CN101575412A

CN101575412A - 超支化聚氨基酸及其制备方法和应用

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Publication number: CN101575412A
Application number: CNA2009100627021A
Authority: CN
Inventors: 钟振林; 彭琪; 卓仁禧
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2009-06-12
Filing date: 2009-06-12
Publication date: 2009-11-11
Anticipated expiration: 2029-06-12
Also published as: CN101575412B

Abstract

本发明涉及超支化聚氨基酸，其化学组成为：

式中Lys、Arg、His分别为赖氨酸、精氨酸、组氨酸，X为除上述氨基酸之外的任何一种或几种氨基酸，其中0.2≤a≤0.95、0≤b≤0.8、0≤c≤0.8、0≤d≤0.3，且a+b+c+d＝1。其制备方法为：将赖氨酸或赖氨酸盐与所述的超支化聚氨基酸中含有的其它氨基酸或其氨基酸盐混合均匀后，在130～180℃反应2～64小时后得到黄色固体，此粗产品经沉淀法纯化后得到超支化聚氨基酸。本发明得到的超支化聚氨基酸可作为人体或动物细胞基因转导的非病毒基因载体应用。本发明提供的超支化聚氨基酸非病毒基因载体设计合理，制备方法简单，转染效率高、细胞毒性低，且在血清存在下有着良好的转导效率。

Description

超支化聚氨基酸及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及非病毒基因载体，具体是涉及化学组成为超支化聚氨基酸的非病毒基因载体及其制备方法和应用。

背景技术

基因治疗是通过合适的载体将目的基因传递到患者体内特定组织细胞(靶细胞)内进行适当的表达，以纠正或改善该致病基因所产生的缺陷，达到治疗疾病的目的。基因治疗在半个世纪的发展道路上取得了很大进展，也遇到了很多困难。目前，基因治疗要进入实用阶段，还有一些根本问题需要解决。其中，安全、高效的基因载体的构建是最重要的问题之一。一般来说，基因传递系统分为两类，病毒载体系统和非病毒载体系统。非病毒载体主要依靠带正电的聚合物或带正电的脂质体与DNA结合形成一定大小的复合物进行输送。但由于脂质体DNA复合物的结构非常复杂，在体内的复杂环境中转染效率不稳定，因而在实际应用中成功的例子并不多。研究中发现一些阳离子聚合物能与DNA形成纳米级的复合物并帮助DNA转染，如聚赖氨酸(PLL)，聚乙烯亚胺(PEI)，PAMAM树形分子，鱼精蛋白等。这些阳离子聚合物都已经在体外基因传递中广泛应用。其中，树形高分子具有结构规整的特点，分子外围分布着很多可质子化的氨基，使其能够与DNA进行有效的结合。但是制备步骤复杂及制备成本高使树形高分子的应用受到限制。而超支化的聚合物则可通过一步反应由低分子量的原料得到大量产物，其合成步骤相对于树形高分子简单得多。

人们在对源于HIV-1病毒的转录反式激活因子(Tat)蛋白的研究中发现，Tat蛋白之所以能自发地穿越细胞膜是因为其含有由10到16个氨基酸组成的特定序列的肽链，这类肽链被称为细胞穿越肽(cell-penetrating peptide，CPP)。CPP主要由精氨酸，赖氨酸等碱性氨基酸组成，其中精氨酸的作用尤为重要。近年来，很多研究机构开始关注CPP对细胞膜的穿越性能，而且研究表明，很多含精氨酸多的多肽显示了很强的细胞穿透能力。一般认为，精氨酸的带正电的胍基侧基与细胞之间除了静电作用之外，由于具有三角形的几何结构，还能与细胞膜上磷酸酯基形成较强的氢键，从而促进对细胞膜的穿越。

本发明以天然氨基酸为原料，通过简单的热缩聚的方法制备出具有类似细胞穿透肽以及在内体中有高缓冲能力的超支化阳离子聚合物，以得到高效低毒的基因载体。

发明内容

本发明目的是提供一种工艺简单、成本低廉的超支化聚氨基酸及其制备方法和应用。

本发明目的是提供作为基因载体的超支化聚氨基酸。

本发明提供的超支化聚氨基酸非病毒基因载体，其化学组成具有以下通式：

式中Lys、Arg、His分别为赖氨酸、精氨酸、组氨酸，X为除上述氨基酸之外的任何一种或几种氨基酸，a，b，c，d分别为赖氨酸，精氨酸，组氨酸及其他任何一种或多种氨基酸在该聚合物中的摩尔分数(a+b+c+d＝1，0.2≤a≤0.95、0≤b≤0.8、0≤c≤0.8、0≤d≤0.3)。

