CN101576523A - 利用微电极阵列阻抗生物传感器芯片检测肿瘤细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用微电极阵列阻抗生物传感器芯片检测肿瘤细胞的方法，利用纳米免疫磁微球富集分离技术俘获痰液或血液样品中的肿瘤细胞，形成磁微球－肿瘤细胞生物磁性组合体，借助外加磁铁产生磁力，将磁微球－肿瘤细胞生物磁性组合体在瞬间吸附于微电极阵列阻抗生物传感器芯片表面上，引起微传感电极的阻抗特性发生变化的原理，通过阻抗分析仪对微传感电极的阻抗特性进行并行扫描式测试，确定是否存在肿瘤细胞。本发明提供了一种无损、快速、简便的肿瘤细胞检测方法，适用于肿瘤早期诊断和治疗，也可对临床肿瘤患者的癌细胞转移复发进行诊断与监测，对重大疾病进行预测普查，同时可用于食品检测、药物筛选等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用微电极阵列阻抗生物传感器芯片检测肿瘤细胞的方法。可用于食品检测、药物筛选、疾病诊断和治疗等领域。属于生物医学工程与电子传感技术交叉学科领域。
背景技术
一般来讲肺癌诊断的方法主要有病理学、影像学、免疫学、分子生物学。所检测的标本有痰液、肿块、胸水和血液等。就目前我国医院影像学检测水平来讲，普遍认为一旦发现肺癌肿块，大多数情况下肿块已≥1cm，患者的病程已不在早期。在上述各项细胞学检查中，尤以血液、痰液细胞检查的应用最为普遍，痰液癌细胞检测有助于提高早期病例的检出率；血液癌细胞检测主要解决临床肺癌患者转移复发预测、预后判断、特异性抗复发治疗问题。而目前，痰液癌细胞检查最终是依赖于光学技术，靠显微镜观测判断分析；血液检测标本最终是通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)进行基因定量分析。还有一种基于压电石英晶体和PZT压电材料的电子传感技术的探测方法，检测生物大分子需要在传感器表面进行免疫反应，从而将生物大分子的质量转化成相应的电子信息。由于需要在传感器的表面进行免疫反应，难以将血液和痰液复杂体系中的数个癌细胞从成千上万个其它细胞中分离并积聚到传感器的表面，灵敏度和检测率非常低。
纳米免疫磁珠是均匀、球形、具有超顺磁性及保护壳的纳米颗粒，磁珠既能结合活性蛋白质(抗体)形成抗原-抗体-免疫磁珠生物磁性组合体，又能被磁铁所吸引。借助外界磁力作用，这种生物磁性组合体能够与其它物质分离，达到有效分离特异性细胞成分的目的。纳米磁珠的体积很小，既不会损伤细胞又不会影响细胞功能且可被生物降解，可立即用于分析和随后的实验。对于存在肿瘤细胞稀少等问题的复杂体系(血液或痰液)来说，纳米免疫磁珠技术是一种有效的富集分离技术，为肿瘤的早期诊断提供了一种新的技术思路。
中国发明专利ZL2005100262113提出了一种“利用生物磁控压电传感芯片探针探测癌细胞的方法”，其中所述生物磁控压电传感芯片探针为锆钛酸铅压电薄膜材料的悬臂梁式传感器芯片，通过磁球-癌细胞的生物磁性组合体吸附到压电传感芯片表面上，将待测癌细胞的质量和数量转换成相应的电子信息，用以探测癌细胞存在与否。该发明中的传感芯片采用悬臂梁式结构，制作工艺复杂，加工质量很难保证，且检测信息需要转换成电子信息才能检测，需要进行繁杂的数据采集和处理工作。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提出一种利用微电极阵列阻抗生物传感器芯片检测肿瘤细胞的方法，可用于对血液或痰液样品中的肿瘤细胞进行快速准确的检测，有效提高癌症早期患者的阳性检出率，且操作简单方便、成本较低。
