侧向同源物。例如，在某些实施方案中，特异性针对人类BTLA的抗体可以与来自非人类物种的BTLA进行交叉反应。在其他实施方案中，对人类BTLA特异性的抗体可能是对人类BTLA完全特异性的，并且可不展示物种或其他类型的交叉反应性。术语“人类BTLA”是指人类序列的BTLA，例如人类BTLA的完全的氨基酸序列，它具有Genbank登录号NP_861445。这些人类BTLA序列不同于SEQ ID NO：73的人类BTLA之处为具有(例如)保守突变或在非保守区域中的突变，并且该BTLA具有与SEQ ID NO：73的人类BTLA基本上相同的生物学功能。例如，人类BTLA的一项生物学功能是阻遏免疫应答，例如T细胞应答。也就是说，BTLA被认为是一种负性调节物。它具有C-末端抑制基序，这些基序涉及IL-2产量及T细胞增殖的减少(Watanabe et al.，Nat.Immunol.，4，670-679，2003；Chemnitz et al.，J.Immunol.，176，6603-6614，2006)。此外，人类BTLA的生物学功能可以具有，例如BTLA的细胞外结构域的一个表位，其被由本公开的抗体特异地结合。
一种特定的BTLA序列通常与SEQ ID NO：73的人类BTLA在氨基酸序列上具有至少90％的同一性，并且含有多个氨基酸残基，当与其他物种(例如鼠类)的BTLA氨基酸序列相比时，这些氨基酸残基鉴定该氨基酸序列是人类的。在某些情况下，人类BTLA可能与SEQ ID NO：73的人类BTLA具有至少95％、或甚至至少96％、97％、98％、或99％的同一性。在某些实施方案中，与SEQ ID NO：73的BTLA序列相比，人类BTLA序列将展示出将不超过10个氨基酸差异。在某些实施方案中，与SEQ IDNO：73的BTLA相比，人类BTLA序列将展示出不超过5个、或甚至不超过4个、3个、2个、或1个氨基酸差异。同一性百分比由在此描述的方法确定。
术语“免疫应答”是指例如，淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞、以及由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子、以及补体)的作用，这些作用导致对侵入性病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞，或者，在自身免疫及病理炎症情况下，正常的人类细胞或组织的选择性损害、破坏或将它们从人体清除。
“信号转导途径”是指在多种信号传导分子之间的生物化学关系，这些分子在将信号从细胞的一部分传递到细胞的另一部分中发挥作用。在此使用的短语“细胞表面受体”包括，例如，能够接受信号并将这种信号传递穿过细胞的原生质膜的分子及分子的复合体。本公开的“细胞表面受体”的一个实例是BTLA受体。
在此使用的术语“抗体”包括整个抗体及它们的任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或它们的单链。“抗体”指包括通过二硫键互相连接的至少两条重链(H链)及两条轻链(L链)的糖蛋白，或其抗原结合部分。每一条重链都包括重链可变区(在此缩写为VH)以及重链恒定区。该重链恒定区包括三个结构域，CH1、CH2以及CH3。每一条轻链都包括轻链可变区(在此缩写为VL)及轻链恒定区。该轻链恒定区包括一个结构域，CL。VH和VL区域可以进一步被细分为多个高可变性区域，被称为互补决定区(CDR)，其间散布有更为保守的被称为构架区(FR)的多个区域。每个VH以及VL均由3个CDR及4个FR构成，按照以下顺序从氨基端至羧基端排布：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链及轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。这些抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主的组织或因子的结合，这些宿主的组织或因子包括免疫系统的不同细胞(例如效应细胞)及经典补体系统的第一成分(Clq)。
此处使用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)，是指保留特异性结合抗原(例如BTLA)的能力的抗体的一个或多个片段。已经发现抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来实现。术语抗体的“抗原结合部分”中所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH1结构域构成的单价片段组成；(ii)F(ab′)2片段，为包括在铰链区由二硫桥连接的两个Fab片段的一个二价片段；(iii)由VH及CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL及VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域，VL与VH，是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法由合成接头将它们连接起来，该接头使它们成为单一蛋白链，其中VL及VH区域配对形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird et al.(1988)Science 242：423-426；及Huston et al.(1988)Science 242：423-426；及Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。术语抗体的“抗原结合部分”也旨在涵盖此类单链抗体。这些抗体片段可通过本领域技术人员已知的常规方法获得，并且对于这些片段进行的有用性的筛选与筛选完整抗体的方式相同。
此处使用的“分离的抗体”，意指抗体，它基本上没有具有不同抗原特异性的其他抗体(例如，特异性结合BTLA的分离的抗体基本上没有特异性结合除BTLA以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合BTLA的分离的抗体对于其他抗原，例如来自其他物种的BTLA分子，可以具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上没有其他细胞材料和/或化学物。
此处使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指由单一分子组分的抗体分子形成的制剂。单克隆抗体组合物显示了针对某一特定表位的单一结合特异性及亲和力。
此处使用的术语“人类抗体”意指包括具有可变区的抗体，在这些可变区中，构架区及CDR区均源自人类种系免疫蛋白序列。此外，如果该抗体包括恒定区，则该恒定区也源自人类种系免疫球蛋白序列。本公开的人类抗体可以包括不是由人类种系免疫球蛋白序列所编码的氨基酸残基(例如，在体外由随机诱变或位点特异性诱变引入的突变或在体内由体细胞突变引入的突变)。然而，此处使用的术语“人类抗体”并非意指包括以下抗体：其中源自另一个哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人类构架区序列上。
术语“人单克隆抗体”是指显示出单一结合特异性的抗体，这些抗体具有多个可变区，其中构架和CDR区均源自人类种系免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括由转基因非人类的动物(例如转基因小鼠)获到的B细胞，所述动物具有包括融合至无限增殖化细胞的人类重链转基因及轻链转基因的基因组。
此处使用的术语“重组人类抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，例如(a)从动物(例如小鼠)中分离的抗体，该动物对于人类免疫球蛋白基因是转基因的或转染色体的，或从由其制备出的杂交瘤分离的抗体(以下将进一步说明)；(b)从经转化以表达人类抗体的宿主细胞(例如转染瘤)中分离的抗体，(c)从重组的组合人类抗体文库中分离的抗体，以及(d)通过任何其他方法来制备、表达、产生或分离的抗体，这些方法包括将人类免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列。这种重组人类抗体具有可变区，其中构架区及CDR区均源自于人类种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方案中，这种重组人类抗体也可经受体外诱变(或者，在使用对于人类Ig序列转基因的动物时，经受体内体细胞诱变)，并且接着，重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列为这样的序列：其尽管衍生于人类种系VH和VL序列并与其相关，但是并不天然存在于体内人类抗体种系所有组成成分之中。
此处使用的“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体种类(例如IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”与“对抗原特异的抗体”此处可以与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
术语“人类抗体衍生物”是指人类抗体的任何经修饰的形式，例如，该抗体与另一种试剂或抗体的偶联物。
术语“人源化抗体”意指以下抗体，其中源自另一个哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人类构架序列上。可以在人类构架序列中进行额外的构架区修饰。
术语“嵌合抗体”意指以下抗体，其中可变区序列源自一个物种而恒定区序列源自另一个物种，例如一种抗体，其中可变区序列源自小鼠抗体而恒定区序列源自人类抗体。
此处使用的“特异性结合人类BTLA”的抗体意指一种抗体，该抗体以1×10-7或更小，更优选为5×10-8M或更小，更优选为1×10-8M或更小，更优选为5×10-9M或更小的KD结合到人类BTLA上。
此处使用的术语“Kassoc”或“Ka”意指特定的抗体-抗原相互作用的结合速率，而此处使用的术语“Kdis”或“Kd”意指特定的抗体-抗原相互作用的解离速率。此处使用的术语“KD”意指解离常数，它是由Kd与Ka之比(即Kd/Ka)得到，并被表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值能够用本领域确立的方法测定。测定抗体的KD的优选方法是使用表面等离振子共振，优选使用诸如
Figure A20078004941500381
系统的生物传感器系统。
此处使用的术语IgG抗体的“高亲和力”是指对于靶抗原而言，抗体具有的KD值为10-8M或更低、更优选10-9M或更低以及甚至更优选10-10M或更低。然而，对于其他抗体同种型而言，“高亲和力”结合可以发生变化。例如，对于一种IgM同种型而言，“高亲和力”结合是指一种抗体具有的KD值为10-7M或更低、更优选10-8M或更低、甚至更优选10-9M或更低。
此处使用的术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物及非哺乳动物，如非人类灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、奶牛、鸡、两栖类动物、爬行类动物等。
在以下各分部中详细说明了本公开的不同方面。
抗-BTLA抗体
本公开的抗体的特征在于抗体的特定的功能性特征或特性。例如，抗体特异性结合BTLA(例如结合人类BTLA、并可以与来自诸如猕猴的其他物种的BTLA交叉反应)。优选地，本公开的抗体以高亲和力结合BTLA，例如具有的KD值为1×10-7M或更低。本公开的抗-BTLA抗体优选地表现以下特征中的一种或多种特征：
(a)以1×10-7M或更小的KD与人类BTLA相结合；
(b)基本上不与人类TrkB、CD28、CTLA-4、PD-1或ICOS相结合；或
(c)抑制HVEM与BTLA的结合。
在额外的实施方案中，本公开的抗-BTLA抗体表现出以下特征：
(a)刺激免疫应答；
(b)刺激抗体应答；或
(c)抑制体内肿瘤细胞生长。
在额外的实施方式中，本公开的抗-BTLA抗体刺激免疫应答。也就是说在一些实施方案中，本公开的抗体是拮抗剂抗体并且阻止HVEM介导的抑制信号，而在本公开的其他实施方案中，所述抗体是激动剂抗体，该激动剂抗体激活BTLA、并且向表达BTLA的细胞提供抑制信号。
优选地，抗体以5×10-8M或更小的KD与人类BTLA相结合、以1×10-8M或更小的KD与人类BTLA相结合、以5×10-9M或更小的KD与人类BTLA相结合、或以1×10-8M至1×10-10M之间或更小的KD与人类BTLA相结合。
本公开的抗体可能表现以上所列的特征的任何组合，例如以上所列的特征中的两种、三种、四种、五种或更多特征。
评价抗体对BTLA的结合能力的标准测定在本领域内是已知的，包括例如ELISA、蛋白质印迹法以及RIA。还可以用本领域内已知的标准测定来评估抗体的结合动力学(例如结合亲和性)，例如通过Biacore分析。用于评估以上所述的特征中任何一种特征的适宜测定在实例中都有详述。
单克隆抗体1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、E8D9、10H6、10H6a、 及4C9
本公开优选的抗体是如实例1和2所述的分离的并进行结构表征的人类单克隆抗体1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、E8D9、10H6、10H6a、以及4C9。1B4、E4H9、3C2、6A5、11E2、E8D9、10H6、10H6a、以及4C9的VH氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、74、以及85中。3C2a的VH氨基酸序列与3C2的VH氨基酸序列相同。10H6a的VH氨基酸序列与10H6的VH氨基酸序列相同。1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、E8D9、10H6、10H6a、以及4C9的VL氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、75、76、以及86中。
由于这些抗体中每一种抗体均可结合BTLA，则VH和VL序列可以“混合并匹配”，以产生本公开的其他抗-BTLA结合分子。可以使用上文以及实施例中说明的结合测定法(例如ELISA)来检测这种“混合并匹配”的抗体与BTLA的结合。优选地，当VH和VL链被混合并进行匹配时，源自某一特定VH/VL对的VH序列被结构相似的VH序列代替。类似地，优选地源自特定VH/VL对的VL序列被结构相似的VL序列代替。
因此，在一个方面，本公开提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括：
(a)重链可变区，包括选自：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、74、及85的氨基酸序列；以及
(b)轻链可变区，包括选自SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、75、76、及86的氨基酸序列；
其中该抗体特异性结合BTLA，优选人类BTLA。
优选的重链及轻链组合包括：
(a)重链可变区，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：1；以及(b)轻链可变区，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：7；或
(a)重链可变区，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：2；以及(b)轻链可变区，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：8；或
(a)重链可变区，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：3；以及(b)轻链可变区，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：9；或
(a)重链可变区，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：3；以及(b)轻链可变区，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：10；或
(a)重链可变区，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：4；以及(b)轻链可变区，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：11；或
(a)重链可变区，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：5；以及(b)轻链可变区，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：12；或
(a)重链可变区，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：6；以及(b)轻链可变区，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：13；
(a)重链可变区，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：74；以及(b)轻链可变区，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：75；
(a)重链可变区，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：74；以及(b)轻链可变区，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：76；
(a)重链可变区，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：85；以及(b)轻链可变区，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：86。
在另一方面，本公开提供了多种抗体，这些抗体包括1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、E8D9、10H6、10H6a、以及4C9的重链及轻链CDR1、CDR2、以及CDR3，或它们的组合。1B4、E4H9、3C2、6A5、11E2、E8D9、10H6、以及4C9的VH CDR1的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：14、15、16、17、18、19、77、以及87中。1B4、E4H9、3C2、6A5、11E2、E8D9、10H6、以及4C9的VH CDR2的氨基酸序列分别显示在SEQ IDNO：20、21、22、23、24、25、78、以及88中。1B4、E4H9、3C2、6A5、11E2、E8D9、10H6、以及4C9的VH CDR3的氨基酸序列分别显示在SEQID NO：26、27、28、29、30、31、79、以及89中。1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、E8D9、10H6、10H6a，及4C9的Vk CDR1的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：32、33、34、35、36、37、38、80、90、以及95中。1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、E8D9、10H6、10H6a、以及4C9的Vk CDR2的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、81、91、以及96中。1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、E8D9、10H6、10H6a，及4C9的Vk CDR3的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：46、47、48、49、50、51、52、82、92、以及97中。CDR区是用Kabat系统进行描绘的(Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department ofHealth and Human Services，NIH Publication No.91-3242)。
在这些抗体的每一种抗体均能够结合BTLA，并且抗原结合特异性主要由CDR1、CDR2、以及CDR3区域提供的条件下，VH CDR1、CDR2、以及CDR3序列与Vk CDR1、CDR2、以及CDR3序列可以被“混和并匹配”(例如，来自不同抗体的CDR可以被混和并进行匹配，尽管各个抗体必须含有VH CDR1、CDR2、以及CDR3以及Vk CDR1、CDR2、以及CDR3，)以产生本公开的其他抗-BTLA结合分子。可以使用上文及实施例说明的结合分析(例如ELISA、Biacore分析)来检测这种“混和并匹配”的抗体的BTLA结合。优选地，当VH CDR被混合并匹配时，来自某一特定VH序列的CDR1、CDR2、和/或CDR3序列被结构相似的CDR序列代替。类似地，当Vk CDR被混合并且匹配时，来自某一特定Vk序列的CDR1、CDR2、和/或CDR3序列被结构相似的另一个或另一些CDR序列代替。针对单克隆抗体1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、E8D9、10H6、10H6a、以及4C9，可以通过将一个或多个VH和/或VL CDR区域序列替换为来自在此所披露的CDR序列的结构相似的序列，可以产生新颖的VH和VL序列，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。
因此，在另一方面，本公开提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括：
(a)重链可变区CDR1，其包括选自SEQ ID NO：14、15、16、17、18、19、77、以及87的氨基酸序列；
(b)重链可变区CDR2，其包括选自SEQ ID NO：20、21、22、23、24、25、78、以及88的氨基酸序列；
(c)重链可变区CDR3，其包括选自SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、79、以及89的氨基酸序列；
(d)轻链可变区CDR1，其包括选自SEQ ID NO：32、33、34、35、36、37、38、80、90、以及95的氨基酸序列；
(e)轻链可变区CDR2，其包括选自SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、81、91、以及96的氨基酸序列；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包括选自SEQ ID NO：46、47、48、49、50、51、52、82、92、以及97的氨基酸序列；
其中该抗体特异性结合BTLA，优选人类的BTLA。
在一个优选的实施方案中，该抗体包含：
(a)重链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：14；
(b)重链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：20；
(c)重链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：26；
(d)轻链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：32；
(e)轻链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：39；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：46。
在另一个优选的实施方案中，该抗体包含：
(a)重链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：15；
(b)重链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：21；
(c)重链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：27；
(d)轻链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：33；
(e)轻链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：40；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：47。
在另一个优选的实施方案中，该抗体包含：
(a)重链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：16；
(b)重链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：22；
(c)重链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：28；
(d)轻链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：34；
(e)轻链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：41；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：48。
在另一个优选的实施方案中，该抗体包含：
(a)重链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：16；
(b)重链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：22；
(c)重链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：28；
(d)轻链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：35；
(e)轻链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：42；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：49。
在另一个优选的实施方案中，该抗体包含：
(a)重链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：17；
(b)重链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：23；
(c)重链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：29；
(d)轻链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：36；
(e)轻链可变区CDR2，其它包括SEQ ID NO：43；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：50。
在另一个优选的实施方案中，该抗体包含：
(a)重链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：18；
(b)重链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：24；
(c)重链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：30；
(d)轻链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：37；
(e)轻链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：44；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：51；
在另一个优选的实施方案中，该抗体包含：
(a)重链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：19；
(b)重链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：25；
(c)重链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：31；
(d)轻链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：38；
(e)轻链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：45；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：52。
在另一个优选的实施方案中，该抗体包含：
(a)重链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：77；
(b)重链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：78；
(c)重链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：79；
(d)轻链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：80；
(e)轻链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：81；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：82。
在另一个优选的实施方案中，该抗体包含：
(a)重链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：87；
(b)重链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：88；
(c)重链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：89；
(d)轻链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：90；
(e)轻链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：91；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：92。
在另一个优选的实施方案中，该抗体包含：
(a)重链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：77；
(b)重链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：78；
(c)重链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：79；
(d)轻链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：95；
(e)轻链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：96；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：97。
在本领域中所熟知的是，CDR3结构域独立于一个或多个CDR1和/或CDR2结构域，可以单独决定抗体对于同族抗原的结合特异性，并且可预期地产生多种抗体，这些抗体具有基于共同的CDR3序列的相同的结合特异性。参见，例如Klimka et al.，British J.of Cancer 83(2)：252-260(2000)(描述了仅使用鼠类抗CD30抗体Ki-4的重链可变结构域CDR3来产生人源化抗CD30抗体)；Beiboer et al.，J.Mol.Biol.296：833-849(2000)(描述了仅使用亲代鼠类MOC-31抗EGP-2抗体的重链CDR3序列的重组上皮糖蛋白-2(EGP-2)抗体)；Rader et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：8910-8915(1998)(描述了使用鼠类抗整联蛋白αvβ3抗体LM609的重链及轻链可变CDR3结构域的一组人源化抗整联蛋白αvβ3抗体，其中每一种成员抗体在CDR3结构域之外均包含不同的序列，并且与亲代鼠类抗体一样结合相同的表位，并且亲和力与亲代鼠类抗体一样高或比亲代鼠类抗体更高)；Barbas et al.，J.Am.Chem.Soc.116：2161-2162(1994)(披露了CDR3结构域对抗原结合的贡献度最大)；Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：2529-2533(1995)(描述了将三个针对人类胎盘DNA的Fab(SI-1、SI-40、以及SI-32)的重链CDR3序列移植到抗破伤风类毒素Fab的重链上，由此替换现有的重链CDR3，并证实仅有CDR3结构域就能够赋予结合特异性)；以及Ditzel et al.，J.Immunol.157：739-749(1996)(描述了移植研究，其中仅将亲代多特异性Fab LNA3的重链CDR3移植到单特异性IgG破伤风类毒素结合的Fab p313抗体的重链上，就足以保留亲代Fab的结合特异性)。这些参考文献中每一篇均完整引入本文作为参考。