本发明提供的超支化聚氨基酸非病毒基因载体的制备方法，包括如下步骤：将赖氨酸或赖氨酸盐与上述超支化聚氨基酸的化学组成中含有的其它氨基酸或其氨基酸盐混合均匀后，在130～180℃加热反应混合物进行热缩聚，在该温度下反应2～64小时后得到超支化聚氨基酸；赖氨酸或赖氨酸盐与所述的超支化聚氨基酸的化学组成中含有的任一种其它氨基酸或其氨基酸盐的摩尔比为1∶0～20，其中的1∶0表示所述的超支化聚氨基酸的化学组成中的b、c或d为0时对应的氨基酸或其氨基酸盐原料用量为0。

本发明提供的超支化聚氨基酸，其特征在于在分子量Mw为1.0×10³g/mol～1.0×10⁵g/mol的范围内具有较好的转导效率。

本发明提供的超支化聚氨基酸与外源基因结合作为基因载体的应用：

超支化聚氨基酸作为基因载体，通过合适的转导方法，可把目的基因带入人体细胞和各种动植物细胞，用于人体基因治疗和动植物的基因转导。

(1)超支化聚氨基酸基因载体的人体及动物细胞基因转导：把超支化聚氨基酸与外源基因(DNA或RNA)结合所形成的复合物与人体及动物细胞共培养，复合物可以转导入细胞。结果表明超支化聚氨基酸能有效转导基因，并能在细胞中高效表达。

(2)超支化聚氨基酸基因载体的植物细胞转导：把超支化聚氨基酸与外源基因结合所形成的复合物与植物细胞进行共同培养，超支化聚氨基酸能有效转导植物细胞并实现基因的表达。

本发明的技术效果：

一、本发明制备超支化聚氨基酸，相比其他聚氨基酸制备的方法，反应更简单易行，并能得到带有多种功能基团的超支化聚氨基酸。

二、本发明得到的超支化聚氨基酸中含有大量赖氨酸。赖氨酸上有α-，ε-两个氨基，可以和羧基形成酰胺键而得到超支化的聚氨基酸。赖氨酸单体上的α-和ε-氨基的pKa值分别为9.1和10.5，故富含赖氨酸的聚氨基酸在生理条件下能与带负电的DNA通过静电作用形成紧密的复合物，从而具有高效转导DNA的作用。

三、本发明采用的组氨酸上有一个咪唑基团，pKa值为6.0，能在偏酸性的细胞内体中充当“质子海绵”。本发明采用热聚合方法一步制备的富含组氨酸的超支化聚氨基酸在pH 5～6具有较强的缓冲能力，当携带DNA进入细胞后，可促进复合物从溶酶体中迅速逃逸，从而有效增强转导效率。

四、本发明采用的精氨酸中富含胍基，其pKa值为12.5，是碱性最强的氨基酸。一般认为，精氨酸的带正电的胍基侧基与细胞之间除了静电作用之外，由于具有三角形的几何结构，还能与细胞膜上磷酸酯基形成较强的氢键，从而促进对细胞膜的穿越。本发明中的超支化聚氨基酸富含精氨酸的结构能起到类似细胞穿透肽的作用，显著增强DNA在细胞中的表达。

五、本发明合成的超支化聚氨基酸上有很多氨基剩余，这些氨基的存在，使超支化聚氨基酸与DNA及其他基因药物的复合成为可能。若再键合上其他配体，则可进一步成为多功能的非病毒基因载体。