为实现上述目的，本发明利用纳米免疫磁微球富集分离技术俘获痰液或血液样品中的肿瘤细胞，形成磁微球-肿瘤细胞生物磁性组合体，借助外加磁铁产生磁力，将磁微球-肿瘤细胞生物磁性组合体在瞬间吸附于微电极阵列阻抗生物传感器芯片表面上，引起微传感电极的阻抗特性发生变化的原理，通过阻抗分析仪对微传感电极的阻抗特性进行并行扫描式测试，确定是否存在肿瘤细胞。
本发明利用微电极阵列阻抗生物传感器芯片检测肿瘤细胞的方法，包括如下具体步骤：
1、采用由4个微电极阵列检测单元构成的微电极阵列阻抗生物传感器芯片，每个微电极阵列检测单元包括支撑层、基底层、微传感电极层、绝缘层和储液池五层结构；所述微传感电极层有16～100个通道的微传感电极，每个微传感电极的尺寸范围为10μm～50μm，微传感电极间距为10μm～30μm。
2、提取1-5毫升的痰液或血液样品，加入到微电极阵列阻抗生物传感器芯片储液池中，经液化处理后，再提取1-5ulA型特异性蛋白质抗原加入到微电极阵列阻抗生物传感器芯片储液池中，使储液池中痰液或血液样品中的肿瘤细胞被A型特异性蛋白质抗原所修复，形成A型特异性蛋白质抗原-肿瘤细胞生物组合体。
3、将一种B型特异性蛋白质抗体修复到Fe3O4磁性微球上，经3-10分钟免疫反应，形成抗体-磁微球，再将这种抗体磁微球1-5ul加入到微电极阵列阻抗生物传感器芯片储液池中，使抗体-磁微球俘获储液池中的A型特异性蛋白质抗原-肿瘤细胞生物组合体，并在25-30℃进行免疫反应，反应时间2-6分钟，反应后形成磁微球-肿瘤细胞生物磁性组合体。
4、在微电极阵列阻抗生物传感器芯片支撑层下方通过施加磁铁产生磁力，使磁微球-肿瘤细胞生物磁性组合体全部吸附到微电极阵列阻抗生物传感器芯片表面上；借助微型三电极体系，以微传感电极为工作电极，以微型铂电极为对电极，以微型Ag/AgCl电极为参考电极，通过阻抗分析仪对微传感电极的阻抗特性进行并行扫描式测试，探测确定是否存在肿瘤细胞。
本发明中，所述微电极阵列阻抗生物传感器芯片选用生物相容性较好的聚合物材料(如聚对二甲苯或聚酰亚胺)作为基底层和绝缘层材料，选用惰性贵金属(金、银、铂、铱等)作为微传感电极材料，选用SU-8光刻胶作为储液池材料，选用单晶硅作为支撑层材料。
所述微电极阵列阻抗生物传感器芯片中的基底层厚度为5～20μm。
所述微电极阵列阻抗生物传感器芯片中的微传感电极层厚度为0.4～1μm。
所述微电极阵列阻抗生物传感器芯片中的绝缘层厚度为2～4μm。
所述微电极阵列阻抗生物传感器芯片中的储液池高度为50～500μm，储液池底部尺寸为250μm×250μm～850×250μm，厚度为50～200μm。
本发明可对多通道微传感电极进行快速扫描式阻抗测试，且多个微电极阵列检测单元可对不同的痰液或血液样品同时进行检测，能够将数量稀少的肿瘤细胞检测出来，实现准确快速检测痰液或血液样品中是否存在肿瘤细胞，极大地降低了漏检的可能。本发明方法对肿瘤细胞存在较高的灵敏度，在对肿瘤细胞进行快速检测时，无需将肿瘤细胞固定在传感器表面，为肿瘤细胞检测提供了一种无损、快速、简便的检测方法，适用于肿瘤早期诊断和治疗，也可对临床肿瘤患者的癌细胞转移复发进行诊断与监测，对重大疾病进行预测普查，同时可用于食品检测、药物筛选等领域。