因此，在某些方面，本公开提供了包括来自非人类抗体(例如小鼠或大鼠抗体)的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，其中该单克隆抗体能够特异地性结合BTLA。在一些实施方案中，包括来自非人类抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的此类创造性的抗体与相应的亲代非人类抗体相比：(a)能够与其竞争结合；(b)保留其功能特性；(c)与其结合至相同的表位；和/或(d)与其具有相似的结合亲和力。
在其他方面，本公开提供了多种单克隆抗体，其包括来自第一人类抗体(例如，从非人类的动物获得的人类抗体)的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域，其中该第一人类抗体能够特异性结合BTLA，并且其中来自该第一人类抗体的CDR3功能域替换了人类抗体中缺乏BTLA结合特异性的CDR3结构域，以产生能够特异性结合BTLA的第二人类抗体。在一些实施方案中，包括来自第一人类抗体的一种或多种重链和/或轻链CDR3结构域的这种发明的抗体对相应的亲代第一人类抗体而言：(a)能够与其竞争结合；(b)保留其功能特征；(c)与其结合至相同的表位；和/或(d)与其具有相似的结合亲和力。
具有特定种系序列的抗体
在某些实施方案中，本公开的抗体包括来自特定的种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定的种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。
例如，在一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体，或该抗体的抗原结合部分，包括重链可变区，该重链可变区是人类VH 2-05基因的产物或由其衍生，其中该抗体特异地结合BTLA，优选人类的BTLA。在另一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体，或该抗体的抗原结合部分，包括重链可变区，该重链可变区是人类VH 2-70基因的产物或由其衍生，其中该抗体特异地结合BTLA，优选人类的BTLA。在另一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体，或该抗体的抗原结合部分，包括重链可变区，该重链可变区是人类VH 4-59基因的产物或由其衍生，其中该抗体特异地结合BTLA，优选人类的BTLA。在另一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体，或该抗体的抗原结合部分，包括重链可变区，该重链可变区是人类VH 3-20基因的产物或由其衍生，其中该抗体特异地结合BTLA，优选人类的BTLA。在另一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体，或该抗体的抗原结合部分，包括重链可变区，该重链可变区是人类VH 3-33基因的产物或由其衍生，其中该抗体特异地结合BTLA，优选人类的BTLA。在另一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体，或该抗体的抗原结合部分，包括轻链可变区，该轻链可变区是人类Vk A27基因的产物或由其衍生，其中该抗体特异地结合BTLA，优选人类的BTLA。在另一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体，或该抗体的抗原结合部分，包括轻链可变区，该轻链可变区是人类Vk L18基因的产物或由其衍生，其中该抗体特异地结合BTLA，优选人类的BTLA。在另一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体，或该抗体的抗原结合部分，包括轻链可变区，该轻链可变区是人类Vk L15基因的产物或由其衍生，其中该抗体特异地结合BTLA，优选人类的BTLA。在另一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体，或该抗体的抗原结合部分，包括轻链可变区，该轻链可变区是人类VK 04基因的产物或由其衍生，其中该抗体特异地结合BTLA，优选人类的BTLA。在又一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体：
(a)包括重链可变区，该重链可变区是人类VH 2-05、2-70、4-59、3-20、或3-33的产物或由其衍生(该基因所编码的氨基酸序列分别在SEQ IDNO：66、67、68、69、或99中给出)；
(b)包括轻链可变区，该轻链可变区是人类VKA27、L18、L15、或04基因的产物或由其衍生(该基因所编码的氨基酸序列分别在SEQ IDNO：70、71、或72中给出)；并且
(c)特异地结合BTLA。
分别具有VH 2-05及VK A27的VH及VK的抗体的实例是1B4、6A5、以及E8D9。分别具有VH 2-70及VK A27的VH及VK的抗体的实例是E4H9。分别具有VH 4-59及VKL18的VH及VK的抗体的实例是3C2。分别具有VH 4-59及VK A27的VH及VK的抗体的实例是3C2a。分别具有VH 3-20及VK l15的VH及VK的抗体的实例是11E2。分别具有VH 3-33及VK 04的VH及VK的抗体的实例是10H6。分别具有VH 3-33及VK A27的VH及VK的抗体的实例是10H6a。分别具有VH 2-05及VK A27的VH及VK的抗体的实例是4C9。
如此处所用，如果一种人类抗体的可变区由使用人类种系免疫球蛋白基因的系统获得，则所述人类抗体包括的重链或轻链可变区是特定种系序列的“产物”或者由其“衍生”。这种系统包括用目的抗原对携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行免疫，或者用目的抗原对在噬菌体上展示的人类免疫球蛋白基因文库进行筛选。通过对人类抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，并选择在序列上最接近(即最大百分数同一性)人类抗体的序列的人类种系免疫球蛋白序列，“产自”或“源自”人类种系免疫球蛋白序列的人类抗体就可以被鉴定为是此类抗体。一种“产自”或“源自”特定的人类种系免疫球蛋白序列的人类抗体，与该种系序列相比，可以含有氨基酸差异，因为例如，自然产生的体细胞突变或故意引入定点突变。然而，经选择的人类抗体典型地与由人类种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列在氨基酸序列上具有至少90％的同一性，而且与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠类种系序列)进行比较时，含有将所述人类抗体鉴定为人源的氨基酸残基。在某些情况下，人类抗体与该种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列在氨基酸序列上可以具有至少95％、或甚至至少96％、97％、98％、或99％的同一性。典型地，与由人类种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列相比，来自特定的人类种系序列的人类抗体将展示不超过10个氨基酸差异。在某些情况下，与由该种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列相比，所述人类抗体可以展示不超过5个，或甚至不超过4个、3个、2个，或1个氨基酸差异。
同源抗体
在又一个实施方案中，本公开的抗体包括一些重链可变区及轻链可变区，这些可变区含有与本文所述的优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中，该抗体保留本公开的抗-BTLA抗体的所希望的功能特性。
例如，本公开提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括重链可变区及轻链可变区，其中：
(a)该重链可变区包括氨基酸序列，它与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、74、以及85的氨基酸序列具有至少80％的同源性；
(b)该轻链可变区包括氨基酸序列，它与选自SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、75、76、以及86的氨基酸序列具有至少80％的同源性；
该抗体表现下列特性中的一种或多种特性：
该抗体以1×10-7M或更小的KD与人类BTLA相结合；
该抗体基本上不与人类TrkB、CD28、CTLA-4、PD-1或ICOS相结合；
该抗体抑制HVEM与BTLA的结合。
(iv)该抗体刺激免疫应答；
该抗体刺激抗体应答；
该抗体抑制体内肿瘤细胞生长。
在其他实施方案中，该抗体抑制或阻遏免疫应答。
在其他实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与以上给出的序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同源性。具有与以上给出的序列的VH与VK区具有高度同源性(即，80％或更大)的VH与VL区的抗体可以通过以下方式来获得：对编码SEQ ID NO：53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、和/或65的核酸分子进行诱变(例如，位点定向诱变或PCR介导的诱变)，然后用此处所述的功能测定检测所编码的、被改变的抗体所保留的功能(即以上(c)到(g)所给出的功能)。
如在此所使用，两个氨基酸序列之间的同源性百分比等同于两个序列之间的同一性百分数。在这两个序列之间的同一性百分数是这些序列共有的相同位置的数目的函数(即，％同源性＝相同位置数/位置总数×100)，考虑到空位(gap)的数目，及每个空位的长度，它们需要被引入用于这两条序列的最优比对。正如在以下的非限制性实例中所述，使用数学算法可以完成两条序列之间的序列比较以及同一性百分数的测定。
使用E.Meyers及W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988)的算法可以确定在两条氨基酸序列之间的同一性百分数，该算法已经结合至ALIGN程序(版本2.0)中，该算法使用了PAM120权重残基表(weightresidue table)、空位长度罚分(gap length penalty)12以及空位罚分4。此外，使用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))算法能确定在两条氨基酸序列之间的同一性百分数，该算法已结合至GCG软件包的GAP程序中(可在http://www.gcg.com获得)，该算法使用了Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及空位权重16、14、12、10、8、6，或4以及长度权重1、2、3、4、5，或6。
额外地或者可替代地，本公开的蛋白质序列可进一步用作“查询序列”，对公共数据库进行检索，例如鉴定相关序列。这种检索可采用Altschul，etal.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的XBLAST程序(版本2.0)来进行。通过XBLAST程序，记分＝50，字长＝3进行BLAST蛋白质检索，以获得与本公开的抗体分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的空位比对，可利用如Altschul et al.((1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402所述的Gapped BLAST。当利用BLAST及Gapped BLAST程序时，可使用各自的程序(例如XBLAST与NBLAST)的默认参数(参见www.ncbi.nlm.nih.gov)。
具有保守性修饰的抗体
在某些实施方案中，本公开的抗体包括含有CDR1、CDR2以及CDR3序列的重链可变区，以及含有CDR1、CDR2以及CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中一个或多个序列包括基于本文所述的优选抗体(例如，1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、及E8D9)的特定的氨基酸序列，或它们的保守性修饰，并且其中这些抗体保留了本公开的抗BTLA抗体的所需功能特性。因此，本公开提供了分离的单克隆抗体或，其抗原结合部分，包含含有CDR1、CDR2、及CDR3序列的重链可变区，以及含有CDR1、CDR2、及CDR3序列的轻链可变区，其中：
(a)该重链可变区CDR3序列含有选自氨基酸序列SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、79、及89的氨基酸序列，以及它们的保守性修饰；
(b)该轻链可变区CDR3序列含有选自氨基酸序列SEQ ID NO：46、47、48、49、50、51、52、82、92、及97的氨基酸序列，以及它们的保守性修饰；并且
该抗体表现下列一种或多种特性：
该抗体以1×10-7M或更小的KD与人类BTLA相结合；
该抗体基本上不与人类TrkB、PD-1、CD28、CTLA-4或ICOS相结合；
该抗体抑制HVEM与BTLA的结合。
(iv)该抗体刺激免疫应答；
该抗体刺激抗体应答；
该抗体抑制体内肿瘤细胞生长。
在其他实施方案中该抗体抑制或阻遏免疫应答。
在一个优选的实施方案中，该重链可变区CDR2序列含有选自氨基酸序列SEQ ID NO：20、21、22、23、24、25、78、及88的氨基酸序列，以及它们的保守性修饰；并且该轻链可变区CDR2序列含有选自氨基酸序列SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、81、91、及96的氨基酸序列，以及它们的保守性修饰。在另一个优选的实施方案中，该重链可变区CDR1序列含有选自氨基酸序列SEQ ID NO：14、15、16、17、18、19、77、及87的氨基酸序列，以及它们的保守性修饰；并且该轻链可变区CDR1序列含有选自氨基酸序列SEQ ID NO：32、33、34、35、36、37、38、80、90、及95d氨基酸序列，以及它们的保守性修饰。
如在此所使用，术语“保守性序列修饰”意指不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这种保守性修饰包括氨基酸的置换、添加、以及缺失。通过本领域已知的标准技术(例如位点定向诱变及PCR介导的诱变)可将修饰引入本公开的抗体中。保守性氨基酸置换是指以下的置换，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，以及具有芳香族侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本公开的抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代，并且使用此处说明的功能测定对已改变的抗体的保留功能(即，在以上(c)至(g)中给出的功能)进行测试。
与本公开的抗BTLA抗体结合至相同表位的抗体
在另一个实施方案中，本公开提供了多种抗体，它们如本公开的BTLA单克隆抗体中的任何抗体同样地结合至人类BTLA的相同表位上(即，这些抗体有能力与本公开的单克隆抗体中的任何抗体进行交叉竞争)。在一些优选的实施方案中，用于交叉竞争研究的参照抗体可以是单克隆抗体1B4(具有的VH与VL序列分别示于SEQ ID NO：1及7)或单克隆抗体E4H9(具有的VH与VL序列分别示于SEQ ID NO：2及8)，或单克隆抗体3C2(具有的VH与VL序列分别示于SEQ ID NO：3及9)，或单克隆抗体3C2a(具有的VH与VL序列分别示于SEQ ID NO：3及10)，或单克隆抗体6A5(具有的VH与VL序列分别示于SEQ ID NO：4及11)，或单克隆抗体11E2(具有的VH与VL序列分别示于SEQ ID NO：5及12)，或单克隆抗体E8D9(具有的VH与VL序列分别示于SEQ ID NO：6及13)，或单克隆抗体10H6(具有的VH与VL序列分别示于SEQ ID NO：74及75)，或单克隆抗体10H6a(具有的VH与VL序列分别示于SEQ ID NO：74及76)，或单克隆抗体4C9(具有的VH与VL序列分别示于SEQ ID NO：85及86)。根据此类交叉竞争的抗体与1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、E8D9、10H6、10H6a、或4C9进行交叉竞争的能力，采用标准的BTLA结合测定能够鉴定此类交叉竞争的抗体。例如，可以使用BIAcore分析、ELISA测定或流式细胞术来证明与本公开的抗体的交叉竞争。例如测试抗体对1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、E8D9、10H6、10H6a、或4C9与人类BTLA结合的抑制能力说明测试抗体可以与1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、E8D9、10H6、10H6a、或4C9竞争性结合人类BTLA，从而与1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、E8D9、10H6、10H6a或4C9一样结合至人类BTLA相同上的表位。在一个优选的实施方案中，与1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、E8D9、10H6、10H6a、或4C9一样结合至人类BTLA上的相同表位上的抗体是一种人类单克隆抗体。如实施例中所述可以对这种人类单克隆抗体进行制备并分离。
工程化并修饰的抗体
通过以下方式可以进一步制备本公开的抗体：使用具有在此披露的VH和/或VL序列中的一个或多个序列的抗体作为起始材料，对经修饰的抗体进行工程化，这种经修饰的抗体可能具有与起始抗体不同的特性。通过在一个或两个可变区(即VH和/或VL)中，例如在一个或多个CDR区内和/或在一个或多个构架区内中修饰一个或多个残基，可以对抗体进行工程化。额外地或备选地，通过在一个或多个恒定区中修饰残基，可以对抗体进行工程化，例如以改变该抗体的一种或多种效应功能。
可以进行的一类可变区的工程化是CDR移植。抗体与靶抗原主要通过位于六个重链及轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基进行相互作用。因此，CDR中的氨基酸序列在各个抗体之间比在CDR之外的序列更具有多样性。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，所以通过构建表达载体，表达模拟特定自然发生的抗体特性的重组抗体是可能的，所述表达载体包括来自自然发生的抗体的CDR序列，其被移植至来自具有不同特性的不同抗体的构架序列(参见，例如Riechmann，L.et al.(1998)Nature332：323-327；Jones，P.et al.(1986)Nature321：522-525；Queen，C.et al(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86：10029-10033；Winter的美国专利号5,225,539，以及Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762及6,180,370)。
因此，本公开的另一个实施方案涉及分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，该单克隆抗体，或其抗原结合部分包括含有CDR1、CDR2、以及CDR3序列的重链可变区，该CDR1、CDR2、以及CDR3序列各包含一个氨基酸序列，所述序列分别选自：SEQ ID NO：14、15、16、17、18、19、77、以及87，SEQ ID NO：20、21、22、23、24、25、78、及88，以及SEQID NO：26、27、28、29、30、31、79、及89；以及含有CDR1、CDR2、以及CDR3序列的轻链可变区，该CDR1、CDR2、以及CDR3序列各包括一个氨基酸序列，所述序列分别选自：SEQ ID NO：32、33、34、35、36、37、38、80、90、及95，SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、81、91、及96，以及SEQ ID NO：46、47、48、49、50、51、52、82、92、及97。因此，此类抗体含有单克隆抗体1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、E8D9、10H6、10H6A、以及4C9的VH与VL CDR序列，但仍有可能含有不同于这些抗体的构架序列。
这种构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或已公开的参考文献获得。例如，人类重链及轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人类种系序列数据库中找到(在互联网http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase中获得)，并且在以下文献中找到：Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242；Tomlinson，I.M.，et al.(1992)″TheRepertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groupsof VH Segments with Different Hypervariable Loops″J.Mol.Biol.227：776-798；以及Cox，J.P.L.et al.(1994)″A Directory of HumanGerm-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage″Eur.J.Immunol.24：827-836；这些文献的每一篇内容均明确地并入本文作为参考。
用序列相似性检索方法中的一种方法(被称为Gapped BLAST)将抗体蛋白序列与汇编的蛋白数据库进行比较(Altschul et al.(1997)NucleicAcids Research 25：3389-3402)，这种方法对于本领域的技术人员而言是熟知的。BLAST是一种启发式算法，因为在抗体序列与数据库序列之间的在统计学上显著的比对可能包含比对字符的高得分片段对(HSP)。通过扩展或修正不能提高片段对分数的片段对被称为命中项(hit)。简言之，翻译VBASE来源的核苷酸序列(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php)，并且保留FR1至FR3构架区之间的区域(包括FR1至FR3构架区)。这些数据库序列具有的平均长度为98个残基。除去重复序列(它们是蛋白质全部长度上的精确匹配)。用于蛋白质的BLAST搜索，使用带有默认值的程序blastp、除低复杂性过滤(已被关闭)以外的标准参数，以及BLOSUM62的置换矩阵，针对实现序列相配的前5个命中项进行过滤。在全部六个框架中翻译核苷酸序列，并且在数据库序列的匹配片段中不具有终止密码子的框架被视为潜在的命中项。进而使用BLAST程序tblastx对此进行确认。该程序翻译了全部六个框架中的抗体序列，并且将这些翻译与在全部六个框架中被动态翻译的VBASE核苷酸序列进行比较。
同一性是在抗体序列与蛋白质数据库之间序列的全长上精确的氨基酸匹配。这些阳性项(同一性+取代匹配)不是相同的，而是由BLOSUM62置换矩阵所引导的氨基酸置换。如果抗体序列以相同的同一性匹配数据库序列中的两条序列，则具有最大阳性的命中项将被判定为匹配的序列命中项。
在本公开的抗体中使用的优选构架序列是结构上与由本公开的已选择的抗体所使用的构架序列相似的构架序列，例如与由本公开优选的单克隆抗体所使用的VH 2-05构架序列(SEQ ID NO：66)和/或VH 2-70构架序列(SEQ ID NO：67)和/或VH 4-59构架序列(SEQ ID NO：68)和/或VH 3-20构架序列(SEQ ID NO：69)和/或VH 3-33构架序列(SEQ ID NO：99)和/或VK A27构架序列(SEQ ID NO：70)和/或VK L18构架序列(SEQID NO：71)和/或VK L15构架序列(SEQ ID NO：72)和/或VK 04构架序列(SEQ ID NO：100)相似。这些VH CDR1、CDR2、和CDR3序列，以及VK CDR1、CDR2、和CDR3序列可以被移植至多个构架区上，这些构架区具有与从中衍生出该构架序列的种系免疫球蛋白基因中所发现的序列相同的序列，或者这些CDR序列可以被移植至多个构架区上，这些构架区与这些种系序列相比含有一个或多个突变。例如，已发现在某些情况下对构架区内的残基进行突变以保持或增强该抗体的抗原结合能力是有益的(参见例如Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762以及6,180,370)。
另一种类型的可变区修饰是在VH和/或VK CDR1、CDR2和/或CDR3区中对氨基酸残基进行突变，由此改善目的抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以进行定向诱变或PCR介导的诱变来引入一种或多种突变，并且对于抗体的结合能力、或其他目的功能特性的作用可以在体内或体外试验中进行评估，如本文所述并在实施例中所提供。优选地引入保守性修饰(如上所述)。这些突变可以是氨基酸置换、添加、或缺失，但优选是置换。此外，典型地在一个CDR区域中改变不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。
因此，在另一实施方案中，本公开提供了分离的抗-BTLA单克隆抗体，或它们的抗原结合部分，包括重链可变区，该重链可变区包括：(a)VH CDR1区，包括氨基酸序列，该氨基酸序列选自：SEQ ID NO：14、15、16、17、18、19、77、及87，或与SEQ ID NO：14、15、16、17、18、19、77、及87相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失、或添加的氨基酸序列；(b)VH CDR2区域，包括氨基酸序列，该氨基酸序列选自：SEQ ID NO：20、21、22、23、24、25、78，及88，或与SEQ ID NO：20、21、22、23、24、25、78、及88相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失、或添加的氨基酸序列；(c)VH CDR3区域，包括氨基酸序列，该氨基酸序列选自：SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、79、及89，或与SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、79、及89相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失、或添加的氨基酸序列；(d)VK CDR1区域，包括氨基酸序列，该氨基酸序列选自：SEQ ID NO：32、33、34、35、36、37、38、80、90，及95，或与SEQ ID NO：32、33、34、35、36、37、38、80、90、及95相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失、或添加的氨基酸序列；(e)VK CDR2区域，包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列选自：SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、81、91，及96，或与SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、81、91、及96相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失、或添加的氨基酸序列；(f)VK CDR3区域，包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列选自：SEQ ID NO：46、47、48、49、50、51、52、82、92、及97，或与SEQ ID NO：46、47、48、49、50、51、52、82、92、及97相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失、或添加的氨基酸序列。
本公开的工程化抗体包括以下抗体：其中在VH和/或VK内已经对构架残基进行了修饰，例如改进了抗体的特性。典型地，对这种构架进行修饰，以降低抗体的免疫原性。例如，一个方法是将一个或多个构架残基“回复突变”成为相应的种系序列。更具体地说，已经经历了体细胞突变的抗体可能包含与从中衍生出该抗体的种系序列不同的构架残基。这些残基可以通过将该抗体构架序列与从中衍生出该抗体的种系序列进行比较而被鉴定。
例如，在以下表1中显示在抗-BTLA抗体1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、E8D9、10H6、10H6a及4C9的构架区内的许多与亲代种系序列不同的氨基酸变化。为了将构架区序列中氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基变回至它们的种系构型，通过例如位点定向诱变或PCR介导的诱变，可以将体细胞突变“回复突变”为该种系序列。
图7显示了1B4的VH区域与亲代种系VH 2-05的氨基酸序列的比对。图8显示了1B4的Vk区域与亲代种系Vk A27的氨基酸序列的比对。图9显示了E4H9的VH区域与亲代种系VH 2-70的氨基酸序列的比对。图10显示了E4H9的Vk区域与亲代种系Vk A27的氨基酸序列的比对。图11显示了3C2的VH区域与亲代种系VH 4-59的氨基酸序列的比对。表12显示了3C2的Vk区域与亲代种系Vk L18的氨基酸序列的比对。图13显示了3C2a的Vk区域与亲代种系Vk L15的氨基酸序列的比对。图14显示了6A5的VH区域与亲代种系VH 2-05的氨基酸序列的比对。图15显示了6A5的Vk区域与亲代种系Vk A27的氨基酸序列的比对。图16显示了11E2的VH区域与亲代种系VH 3-20的氨基酸的比对。图17显示了11E2的Vk区域与亲代种系Vk L15的氨基酸序列的比对。图18显示了E8D9的VH区域与亲代种系VH 2-05的氨基酸序列的比对。图19显示了E8D9的Vk区域与亲代种系Vk A27的氨基酸序列的比对。图22显示了10H6的VH区域与亲代种系VH 3-33的氨基酸序列的比对。图23显示了10H6的Vk区域与亲代种系Vk 04的氨基酸序列的比对。图24显示了10H6a的Vk区域与亲代种系Vk 04A27的氨基酸序列的比对。图26显示了4C9的VH区域与亲代种系VH 2-05的氨基酸序列的比对。图27显示了4C9的Vk区域与亲代种系Vk A27的氨基酸序列的比对。
表1.从种系构型对1B4、E4H9、3C2、6A5、11E2抗体进行修饰。
 抗-BTLA抗体   氨基酸位置   抗体的氨基酸   种系构型的原始的氨基酸
 1B4 VH   30   N   S
  72   T
 E4H9 VH   86   D   N
 3C2 VH   24   I   V
  69   M   I
  72   E   D
 6A5 VH   85   A   T
 11E2 VH   12   I   V
  91   S   T
  95   Y   H
  10H6 VH   33   D   G
  50   A   V
  53   N   Y
  10H6a VH   32   I   S
  4C9 VH   37   A   G
  56   D   N
  85   S   T
  4C9 VK   32   T   S
  35   V   A
另一种类型的构架修饰涉及对构架区内一个或多个残基，或甚至对一个或多个CDR区域内的一个或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，由此降低该抗体的潜在免疫原性。这一方法也被称为“去免疫原化”，并且在Carr等人的美国专利公开号20030153043中有进一步的详细说明。
除了在构架区或CDR区域内进行的修饰之外，或作为其替代，还可以对本公开的抗体进行工程化，以在Fc区域内也包括一些修饰，典型地改变该抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体固定(complement fixation)、Fc受体结合、和/或依赖抗原的细胞毒性作用。此外，本公开的抗体可以被化学修饰(例如，可以将一个或多个化学物部分附着至该抗体)，或被修饰以改变其糖基化作用，再次以便改变该抗体的一个或多个功能特性。以下对这些实施方案中的每一个均进行进一步详细的说明。Fc区中残基的编号是Kabat的EU索引编号。
在一个实施方案中，对CH1的铰链区进行修饰，使得铰链区中的半胱氨酸残基的个数发生变化(例如，增加或减少)。在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中进一步说明了该方法。CH1的铰链区中的半胱氨酸残基的数目发生变化，例如便于组装轻链及重链或者增大或减小该抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，对抗体的Fc铰链区进行突变以减小该抗体的生物半衰期。更确切地说，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域，使得相对于天然Fc铰链域的葡萄球菌A蛋白(Staphylococal protein A，SpA)的结合而言，该抗体减弱了SpA的结合。Ward等人的美国专利号6,165,745更详细地说明了这一方法。
在另一个实施方案中，对该抗体进行修饰以增大其生物半衰期。不同的方法是可能的。例如，如Ward的美国专利号6,277,375所述，引入以下突变中的一个或多个突变：T252L、T254S、T256F。备选地，为增加生物半衰期，该抗体可以在CH1或CL区域中发生变化以包括从IgG的Fc区域的CH2结构域的两个环处获得的补救受体(salvage receptor)结合表位，如Presta等人的美国专利号5,869,046及6,121,022中所述。