本发明的优点：①在生理环境中，所提供的超支化聚氨基酸中的氨基和胍基被质子化而带正电，是一种高电荷密度的阳离子聚合物，可和DNA及其他基因药物有效结合成纳米级的复合物。②在聚合物中引入咪唑基，可以提高其在内体的弱酸性环境中的缓冲能力，使复合物能快速从溶酶体中逃逸出去。③聚合物中富含胍基，能促进载体对细胞膜的穿越。⑤与传统基因载体相比，超支化聚氨基酸的DNA装载量大，转导效率高，无免疫原性、细胞毒性低，且具有生物可降解性等优点。⑥本发明所用原材料为各种氨基酸，都是天然的生物材料，无毒性，无副作用，是一种绿色环保型的药物载体和全新的基因载体，使用者易于接受。⑦该发明制备工艺简单，设备要求不高，易于操作，而且材料易得，成本低廉。

附图说明

图1为本发明的超支化聚氨基酸(Lys)_0.85-(Arg)_0.15和(Lys)_0.7-(Arg)_0.3装载荧光素酶质粒DNA在293T细胞中转导的效果图，其结果显示本发明的超支化聚氨基酸(Lys)_0.85-(Arg)_0.15和(Lys)_0.7-(Arg)_0.3能在293T细胞中有效转导该基因。

图2为本发明的超支化聚氨基酸(Lys)_0.85-(Arg)_0.15和(Lys)_0.7-(Arg)_0.3装载荧光素酶质粒DNA在COS 7细胞中转导的效果图，其结果显示本发明的超支化聚氨基酸(Lys)_0.85-(Arg)_0.15和(Lys)_0.7-(Arg)_0.3能在COS 7细胞中有效转导该基因。

图3为本发明的超支化聚氨基酸(Lys)_0.85-(Arg)_0.15和(Lys)_0.7-(Arg)_0.3装载荧光素酶质粒DNA在HeLa细胞中转导的效果图，其结果显示本发明的超支化聚氨基酸(Lys)_0.85-(Arg)_0.15和(Lys)_0.7-(Arg)_0.3能在HeLa细胞中有效转导该基因。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行详细的描述，但不限于实施例所公开的内容。

实施例1：(Lys)_0.9-(Arg)_0.1的合成

将60.0mmolL-赖氨酸(Lys)和60.0mmolL-精氨酸(Arg)在研钵中混匀后，将白色固体混合物移入一个250ml三口烧瓶中，在氩气保护和机械搅拌的条件下，加热反应混合物至160℃反应48小时，得到黄色固体。加入200ml甲醇，超声溶解大部分固体。过滤，向滤液中逐滴加入四氢呋喃，分级沉淀，得到赖氨酸和精氨酸的共聚产物，由元素分析法测得产物中碳原子的含量为44.26％，氮原子的含量为18.81％，氢原子的含量为7.84％，经确定，最终产物为(Lys)_0.9-(Arg)_0. ₁，该产物由凝胶渗透色谱法测得其分子量Mw为1.5×10⁴g/mol。

实施例2：(Lys)_0.8-(Arg)_0.2的合成

把60.0mmol L-赖氨酸盐酸盐和60.0mmol氢氧化钾在研钵中混匀，研磨成浆状，再向其中加入120.0mmol L-精氨酸，混合均匀后，将白色固体混合物移入一个250ml三口烧瓶中，在氩气保护和机械搅拌的条件下，加热反应混合物至160℃反应48小时，得到黄色固体。加入200ml甲醇，超声溶解大部分固体。过滤，向滤液中逐滴加入四氢呋喃，分级沉淀，得到赖氨酸和精氨酸的共聚产物，由元素分析法测得产物中碳原子的含量为45.05％，氮原子的含量为20.10％，氢原子的含量为7.92％，经确定，最终产物为(Lys)_0.8-(Arg)_0.2，该产物由凝胶渗透色谱法测得其分子量Mw为1.1×10⁴g/mol。

实施例3：(Lys)_0.85-(His)_0.15的合成

将60.0mmol L-赖氨酸和50.0mmol L-组氨酸在研钵中混匀后，将白色固体混合物移入一个250ml三口烧瓶中，在氩气保护和机械搅拌的条件下，加热反应混合物至120℃反应64小时，得到黄色固体。加入150ml甲醇，超声溶解大部分固体。过滤，向滤液中逐滴加入四氢呋喃，分级沉淀，得到赖氨酸和组氨酸的共聚产物，由元素分析法测得产物中碳原子的含量为44.73％，氮原子的含量为19.19％，氢原子的含量为7.34％，经确定，最终产物为(Lys)_0.85-(His)_0.15，该产物由凝胶渗透色谱法测得其分子量Mw为9.6×10³g/mol。