附图说明
图1为本发明利用微电极阵列阻抗生物传感器芯片检测肿瘤细胞的工作原理图。
图1中，1为支撑层；2为基底层；3为微传感电极层；4为绝缘层；5为储液池；6为引线；7为引线焊点；8为微型铂电极；9为微型Ag/AgCl参比电极；10为阻抗分析仪；11为磁珠-肿瘤细胞的生物磁性组合体。
图2为本发明中所述微电极阵列阻抗生物传感器芯片的结构示意图。
图2中，1为支撑层；2为基底层；3为微传感电极层；4为绝缘层；5为储液池；7为引线焊点。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案作详细描述。
本发明提出的一种利用微电极阵列阻抗生物传感器芯片检测肿瘤细胞的方法，其基本的工作原理如图1所示。对于一个基于阻抗特性的传感器，在正常条件下其电容、电感和电阻特性的组合会产生一个特定的阻抗信号。如果传感器周围环境的变化引起上述特性的任何变化，都会造成阻抗的改变。通过测量这种阻抗传感器随频率变化的特性，将会得到一系列新的阻抗特性。本发明采用了一种微电极阵列阻抗生物传感器芯片，其结构如图2所示。该传感器芯片由4个微电极阵列检测单元构成，每个微电极阵列检测单元包括支撑层1、基底层2、微传感电极层3、绝缘层4和储液池5五层结构。所述微传感电极层由16～100个通道的微传感电极，每个微传感电极的尺寸范围为10μm～50μm，电极间距为10μm～30μm。
本发明所述方法在用于肿瘤细胞检测过程中，还包括微传感电极的引线6、用于电连接的引线焊点7、微型铂电极8、微型Ag/AgCl参比电极9、阻抗分析仪10和磁珠-肿瘤细胞的生物磁性组合体11。
以下三个实施例详细给出了利用微电极阵列阻抗生物传感器芯片检测肿瘤细胞的方法的具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
1)采用由4个微电极阵列检测单元构成的微电极阵列阻抗生物传感器芯片，每个微电极阵列检测单元包括支撑层、基底层、微传感电极层、绝缘层和储液池五层结构；所述微传感电极层有16个通道的微传感电极，每个微传感电极的尺寸范围为10μm，微传感电极间距为10μm；
2)提取1毫升的痰液或血液样品，加入到微电极阵列阻抗生物传感器芯片储液池中，经液化处理后，再提取1ul A型特异性蛋白质抗原加入到微电极阵列阻抗生物传感器芯片储液池中，使储液池中痰液或血液样品中的肿瘤细胞被A型特异性蛋白质抗原所修复，形成A型特异性蛋白质抗原-肿瘤细胞生物组合体；
3)将一种B型特异性蛋白质抗体修复到Fe3O4磁性微球上，经8分钟免疫反应，形成抗体-磁微球，再将这种抗体磁微球1ul加入到微电极阵列阻抗生物传感器芯片储液池中，使抗体-磁微球俘获储液池中的A型特异性蛋白质抗原-肿瘤细胞生物组合体，并在28℃进行免疫反应，反应时间4分钟，反应后形成磁微球-肿瘤细胞生物磁性组合体；
4)在微电极阵列阻抗生物传感器芯片支撑层下方通过施加磁铁产生磁力，使磁微球-肿瘤细胞生物磁性组合体全部吸附到微电极阵列阻抗生物传感器芯片表面上；借助微型三电极体系，以微传感电极为工作电极，以微型铂电极为对电极，以微型Ag/AgCl电极为参考电极，通过阻抗分析仪对微传感电极的阻抗特性进行并行扫描式测试，探测确定是否存在肿瘤细胞。如微传感电极的阻抗较检测前有所增加，说明痰液或血液样品中可能存在肿瘤细胞。