在另外的其他的实施方案中，通过用不同的氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基以改变Fc区，从而改变该抗体的一种或多种效应功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320及322的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基所替换，使得抗体对于效应物配体而言具有已改变的亲和力，但仍保留该亲本抗体的抗原结合能力。例如，亲和力被改变的效应物配体可以是Fc受体或补体的C1成分。Winter等人的美国专利号5,624,821及5,648,260进一步详细说明了这一方法。
在另一个实例中，选自氨基酸残基329、331及322的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基所替换，使得该抗体具有已改变的C1q结合能力和/或减低的或消除的依赖补体的细胞毒性(CDC)。Idusogie等人的美国专利号6,194,551进一步详细说明了这一方法。
在另一个实例中，改变氨基酸位置231及239中的一个或多个氨基酸，由此改变抗体固定补体的能力。Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中进一步详细说明了这一方法。
在另一个实例中，为了提高该抗体介导抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)的能力和/或提高该抗体对Fcγ受体的亲和性，通过在下列位置修饰一个或多个氨基酸，对Fc区域进行了修饰：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。Presta的PCT公开文件WO 00/42072中进一步详细地说明了这一方法。此外，在人类IgG1上已做出针对FcγRI、FcγRII、FcγRIII及FcRn的结合位点的图谱，并说明了具有改善的结合的变体(参见Shields，R.L.et al.(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。在位置256、290、298、333、334及339具有的特定突变显示出改善对FcγRIII的结合。另外，下列组合突变体显示出改善FcγRIII的结合：T256A/S298A，S298A/E333A，S298A/K224A及S298A/E333A/K334A。
在再一个实施方案中，对抗体的糖基化进行了修饰。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，该抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化作用，以(例如)增加该抗体对抗原的亲和力。例如，通过在该抗体序列中改变一个或多个糖基化的位点可以实现这种碳水化合物修饰。例如，可以进行一个或多个氨基酸的置换，这导致去除一个或多个可变区构架的糖基化位点，由此在该位点处消除糖基化作用。这种去糖基化作用可以提高该抗体对抗原的亲和力。Co等人的美国专利号5,714,350及6,350,861进一步详细地说明了这一方法。
额外地或备选地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有减少的岩藻糖残基含量的低岩藻糖化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经证实这种已改变的糖基化模式可以提高一些抗体的ADCC能力。例如，通过在具有被改变的糖基化机器的宿主细胞中表达该抗体可以实现这种碳水化合物修饰。具有被改变的糖基化机器的细胞在本领域中描述，并可以用作表达本公开的重组抗体的宿主细胞，由此产生具有被改变的糖基化作用的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705、及Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1，6)岩藻糖基转移酶)，使得在Ms704、Ms705，及Ms709细胞系中表达的抗体在它们的碳水化合物上缺乏岩藻糖。Ms704、Ms705以及Ms709FUT8-/-细胞系是通过使用两种替换载体对CHO/DG44细胞中的FUT8基因进行靶向破坏之后产生的(参见Yamane等人的美国专利公开号20040110704及Yamane-Ohnuki et al.(2004)Biotechnol Bioeng87：614-22)。作为另一个实例，Hanai等人的EP 1,176,195描述了一种带有在功能上被破坏的FUT8基因的细胞系(该基因编码岩藻糖基转移酶)，使得通过减少或消除α1，6键相关的酶，在这种细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化。Hanai等人也描述了多种细胞系，这些细胞系具有用于将岩藻糖添加至N-乙酰葡糖胺的低酶活性(该N-乙酰葡糖胺结合至该抗体的Fc区域)，或者不具有该酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCCCRL 1662)。Presta的PCT公开号WO 03/035835描述了一种变异CHO细胞系Lec13细胞，其将岩藻糖连接至与Asn(297)相连的碳水化合物的能力降低，这也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化(还可参见Shields，R.L.et al.(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人的PCT公开文件WO 99/54342中描述了经过工程化而表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在这种经过工程化的细胞系中表达的抗体具有增多的二等分GlcNac结构，这导致抗体的ADCC活性提高(还可参见Umana et al.(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。作为替代，可以使用岩藻糖苷酶切去该抗体的岩藻糖残基。例如，该岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体上除去岩藻糖残基(Tarentino，A.L.et al.(1975)Biochem.14：5516-23)。
由本公开在此所考虑的抗体的另一种修饰是聚乙二醇化(pegylation)。对抗体进行聚乙二醇化以便(例如)增加抗体的生物学半衰期(例如血清半衰期)。为了对抗体进行聚乙二醇化，典型地在使一个或多个聚乙二醇(PEG)基团附着至该抗体或抗体片段的条件下，将该抗体，或其片段与PEG(例如PEG的反应活性酯或醛衍生物)进行反应。优选地，使用反应活性PEG分子(或一种类似的反应性的水溶性聚合物)，通过酰基化反应或烷基化反应进行聚乙二醇化。在此使用的术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生其他蛋白的PEG的任何形式，例如单(C1-C10)烷氧基聚乙二醇或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，有待聚乙二醇化的抗体是去糖基化的抗体。对蛋白进行聚乙二醇化的方法在本领域中是已知的，并可以被应用于本公开的抗体。参见，例如Nishimura等人的EP 0 154 316及Ishikawa等人的EP 0 401 384。
工程化抗体的方法
如上所述，通过修饰VH和/或Vk序列，或其附着的一个或多个恒定区，可以使用具有在此披露的VH和Vk序列的抗-BTLA抗体以产生新的抗-BTLA抗体。因此，在本公开的另一方面，使用本公开的抗-BTLA抗体(例如1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、或E8D9)的结构特征，产生在结构上相关的抗-BTLA抗体，该抗体保留了本公开抗体的至少一种功能特性，例如结合人类BTLA。例如，如以上所讨论，可以将1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、或E8D9的一个或多个CDR区，或它们的突变与已知的构架区和/或其他CDR重组组合，以产生额外的重组工程化的本公开的抗-BTLA抗体。其他类型的修饰包括上节中描述的那些修饰。用于工程化方法的起始材料是在此提供的VH和/或Vk序列中的一个或多个序列，或它们的一个或多个CDR区。为产生工程化的抗体，不必实际制备出一种抗体(即，表达成蛋白质)，该抗体具有在此提供的VH和/或Vk序列中的一个或多个序列，或它们的一个或多个CDR区。相反，使用这个或这些序列中含有的信息作为起始材料，生成源自这个或这些原始的序列的“第二代”序列，并接着制备这个或这些“第二代”序列，并将其表达成蛋白质。
因此，在另一个实施方案中，本公开提供了一种制备抗-BTLA抗体的方法，包括：
(a)提供(i)重链可变区抗体序列，其包括CDR1序列，该序列选自：SEQ ID NO：14、15、16、17、18、19、77、以及87，CDR2序列，该序列选自：SEQ ID NO：20、21、22、23、24、25、78、以及88，和/或CDR3序列，该序列选自：SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、79、以及89；和/或(ii)轻链可变区抗体序列，其包括CDR1序列，该序列选自：SEQ IDNO：32、33、34、35、36、37、38、80、90、以及95，CDR2序列，该序列选自：SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、81、91、以及96，和/或CDR3序列，该序列选自：SEQ ID NO：46、47、48、49、50、51、52、82、92、以及97；
(b)改变在重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列中的至少一个氨基酸残基，以产生至少一种被改变的抗体序列；并且
(c)将被改变的抗体序列表达成蛋白质。
可以使用标准的分子生物学技术来制备并表达被改变的抗体序列。
优选地，由被改变的一种或多种抗体序列编码的这种抗体是这样一种抗体，它保留了在此所述的抗-BTLA抗体的一种、几种或全部功能特性，该功能特性包括但不限于：
(a)该抗体以1×10-7M或更小的KD与人类BTLA相结合；
(b)该抗体基本上不与人类TrkB、PD-1、CD28、CTLA-4或ICOS相结合；
(c)该抗体抑制HVEM与BTLA的结合；
(d)该抗体刺激免疫应答；
(e)该抗体刺激抗体应答；
(f)该抗体在体内抑制肿瘤细胞的生长。
在其他实施方案中，抗体抑制或阻遏免疫应答。
使用本领域已知的和/或在此所述的标准测定法例如实例中给出的测定法(例如流式细胞术，结合测定)可以对改变的抗体的功能特性进行评估。
在本公开的工程化抗体的方法的某些实施方案中，可沿抗-BTLA抗体编码序列的全长或一部分中随机地或选择性地引入突变，并针对结合活性和/或在此所述的其他功能特性对得到的经修饰的抗-BTLA抗体进行筛选。突变方法已经在本领域中进行说明。例如，Short的PCT公开文件WO02/092780说明了使用饱和诱变、合成连接装配、或它们的组合来生成并筛选抗体突变的方法。备选地，Lazar等人的PCT公开文件WO 03/074679说明了使用计算机筛选方法优化抗体的理化特性的方法。
编码本公开的抗体的核酸分子
本公开的另一个方面涉及对本公开的抗体进行编码的核酸分子。这些核酸可以存在于整个细胞中、细胞裂解液中、或者以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过标准技术(包括碱/SDS处理，CsCl成带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳以及本领域的其他熟知技术)从其他细胞成分或其他杂质(如其他细胞核酸或蛋白质)中纯化出核酸时，该核酸是“分离的”或“使之基本上是纯的”。参见F.Ausubel et al.(1987)Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。本公开的核酸可以是，例如DNA或RNA，并且可以含有或不含有内含子序列。在优选的实施方案中，核酸为cDNA分子。
使用标准的分子生物学技术可以获得本公开的核酸。对于杂交瘤表达的抗体(例如，从以下进一步说明的携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)而言，通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术可以获得编码杂交瘤产生的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库中获得的抗体(例如使用噬菌体展示技术)而言，可以从该文库回收编码该抗体的核酸。
本公开的优选的核酸分子是对1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、E8D9、10H6、10H6a或4C9单克隆抗体的VH和VL序列进行编码的核酸分子。对1B4、E4H9、3C2、6A5、11E2、E8D9、10H6，以及4C9的VH序列进行编码的DNA序列分别显示在SEQ ID NO：53、54、55、56、56、58、83及93中。对1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、E8D9、10H6以及4C9的VL序列进行编码的DNA序列分别显示在SEQ ID NO：59、60、61、62、63、64、65、84、98、以及94中。
一旦获得了编码VH和VL区段的DNA片段，则通过标准的重组DNA技术可以进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转变成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段被有效连接至编码另一种蛋白质(例如抗体恒定区或柔性接头)的另一条DNA片段。在此使用的术语“有效连接”意指连接两条DNA片段，使得由这两条DNA片段编码的氨基酸序列保留在读框内。
通过将编码VH的DNA有效连接至另一个编码重链恒定区(CH1、CH2及CH3)的DNA分子，可以将编码VH区的分离的DNA转化成全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见例如Kabat，E.A.，el al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，FifthEdition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH PublicationNo.91-3242)，并且包含这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增来获得。该重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因而言，可以将编码VH的DNA有效连接至另一个仅对重链CH1恒定区进行编码的DNA分子。
通过将编码VL的DNA有效连接至另一个编码轻链恒定区CL的DNA分子上，可以将编码VL区的分离的DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因序列在本领域中是已知的(参见例如Kabat，E.A.，el al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242)，并且通过标准PCR扩增可以获得包含这些区的DNA片段。该轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但最优选是κ恒定区。
为了产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段有效连接至编码柔性接头的另一条片段，例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3，使得VL和VH序列可表达为连续的单链蛋白，其中VH和VL区域通过柔性接头连接(参见，例如Bird et al.(1988)Science242：423-426；Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty et al.，(1990)Nature348：552-554)。
本公开的单克隆抗体的生产
可以通过多种技术产生本公开的单克隆抗体(mAb)，该技术包括常规的单克隆抗体方法学，例如Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交步骤，但是原则上可以采用其他用于生产单克隆抗体的技术，例如B淋巴细胞的病毒性转化或致癌性转化。
用于制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠类系统。在小鼠中产生杂交瘤是充分确立的程序。用于分离被免疫的脾细胞以进行融合的免疫方案和技术在本领域中是已知的。融合伴侣(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。
基于如上所述制备的鼠类单克隆抗体的序列，可以制备本公开的嵌合抗体或人源化抗体。从目的鼠类杂交瘤可以获得对重链和轻链免疫球蛋白进行编码的DNA，并且使用标准的分子生物学技术进行工程化，以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为生成嵌合抗体，使用本领域中已知的方法可以将鼠类可变区与人类恒定区连接(参见例如Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，使用本领域已知的方法可以将鼠类CDR区插入人类构架区(参见例如Winter的美国专利号5,225,539及Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762以及6,180,370)。
在优选的实施方案中，本公开的抗体是人类单克隆抗体。使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因小鼠或转染色体小鼠，可以产生针对BTLA的这种人类单克隆抗体。这些转基因小鼠及转染色体小鼠包括在此分别称为HuMAb小鼠及KM miceTM的小鼠，并在此统称为“人类Ig小鼠”。
HuMAb
Figure A20078004941500681
(Medarex，Inc.)含有对非重排的人重链(μ及γ)以及κ轻链免疫球蛋白序列进行编码的人类免疫球蛋白基因微基因座，并含有使内源性μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如Lonberg，et al.(1994)Nature 368(6474)856-859)。因此，这些小鼠表现出小鼠IgM或κ的表达降低，并且响应于免疫应答，被导入的人类重链和轻链转基因经历了类别转换及体细胞突变，以产生高亲和力的人类IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.et al.(1994)，supra；Lonberg，N.(1994)Handbook ofExperimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg，N.and Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93，以及Harding，F.and Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546中综述)。HuMAb小鼠的制备和用途，以及由这种小鼠携带的基因组修饰，进一步记载于Taylor，et al.(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.et al.(1993)InternationalImmunology 5：647-656；Tuaillon et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci. USA90：3720-3724；Choi et al.(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.et al.(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon et al.(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.et al.(1994)International Immunology 6：579-591；以及Fishwild，D.et al.(1996)Nature Biotechnology 14：845-851，所有这些文献的内容完整并入本文作为参考。进一步参见，均为Lonberg及Kay的美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；及5,770,429；Surani等人的美国专利号5,545,807；均为Lonberg及Kay的PCT公开号WO 92/03918，WO 93/12227，WO 94/25585，WO 97/13852，WO 98/24884及WO99/45962；以及Korman等人的PCT公开号WO 01/14424。
在另一个实施方案中，使用在转基因及转染色体上携带人类免疫球蛋白序列的小鼠(例如，携带一个人类重链转基因及一个人类轻链转染色体的小鼠)可以生产本公开的人类抗体。这种小鼠在此被称为“KM miceTM”，在Ishida等人的PCT公开文件WO 02/43478中有详细的说明。
再者，备选的表达人类免疫球蛋白基因的转基因动物系统在本领域内是可以获得的，并且可以用于生产本公开的抗-BTLA抗体。例如，可以使用被称作Xenomouse(Abgenix，Inc.)的备选转基因系统；这种小鼠记载于，例如Kucherlapat等人的美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584及6,162,963中。
此外，备选的表达人类免疫球蛋白基因的转基因动物系统在本领域内是可以获得的，并且可以用于生产本公开的抗-BTLA抗体。例如，可以使用被称作“TC小鼠”的小鼠，该小鼠同时携带人类重链转染色体和人类轻链转染色体；这种小鼠记载于Tomizuka et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中。此外，在本领域中已经说明了携带人类重链转染色体和人类轻链转染色体的奶牛(Kuroiwa et al.(2002)Nature Biotechnology20：889-894)，并且这些奶牛可以被用于生产本公开的抗-BTLA抗体。
通过用于筛选人类免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法也可以制备本公开的人类单克隆抗体。这种用于分离人类抗体的噬菌体展示方法在本领域内已经建立。参见例如：Ladner等人的美国专利号5,223,409；5,403,484；以及5,571,698；Dower等人的美国专利号5,427,908及5,580,717；McCafferty等人的美国专利号5,969,108及6,172,197；以及Griffiths等人的美国专利号5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915以及6,593,081。
使用SCID小鼠也可以制备本公开的人类单克隆抗体，其中人类免疫细胞已被重建入SCID小鼠，使得免疫时可产生人类抗体反应。这种小鼠记载于，例如Wilson等人的美国专利号5,476,996及5,698,767中。
人类Ig小鼠的免疫
当人类Ig小鼠被用于生产本公开的人类抗体时，如Lonberg，N.et al.(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.et al(1996)NatureBiotechnology 14：845-851；以及PCT公开文件WO 98/24884及WO01/14424所述，用经纯化的或富集的BTLA抗原和/或重组BTLA、或BTLA融合蛋白制剂对这种小鼠进行免疫。优选地，这些小鼠在初次输注时是6至16周龄。例如，纯化的或重组的BTLA抗原制剂(5至50μg)可用于经腹膜内对人类Ig小鼠进行免疫。
在以下实施例1中说明了用于产生抗BTLA的全长人类单克隆抗体的详细步骤。关于不同抗原的积累的经验已显示，转基因小鼠在以下条件下会应答：当用Ribi(Sigma M 6536：MPL+TDM)中的抗原经腹膜内(IP)进行初始免疫，随后每隔一周用佐剂中的抗原进行IP免疫(达到共6次)。然而，也发现除Ribi(弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂)之外的佐剂也是有效的。另外，也发现在没有佐剂的情况下整个细胞具有高度的免疫原性。在免疫过程中可以用眶后取血得到的血浆样品监测免疫应答。通过ELISA(如以下所述)可以筛选该血浆，并且具有足够滴度的抗-BTLA人类免疫球蛋白的小鼠可用于融合。可以在处死并取出脾脏前的3天，通过静脉内对小鼠用抗原加强。预期对每个免疫可能需要进行2至3次融合。每种抗原通常对6至24只小鼠进行免疫。通常使用HCo7与HCo12品种。另外，HCo7与HCo12两个转基因均可以被共同培育成单一小鼠，该小鼠具有两种不同的人类重链转基因(HCo7/HCo12)。备选地或额外地，如实施例1所述，可以使用KM mouseTM系。
产生人单克隆抗体的杂交瘤的生成
为了生成产生本公开的人单克隆抗体的杂交瘤，可从被免疫的小鼠分离脾细胞和/或淋巴结细胞，并且与合适的无限增殖化细胞系(例如小鼠骨髓瘤细胞系)融合。针对抗原特性抗体的产生可以对得到的杂交瘤进行筛选。例如，用50％PEG可以将来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)融合。将大约2×105细胞接种在平底微量滴定板上，随后在以下选择性培养基内培育2周：该培养基含有10％FBS、3-5％Origen(IGEN)、OPI补充成分(Sigma O 5003：1.1×10-3M Oxalo乙酸、4.5×10-4M丙酮酸钠、以及24国际单位/L牛胰岛素)、4mM L-谷氨酰胺、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、以及1×HAT(Sigma H 0262)。在大约2周后，可以将细胞培养于以HT(Sigma H 0137)替代HAT的培养基中。然后可以通过ELISA筛选这些单个孔中的人单克隆IgG抗体。可以将分泌抗体的杂交瘤再次平板接种，再筛选，并且如果仍然是对人类IgG阳性的，则可以通过有限稀释将该杂交瘤进行亚克隆至少2次。然后可以在体外培养稳定的亚克隆以便在组织培养基中产生少量抗体用于表征。
为了纯化人类单克隆抗体，可以将已选择的杂交瘤培养于2升的旋瓶中用于单克隆抗体纯化。可以对上清液进行过滤并浓缩，之后用A蛋白-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。通过凝胶电泳及高效液相色谱可以检查被洗脱的IgG以确保纯度。可以将该缓冲液交换为PBS，并且通过OD280使用1.43的消光系数确定其浓度。可以将单克隆抗体等份，并保存于-80℃。
产生单克隆抗体的转染瘤的生成
使用(例如)本领域中熟知的重组DNA技术及基因转染方法的结合，在宿主细胞转染瘤中也可以产生本公开的抗体(例如Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。
例如，为了表达抗体，或它们的抗体片段，可以通过标准的分子生物学技术(例如，使用表达目的抗体的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆)获得对部分或全长轻链和重链进行编码的DNA，并且可以将这些DNA插入至表达载体中，使得这些基因被有效连接至转录和翻译控制序列。在本文中，术语“有效连接”意指将抗体基因连接进入载体，使得载体中转录和翻译控制序列起到其调节抗体基因的转录和翻译的预期功能。对表达载体及表达控制序列进行选择以便与所使用的表达宿主细胞相容。可以将该抗体轻链基因与该抗体重链基因插入至单独的载体中，或者更典型地是将两个基因均插入至相同的表达载体中。通过标准的方法(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补限制位点，或者如果不存在限制位点则进行平端连接)将这些抗体基因插入至该表达载体中。可以通过以下方法将本文所述的该抗体的轻链和重链可变区用于生产任何抗体同种型的全长抗体基因：将轻链和重链可变区插入至已经对希望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区进行编码的表达载体中，使得VH区段有效连接至载体中的CH区段，并且将VK区段有效连接至载体中的CL区段。另外地或备选地，重组的表达载体可以编码一种信号肽，该信号肽有助于从宿主细胞中分泌抗体链。可以将抗体链基因克隆进入该载体，使得该信号肽符合读框地被连接至该抗体链基因的氨基末端。该信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或者是异源的信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
本公开的重组表达载体除了抗体链基因之外，还携带在宿主细胞中调控抗体链基因表达的调节序列。术语“调节序列”意指包括启动子、增强子以及控制抗体链基因的转录或翻译的其他表达控制元件(例如，多聚腺苷酸化信号)。这种调控序列被描述于，例如Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990))中。本领域技术人员将会了解，表达载体的设计，包括调节序列的选择，可以依赖于以下因素，如待转化的宿主细胞的选择、希望的蛋白质的表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导蛋白质在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，例如来自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))及多瘤病毒的启动子和/或增强子。备选地，可以使用非病毒调节序列，例如泛蛋白启动子或β-珠蛋白启动子。再者，可使用由来自不同来源的序列组成的调节元件，例如SRα启动子系统，它包含来自SV40早期启动子及人类T细胞白血病病毒I型的长末端重复序列(Takebe，Y.et al.(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
本公开的重组表达载体除了携带抗体链基因和调节序列之外，还可以携带另外的序列，例如在宿主细胞中调节载体复制的序列(例如，复制起点)及可选择的标记基因。该可选择的标记基因有利于对其中已导入载体的宿主细胞的选择(参见例如，均为Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634,665及5,179,017)。例如，典型地可选择的标记基因赋予已导入载体的宿主细胞对，例如G418、潮霉素或甲氨喋呤的药物抗性。优选的可选择的标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主细胞中用于甲氨喋呤选择/扩增)以及neo基因(用于G418选择)。
为了轻链及重链的表达，通过标准技术将编码这些重链与轻链的一个或多个表达载体转染进入宿主细胞中。术语“转染”的不同形式旨在涵盖范围宽广的多种技术，这些技术一般用于将外源DNA导入原核的或真核的宿主细胞，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。虽然在理论上可以无论在原核宿主细胞或在真核宿主细胞中均表达本公开的抗体，但是在真核细胞中抗体的表达，并且最优选在哺乳动物宿主细胞中的表达是最优选的，因为这种真核细胞，并且特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更有可能组装并分泌正确折叠并且具有免疫活性的抗体。已经报道了抗体基因的原核表达不能有效产生大量活性抗体(Boss，M.A.and Wood，C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。
用于表达本公开的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，说明于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，使用DHFR选择标记，例如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中所说明)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞及SP2细胞。特别是，对于使用NSO骨髓瘤细胞而言，另一种优选的表达系统是在WO 87/04462、WO89/01036、以及EP 338,841中披露的GS基因表达系统。在编码抗体基因的重组表达载体基因被引入哺乳动物宿主细胞时，通过对宿主细胞培养一段时间可以产生抗体，所述时间足够使该抗体在该宿主细胞中得到表达，或者更优选地使该抗体分泌进入生长宿主细胞的培养基。使用标准的蛋白纯化方法可以从培养基中回收抗体。
结合至抗原的抗体的表征
可以通过例如标准ELISA测试本公开的抗体与BTLA的结合。简言之，将微量滴定板用PBS中的1μg/ml的经纯化的BTLA进行包被，并接着用含1％牛血清白蛋白的PBS/吐温(tween)进行封闭。在每个孔中加入抗体的稀释物(例如，来自被BTLA免疫的小鼠血浆的稀释物)，并在室温下孵育1至2小时。用PBS/吐温冲洗该板，并接着与缀合至碱性磷酸酶的第二试剂(例如，对于人类抗体而言，一种山羊-抗人类IgG Fc特异性的多克隆试剂)在37℃孵育1小时。冲洗后，用pNPP底物(1mg/ml)对该板进行显影，并在OD 405至650下进行分析。优选地，形成最高效价的小鼠将用于融合。
以上说明的ELISA测定还可用于筛选与BTLA免疫原显示阳性反应的杂交瘤。对以高亲合力结合BTLA的杂交瘤进行亚克隆并且进一步表征。可以从每个杂交瘤(通过ELISA)选择保持亲本细胞反应性的一个克隆，用于制备5至10小瓶细胞库，保存于-140℃，并用于抗体纯化。