本发明中所述微电极阵列阻抗生物传感器芯片可按如下具体工艺制作：
1、选取单晶硅为支撑层，在其上方沉积或旋涂一层具有生物相容性的聚合物薄膜作为基底层，厚度控制在5μm～20μm；
2、在基底层上方，采用光刻、溅射或蒸发和剥离(Lift-off)工艺制作图形化的微传感电极层，同时制作电极引线层和引线焊点层；制作微传感电极层的金属包括金、银、铂、铱等惰性贵金属；微传感电极层厚度控制在0.4μm～1μm；
3、在微传感电极层上方，再沉积或旋涂具有生物相容性的聚合物薄膜作为绝缘层，厚度控制在2μm～4μm；
4、通过反应离子刻蚀(RIE)、激光剥蚀或光刻工艺，将微传感电极层和引线焊点层上方的绝缘层去除，从而暴露出“导电窗口”；
5、选用SU-8光刻胶，在绝缘层上方，通过光刻、曝光、显影工艺，在每一个微电极阵列检测单元上方制作一个储液池，储液池高度控制在50～500μm，储液池底部尺寸为250μm×250μm～850×250μm，厚度控制在50～200μm，从而完成芯片的制作过程。
实施例2
1)采用由4个微电极阵列检测单元构成的微电极阵列阻抗生物传感器芯片，每个微电极阵列检测单元包括支撑层、基底层、微传感电极层、绝缘层和储液池五层结构；所述微传感电极层有36个通道的微传感电极，每个微传感电极的尺寸范围为30μm，微传感电极间距为20μm；
2)提取3毫升的痰液或血液样品，加入到微电极阵列阻抗生物传感器芯片储液池中，经液化处理后，再提取3ul A型特异性蛋白质抗原加入到微电极阵列阻抗生物传感器芯片储液池中，使储液池中痰液或血液样品中的肿瘤细胞被A型特异性蛋白质抗原所修复，形成A型特异性蛋白质抗原-肿瘤细胞生物组合体；
3)将一种B型特异性蛋白质抗体修复到Fe3O4磁性微球上，经10分钟免疫反应，形成抗体-磁微球，再将这种抗体磁微球3ul加入到微电极阵列阻抗生物传感器芯片储液池中，使抗体-磁微球俘获储液池中的A型特异性蛋白质抗原-肿瘤细胞生物组合体，并在25℃进行免疫反应，反应时间6分钟，反应后形成磁微球-肿瘤细胞生物磁性组合体；
4)在微电极阵列阻抗生物传感器芯片支撑层下方通过施加磁铁产生磁力，使磁微球-肿瘤细胞生物磁性组合体全部吸附到微电极阵列阻抗生物传感器芯片表面上；借助微型三电极体系，以微传感电极为工作电极，以微型铂电极为对电极，以微型Ag/gCl电极为参考电极，通过阻抗分析仪对微传感电极的阻抗特性进行并行扫描式测试。如微传感电极的阻抗较检测前有所增加，说明痰液或血液样品中可能存在肿瘤细胞。
实施例3
1)采用由4个微电极阵列检测单元构成的微电极阵列阻抗生物传感器芯片，每个微电极阵列检测单元包括支撑层、基底层、微传感电极层、绝缘层和储液池五层结构；所述微传感电极层有100个通道的微传感电极，每个微传感电极的尺寸范围为50μm，微传感电极间距为30μm；
2)提取5毫升的痰液或血液样品，加入到微电极阵列阻抗生物传感器芯片储液池中，经液化处理后，再提取5ul A型特异性蛋白质抗原加入到微电极阵列阻抗生物传感器芯片储液池中，使储液池中痰液或血液样品中的肿瘤细胞被A型特异性蛋白质抗原所修复，形成A型特异性蛋白质抗原-肿瘤细胞生物组合体；
3)将一种B型特异性蛋白质抗体修复到Fe3O4磁性微球上，经3分钟免疫反应，形成抗体-磁微球，再将这种抗体磁微球5ul加入到微电极阵列阻抗生物传感器芯片储液池中，使抗体-磁微球俘获储液池中的A型特异性蛋白质抗原-肿瘤细胞生物组合体，并在30℃进行免疫反应，反应时间2分钟，反应后形成磁微球-肿瘤细胞生物磁性组合体；