为了纯化抗-BTLA抗体，可以将已选择的杂交瘤以2升体积培养于组织培养瓶或旋瓶中用于单克隆抗体纯化。可以将上清液进行过滤并浓缩，之后用A蛋白-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。通过凝胶电泳及高效液相色谱可以检查被洗脱的IgG以确保纯度。可以将该缓冲液交换到PBS中，并且通过OD280使用1.43消光系数确定其浓度。可以将单克隆抗体等分，并保存于-80℃。
为了确定已选择的抗-BTLA单克隆抗体是否结合至独特的表位，使用可商购的试剂(Pierce，Rockford，IL)可以对每种抗体进行生物素化。使用未标记的单克隆抗体及生物素化的单克隆抗体的竞争性研究可以用以上描述的经BTLA包被的ELISA板进行。使用链霉抗生物素蛋白-抗生物素蛋白-碱性磷酸酶探针可以检测生物素化的mAb结合。另外，类似的竞争性研究可以通过FACS法在BTLA-CHO细胞上完成。生物素标记的BTLA抗体对细胞的结合可以用链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白探针检测。
为了确定纯化的抗体的同种型，可以使用对特定同种型的抗体特异的试剂进行同种型ELISA。例如，为了确定人类单克隆抗体的同种型，可以用1μg/ml的抗-人类免疫球蛋白抗体在4℃下过夜对微量滴定板的孔进行包被。用1％BSA封闭后，该板与1μg/ml或更低的测试单克隆抗体或者经纯化的同种型对照在环境温度下反应1至2小时。随后将这些孔与人类IgG1或人类IgM-特异的碱性磷酸酶缀合的探针进行反应。如以上所述对板进行显影并分析。
FACS测定可以用来证实本发明的抗体与细胞上表达的天然BTLA的结合。简言之，将在含有1％BSA及0.5％叠氮化钠的PBS(FACS缓冲液)中的抗体稀释液与经转染的、表达BTLA的CHO细胞(105细胞)在4℃下孵育30分钟。将细胞通过离心洗涤两次，吸出上清液，并加入新鲜的FACS缓冲液。与细胞上BTLA结合的抗体可以通过以下操作检测：将经PE标记的山羊抗-人类IgG(Fc特异性)抗体与这些细胞在4℃下孵育30分钟，如上洗涤这些细胞两次，并且用FACS进行分析。
通过蛋白质印迹法可以进一步测试抗-BTLA人类IgG与BTLA抗原的反应性。简言之，可以制备BTLA并对其进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移至硝酸纤维素膜上，用10％的胎牛血清进行封闭，并用待测试的单克隆抗体进行探测。人类IgG的结合可以用抗-人类IgG碱性磷酸酶进行检测并用BCIP/NBT底物片(SigmaChem.Co.，St.Louis，Mo.)进行显影。
抗体的物理特性
本公开的抗体还可以通过抗-BTLA抗体的不同物理特性进行进一步表征。基于这些物理特性，可以使用不同测定法来检测和/或区分不同类型的抗体。
在一些实施方案中，本公开的抗体可以在该轻链或重链可变区含有一个或多个糖基化位点。在可变区中一个或多个糖基化位点的存在可导致抗体的免疫原性提高或抗体的pK值发生变化，这是因为抗原结合发生改变(Marshall et al(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala FA andMorrison SL(2004)J Immunol 172：5489-94；Wallick et al(1988)J Exp Med168：1099-109；Spiro RG(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh et al(1985)Nature 316：452-7；Mimura et al.(2000)Mol Immunol 37：697-706)。已知糖基化作用发生在含有N-X-S/T序列的基序中。使用Glycoblot测定可以检测可变区的糖基化作用，在该测定中对该抗体进行切割产生Fab，并接着使用测量高碘酸氧化及席夫碱形成的测定法来检测糖基化作用。备选地，使用Dionex光色谱(Dionex-LC)可以检测可变区的糖基化，在该测试中将Fab上的糖类剪切成单糖，并分析每种糖的含量。在某些情况下，优选具有不包含可变区糖基化作用的抗-BTLA抗体。这可以通过选择在可变区中不含有糖基化基序的抗体，或者通过使用本领域熟知的标准技术对糖基化基序中的残基进行突变来实现。
在优选的实施方案中，本公开的抗体不含有天冬酰胺异构化位点。在N-G序列或D-G序列上可分别发生脱酰胺反应或异天冬氨酸效应。脱酰胺反应或异天冬氨酸效应导致异天冬氨酸的生成，这通过在侧链羧基端而不是在主链上生成缠绕结构，降低了抗体的稳定性。使用等产量测定(iso-quant assay)可以测量异天冬氨酸的产生，该测试使用反相HPLC来检测异天冬氨酸。
每种抗体都具有独特的等电点(pI)，但是抗体的等电点通常都落在pH6至9.5之间的范围内。IgG1抗体的pI典型地落在pH7至9.5的范围内，并且IgG4抗体的pI典型地落在pH6至8的范围内。抗体可以具有在此范围以外的等电点。虽然这些效果并不完全清楚，但是推测pI在正常范围之外的抗体在体内条件下可能会有一些解折叠(unfolding)及不稳定性。使用毛细管等电聚焦测定可以测量等电点，该测定产生pH梯度，并可以使用激光聚焦来提高准确性(Janini et al(2002)Electrophoresis23：1605-11；Ma et al.(2001)Chromatographia 53：S75-89；Hunt et al(1998)J Chromatogr A 800：355-67)。在某些情况下，优选具有包含pI值落在正常范围内的抗-BTLA抗体。这可以通过选择pI值在正常范围内的抗体，或者通过使用本领域熟知的标准技术对带电荷的表面残基进行突变来实现。
每种抗体都有解链温度，这是热稳定性的指标(Krishnamurthy R andManning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol 3：361-71)。较高的热稳定性表明抗体在体内的总体稳定性较好。可以使用诸如差示扫描量热法的技术来测量抗体的解链温度(Chen et al(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlandoet al(1999)Immunol Lett 68：47-52)。TM1表示抗体起始解折叠的温度。TM2表示抗体的完全解折叠的温度。通常地，优选本公开抗体的TM1高于60℃的，优选高于65℃，甚至更优选高于70℃。备选地，使用圆二色性可以测量抗体的热稳定性(Murray et al.(2002)J.Chromatogr Sci 40：343-9)。
在优选的实施方案中，选择不会快速降解的抗体。使用本领域所熟知的毛细管电泳(CE)及MALDI-MS可以测量抗-BTLA抗体的片段化(Alexander AJ and Hughes DE(1995)Anal Chem 67：3626-32)。
在另一个优选的实施方案中，选择具有最小聚集效应的抗体。聚集作用可能导致引发不需要的免疫反应和/或改变的或不利的药物动力学特性。总体上，可接受的抗体的聚集度是25％或更低，优选20％或更低，甚至更优选是15％或更低，甚至更优选是10％或更低，并甚至更优选地是5％或更低。通过本领域熟知的几种技术可以对聚集进行测量以鉴定单体、二聚体、三聚体或多聚体，这些技术包括大小排阻柱(SEC)、高效液相色谱(HPLC)及光散射法。
免疫缀合物
在另一方面，本公开的特征还在于缀合至治疗性部分的抗-BTLA抗体，或该抗体的片段，该治疗性部分例如是细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)、或放射性毒素。这种缀合物在此被称为“免疫缀合物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫缀合物被称为“免疫毒素”。细胞毒素或者细胞毒性物质包括任何对细胞有害(例如杀死细胞)的物质。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光辉霉素、放射菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔，及嘌呤霉素及它们的类似物或同系物。治疗性物质还包括，例如抗代谢物(如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨氮烯咪胺)、烷基化试剂(如氮芥、噻替哌、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)及洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C，及顺铂(II)(DDP)、蒽环类抗生素(如柔红比星(以前称柔红霉素)及多柔比星)，抗生素(如更生霉素(以前称放线菌素)、博来霉素、光辉霉素，及安曲霉素(AMC))，以及抗有丝分裂剂(如长春新碱及长春碱)。
可与本公开的抗体相缀合的治疗性细胞毒素的其他优选的实例包括多卡霉素(duocarmycin)、加利车霉素、美登素及阿里斯达汀(auristatin)，以及它们的衍生物。一种加利车霉素抗体缀合物的实例是可商购的(MylotargTM；Wyeth-Ayerst)。
使用本领域已知的接头技术可以将细胞毒素缀合至本公开的抗体上。已用于将细胞毒素缀合至抗体的接头类型的实例包括但不限于：腙、硫醚、酯类，二硫化物及含有接头的肽。可选择一个接头，例如，该接头在溶酶体区室中易于被低pH值剪切，或者易于被蛋白酶(例如，优先在肿瘤组织中表达的蛋白酶，例如组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B、C、D))剪切。
关于细胞毒素、接头以及将治疗剂与抗体缀合的方法的进一步讨论，还参见Saito，G.et al.(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A.et al.(2003)Cancer Immunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan，I.and Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs3：1089-1091；Senter，P.D.and Springer，C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264。
本公开的抗体还可以被缀合至放射性同位素上，以产生细胞毒性的放射性药物，也被称为放射免疫缀合物。可偶联至抗体上而用于诊断或治疗的放射性同位素的实例包括但不限于：碘131、铟111、钇90以及镥177。制备放射免疫缀合物的方法在本领域内已经确立。放射免疫缀合物的实例是可商购的，包括ZevalinTM(IDEC Pharmaceuticals)及BexxarTM(CorixaPharmaceuticals)，并且使用类似的方法用本公开的抗体可以制备放射免疫缀合物。
本公开的抗体缀合物可被用于修饰给定的生物学应答，并且该药物部分不应被理解为仅限于经典的化学治疗剂。例如，该药物部分可以是具有希望的生物活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可能包括，例如酶活性毒素，或其活性片段，例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素，或白喉毒素；蛋白质，例如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或者，生物反应调节剂，例如淋巴因子、白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)、或其他生长因子。
用于将这种治疗性部分缀合至抗体上的技术是熟知的，参见例如Arnon et al.，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld et al.(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom et al.，″Antibodies For Drug Delivery″，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson et al.(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review″，in Monoclonal Antibodies ′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera et al.(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy″，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin et al.(eds.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，以及Thorpe et al.，″The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConjugates″，Immunol.Rev.，62：119-58(1982))。
双特异性分子
在另一方面，本公开的特征在于包含本公开的抗-BTLA抗体，或该抗体的片段的双特异性分子。本公开的抗体，或其抗原结合部分可被衍生化或与另一种功能分子相连接，例如与另一种肽或蛋白质(例如，另一种抗体或受体的配体)相连接，以生成结合至少两种不同的结合位点或靶分子的双特异性分子。事实上，本公开的抗体可能被衍生化或连接至多于一个的其他功能分子上，以生成结合到多于两种不同的结合位点和/或靶分子的多特异性分子；在此所使用的术语“双特异性分子”也旨在涵盖这种多特异性分子。为了生成本公开的双特异性分子，可将本公开的抗体与一个或多个其他的结合分子(例如，另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)功能性地连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价连接等等)，由此得到双特异性分子。
因此，本公开还包括双特异性分子，该双特异性分子含有针对BTLA的至少一种第一结合特异性以及针对第二靶表位的第二结合特异性。在本公开的一个具体实施方案中，该第二靶表位是Fc受体，例如人类FcγRI(CD64)或人类Fcα受体(CD89)。因为，本公开包括的双特异性分子既能够结合表达FcγR或FcαR受体的效应细胞(例如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))，又能够结合表达BTLA的靶细胞。这些双特异性分子将表达BTLA的细胞靶向效应细胞，并触发Fc受体介导的效应细胞活性，例如，表达BTLA的细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子的释放、或超氧化物阴离子的生成。
在本公开的一个实施方案(其中该双特异性分子是多特异性的)中，该分子除了包括抗-Fc结合特异性及抗-BTLA结合特异性之外，还能进一步包括第三种结合特异性。在一个实施方案中，第三结合特异性是抗增强因子(EF)部分，例如，结合至涉及细胞毒素活性的表面蛋白上并由此增强针对靶细胞的免疫应答的分子。“抗增强因子部分”可以是结合至给定分子(例如抗原或受体)的抗体、功能抗体片段、或配体，并且由此增强Fc受体或靶细胞抗原的结合决定簇的效果。“抗增强因子部分”可以结合Fc受体或靶细胞抗原。备选地，抗增强因子部分可以结合实体，该实体不同于第一及第二结合特异性结合的实体。例如，抗增强因子部分可结合细胞毒性T细胞(例如，经CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1、或其他免疫细胞，导致针对该靶细胞的免疫应答的增强)。
在一个实施方案中，本公开的双特异性分子包含作为一种结合特异性的至少一种抗体、或该抗体的抗体片段，包括，例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、或单链Fv。该抗体还可以是轻链或重链二聚物，或是其任何最小片段，例如Fv或单链构建体，如在Ladner等人的美国专利号4,946,778所述，其内容明确地并入本文作为参考。
在一个实施方案中，Fcγ受体的结合特异性由单克隆抗体提供，其结合并未被人类免疫球蛋白G(IgG)所阻断。在此所使用的术语“IgG受体”指位于染色体1上的8个γ链基因的任何基因。这些基因总共编码12种跨膜或可溶性受体同种型，它们被分为三类Fcγ受体：FcγRI(CD64)、FcγR II(CD32)、以及FcγRIII(CD16)。在一个优选的实施方案中，Fcγ受体是人类高亲合性FcγRI。人类FcγRI是一种72kDa的分子，它对单体IgG具有高亲合性(108至109M-1)。
在Fanger等人的PCT公开文件WO 88/00052及美国专利号4,954,617中描述了某些优选的抗-Fcγ单克隆抗体的制备及表征，其中传授的内容都通过引用全部结合在此。这些抗体结合至FcγI、FcγII及FcγIII的表位上不同于受体的Fcγ结合位点的位点，并因此它们的结合基本上不会被IgG的生理水平所阻断。在本公开有用的特异性抗-FcγRI抗体是mAb 22、mAb32、mAb 44、mAb 62及mAb 197。产生mAb 32的杂交瘤可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，ATCC保藏号HB9469。在其他实施方案中，抗-Fcγ受体抗体是一种单克隆抗体22(H22)的人源化形式。H22抗体的制备及表征说明于Graziano，R.F.et al.J.(1995)Immunol 155(10)：4996-5002，及PCT公开文件WO 94/10332中。产生H22抗体的细胞系保藏于美国典型培养物保藏中心，被命名为HA022CL1，保藏号为CRL11177。
在另外的优选实施方案中，对于Fc受体的结合特异性由结合至人类IgA受体的抗体提供，所述人类IgA受体例如是Fcα受体(FcαRI(CD89))，这种结合优选不会被人类免疫球蛋白A(IgA)所阻断。术语“IgA受体”意在包括位于染色体19上的一个α基因(FcαRI)的基因产物。已知这一基因编码几种55至110kDa的选择性剪接的跨膜同种型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞及嗜中性粒细胞中组成型表达，但在非效应细胞类群中不组成型表达。FcαRI对于IgA1和IgA2都具有中等的亲合力(≈5×107M-1)，该亲合性在暴露于细胞因子例如G-CSF或GM-CSF时会增加(Morton，H.C.et al.(1996)Critical Reviews in Immunology16：423-440)。已经描述了四种FcαRI特异性的单克隆抗体，被鉴定为A3、A59、A62及A77，它们结合IgA配体结合域外侧的FcαRI(Monteiro，R.C.et al.(1992)J.Immunol.148：1764)。
在本公开的双特异性分子的使用中，FcαRI及FcγRI是优选的触发受体，因为它们：(1)主要表达于免疫效应细胞(例如单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突细胞)；(2)表达水平高(例如5,000至100,000/细胞)；(3)是细胞毒性活性(例如ADCC、吞噬作用)的介体；以及(4)介导靶向它们的抗原(包括自身抗原)的增强的抗原呈递。
虽然人类单克隆抗体是优选的，但是可用于本公开的双特异性分子的其他抗体是鼠类抗体、嵌合抗体及人源化单克隆抗体。
使用本领域中已知的方法通过缀合组成性结合的特异性(例如，抗-FcR及抗-BTLA的结合特异性)可以制备本公开的双特异性分子。例如，可以单独地生成双特异性分子中的每一种结合特异性，并接着将它们缀合在一起。当结合特异性是蛋白质或肽时，可以使用多种偶联试剂或交联试剂来进行共价缀合。交联试剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻-亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、以及4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky et al.(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括在Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78，118-132；Brennan etal.(1985)Science 229：81-83)，以及Glennie et al.(1987)J.Immunol.139：2367-2375)中说明的方法。优选的缀合试剂是SATA及磺基-SMCC，都可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)公司购得。
当这些结合特异性是抗体时，它们可以通过两个重链之间的C末端铰链区的巯基键合相缀合。在一个特别优选的实施方案中，在缀合之前对铰链区进行修饰，使其含有奇数个巯基残基，优选地含有一个巯基残基。
备选地，两种结合特异性均可以在相同的载体中被编码并在同一宿主细胞中被表达并且组装。当双特异性分子是mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab’)2或配体×Fab融合蛋白时，这一方法特别有用。本公开的一种双特异性分子可以是含有一个单链抗体及一个结合决定簇的单链分子，或含有两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以含有至少两种单链分子。制备双特异性分子的方法说明在例如美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；以及美国专利号5,482,858中。
双特异性分子与它们的特异性靶标的结合可以通过下列方法来确认，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)、或蛋白印迹测定。这些测定中的每一种测定通常都是通过采用对目的复合体特异的标记试剂(例如，抗体)，检测特定目的蛋白-抗体复合体的存在。例如，可以使用例如识别并且特异性结合至抗体-FcR复合体的酶联抗体或抗体片段来检测这些FcR-抗体复合体。备选地，使用多种其他免疫测定中的任何测定可以检测这些复合体。例如，该抗体可被放射性标记，并用于放射免疫测定(RIA)中(参见例如，Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh TrainingCourse on Radioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，March，1986，将其并入本文作为参考)。可以使用例如γ计数器或闪烁计数器或通过放射自显影来检测放射性同位素。
药物组合物
在另一方面，本公开提供了一种组合物，例如药物组合物，该组合物包含本公开的一种单克隆抗体或多种单克隆抗体的组合、或它们的一个或多个抗原结合部分，并与药学上可接受的载体共同配制而成。这种组合物可包含本公开的一种抗体或(例如，两种或多种不同的)多种抗体的组合、或免疫缀合物、或双特异性分子。例如，本公开的药物组合物可以包含多种抗体(或免疫缀合物、或双特异性分子)的组合，这些抗体与该靶抗原上的不同表位结合、或具有互补的活性。
还可以在联合治疗中施用本公开的药物组合物(即，与其他试剂组合)。例如，该联合疗法可以包括本公开的抗-BTLA抗体，该抗-BTLA抗体与至少一种其他抗炎性或免疫抑制剂组合。以下在本公开的关于抗体用途的章节中对可用于联合治疗的治疗剂的实例进行了更加详尽的说明。
如此处使用的“药学上可接受的载体”包括任何及全部的生理学上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延缓剂等。优选地，该载体适宜于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮给药(例如通过注射或输注)。依据给药途径，活性化合物(即抗体、免疫缀合物、或双特异性分子)可用材料包被以保护该化合物免受可能导致该化合物失活的酸以及其他自然条件的作用。
本公开的药物化合物可包含一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指一种盐，它保持了母体化合物的希望的生物活性并不会引起任何不希望的毒理学效应(参见例如Berge，S.M.，et al.(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这种盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括源自无毒无机酸的盐，例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等，以及源自无毒有机酸的盐，例如脂肪族单羧酸及二羧酸、苯基取代的烷醇酸、羟基烷醇酸、芳香酸、脂肪族及芳香族磺酸等。碱性加成盐包括源自碱土金属的盐，例如钠、钾、镁及钙等的盐，以及源自无毒有机胺的盐，例如N，N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺及普鲁卡因等。
本公开的药物组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)，丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯及α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸及磷酸等。
在本公开的药物组合物中可以采用的适宜的水性及非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇及聚乙二醇等)，以及它们的适宜的混合物、植物油，如橄榄油，以及可注射的有机酯，例如油酸乙酯。例如通过使用包衣材料(如卵磷脂)、通过维持分散系中所需颗粒的大小、以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。
这些组合物还可包含佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂及分散剂。可通过灭菌程序(见上文)，以及通过加入不同的抗细菌剂及抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)均可确保防止微生物的存在。将等渗剂(如糖及氯化钠等)包含进入这些组合物中也可能是令人希望的。另外，通过包含延迟吸收的物质(如单硬脂酸铝及明胶)可以实现可注射药物形式的延长吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液、以及用于无菌注射溶液或分散液的即时配制的无菌粉末。用于药学活性物质的这种介质及试剂的使用在本领域中是已知的。除了与活性化合物不相容的任何常规介质或试剂之外，可考虑它在本公开的多种药学组合物中使用。还可以在这些组合物中掺入辅助性活性化合物。
治疗组合物典型地必须是无菌的并且在制造及存储条件下是稳定的。该组合物可以被配制成溶液、微乳剂、脂质体、或者其他适于高药物浓度的有序结构。该载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇，以及液体聚乙二醇等)，以及它们的适宜的混合物。例如，通过使用一种包衣(如卵磷脂)、通过维持分散系中所需颗粒的大小、以及通过使用表面活性剂，可维持适合的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗试剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)，或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐及明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
通过在适当的溶剂中将所需量的活性化合物与以上列举的多种组分中的一种或组合(按照需要)相掺和、然后进行无菌微过滤即可制备出无菌注射液。总体上，通过将活性化合物掺入至无菌载体(它包含基本分散介质及上述列举的所需的其他组分)来制备分散体。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况，优选的制备方法是真空干燥及冷冻干燥(冻干)，制得该活性组分以及任何来自其预先无菌过滤的溶液的其他希望的组分的粉末。
与载体物质组合以产生单一剂型的活性组分的量值将随着正在接受治疗的受试者及具体给药方式而变化。与载体物质组合以产生单一剂型的活性组分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。总体上讲，在100％的数量内，与药学上可接受的载体组合的活性组分的量大约是从0.01％至约99％的范围内，优选从约0.1％至约70％，最优选从约1％至约30％。
对剂量方案进行调节以提供最佳的理想的反应(如治疗反应)。例如，可给予单次大丸剂，可以随时间施用几次分份剂量，或者根据治疗情况的紧急程度所示按比例减少或增加剂量。为给药方便以及剂量统一而按剂量单位形式配制成肠胃外组合物尤为有利。此处使用的剂量单位形式指用于待治疗的受试者单一剂量的物理上不连续的单位；每个单位包含经计算能与所需的药学载体相结合产生理想的疗效的预定量的活性化合物。本公开的剂量单位形式的说明由以下因素决定并直接取决于以下因素：(a)活性化合物的独特特性及待实现的特定疗效，以及(b)配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的领域中固有的局限性。
对于该抗体的给药，剂量为约0.0001至100mg/kg，并且更经常是0.01至5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或者在1至10mg/kg的范围内。一种示例性治疗方案限定为每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三个月一次或每3至6个月一次。本公开的抗-BTLA抗体的优选的剂量方案包括通过静脉内给药1mg/kg体重或3mg/kg体重，使用以下剂量方案之一给予抗体：(i)每4周给予6个剂量，之后每3个月给药；(ii)每三周给药；(iii)3mg/kg体重一次给药，接着每三周按1mg/kg体重给药。
在一些方法中，两种或多种具有不同的结合特异性的单克隆抗体被同时给药，这种情况下，所给予的每种抗体的剂量都在所指示的范围之内。通常在多个时间点给予抗体。单个剂量之间的间隔可以是，例如一周、一个月、每三个月或一年。间隔也可以是不规则的，如通过测量患者的针对靶抗原的抗体的血液水平所指示。在一些方法中，调整剂量使血浆抗体浓度大约是1至1000μg/ml，并且在一些方法中大约是25至300μg/ml。
备选地，抗体可以作为缓释制剂给药，在这种情况中需要以较低频率给药。剂量及频率随抗体在患者体内的半衰期而变。一般而言，人类抗体的半衰期最长，其次是人源化抗体、嵌合抗体、以及非人类抗体。给药的剂量及频率可根据治疗是预防性的或是治疗性的而变化。在预防性应用时，在很长的一段时间内以相对较不频繁的间隔给予相对少的剂量。一些患者在其余生中继续接受治疗。在治疗性的应用时，有时需要在相对较短的间隔内给予相对较高的剂量直至疾病缓减或终止，并且优选地直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。之后，该患者可以接受预防性的给药方案。
可以改变本公开的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平，以获得针对特定患者、组合物、以及给药方式实现希望的治疗反应有效而对该患者无毒的活性组分的量。所选的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括采用的本公开的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、给药时间、所采用的特定化合物的排泄速率、疗程、以及与采用的特定组合物组合中使用的其他药物、化合物和/或材料、正在接收治疗的患者的年龄、性别、体重、状态、总体健康状态及病史，以及在医学领域熟知的类似因素。
本公开的抗-BTLA抗体的“治疗有效剂量”优选地导致疾病症状的严重程度降低、无症状期的频率和持续时间增加、或防止由于该病痛产生的损害或残疾。例如，对于治疗肿瘤，与未治疗的受试者相比，“治疗有效剂量”优选地抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％，更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，并仍更优选至少约80％。化合物抑制肿瘤生长的能力可以在预测人类肿瘤功效的动物模型系统中进行评价。备选地，组合物的这一特性可通过检验该化合物的抑制能力来评价，这种抑制作用可通过有经验的从业者已知的测定方法在体外测定。治疗性化合物的治疗有效量可减小肿瘤的大小，或者缓解受试者的症状。本领域的技术人员应能根据受试者的大小、受试者症状的严重程度、以及所选具体组合物或所选择的给药途径等因素而确定这种量值。
使用本领域已知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径可以对本公开的组合物进行给药。如技术人员应当理解，给药途径和/或方式将随所希望的结果而变化。本公开的抗体的优选给药途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他胃肠外给药途径，例如通过注射或输注。此处使用的短语“胃肠外给药”是指除了肠内及局部给药外的其他给药方式，通常通过注射，并包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外及胸骨内注射及输注。
备选地，本公开的抗体可经非胃肠外途径进行给药，非胃肠外途径例如局部、表皮或粘膜途径给药，例如经鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部途径给药。