4)在微电极阵列阻抗生物传感器芯片支撑层下方通过施加磁铁产生磁力，使磁微球-肿瘤细胞生物磁性组合体全部吸附到微电极阵列阻抗生物传感器芯片表面上；借助微型三电极体系，以微传感电极为工作电极，以微型铂电极为对电极，以微型Ag/AgCl电极为参考电极，通过阻抗分析仪对微传感电极的阻抗特性进行并行扫描式测试。如微传感电极的阻抗较检测前有所增加，说明痰液或血液样品中可能存在肿瘤细胞。
Claims (6)
1、一种利用微电极阵列阻抗生物传感器芯片检测肿瘤细胞的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)采用由4个微电极阵列检测单元构成的微电极阵列阻抗生物传感器芯片，每个微电极阵列检测单元包括支撑层、基底层、微传感电极层、绝缘层和储液池五层结构；所述微传感电极层有1～100个通道的微传感电极，每个微传感电极的尺寸范围为10μm～50μm，微传感电极间距为10μm～30μm；
2)提取1-5毫升的痰液或血液样品，加入到微电极阵列阻抗生物传感器芯片储液池中，经液化处理后，再提取1-5ul A型特异性蛋白质抗原加入到微电极阵列阻抗生物传感器芯片储液池中，使储液池中痰液或血液样品中的肿瘤细胞被A型特异性蛋白质抗原所修复，形成A型特异性蛋白质抗原-肿瘤细胞生物组合体；
3)将一种B型特异性蛋白质抗体修复到Fe3O4磁性微球上，经3-10分钟免疫反应，形成抗体-磁微球，再将这种抗体磁微球1-5ul加入到微电极阵列阻抗生物传感器芯片储液池中，使抗体-磁微球俘获储液池中的A型特异性蛋白质抗原-肿瘤细胞生物组合体，并在25-30℃进行免疫反应，反应时间2-6分钟，反应后形成磁微球-肿瘤细胞生物磁性组合体；
4)在微电极阵列阻抗生物传感器芯片支撑层下方通过施加磁铁产生磁力，使磁微球-肿瘤细胞生物磁性组合体全部吸附到微电极阵列阻抗生物传感器芯片表面上；借助微型三电极体系，以微传感电极为工作电极，以微型铂电极为对电极，以微型Ag/AgCl电极为参考电极，通过阻抗分析仪对微传感电极的阻抗特性进行并行扫描式测试，探测确定是否存在肿瘤细胞。
2、根据权利要求1的利用微电极阵列阻抗生物传感器芯片检测肿瘤细胞的方法，其特征在于所述微电极阵列阻抗生物传感器芯片采用聚对二甲苯或聚酰亚胺作为基底层和绝缘层材料，选用惰性贵金属作为微传感电极材料，选用SU-8光刻胶作为储液池材料，选用单晶硅作为支撑层材料。
3、根据权利要求1的利用微电极阵列阻抗生物传感器芯片检测肿瘤细胞的方法，其特征在于所述微电极阵列阻抗生物传感器芯片中的基底层厚度为5～20μm。
4、根据权利要求1的利用微电极阵列阻抗生物传感器芯片检测肿瘤细胞的方法，其特征在于所述微电极阵列阻抗生物传感器芯片中的微传感电极层厚度为0.4～1μm。
5、根据权利要求1的利用微电极阵列阻抗生物传感器芯片检测肿瘤细胞的方法，其特征在于所述微电极阵列阻抗生物传感器芯片中的绝缘层厚度为2～4μm。
6、根据权利要求1的利用微电极阵列阻抗生物传感器芯片检测肿瘤细胞的方法，其特征在于所述微电极阵列阻抗生物传感器芯片中的储液池高度为50～500μm，储液池底部尺寸为250μm×250μm～850×250μm，厚度为50～200μm。
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