活性化合物可用载体制备，该载体将保护化合物免于快速释放，例如控释制剂，包括植入剂、经皮贴剂、以及微囊化递送系统。可以使用生物降解的、生物相容性的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、以及聚乳酸。用于制备这种制剂的许多方法已获得专利，或者是本领域技术人员所熟知的。参见，例如Sustained and ControlledRelease Drug Delivery SystemsJ.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1978。
治疗组合物可利用本领域中已知的医用装置进行给药。例如，在优选的实施方案中，本公开的治疗组合物可利用无针皮下注射装置进行给药，例如在美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中所披露的装置。在本公开中有用的熟知的植入剂与装置的实例包括：美国专利号4,487,603，它披露了用于以受控速度释放药物的一种可植入式微量输注泵；美国专利号4,486,194，它披露了用于通过皮肤给药的一种治疗装置；美国专利号4,447,233，它披露了用于以精确的输注速度递送药物的一种药物输注泵；美国专利号4,447,224，它披露了用于持续药物递送的一种可变流速的可植入输注装置；美国专利号4,439,196，它披露了一种具有多腔区室的渗透药物送递系统；以及美国专利号4,475,196，它披露了一种渗透药物送递系统。这些专利通过引用并入本文。许多其他这种植入剂、递送系统、以及模型是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，对本公开的人类单克隆抗体进行配制以确保其在体内分布适宜。例如，血脑屏障(BBB)阻止了许多高亲水性化合物。为确保本公开的治疗性化合物穿过BBB(如果需要时)，(例如)可以将它们配制在脂质体中。用于制造脂质体的方法，参见，例如，美国专利号4,522,811；5,374,548；以及5,399,331。这些脂质体可能包含一个或多个部分，这些部分被选择性地输送到特定的细胞或器官中，由此增强靶标药物的递送(参见，例如V.V.Ranade J.Clin.Pharmacol.29：685，(1989))。示例性靶向部分包括叶酸盐或生物素(参见，例如Low等人的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa et al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman et al(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais et al.(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe et al.(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier etal.(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods4：273。
本公开的用途及方法
本公开中的抗体、抗体组合物及方法在体内和体外具有多种用途，包括例如检测BTLA或是通过阻断BTLA而增强免疫应答。在一些实施方案中，抗体通过与BTLA结合而阻遏免疫应答。在这一实施方案中，该抗体作为激动剂发挥作用。在优选的实施方案中，本公开的抗体是人类抗体。例如，这些分子可以被给予至体外或活体外的培养细胞，或者给予人类受试者，例如在体内，以增强多种情形下的免疫性。因此，在一方面，本公开提供了改变受试者内的免疫应答的方法，包括给予该受试者本公开的抗体、或其抗原结合部分，使得受试者体内的免疫应答发生变化。优选地，该应答得到增强、受到刺激、或被上调。
在此所使用的术语“受试者”意在包括人类及非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如，非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、奶牛、马、鸡、两栖动物、以及爬行动物，然而哺乳动物是优选的，如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、奶牛和马。优选的受试者包括需要增强免疫应答的人类患者。该方法还特别适合治疗患有可通过增强T细胞介导的免疫应答来治疗的病症的病人。在具体的实施方案中，这些方法尤其适宜治疗体内癌细胞。为实现抗原特异的免疫性增强，可将这些抗BTLA抗体与目的抗原共同给药。当抗BTLA的抗体与另一种药物联合给药时，这两种物质可以依次或者同时给药。
本公开进一步提供了用于检测样品中是否存在人类BTLA抗原，或者测量人类BTLA抗原的量的方法，包括使该样品，及对照样品与人类单克隆抗体，或其抗原结合部分相接触，所述人类单克隆抗体，或其抗原结合部分特异性结合人类BTLA，接触条件允许该抗体或其部分与人类BTLA之间形成复合体。然后检测该复合体的形成，其中，该样品与对照样品相比之间的复合体形成的差异指示在样品中存在人类BTLA抗原。
考虑到本公开的抗体对BTLA的特异性结合，与CD28、ICOS及CTLA-4相比，本公开的抗体可用于特异检测BTLA在细胞表面的表达情况，并甚至可以用于通过免疫亲和纯化法纯化BTLA。
癌症
通过抗体阻断BTLA可增强患者体内对癌细胞的免疫应答。BTLA的配体HVEM是TNFR家族成员，并且可在一些体细胞组织及淋巴细胞，包括T细胞、B细胞、NK细胞、树突细胞、及髓样细胞中被诱导(Murphyet al.，Nat.Reviews Immunology，6，671-681，2006)。由HVEM/BTLA相互作用引起的免疫抑制可以通过抑制BTLA与HVEM局部的相互作用而逆转。(Watanabe et al.，Nat.Immunol.，4，670-679，2003；Otsuki et al.，BBRC 344，1121-1127，2006)。在一方面，本公开涉及使用抗-BTLA抗体对受试者进行体内治疗，使得癌性肿瘤的生长受到抑制。可单独使用一种抗-BTLA抗体以抑制癌性肿瘤的生长。备选地，如下所述，抗-BTLA抗体可与其他免疫原性药剂、标准癌症治疗、或其他抗体结合使用。
因此，在一个实施方案中，本公开提供了一种在受试者体内抑制肿瘤细胞生长的方法，包括对该受试者给予治疗有效量的抗-BTLA抗体，或其抗原结合部分。优选地，该抗体是人类抗-BTLA抗体(例如本文所述的任何人类抗-人类BTLA抗体)。额外地或者备选地，该抗体可以是嵌合的或人源化的抗-BTLA抗体。
优选的可使用本公开的抗体抑制其生长的癌症包含典型地对免疫疗法作出响应的癌症。用于治疗的优选的癌症的非限制性实例包括黑色素瘤(如转移性恶性黑色素瘤)、肾癌、前列腺癌、乳癌、结肠癌及肺癌。可使用本公开的方法治疗的其他癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、表皮或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区的癌症、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、儿童期的实体瘤、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱轴瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状上皮细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌(包括那些由石棉诱发的癌症)、以及所述癌症的组合。本公开还可用于治疗转移性癌症。
任选地，抗BTLA的抗体可与免疫原性物质组合，例如癌细胞、经纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽、以及碳水化合物分子)、细胞、以及用编码免疫刺激性细胞因子的基因转染的细胞(He et al(2004)J.Immunol.173：4919-28)。可使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑色素瘤抗原的肽，例如gpl00、MAGE抗原、Trp-2、MARTl和/或酪氨酸酶、或经转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞的肽(以下进一步讨论)。
在人类中，已经表明一些肿瘤具有免疫原性，例如黑色素瘤。据预计，通过阻断BTLA提高T细胞活化的阈值，可在宿主体内激活肿瘤应答。
当与接种疫苗方案组合时，BTLA阻断可能是最为有效的。已经设计了许多实验策略用于接种疫苗对抗肿瘤(参见Rosenberg，S.，2000，Development of Cancer Vaccines，ASCO Educational Book Spring：60-62；Logothetis，C.，2000，ASCO Educational Book Spring：300-302；Khayat，D.2000，ASCO Educational Book Spring：414-428；Foon，K.2000，ASCOEducational Book Spring：730-738；也参见Restifo，N.and Sznol，M.，Cancer Vaccines，Ch.61，pp 3023-3043in DeVita，V.et al.(eds.)，1997，Cancer：.Principles and Practice of Oncology.Fifth Edition)。在这些策略的其中之一，使用自体或同种异体的肿瘤细胞来制备疫苗。已经表明这些细胞疫苗在肿瘤细胞进行转导以表达GM-CSF时最为有效。已经表明，对于肿瘤接种而言，GM-CSF是抗原呈递的有效激活剂(Dranoff et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.90：3539-43)。
对不同肿瘤中的基因表达及大规模基因表达模式的研究导致对所谓的肿瘤特异性抗原给出了定义(Rosenberg，SA(1999)Immunity10：281-7)。在很多情况下，这些肿瘤特异性抗原是在肿瘤中、以及从其中产生肿瘤的细胞中表达的分化抗原，例如黑色素细胞抗原gpl00、MAGE抗原、以及Trp-2。更重要的是，这些抗原中有许多抗原可以显示为在宿主体内发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。BTLA阻断可与在肿瘤中表达的一组重组蛋白和/或肽结合使用，目的是产生对这些蛋白质的免疫应答。这些蛋白质通常被免疫系统视为是自身抗原，并因此对它们具有耐受性。肿瘤抗原还可包括端粒酶蛋白，该酶是合成染色体的端粒所必需的，并且在超过85％的人类癌症中、以及仅在有限数量的体细胞组织中表达(Kim etal.(1994)Science 266：2011-2013)(这些体细胞组织可通过不同方式免受免疫攻击)。因为改变蛋白序列或在两个无关序列(如费城染色体(Philadephiachromosome)中的bcr-abl)之间生成融合蛋白的体细胞突变，或来自B细胞肿瘤的独特型，肿瘤抗原也可以是在癌细胞中表达的“新抗原”。
其他肿瘤疫苗可以包括来自涉及人类癌症的病毒蛋白，例如人乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV及HCV)及卡波西疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可与BTLA阻断联合使用的肿瘤特异性抗原的另一种形式是从肿瘤组织自身分离出来的经纯化的热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白含有来自肿瘤细胞的蛋白质片段，并且这些HSP在送递至抗原呈递细胞时对于引发肿瘤免疫性是高度有效的(Suot，R&Srivastava，P(1995)Science269：1585-1587；Tamura，Y.et al.(1997)Science278：117-120)。
树突细胞(DC)是可以用于引发抗原特异性应答的有效的抗原呈递细胞。DC可在活体外(ex vivo)产生，并且负载有不同蛋白及肽抗原、以及肿瘤细胞提取物(Nestle，F.et al.(1998)Nature Medicine 4：328-332)。DC同样也可通过遗传方法被转导以表达这些肿瘤抗原。为了进行免疫，还将DC直接与肿瘤细胞进行融合(Kugler，A.et al.(2000)NatureMedicine 6：332-336)。作为接种的一种方法，DC免疫可与BTLA阻断有效地联合，以激活更有效的抗肿瘤应答。
BTLA阻断还可与标准的癌症治疗相结合。BTLA阻断可与化学疗法的方案有效联合。在这些情况下，降低所给予的化疗试剂的剂量是可能的(Mokyr，M.et al.(1998)Cancer Research 58：5301-5304)。此类组合的一个实例是抗-BTLA抗体与氨烯咪胺组合用于治疗黑色素瘤。此类组合的另一个实例是抗-BTLA抗体与白细胞介素-2(IL-2)组合用于治疗黑色素瘤。BTLA阻断与化学疗法的联合使用背后的科学理论在于：大部分化疗化合物的细胞毒性作用所致的细胞死亡将会导致抗原呈递途径中肿瘤抗原水平的升高。通过细胞死亡可能导致与BTLA阻断起到协同作用的其它联合疗法是放射、外科手术、以及激素剥夺(hormone deprivation)。这些方法中每一种方法在宿主中均生成了肿瘤抗原的来源。血管发生抑制剂也可与BTLA阻断组合。血管发生的抑制作用导致肿瘤细胞死亡，这可使肿瘤抗原进入宿主抗原呈递途径。
BTLA阻断抗体可以与双特异性抗体联合使用，这些双特异性抗体可以将表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞(参见例如美国专利号5,922,845及5,837,243)。双特异性抗体可以用于靶向两个单独的抗原。例如抗Fc受体/抗肿瘤抗原(如Her-2/neu)双特异性抗体已经被用于将巨噬细胞靶向肿瘤位点。这一靶向可更有效地激活肿瘤特异性应答。这些应答的T细胞分支(arm)可通过使用BTLA阻断得到增大。备选地，通过使用双特异性抗体可将抗原直接递送至DC，这些双特异性抗体结合肿瘤抗原及树突细胞特异性的细胞表面标记。
肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监视。可能通过使由肿瘤表达并且具有免疫抑制性的蛋白质的失活来克服这些机制中的许多机制。除此之外，这些蛋白包括TGF-β(Kehrl，J.et al.(J)1986和163；1037-1050)，IL-10(Howard，M.&O′Garra，A.(1992)Immunology Today 13：198-200)，及Fas配体(Hahne，M.et al.(1996)Science 274：1363-1365)。抗这些实体中的每一种的抗体可能与抗-BTLA联合使用，以抵销免疫抑制剂的作用，并有助于宿主的肿瘤免疫应答。
可用于激活宿主免疫应答的其他抗体可以与抗-BTLA联合使用。这些抗体包括在树突细胞表面激活DC功能及抗原呈递的分子。抗-CD40抗体能够有效的取代T细胞辅助细胞的活性(Ridge，J.et al.(1998)Nature393：474-478))并且可以用于结合BTLA抗体(Ito，N.et al(2000)Immunobiology 201(5)527-40)。激活T细胞共刺激分子的抗体，例如CTLA-4(美国专利号5,811,097)、OX-40(Weinberg，A.et al.(2000)Immunol 164：2160-2169)，4-1BB(Melero，I.et al.(1997)Nature Medicine3：682-685(1997)、以及ICOS(Hutloff，A.et al.(1999)Nature 397：262-266)也可以使T细胞的活化水平增加。
目前，骨髓移植被用来治疗多种造血源的肿瘤。尽管移植物抗宿主病是由于这种治疗所致，但是治疗益处可能获自移植物抗肿瘤的应答。BTLA阻断可以用于提高移植肿瘤特异性T细胞的供体的有效性。
还有几个实验性治疗方案，这些治疗方案涉及抗原特异性T细胞的活体外激活和扩增，以及将这些细胞过继转移进入受者，以便抗原特异性T细胞对抗肿瘤(Greenberg，R.&Riddell，S.(1999)Science 285：546-51)。这些方法还可用于激活对于诸如CMV的感染物的T细胞应答。在抗-BTLA抗体存在时，活体外激活有望增加过继转移的T细胞的频率及活性。
感染性疾病
本公开的其它方法可用于治疗暴露于特定毒素或病原体的患者。因此，本公开的另一方面提供了治疗受试者体内感染性疾病的方法，包含给予受试者抗-BTLA抗体或，其抗原结合部分，使得受试者的感染性疾病得以治疗。优选地，该抗体是一种人类抗-人类BTLA抗体(例如本文所述的人类抗-BTLA抗体中任何抗体)。另外地或备选地，该抗体可以是一种嵌合的或人源化的抗体。
与以上讨论的对肿瘤的应用相似，抗体介导的BTLA阻断可以单独使用，或作为佐剂与疫苗联合，以刺激针对病原体、毒素、以及自身抗原的免疫应答。本治疗方法特别适用的病原体的实例包括：目前没有有效疫苗的病原体、或者常规疫苗不完全有效的病原体。这些病原体包括但不限于HIV、肝炎(乙型，及丙型)、流行性感冒、疱疹、贾弟虫、疟疾、利什曼原虫、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。BTLA阻断对抗由诸如HIV(它在感染过程中呈现经改变的抗原)的物质建立的感染是特别有用的。这些新表位在抗-人类BTLA给药期间被识别为外源的，因此引起强烈的T细胞应答，该应答不会被提供BTLA的负性信号减弱。
引起本公开方法可治疗的感染的病原性病毒的一些实例包括HIV、肝炎(乙型、或丙型)、疱疹病毒(如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、以及CMV、EB病毒)、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒(cornovirus)、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒、以及虫媒病毒性脑炎病毒。
引起本公开的方法可治疗的感染的病原性细菌的一些实例包括衣原体、立克次体细菌、分支杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌及淋球菌(conococci)克雷伯氏菌属、变形菌、沙雷氏菌、假单胞菌、军团杆菌、白喉、沙门氏菌、芽孢杆菌、霍乱、破伤风、肉毒杆菌、炭疽、鼠疫、钩端螺旋体病、以及莱姆病细菌。
可引起本公开方法可治疗的感染的病原性真菌的一些实例包括假丝酵母属(白假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、光滑假丝酵母、热带假丝酵母等)、新型隐球酵母、曲霉属(烟曲霉、黑曲霉等)、毛霉菌目的属(毛霉属、犁头霉属、根霉属(rhizophus))、申克氏孢子丝菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌、以及夹膜组织胞浆菌。
引起本公开方法可治疗的感染的病原性寄生虫的一些实例包括溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠肠袋虫(Balantidium coli)、福氏耐格里原虫(Naegleria fowleri)、棘阿米巴属的种(Acanthamoebasp.)、兰伯贾弟虫(Giardia lamblia)、隐孢子虫属的种(Cryptosporidiumsp.)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、果氏巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、鼠弓形体(Toxoplasma gondi)、巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)。
在所有以上方法中，BTLA阻断可与其他形式的免疫疗法，例如细胞因子治疗(例如干扰素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)、或双特异性抗体疗法联合，这会提供增强的肿瘤抗原呈递(参见例如，Holliger(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak(1994)Structure 2：1121-1123)。
自身免疫反应
抗-BTLA抗体可以引发并扩大自身免疫反应。实际上，使用肿瘤细胞及肽疫苗引起的抗肿瘤应答显示许多抗肿瘤应答参与抗自身反应性(在van Elsas et al.(同上)抗-CTLA-4+GM-CSF-修饰的B16黑色素瘤中观察到的脱色作用；Trp-2接种的小鼠中的脱色作用(Overwijk，W.et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：2982-2987)；通过TRAMP肿瘤细胞疫苗引起的自身免疫前列腺炎(Hurwitz，A.(2000)supra)，在人类临床试验中观察到的黑色素瘤肽抗原接种疫苗及白癜风(vitiligo)(Rosenberg，SA and White，DE(1996)J.Immunother Emphasis Tumor Immunol 19(1)：81-4)。
因此，可能考虑使用与多种自身蛋白联合的抗-BTLA阻断，目的是设计疫苗接种方案，以有效产生针对这些自身蛋白的免疫应答用于疾病治疗。例如，阿尔茨海默氏病涉及脑内淀粉样沉积物中Aβ肽的不适当累积；针对淀粉状蛋白的抗体应答能够清除这些淀粉样沉积物(Schenk et al.，(1999)Nature 400：173-177)。
其它自身蛋白也可能用作靶标，例如用于治疗过敏反应及哮喘的IgE，以及用于类风湿性关节炎的TNFα。最后，针对多种激素的抗体应答可通过使用抗-BTLA抗体来诱导。对于生殖激素的中和抗体应答可用于避孕。针对特定肿瘤生长所需的激素以及其他可溶性因子的中和抗体应答也可被认为是可能的疫苗接种靶标。
与以上所述的抗-BTLA抗体的使用相似的方法可以用于诱导治疗性自身免疫应答，以治疗具有其他自身抗原不适当累积的患者，例如淀粉样蛋白沉积物，包括阿尔茨海默氏病中的Aβ、诸如TNFα的细胞因子、以及IgE。
同时，在一些实施方案中，激动剂也可以用于降低自身免疫应答。抗-BTLA抗体可用作激动剂，由此抑制由表达BTLA的免疫细胞介导的免疫应答。使用这种激动剂抗体可以治疗的疾病的一些实例包括自身免疫疾病、移植排斥、以及炎症。
疫苗
通过将抗-BTLA抗体与目的抗原(如疫苗)进行同时给药，抗-BTLA抗体可用于刺激抗原特异性免疫应答。因此，本公开的另一方面提供了在受试者体内增强针对抗原的免疫应答的方法，包含对受试者施用：(i)抗原；以及(ii)抗-BTLA抗体、或其抗原结合部分，使得在受试者体内的对于该抗原的免疫应答得以增强。优选地，该抗体是人类抗-人类BTLA抗体(例如在此所述的人类抗-BTLA抗体中任何抗体)。另外地或备选地，该抗体可以是嵌合的或人源化的抗体。该抗原可以是，例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、或来自病原体的抗原。这种抗原的非限制性实例包括在以上各部分讨论的抗原，例如以上讨论的肿瘤抗原(或肿瘤疫苗)、或来自以上所述的病毒、细菌、或其他病原体的抗原。
体内或体外施用本公开的抗体组合物(如，人类单克隆抗体、多特异性及双特异性分子及免疫缀合物)的适宜途径在本领域中是熟知的，并且可通过本领域的普通技术人员进行选择。例如，这些抗体组合物可通过注射(如静脉内或皮下)进行给药。所用分子的适宜剂量取决于受试者的年龄与体重、以及抗体组合物的浓度和/或剂型。
如先前所述，本公开的人类抗-BTLA抗体可以与一种或其他多种治疗剂(细胞毒性剂、放射毒性剂、或免疫抑制剂)共同给药。该抗体可以与该治疗剂相连接(作为免疫复合体)，或者可以与该治疗剂分开给药。在后一种(分开给药)情况下，该抗体可以在该试剂之前、之后给药、或与该试剂同时给药，或者可以与其他已知治疗(例如抗癌治疗，如放射)共同给药。除其他之外，这种治疗剂还包含抗肿瘤剂，例如多柔比星(阿霉素)、顺铂、硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、氨烯咪胺以及环磷酰胺、羟基脲，它们自身只在对患者有毒性或亚毒性的水平时有效。顺铂以100mg/ml的剂量静脉内给药，每四周一次，而阿霉素以60至75mg/ml的剂量静脉内给药，每21天一次。本公开的人类抗-BTLA抗体，或它们的抗原结合片段与化学治疗剂共同给药，提供两种抗癌治疗剂，这两种抗癌治疗剂通过不同的机制起作用，这些机制产生针对人类肿瘤细胞的细胞毒效应。这种共同给药可以解决由于肿瘤细胞产生药物抗性或者抗原性改变方面的问题，该抗原性改变可能会导致肿瘤细胞与抗体不反应。
同样在本公开范围内的是包含本公开的抗体组合物(如人类抗体、双特异性或多特异性分子、或免疫缀合物)以及使用说明书的试剂盒。该试剂盒可以进一步包含至少一种额外的试剂、或者一种或多种额外的本公开人类抗体(例如，具有互补活性的人类抗体，其结合不同于该第一人类抗体的BTLA抗原中的表位)。试剂盒典型地包括标签，其指示该试剂盒的内容物的预期用途。术语标签包括在试剂盒上或与该试剂盒一起提供的，或者随附该试剂盒的任何书面，或录音材料。
通过下列实施例对本公开进行进一步阐述，不应将这些实施例理解为进一步限定。本申请通篇引用的所有附图及所有参考文献、专利及公开的专利申请的内容均明确地并入本文作为参考。
实施例
实施例1：针对BTLA的人类单克隆抗体的产生
抗原
免疫接种方案使用以下二者作为抗原：(i)包含BTLA的细胞外部分的重组融合蛋白以及(ii)膜结合的全长BTLA。这两种抗原均通过重组转染方法在CHO细胞系内产生。
转基因HuMab及KM小鼠 TM
使用HuMab转基因小鼠的HCo7品系及转基因转染色体小鼠的KM品系制备BTLA的完全人类单克隆抗体，其中的每一种均表达人类抗体基因。在这些小鼠品系的每一品系中，内源性小鼠κ轻链基因已经被纯合破坏，如Chen et al.(1993)EMBO J.12：811-820所述的，并且内源性小鼠重链基因已经被纯合地破坏，如PCT公开文件WO 01/09187的实施例1所述。这些小鼠品系中每一种品系携带人类κ轻链转基因KCo5，如Fishwildet al.(1996)Nature Biotechnology 14：845-851所述。HCo7品系携带HCo7人类重链转基因，如美国专利号5,545,806；5,625,825；以及5,545,807所述。KM品系含有SC20转染色体，如PCT公开文件WO 02/43478中所述。
HuMab及KM免疫：
为产生抗BTLA的完全人类单克隆抗体，用纯化的重组BTLA融合蛋白及经BTLA转染的CHO细胞作为抗原对HuMab小鼠及KM小鼠TM进行免疫。对于HuMab小鼠的通用免疫方案说明于Lonberg，N.et al(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.et al.(1996)NatureBiotechnology 14：845-851以及PCT公开WO 98/24884。使用BTLA融合蛋白抗原的纯化重组制剂(5至50μg)及5至10×106细胞经腹膜内(Ip))、或皮下(Sc)对HuMab小鼠及KM小鼠TM进行免疫。
表2
BTLA KM小鼠TM免疫方案
Figure A20078004941501011
＊Ribi佐剂中BTLA-Ig 25μ/小鼠
＊细胞＝每只小鼠107个CHO-BTLA细胞
将BTLA Ig抗原及如表2列出的在CHO细胞上表达的BTLA联合，对转基因KM小鼠TM进行为期90天的免疫。融合前，将Ribi佐剂中的BTLA-Ig作为Sc+Ip免疫进行给药，或在PBS中作为静脉间注射进行给药。将PBS中的细胞(1×107/小鼠))进行Ip给药。该免疫方案见表2。通过眶后取血监测免疫应答。通过ELISA筛选血浆(如以下所述)，将具有足够抗-BTLA人类免疫球蛋白滴度的小鼠用于融合。用抗原经静脉内加强免疫小鼠3天，然后处死并取出脾脏。对10只HuMab及10只KM小鼠TM进行免疫。
生产抗-BTLA抗体的HuMab或KM小鼠 TM 的选择
为了选择产生结合BTLA的抗体的HuMab或KM小鼠TM，如Fishwild，D.et al.(1996)所述，用ELISA测试来自经免疫的小鼠的血清。简言之，用含有1μg/ml的来自经转染的CHO细胞的经纯化的重组BTLA融合蛋白的PBS对微量滴定板进行包被，每孔100μl，在4℃下孵育过夜，然后用含有1％BSA的PBS/吐温(0.05％)以每孔200μl进行封闭。将来自经BTLA免疫的小鼠的血清稀释液加入每一个孔，并在环境温度下孵育1至2小时。用PBS/吐温清洗该板，然后用缀合有碱性磷酸酶(AP)的山羊-抗人类IgG多克隆抗体在室温下孵育1小时。清洗后，将该板用pNPP底物(Sigma N 2770)进行显色，并由分光光度计在OD405进行分析。将形成抗-BTLA抗体最高滴度的小鼠用于融合。如以下所述进行融合，并通过ELISA及FACS测试杂交瘤上清液的抗-BTLA活性。
产生抗BTLA的人类单克隆抗体的杂交瘤的生成：
根据标准方法，用PEG将从KM小鼠TM分离的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系进行融合。接着对产生的杂交瘤进行筛选抗原特异性抗体的产生。用50％PEG(Sigma)使来自免疫小鼠的脾细胞的单细胞悬液与相同数目的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)进行融合、或通过电融合(E-fusion，Cyto Pulse TM技术)进行融合。将细胞以大约2×105培养在平底微量滴定板上，之后在含有以下物质的选择性培养基中培育2周：10％FBS、3至5％Origen(IGEN)、OPI补充成分(SigmaO 5003：1.1×10-3M草酰乙酸、4.5×10-4丙酮酸钠、以及24国际单位/L牛胰岛素)、4mM L-谷氨酰胺、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、以及1×HAT。大约2周后，可以将细胞培养于以HT替代HAT的培养基中。然后针对人类抗-BTLA单克隆IgG抗体，通过ELISA及FACS(以上所述)对各个孔进行筛选。对分泌抗体的杂交瘤进行再次平板接种、再次筛选，并且，如果仍对人类IgG呈阳性，则通过有限稀释将抗-BTLA单克隆抗体进行亚克隆至少两次。然后将稳定的亚克隆在体外培养以在组织培养基中产生少量抗体用于进一步表征。
选择杂交瘤克隆1B4、E4H9、3C2、6A5、11E2、E8D9、10H6、以及4C9用于进一步分析。
实施例2：人类单克隆抗体1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、E8D9、10H6、以及4C9的结构表征
使用标准PCR技术，分别从1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、E8D9、10H6及4C9杂交瘤获得编码1B4、E4H9、3C2、3C2a、6A5、11E2、E8D9、10H6及4C9单克隆抗体的重链和轻链可变区的cDNA序列，并用标准DNA测序技术进行测序。
1B4的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图1A以及SEQ IDNO：53及1所示。
1B4的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图1B以及SEQ IDNO：59及7所示。
将1B4重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列进行比较，证明1B4重链利用来自人类种系VH 2-05的VH区段、来自人类种系3-10的D区段、以及来自人类种系JH 6b的JH区段。1B4的VH序列与种系VH 2-05序列的比对如图7所示。使用CDR区测定的Kabat系统对1B4VH序列进一步分析，得到分别如图1A及7，以及SEQ ID NO：14、20及26所示的重链CDR1、CDR2以及CD3区的说明。
将1B4轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列进行比较，证明1B4轻链利用来自人类种系VK A27的VL区段及来自人类种系JK 5的JK区段。1B4的VL序列与种系VK A27序列的比对如图8所示。使用CDR区测定的Kabat系统对1B4VL序列进一步分析，得到分别如图1B及8，以及SEQ ID NO：32、39及46所示的轻链CDR1、CDR2以及CD3区的说明。
E4H9的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图2A以及SEQ IDNO：54及2所示。
E4H9的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图2B以及SEQ IDNO：60及8所示。
将E4H9重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列进行比较，证明E4H9重链利用来自人类种系VH 2-70的VH区段、来自人类种系3-10的D区段、以及来自人类种系JH 6b的JH区段。E4H9VH序列与种系VH 2-70序列的比对如图9所示。使用CDR区测定的Kabat系统对E4H9VH序列进一步分析，得到分别如图2A及9，以及SEQ ID NO：15、21及27所示的重链CDR1、CDR2以及CD3区的说明。
将E4H9的轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列进行比较，证明E4H9轻链利用来自人类种系VK A27的VL区段及来自人类种系JK 3的JK区段。E4H9VL序列与种系VK A27序列的比对如图10所示。使用CDR区测定的Kabat系统对E4H9VL序列进一步分析，得到分别如图2B及33，以及SEQ ID NO：40和47所示的轻链CDR1、CDR2以及CD3区的说明。
3C2的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图3A以及SEQ IDNO：55及3所示。
3C2的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图3B以及SEQ IDNO：61及9所示。
将3C2的重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列进行比较，证明3C2重链利用来自人类种系VH 4-59的VH区段、来自人类种系6-19的D区段、以及来自人类种系JH 4b的JH区段。3C2VH序列与种系VH 4-59序列的比对如图11所示。使用CDR区测定的Kabat系统对3C2VH序列进一步分析，得到分别如图3A及11，以及SEQ ID NO：16、22及28所示的重链CDR1、CDR2以及CD3区的说明。
将3C2的轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列进行比较，证明3C2轻链利用来自人类种系VK L18的VL区段及来自人类种系JK 4的JK区段。3C2的VL序列与种系VK L18序列的比对如图12所示。使用CDR区测定的Kabat系统对3C2VL序列进一步分析，得到分别如图3B及11，以及SEQ ID NO：34、41及48所示的轻链CDR1、CDR2以及CD3区的说明。
3C2a的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图3C以及SEQ IDNO：62及10所示。
将3C2a的轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列进行比较，证明3C2a轻链利用来自人类种系VK A27的VL区段及来自人类种系JK 2的JK区段。3C2a的VL序列与种系VK A27序列的比对如图13所示。使用CDR区测定的Kabat系统对3C2a VL序列进一步分析，得到分别如图3C和12以及SEQ ID NO：35、42及49所示的轻链CDR1、CDR2以及CD3区的说明。6A5的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图4A以及SEQ ID NO：56及4所示。
6A5的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图4B以及SEQ IDNO：63及11所示。
将6A5的重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列进行比较，证明6A5重链利用来自人类种系VH 2-05的VH区段、来自人类种系3-10的D区段、以及来自人类种系JH 6b的JH区段。6A5的VH序列与种系VH 2-05序列的比对如图14所示。使用CDR区测定的Kabat系统对6A5VH序列进一步分析，得到分别如图4A及14，以及SEQ ID NO：17、23及29所示的重链CDR1、CDR2以及CD3区的说明。
将6A5轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列进行比较，证明6A5轻链利用来自人类种系VK A27的VL区段及来自人类种系JK 5的JK区段。6A5的VL序列与种系VK A27序列的比对如图15所示。使用CDR区测定的Kabat系统对6A5VL序列进一步分析，得到分别如图4B及36，以及SEQ ID NO：43及50所示的轻链CDR1、CDR2以及CD3区的说明。
11E2的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图5A以及SEQ IDNO：57及5所示。
11E2的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图5B以及SEQ IDNO：64及12所示。
将11E2的重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列进行比较，证明11E2重链利用来自人类种系VH 3-20的VH区段、来自人类种系3-10的D区段、以及来自人类种系JH 6b的JH区段。11E2的VH序列与种系VH 3-20序列的比对如图16所示。使用CDR区测定的Kabat系统对11E2VH序列进一步分析，得到分别如图5A及16，以及SEQ ID NO：18、24及30所示的重链CDR1、CDR2以及CD3区的说明。
将11E2的轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列进行比较，证明11E2轻链利用来自人类种系VK L15的VL区段及来自人类种系JK 1的JK区段。11E2的VL序列与种系VK L15序列的比对如图17所示。使用CDR区测定的Kabat系统对11E2VL序列进一步分析，得到分别如图5B及17，以及SEQ ID NO：37、44及51所示的轻链CDR1、CDR2以及CD3区的说明。E8D9的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图6A以及SEQ ID NO：57及5所示。
E8D9的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图6B以及SEQ IDNO：65及13所示。
将E8D9重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列进行比较，证明E8D9重链利用来自人类种系VH 2-05的VH区段、来自人类种系3-10的D区段、以及来自人类种系JH 6b的JH区段。E8D9的VH序列与种系VH 2-05序列的比对如图18所示。使用CDR区测定的Kabat系统对E8D9VH序列进一步分析，得到分别如图6A及18，以及SEQID NO：19、25及31所示的重链CDR1、CDR2以及CD3区的说明。
将E8D9的轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列进行比较，证明E8D9轻链利用来自人类种系VK A27的VL区段及来自人类种系JK 4的JK区段。E8D9 VL的序列与种系VK A27序列的比对如图19所示。使用CDR区测定的Kabat系统对E8D9VL序列进一步分析，得到分别如图6B及19，以及SEQ ID NO：38、45及52所示的轻链CDR1、CDR2以及CD3区的说明。
10H6的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图21A以及SEQ IDNO：83及74所示。
10H6的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图21B以及SEQ IDNO：84及75所示。
将10H6重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列进行比较，证明10H6重链利用来自人类种系VH 3-33的VH区段、来自人类种系3-10的D区段、以及来自人类种系JH 6b的JH区段。10H6的VH序列与种系VH 4-59序列的比对如图22所示。使用CDR区测定的Kabat系统对10H6的VH序列进一步分析，得到分别如图21A及22，以及SEQ ID NO：77、78及79所示的重链CDR1、CDR2以及CD3区的说明。
将10H6轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列进行比较，证明10H6轻链利用来自人类种系VK 04的VL区段，它被分类为一种拟基因。但是在这种情况下，实际上它是被表达的。10H6轻链还利用人类种系JK 2的JK片段。10H6的VL序列与种系VK 04序列的比对如图23所示。使用CDR区测定的Kabat系统对10H6VL序列进一步分析，得到分别如图21B及23，以及SEQ ID NO：80、81及82所示的轻链CDR1、CDR2以及CD3区的说明。10H6a的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图21C以及SEQ ID NO：98及76所示。
将10H6a的轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列进行比较，证明10H6a轻链利用来自人类种系VK A27的VL区段及来自人类种系JK 5的JK区段。10H6a的VL序列与种系VK A27序列的比对如图24所示。使用CDR区测定的Kabat系统对10H6a VL序列进一步分析，得到分别如图21C及24，以及SEQ ID NO：95、96及97所示的轻链CDR1、CDR2以及CD3区的说明。
4C9的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图25A以及SEQ IDNO：93及85所示。
4C9的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图25B以及SEQ IDNO：94及86所示。
将4C9重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列进行比较，证明4C9重链利用来自人类种系VH 2-05的VH区段、来自人类种系3-10的D区段、以及来自人类种系JH 6b的JH区段。4C9的VH序列与种系VH 2-05序列的比对如图26所示。使用CDR区测定的Kabat系统对4C9VH序列进一步分析，得到分别如图25A及26，以及SEQ IDNO：87、88及89所示的重链CDR1、CDR2以及CD3区的说明。
将4C9的轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列进行比较，证明4C9轻链利用来自人类种系VK A27的VL区段及来自人类种系JK 1的JK区段。4C9的VL序列与种系VK A27序列的比对如图27所示。使用CDR区测定的Kabat系统对4C9VL序列进一步分析，得到分别如图25B及27，以及SEQ ID NO：90、91及92所示的轻链CDR1、CDR2以及CD3区的说明。
实施例3：抗-BTLA人类单克隆抗体的结合的表征
在本实施例中，用Biacore分析法检测了抗-BTLA抗体的结合亲和力及结合动力学。用流式细胞术检测结合动力学及抑制作用。
结合亲和力及动力学
通过Biacore分析(Biacore AB，Uppsala，Sweden)表征抗-BTLA抗体的亲和力及结合动力学。使用标准的胺偶联化学及由Biacore提供的试剂盒，将经纯化的重组人类BTLA融合蛋白通过伯胺共价连接到CM5芯片(羧甲基葡聚糖包被的芯片)上。通过含有该抗体(浓度为267nM)的HBS EP缓冲液(由Biacore AB提供)以50μl/min的流速进行流动，对结合进行测定。抗原-抗体的结合动力学持续3分钟，并且解离动力学持续7分钟。使用BIA评估软件(Biacore，AB)将结合曲线与解离曲线拟合至1∶1的Langmuir结合模型。为了使结合常数的估计中亲合力的影响最小化，只有相应于结合及解离相的最初部分的数据用于拟合。所测定的KD值在表3中示出。
表3.重链与轻链的质量(KD)
Figure A20078004941501081
Figure A20078004941501091
通过流式细胞术的结合特异性
在细胞表面表达重组人类BTLA的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系被开发，并用于通过流式细胞术测定BTLA人类单克隆抗体的特异性。用表达质粒转染CHO细胞，该质粒含有全长cDNA，该cDNA编码跨膜形式的BTLA。通过将该转染细胞与浓度为0.01nM至66nM的抗-BTLA人类单克隆抗体一起孵育，来评估抗-BTLA人类单克隆抗体的结合。该抗体与105个BTLA CHO细胞在4℃下在含有1％BSA的PBS中孵育60分钟。将细胞在含有1％BSA的PBS里清洗2次，然后用PE标记的抗人类IgG进行染色(Jackson InmmuoResearch 109-115-098)。使用Prism制图软件(GraphPad software)，通过平均荧光强度(MFI)对抗体浓度的对数作图以图解的方式确定了EC50。使用FACSArray流式细胞术(BectonDickinson，San Jose，CA)进行流式细胞术分析。该结果如图28A所示。
实施例4：抗-BTLA抗体抑制HVEM配体与表达BTLA的细胞的结合
BTLA Mab对HVEM与BTLA的结合的阻断能力也可以通过FACS测定，并表达为阻止HVEM Ig与105个BTLA CHO细胞的最大程度结合的一半的抗-BTLA IgG浓度(IC50)。将BTLA CHO细胞与不同浓度的抗体于4℃下预先孵育30分钟，然后将0.5μg/ml经生物素标记的HVEMIg(R&D Systems BAF 356)加入BTLA CHO-IgG混合物，继续孵育30分钟。用含1％BSA的PBS清洗细胞2次，并用链霉抗生物素蛋白-PE(BDParmingen 3554061)对细胞进行染色后，通过FACS检测生物素HVEM Ig的结合。使用Prism软件(GraphPad Software)通过图解的方式测定IC50值。结果如图28B及图28C所绘。
实施例5：抗-BTLA抗体特异性的测定开发了ELISA测定法以确定一组抗-BTLA抗体对BTLA受体的特异性，并显示抗-BTLA抗体与CD28受体家族的其他成员基本上没有交叉反应性
将ELISA板用融合蛋白包被过夜，这些融和蛋白由一组CD28受体家族分子的细胞外结构域融合到人类IgG的Fc部分而组成(表4)。将该板进行清洗并且封闭，以使非特异性结合最小化。将一组抗-BTLA抗体及同种型对照抗体(表5)、以及阳性对照检测抗体(表3)，全部稀释至1μg/mL，以一式两份加入至检测板达1个小时。充分清洗后，将适宜的HRP缀合的检测抗体加入该板达1小时，随后进行清洗，并且使用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)作为底物进行显色。记录在650nm测量的光密度。
表4.
错误！从编辑字段的代码无法产生目标。
表5.错误！从编辑字段的代码无法产生目标。
与观察到的BTLA特异的反应性相比(图29A及29B)，不存在与所测试的其他CD28受体家族成员中的任何成员的实质性交叉反应。这些试验结果提示这里所测试的这组抗-BTLA抗体特异性结合人类BTLA。
实施例6：在体内肿瘤模型中使用抗-BTLA抗体的治疗
用抗-BTLA抗体对植入了癌性肿瘤的小鼠进行体内治疗，以测定该抗体在体内对肿瘤生长的影响。使用抗-CTLA-4的抗体作为阳性对照，因为已经表明这种抗体在体内抑制肿瘤的生长。
为了该项肿瘤研究，将6至8周龄的雌性AJ小鼠(HarlanLaboratories)根据体重随机分成6组。在第0天，将溶解于200μl DMEM培养基中的2×106个SA1/N纤维肉瘤细胞经皮下植入小鼠右侧腹部。用PBS载体、或者10mg/kg的抗体治疗这些小鼠。在第1、4、8及第11天，将大约200μl含有抗体或者载体的PBS以腹膜内注射对这些动物给药。每组包含10只动物，并且这些组的构成是：(i)载体组；(ii)对照小鼠IgG；(iii)对照仓鼠IgG；(iv)仓鼠抗-小鼠BTLA抗体以及；(v)完全的人类抗-BTLA。对小鼠每周监测肿瘤生长两次，持续大约6周。使用电子测径器对肿瘤进行三维测量(高度×宽度×长度)并且计算肿瘤的体积。当肿瘤长至肿瘤的终点(1500mm3)或者显示体重减轻超过15％时，将小鼠实施安乐死。
实施例7：抗体的其他结合特征
通过BIAcoreTM使用抗体捕获方法检测了1B4、E4H9、3C2、6A5、11E2及10H6抗体与重组BTLA蛋白的结合。使用抗-CH1(一种试剂抗体)捕获这六种抗-BTLA单克隆抗体的每一种抗体，该抗-CH1对人类抗体的重链恒定区1是特异的(Zymed，Clone HP6045，储存液浓度1.0mg/ml)。将抗-CH1以高密度(6200-7960RU)包被在CM5芯片上(BR-1000-14，研究级)。基于由生产商推荐的标准固定操作进行了包被。然后，经纯化的1B4、E4H9、3C2、6A5、11E2及10H6抗体以1至10μg/mL的浓度以10μl/min的流速持续0.5至1分钟各自被捕获在经抗-CH1包被的芯片表面。将单一浓度的重组人类BTLA融合蛋白(200nM)以30μl/min的流速在被捕获的抗体上注射了4分钟。允许抗原解离10分钟。每次循环后，用10μl的30mM NaOH对芯片表面进行再生，然后用30μl的HBS EP清洗。在芯片上进行同种型对照，并且将这些数据用于减去非特异性结合。使用BIAcore Control软件v 3.2，在Biacore 3000表面等离振子共振仪上进行所有的实验。使用BiaEvaluation v3.2软件进行数据分析。这些结果如表6所示。
表6：抗-BTLA抗体对人类BTLA的结合亲和力及动力学
  抗体   KD×10-9(M)   kon×104(1/Ms)   koff×10-4(1/s)
  1B4   5.74   4.94   2.84
  E4H9   0.006   4.57   0.003
  3C2   6.65   4.52   3.01
  6A5   0.09   3.89   0.04
  11E2   8.54   2.8   9.84
  10H6   3.82   4.0   1.53
对于1B4、E4H9、3C2、6A5、11E2及10H6的BIAcore结果证实了流式细胞术及较早前的BIAcore结果(如以上实例3中所述)，即所述抗体能够以高亲和力结合人类BTLA。值得注意的是使用在本实施例中所述的抗体捕获法获得的KD值与实施例3中描述的KD值稍有不同，实施例3使用的是抗原捕获法。这可能是因为本实施例中使用的抗体捕获法对其不具有抗体亲和组分。额外地或备选地，这两种方法之间的亲和力差别可表明mAb对芯片表面捕获的抗原与对溶液中抗原的分子识别过程中的不同。
序列表
<110>A·科曼
<120>结合BTLA的人类单克隆抗体及使用方法
<130>000000
<140>WO PCT/US00/00000
<141>2007-11-05
<150>US 60/866,058
<151>2006-11-15
<160>100
<170>PatentIn版本3.4
<210>1
<211>128
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr Ile
            20                  25                  30
Gly Val Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Arg Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala His Ser Gly Ile Thr Glu Val Arg Gly Val Ile Ile His Tyr
            100                 105                 110
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>2
<211>128
<212>PRT
<213>人
<400>2
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala Leu Ile Asp Trp Asp Asp Val Lys Tyr Tyr Ser Ser Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asp Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Ile Arg Phe Thr Met Phe Arg Gly Val Tyr Tyr Tyr Tyr
            100                 105                 110
Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>3
<211>120
<212>PRT
<213>人
<400>3
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ile Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Thr Ser Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Met Ser Val Glu Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Val Lys Val Tyr Ser Thr Gly Trp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>4
<211>128
<212>PRT
<213>人
<400>4
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Ala Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala His Ile Arg Ile Thr Glu Val Arg Gly Val Ile Ile Ser Tyr
            100                 105                 110
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>5
<211>127
<212>PRT
<213>人
<400>5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Ile Arg Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Ala Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gly Ser Pro Asn Tyr Phe Tyr Tyr
            100                 105                 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>6
<211>128
<212>PRT
<213>人
<400>6
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala His Thr Ser Ile Thr Glu Val Arg Gly Ala Ile Ile Tyr Tyr
            100                 105                 110
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>7
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>7
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Ile
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>8
<211>109
<212>PRT
<213>人
<400>8
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Pro Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
            100                 105
<210>9
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>9
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>10
<211>108
<212>PRT
<213>人
<400>10
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>11
<211>109
<212>PRT
<213>人
<400>11
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>12
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>13
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>13
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly His Ser Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>14
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>14
Thr Ile Gly Val Gly Val Asn
1               5
<210>15
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>15
Thr Ser Gly Met Cys Val Ser
1               5
<210>16
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>16
Asn Tyr Tyr Trp Asn
1               5
<210>17
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>17
Thr Ser Gly Val Gly Val Gly
1               5
<210>18
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>18
Asp Tyr Gly Met Ser
1               5
<210>19
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>19
Thr Ser Gly Val Gly Val Gly
1               5
<210>20
<211>16
<212>PRT
<213>人
<400>20
Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Arg
1               5                   10                  15
<210>21
<211>16
<212>PRT
<213>人
<400>21
Leu Ile Asp Trp Asp Asp Val Lys Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Thr
1               5                   10                  15
<210>22
<211>16
<212>PRT
<213>人
<400>22
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Thr Ser Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>23
<211>16
<212>PRT
<213>人
<400>23
Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>24
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>24
Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Ala Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>25
<211>16
<212>PRT
<213>人
<400>25
Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>26
<211>18
<212>PRT
<213>人
<400>26
Ser Gly Ile Thr Glu Val Arg Gly Val Ile Ile His Tyr Tyr Gly Met
1               5                   10                  15
Asp Val
<210>27
<211>18
<212>PRT
<213>人
<400>27
Ile Arg Phe Thr Met Phe Arg Gly Val Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu
1               5                   10                  15
Asp Val
<210>28
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>28
Val Lys Val Tyr Ser Thr Gly Trp Phe Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>29
<211>18
<212>PRT
<213>人
<400>29
Ile Arg Ile Thr Glu Val Arg Gly Val Ile Ile Ser Tyr Tyr Gly Met
1               5                   10                  15
Asp Val
<210>30
<211>18
<212>PRT
<213>人
<400>30
Asp Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gly Ser Pro Asn Tyr Phe Tyr Tyr Ala Met
1               5                   10                  15
Asp Val
<210>31
<211>18
<212>PRT
<213>人
<400>31
Thr Ser Ile Thr Glu Val Arg Gly Ala Ile Ile Tyr Tyr Tyr Gly Met
1               5                   10                  15
Asp Val
<210>32
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>32
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>33
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>33
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>34
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>34
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1               5                   10
<210>35
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>35
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>36
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>36
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>37
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>37
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1               5                   10
<210>38
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>38
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>39
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>39
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>40
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>40
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>41
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>41
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1               5
<210>42
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>42
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>43
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>43
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>44
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>44
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210>45
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>45
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>46
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>46
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Ile Thr
1               5
<210>47
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>47
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>48
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>48
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210>49
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>49
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr
1               5
<210>50
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>50
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>51
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>51
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Thr
1               5
<210>52
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>52
Gln Gln Tyr Gly His Ser Leu Thr
1               5
<210>53
<211>384
<212>DNA
<213>人
<400>53
cagatcacct tgaaggagtc tggtcctacg ctggtgaaac ccacacagac cctcacgctg     60
acctgcacct tctctgggtt ctcactcaac actattggag tgggtgtaaa ctggatccgt    120
cagcccccag gaaaggccct ggagtggctt gcactcattt attgggatga tgataagcgc    180
tacagcccat ctctgaagag gaggctcacc atctccaagg acacctccaa aaaccaggtg    240
gtcctcacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca catattactg tgcacacagc    300
gggattactg aggttcgggg agttattata cattactacg gtatggacgt ctggggccaa    360
gggaccacgg tcaccgtctc ctca                                           384
<210>54
<211>384
<212>DNA
<213>人
<400>54
caggtcacct tgagggagtc tggtcctgcg ctggtgaaac ccacacagac cctcacactg     60
acctgcacct tctctgggtt ctcactcagc actagtggaa tgtgtgtgag ctggatccgt    120
cagcccccag ggaaggccct ggagtggctt gcactcattg attgggatga tgttaaatac    180
tacagctcat ctctgaagac caggctcacc atctccaagg acacctccaa aaaccaggtg    240
gtccttacaa tgaccgacat ggaccctgtg gacactgcca cgtattactg tgcacggata    300
cggtttacta tgtttcgggg agtctactac tattactacg gtttggacgt ctggggccaa    360
gggaccacgg tcaccgtctc ctca                                           384
<210>55
<211>360
<212>DNA
<213>人
<400>55
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc     60
acctgcacta tctctggtgg ctccatcagt aattactact ggaactggat ccggcagccc    120
ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtacgagcac caagtacaac    180
ccctccctca agagtcgagt caccatgtca gtagagacgt ccaagaacca gttctccctg    240
aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agtgaaagtg    300
tatagcactg gctggttctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca    360
<210>56
<211>384
<212>DNA
<213>人
<400>56
cagatcacct tgaaggagtc tggtcctacg ctggtgaaac ccacacagac cctcacgctg     60
acctgcacct tttctgggtt ctcactcagc actagtggag tgggtgtggg ctggatccgt    120
cagcccccag gaaaggccct ggagtggctt gcactcattt attgggatga tgataagcgc    180
tacagtccat ctctgaagag caggctcacc atcaccaagg acacctccaa aaaccaggtg    240
gtccttacaa tggccaacat ggaccctgtg gacacagcca catattactg tgcacacatc    300
cgtattactg aggttcgggg agttattatc tcctactacg gtatggacgt ctggggccaa    360
gggaccacgg tcaccgtctc ctca                                           384
<210>57
<211>381
<212>DNA
<213>人
<400>57
gaggtgcaac tggtggagtc tgggggaggt gtgatacggc ctggggggtc cctgagactc     60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatggca tgagctgggt ccgccaagct    120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctctggt attaattgga atggtggtag cacaggttat    180
gcagcctctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat    240
ctacaaatga acagtctgag agccgaggac tcggccttgt attactgtgc gagagattat    300
tactatggtc cggggagtcc taactacttc tactacgcta tggacgtctg gggccaaggg    360
accacggtca ccgtctcctc a                                              381
<210>58
<211>384
<212>DNA
<213>人
<400>58
cagatcacct tgaaggagtc tggtcctacg ctggtgaaac ccacacagac cctcacgctg     60
acctgcacct tctctgggtt ctcactcagc actagtggag tgggtgtggg ctggatccgt    120
cagcccccag gaaaggccct ggagtggctt gcactcattt attgggatga tgataagcgc    180
tacagcccat ctctgaagag caggctcacc atcaccaagg acacctccaa aaaccaggtg    240
gtccttacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca catattactg tgcacacacc    300
agtattactg aggttcgggg agctattatc tactactacg gtatggacgt ctggggccaa    360
gggaccacgg tcaccgtctc ctca                                           384
<210>59
<211>321
<212>DNA
<213>人
<400>59
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc     60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa    120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca    180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag    240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaatcac cttcggccaa    300
gggacacgac tggagattaa a                                              321
<210>60
<211>327
<212>DNA
<213>人
<400>60
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc     60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa    120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca    180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag    240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcc gatcactttc    300
ggccctggga ccaaagtgga tatcaaa                                        327
<210>61
<211>321
<212>DNA
<213>人
<400>61
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc     60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca    120
gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca    180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct    240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt accctctcac tttcggcgga    300
gggaccaagg tggagatcaa a                                              321
<210>62
<211>324
<212>DNA
<213>人
<400>62
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc     60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa    120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca    180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag    240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgta cacttttggc    300
caggggacca agctggagat caaa                                           324
<210>63
<211>327
<212>DNA
<213>人
<400>63
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc     60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcacctact tagcctggta ccagcagaaa    120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca    180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag    240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcc gatcaccttc    300
ggccaaggga cacgactgga gattaaa                                        327
<210>64
<211>321
<212>DNA
<213>人
<400>64
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc     60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca    120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca    180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct    240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctcggac gttcggccaa    300
gggaccaagg tggaaatcaa a                                              321
<210>65
<211>321
<212>DNA
<213>人
<400>65
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc     60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa    120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca    180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag    240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggtc actcgctcac tttcggcgga    300
gggaccaagg tggagatcaa a                                              321
<210>66
<211>100
<212>PRT
<213>人
<400>66
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala His Arg
            100
<210>67
<211>100
<212>PRT
<213>人
<400>67
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala Leu Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Ile
            100
<210>68
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>68
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg
<210>69
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>70
<211>95
<212>PRT
<213>人
<400>70
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser
                85                  90                  95
<210>71
<211>95
<212>PRT
<213>人
<400>71
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro
                85                  90                  95
<210>72
<211>95
<212>PRT
<213>人
<400>72
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro
                85                  90                  95
<210>73
<211>289
<212>PRT
<213>人
<400>73
Met Lys Thr Leu Pro Ala Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp Val
1               5                   10                  15
Phe Phe Leu Ile Pro Tyr Leu Asp Ile Trp Asn Ile His Gly Lys Glu
            20                  25                  30
Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile
        35                  40                  45
Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala
    50                  55                  60
Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val
65                  70                  75                  80
Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn Ile Ser
                85                  90                  95
Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser
            100                 105                 110
Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser
        115                 120                 125
Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser
    130                 135                 140
Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Ser Leu Leu Pro
145                 150                 155                 160
Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys Leu Phe Cys
                165                 170                 175
Cys Leu Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala
            180                 185                 190
Gly Arg Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr
        195                 200                 205
Glu Ala Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr Gly
    210                 215                 220
Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser
225                 230                 235                 240
Glu Val Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val
                245                 250                 255
Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Pro Asn Ser Arg Leu Ala
            260                 265                 270
Arg Asn Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg
        275                 280                 285
Ser
<210>74
<211>127
<212>PRT
<213>人
<400>74
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Trp Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Arg Ile Thr Met Val Arg Gly Val Ile Thr Gln Tyr Tyr
            100                 105                 110
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>75
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>75
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Gly Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>76
<211>109
<212>PRT
<213>人
<400>76
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ile
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>77
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>77
Ser Tyr Asp Met His
1               5
<210>78
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>78
Ala Ile Trp Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>79
<211>18
<212>PRT
<213>人
<400>79
Asp Arg Ile Thr Met Val Arg Gly Val Ile Thr Gln Tyr Tyr Gly Met
1               5                   10                  15
Asp Val
<210>80
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>80
Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>81
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>81
Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser
1               5
<210>82
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>82
Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Tyr Thr
1               5
<210>83
<211>381
<212>DNA
<213>人
<400>83
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc     60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatgaca tgcactgggt ccgccaggct    120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagct atatggaatg atggaagtaa taaatactat    180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaccgt    300
attactatgg ttcggggagt tattacccaa tactacggta tggacgtctg gggccaaggg    360
accacggtca ccgtctcctc a                                              381
<210>84
<211>321
<212>DNA
<213>人
<400>84
gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc     60
atcacttgcc gggtgagtca gggcattagc agttatttaa attggtatcg gcagaaacca    120
gggaaagttc ctaagctcct gatctatagt gcatccaatt tgcaatctgg agtcccatct    180
cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ctatcagcag cctgcagcct    240
gaagatgttg caacttatta cggtcaacgg acttacaatg ccccgtacac ttttggccag    300
gggaccaagc tggagatcaa a                                              321
<210>85
<211>128
<212>PRT
<213>人
<400>85
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Val Gly Val Ala Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Ser Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala His Thr Arg Ile Ala Glu Val Arg Gly Val Ile Tyr Tyr Tyr
            100                 105                 110
Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>86
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>86
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr
            20                  25                  30
Tyr Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>87
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>87
Thr Ser Gly Val Gly Val Ala
1               5
<210>88
<211>16
<212>PRT
<213>人
<400>88
Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>89
<211>18
<212>PRT
<213>人
<400>89
Thr Arg Ile Ala Glu Val Arg Gly Val Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Ile
1               5                   10                  15
Asp Val
<210>90
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>90
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr Tyr Leu Val
1               5                   10
<210>91
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>91
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>92
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>92
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Trp Thr
1               5
<210>93
<211>384
<212>DNA
<213>人
<400>93
cagatcacct tgaaggagtc tggtcctacg ctggtgaagc ccacacagac cctcacgctg     60
acctgcacct tctctgggtt ctcactcagc actagtggag tgggtgtggc ctggatccgt    120
cagcccccag gaaaggccct ggagtggctt gcactcattt attgggatga tgataagcgc    180
tacagcccat ctctgaagag caggctcacc atcaccaagg acacctccaa aaaccaggtg    240
gtccttacaa tgagcaacat ggaccctgtg gacacagcca catattactg tgcgcacacc    300
cgcattgctg aggttcgggg agttatatac tactactacg gtatagacgt ctggggccaa    360
gggaccacgg tcaccgtctc ctca                                           384
<210>94
<211>321
<212>DNA
<213>人
<400>94
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc     60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcacctact tagtctggta ccagcagaaa    120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca    180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag    240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcgtggac gttcggccaa    300
gggaccaagg tggaaatcaa a                                              321
<210>95
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>95
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ile Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>96
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>96
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>97
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>97
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>98
<211>327
<212>DNA
<213>人
<400>98
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc     60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcatctact tagcctggta ccagcagaaa    120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca    180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag    240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcc gatcaccttc    300
ggccaaggga cacgactgga gattaaa    327
<210>99
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>99
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>100
<211>95
<212>PRT
<213>人
<400>100
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1                5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Gly Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro
                85                  90                  95

Claims (87)

1.分离的人类单克隆抗体、或该抗体的抗原结合部分，其中该抗体结合BTLA，并且其中该抗体表现出以下特性的至少一种：
(a)以1×10-7M或更小的KD与人类BTLA相结合；
(b)抑制HVEM与BTLA的结合；或
(c)基本上不与人类TrkB、CD28、CTLA-4、PD-1或ICOS相结合。
2.如权利要求1所述的抗体，该抗体是IgG1或IgG4同种型的全长抗体。
3.如权利要求1所述的抗体，该抗体是抗体片段或单链抗体。
4.如权利要求1所述的抗体，其中该抗体以5×10-8M或更小的KD与人类BTLA相结合。
5.如权利要求1所述的抗体，其中该抗体以1×10-8M或更小的KD与人类BTLA相结合。
6.如权利要求1所述的抗体，其中该抗体以5×10-9M或更小的KD与人类BTLA相结合。
7.如权利要求1所述的抗体，其中该抗体以1×10-8M至1×10-10M之间的KD与人类BTLA相结合。
8.分离的人单克隆抗体、或该抗体的抗原结合部分，其中该抗体与参照抗体交叉竞争结合BTLA，该参照抗体包含：
(a)人类重链可变区，其包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、74、以及85的氨基酸序列；以及
(b)人类轻链可变区，其包含选自SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、75、76、以及86的氨基酸序列。
9.如权利要求8所述的抗体，其中所述人类重链可变区包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列，并且所述人类轻链可变区包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
10.如权利要求8所述的抗体，其中所述人类重链可变区包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列，并且所述人类轻链可变区包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
11.如权利要求8所述的抗体，其中所述人类重链可变区包含SEQ IDNO：3的氨基酸序列，并且所述人类轻链可变区包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
12.如权利要求8所述的抗体，其中所述人类重链可变区包含SEQ IDNO：3的氨基酸序列，并且所述人类轻链可变区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
13.如权利要求8所述的抗体，其中所述人类重链可变区包含SEQ IDNO：4的氨基酸序列，并且所述人类轻链可变区包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
14.如权利要求8所述的抗体，其中所述人类重链可变区包含SEQ IDNO：5的氨基酸序列，并且所述人类轻链可变区包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
15.如权利要求8所述的抗体，其中所述人类重链可变区包含SEQ IDNO：6的氨基酸序列，并且所述人类轻链可变区包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。
16.如权利要求8所述的抗体，其中所述人类重链可变区包含SEQ IDNO：74的氨基酸序列，并且所述人类轻链可变区包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列。
17.如权利要求8所述的抗体，其中所述人类重链可变区包含SEQ IDNO：74的氨基酸序列，并且所述人类轻链可变区包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列。
18.如权利要求8所述的抗体，其中所述人类重链可变区包含SEQ IDNO：85的氨基酸序列，并且所述人类轻链可变区包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列。
19.分离的单克隆抗体、或该抗体的抗原结合部分，其包含重链可变区，该重链可变区是人类VH 2-05基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异结合BTLA。
20.分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其包含重链可变区，该重链可变区是人类VH 2-70基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异结合BTLA。
21.分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其包含重链可变区，该重链可变区是人类VH 4-59基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异结合BTLA。
22.分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其包含重链可变区，该重链可变区是人类VH 3-20基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异结合BTLA。
23.分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其包含重链可变区，该重链可变区是人类VH 3-33基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异结合BTLA。
24.分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其包含轻链可变区，该轻链可变区是人类VK A27基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异结合BTLA。
25.分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其包含轻链可变区，该轻链可变区是人类VK L18基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异结合BTLA。
26.分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其包含轻链可变区，该轻链可变区是人类VK L15基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异结合BTLA。
27.分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其包含轻链可变区，该轻链可变区是人类VK 04基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异结合BTLA。
28.分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其包含：
(a)人类VH 2-05基因的重链可变区；以及
(b)人类VK A27基因的轻链可变区；
其中该抗体特异结合BTLA。
29.分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其包含：
(a)人类VH 2-70基因的重链可变区；以及
(b)人类VK A27基因的轻链可变区；
其中该抗体特异结合BTLA。
30.分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其包含：
(a)人类VH 4-59基因的重链可变区；以及
(b)人类VK L18基因的轻链可变区；
其中该抗体特异结合BTLA。
31.分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其包含：
(a)人类VH 4-59基因的重链可变区；以及
(b)人类VK A27基因的轻链可变区；
其中该抗体特异结合BTLA。
32.分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其包含：
(a)人类VH 3-20基因的重链可变区；以及
(b)人类VK L15基因的轻链可变区；
其中该抗体特异结合BTLA。
33.分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其包含：
(a)人类VH 3-33基因的重链可变区；以及
(b)人类VK 04基因的轻链可变区；
其中该抗体特异结合BTLA。
34.分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其包含：
(a)人类VH 3-33基因的重链可变区；以及
(b)人类VK A27基因的轻链可变区；
其中该抗体特异结合BTLA。
35.分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其包含含有CDR1、CDR2、以及CDR3序列的重链可变区；以及含有CDR1、CDR2、以及CDR3序列的轻链可变区，其中：
(a)该重链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、79、以及89的氨基酸序列，及其保守性修饰；
(b)该轻链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO：46、47、48、49、50、51、52、82、92、以及97的氨基酸序列，及其保守性修饰；并且
(c)该抗体特异结合BTLA。
36.如权利要求35所述的抗体，其中该重链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID No：20、21、22、23、24、25、78以及88的氨基酸序列，及其保守性修饰；并且该轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID No：39、40、41、42、43、44、45、81、91、以及96的氨基酸序列，及其保守性修饰。
37.如权利要求36所述的抗体，其中所述重链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID No：14、15、16、17、18、19、77、以及87的氨基酸序列，及其保守性修饰；并且所述轻链可变区CDR1序列包含选自SEQ IDNo：32、33、34、35、36、37、38、80、90、以及95的氨基酸序列，及其保守性修饰。
38.分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其包含重链可变区及轻链可变区，其中：
(a)该重链可变区包含氨基酸序列，该氨基酸序列与选自SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、74、以及85的氨基酸序列具有至少80％的同源性；
(b)该轻链可变区包含氨基酸序列，该氨基酸序列与选自SEQ IDNO：7、8、9、10、11、12、13、75、76、以及86的氨基酸序列具有至少80％的同源性；
(c)该抗体以1×10-7M或更小的KD与人类BTLA相结合；并且
(d)该抗体基本上不与人类TrkB、CD28、CTLA-4、PD-1或ICOS相结合。
39.如权利要求38所述的抗体，其中该抗体阻断HVEM与BTLA的结合。
40.分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含选自SEQ ID NO：14、15、16、17、18、19、77、以及87的氨基酸序列；
(b)重链可变区CDR2，其包含选自SEQ ID NO：20、21、22、23、24、25、78、以及88的氨基酸序列；
(c)重链可变区CDR3，其包含选自SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、79、以及89的氨基酸序列；
(d)轻链可变区CDR1，其包含选自SEQ ID NO：32、33、34、35、36、37、38、80、90、以及95的氨基酸序列；
(e)轻链可变区CDR2，其包含选自SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、81、91、以及96的氨基酸序列；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包含选自SEQ ID NO：46、47、48、49、50、51、52、82、92、以及97的氨基酸序列；
其中该抗体特异结合BTLA。
41.如权利要求40所述的抗体，该抗体包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：14；
(b)重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：20；
(c)重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：26；
(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：32；
(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：39；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：46。
42.如权利要求40所述的抗体，该抗体包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：15；
(b)重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：21；
(c)重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：27；
(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：33；
(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：40；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：47。
43.如权利要求40所述的抗体，该抗体包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：16；
(b)重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：22；
(c)重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：28；
(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：34；
(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：41；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：48。
44.如权利要求40所述的抗体，该抗体包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：17；
(b)重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：23；
(c)重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：29；
(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：36；
(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：43；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：50。
45.如权利要求40所述的抗体，该抗体包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：18；
(b)重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：24；
(c)重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：30；
(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：37；
(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：44；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：51。
46.如权利要求40所述的抗体，该抗体包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：19；
(b)重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：25；
(c)重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：31；
(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：38；
(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：45；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：52。
47.如权利要求40所述的抗体，该抗体包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：77；
(b)重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：78；
(c)重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：79；
(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：80；
(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：81；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：82。
48.如权利要求40所述的抗体，该抗体包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：77；
(b)重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：78；
(c)重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：79；
(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：95；
(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：96；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：97。
49.如权利要求40所述的抗体，该抗体包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：87；
(b)重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：88；
(c)重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：89；
(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：90；
(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：91；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：92。
50.分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其包含：
(a)重链可变区，包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、74、以及85的氨基酸序列；以及
(b)轻链可变区，包含选自SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、75、76、以及86的氨基酸序列；
其中该抗体特异结合BTLA。
51.如权利要求50所述的抗体，该抗体包含：
(a)重链可变区，包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；以及
(b)轻链可变区，包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
52.如权利要求50所述的抗体，该抗体包含：
(a)重链可变区，包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；以及
(b)轻链可变区，包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
53.如权利要求50所述的抗体，该抗体包含：
(a)重链可变区，包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；以及
(b)轻链可变区，包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
54.如权利要求50所述的抗体，该抗体包含：
(a)重链可变区，包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；以及
(b)轻链可变区，包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
55.如权利要求50所述的抗体，该抗体包含：
(a)重链可变区，包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；以及
(b)轻链可变区，包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
56.如权利要求50所述的抗体，该抗体包含：
(a)重链可变区，包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；以及
(b)轻链可变区，包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
57.如权利要求50所述的抗体，该抗体包含：
(a)重链可变区，包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；以及
(b)轻链可变区，包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。
58.如权利要求50所述的抗体，该抗体包含：
(a)重链可变区，包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列；以及
(b)轻链可变区，包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列。
59.如权利要求50所述的抗体，该抗体包含：
(a)重链可变区，包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列；以及
(b)轻链可变区，包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列。
60.如权利要求50所述的抗体，该抗体包含：
(a)重链可变区，包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列；以及
(b)轻链可变区，包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列。
61.组合物，其包含如权利要求1至60的任何一项所述的抗体，或其抗原结合部分、以及药学上可接受的载体。
62.免疫缀合物，其包含连接到治疗剂的如权利要求1至60的任何一项所述的抗体，或其抗原结合部分。
63.组合物，其包含如权利要求62所述的免疫缀合物以及药学上可接受的载体。
64.如权利要求62所述的免疫缀合物，其中所述治疗剂是细胞毒素。
65.组合物，其包含如权利要求64所述的免疫缀合物以及药学上可接受的载体。
66.如权利要求62所述的免疫缀合物，其中所述治疗剂是放射性同位素。
67.组合物，其包含如权利要求64所述的免疫缀合物以及药学上可接受的载体。
68.双特异性分子，其包含如权利要求1至60任何一项所述的抗体、或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分连接到第二功能部分，该第二功能部分具有不同于所述抗体、或其抗原结合部分的结合特异性。
69.组合物，其包含如权利要求68所述的双特异性分子，以及药学上可接受的载体。
70.分离的核酸分子，其编码如权利要求1至60任何一项所述的抗体、或其抗原结合部分。
71.表达载体，其包含如权利要求70所述的核酸分子。
72.宿主细胞，其包含如权利要求71所述的表达载体。
73.转基因小鼠，其包含人类免疫球蛋白的重链及轻链转基因，其中该小鼠表达如权利要求1至60任何一项所述的抗体。
74.从权利要求73所述的小鼠制备的杂交瘤，其中该杂交瘤产生所述抗体。
75.调节受试者中免疫应答的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求1至60任何一项所述的抗体、或其抗原结合部分，使得该受试者体内的免疫应答得以调节。
76.抑制受试者体内肿瘤细胞生长的方法，该方法包括对该受试者施用治疗有效量的抗-BTLA抗体、或其抗原结合部分。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述抗体是嵌合抗体。
78.如权利要求76所述的方法，其中所述抗体是人源化抗体。
79.如权利要求76所述的方法，其中所述抗体是全长人类抗体。
80.如权利要求76所述的方法，其中所述肿瘤细胞是癌症的细胞，所述癌症选自黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、乳癌、结肠癌以及肺癌。
81.如权利要求76所述的方法，其中所述肿瘤细胞是癌症的细胞，该癌症选自以下列表，其构成为：骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、表皮或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区的癌症、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病，儿童期的实体瘤、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱轴瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状上皮细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌，包括那些由石棉诱发的癌症，以及所述癌症的组合。
82.抑制受试者体内肿瘤细胞生长的方法，该方法包括对受试者施用有效抑制肿瘤细胞的生长量的如权利要求1至60任何一项所述的抗体、或其抗原结合部分。
83.治疗受试者中感染性疾病的方法，该方法包括对该受试者施用如权利要求1至60任何一项所述的抗体、或其抗原结合部分，使得该受试者的感染性疾病得到治疗。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述感染性疾病选自以下列表，其组成为：HIV、流行性感冒、疱疹、贾弟虫、疟疾、利什曼原虫；由以下病毒：(甲、乙、以及丙型)肝炎病毒、疱疹病毒(如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、以及CMV、EB病毒)、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、JC病毒以及虫媒脑炎病毒所引起的病原性感染；由以下细菌：衣原体、立克次体细菌、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌以及淋球菌、克雷伯氏菌、变形菌、沙雷氏菌、假单胞菌、军团杆菌、白喉杆菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、霍乱、破伤风、肉毒杆菌、炭疽、鼠疫、钩端螺旋体病及莱姆氏病细菌所引起的病原性感染；由以下真菌：假丝酵母属(白假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、光滑假丝酵母、热带假丝酵母等)、新型隐球酵母、曲霉属(烟曲霉、黑曲霉等)、毛霉菌目的属(毛霉属、犁头霉属、根霉属)、申克氏孢子丝菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌、以及夹膜组织胞浆菌所引起的病原性感染；以及由以下寄生虫：溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠肠袋虫(Balantidium coli)、福氏耐格里原虫(Naegleria fowleri)、棘阿米巴属的种(Acanthamoeba sp.)、兰伯贾弟虫(Giardia lamblia)、隐孢子虫属的种(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、果氏巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、鼠弓形体(Toxoplasma gondi)、巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)所引起的病原性感染。
85.增强受试者体内针对抗原的免疫应答的方法，其包括对该受试者施用：(i)该抗原；以及(ii)如权利要求1至60任何一项所述的抗体、或其抗原结合部分，使得在该受试者体内针对该抗原的免疫应答得到增强。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。
87.制备抗-BTLA抗体的方法，该方法包括：
提供：(i)重链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO：14、15、16、17、18、19、77、以及87的CDR1序列，选自SEQ ID NO：20、21、22、23、24、25、78、以及88的CDR2序列，以及选自SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、79、以及89的CDR3序列；或(ii)轻链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO：32、33、34、35、36、37、38、80、90、以及95的CDR1序列，选自SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、81、91、以及96的CDR2序列，以及选自SEQ ID NO：46、47、48、49、50、51、52、82、92、以及97的CDR3序列；
在至少一个可变区抗体序列内改变至少一个氨基酸残基，所述序列选自该重链可变区抗体序列以及该轻链可变区抗体序列，以产生至少一个被改变的抗体序列；并且
将该被改变的抗体序列表达为蛋白质。
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