实施例4：(Lys)_0.6-(His)_0.4的合成

将60.0mmol L-赖氨酸盐酸盐和60.0mmol氢氧化钾在研钵中混匀，研磨成浆状，再向其中加入150.0mmol L-组氨酸在研钵中混匀后，将白色固体混合物移入一个250ml三口烧瓶中，在氩气保护和机械搅拌的条件下，加热反应混合物至160℃反应48小时，得到黄色固体。加入200ml甲醇，超声溶解大部分固体。过滤，向滤液中逐滴加入四氢呋喃，分级沉淀，得到赖氨酸和组氨酸的共聚产物，由元素分析法测得产物中碳原子的含量为45.75％，氮原子的含量为21.46％，氢原子的含量为6.25％，经确定，最终产物为(Lys)_0.6-(His)_0.4，该产物由凝胶渗透色谱法测得其分子量Mw为6.8×10³g/mol。

实施例5：(Lys)_0.75-(Arg)_0.15-(His)_0.1的合成

将60.0mmol L-赖氨酸，50.0mmol L-精氨酸和45.0mmol L-组氨酸在研钵中混匀后，将白色固体混合物移入一个250ml三口烧瓶中，在氩气保护和机械搅拌的条件下，加热反应混合物至160℃反应56小时，得到黄色固体。加入200ml甲醇，超声溶解大部分固体。过滤，向滤液中逐滴加入四氢呋喃，分级沉淀，得到赖氨酸、精氨酸和组氨酸的共聚产物，由元素分析法测得产物中碳原子的含量为45.13％，氮原子的含量为20.07％，氢原子的含量为7.69％，经确定，最终产物为(Lys)_0.75-(Arg)_0.15-(His)_0.1，该产物由凝胶渗透色谱法测得其分子量Mw为1.4×10⁴g/mol。

实施例6：(Lys)_0.65-(Arg)_0.1-(His)_0.1-(Ala)_0.15的合成

将60.0mmol L-赖氨酸，40.0mmol L-精氨酸，50.0mmol L-组氨酸和80.0mmol L-丙氨酸在研钵中混匀后，将白色固体混合物移入一个250ml三口烧瓶中，在氩气保护和机械搅拌的条件下，加热反应混合物至140℃反应60小时，得到黄色固体。加入200ml甲醇，超声溶解大部分固体。过滤，向滤液中逐滴加入四氢呋喃，分级沉淀，得到赖氨酸、精氨酸、组氨酸和丙氨酸的共聚产物，由元素分析法测得产物中碳原子的含量为45.4％，氮原子的含量为19.35％，氢原子的含量为7.57％，经确定，最终产物为(Lys)_0.65-(Arg)_0.1-(His)_0.1-(Ala)_0.15，该产物由凝胶渗透色谱法测得其分子量Mw为1.2×10⁴g/mol。

实施例7：(Lys)_0.55-(Arg)_0.2-(His)_0.15-(Gln)_0.1的合成

将60.0mmol L-赖氨酸，100.0mmol L-精氨酸，80.0mmol L-组氨酸和40.0mmol L-谷氨酰胺在研钵中混匀后，将白色固体混合物移入一个250ml三口烧瓶中，在氩气保护和机械搅拌的条件下，加热反应混合物至140℃反应60小时，得到黄色固体。加入200ml甲醇，超声溶解大部分固体。过滤，向滤液中逐滴加入四氢呋喃，分级沉淀，得到赖氨酸、精氨酸、组氨酸和谷氨酰胺的共聚产物，由元素分析法测得产物中碳原子的含量为43.06％，氮原子的含量为20.74％，氢原子的含量为7.13％，经确定，最终产物为(Lys)_0.65-(Arg)_0.1-(His)_0.1-(Ala)_0.15，该产物由凝胶渗透色谱法测得其分子量Mw为1.6×10⁴g/mol。

实施例8：(Lys)_0.7-(Arg)_0.2-(Phe)_0.1的合成

将60.0mmol L-赖氨酸，90.0mmol L-精氨酸和40.0mmol L-苯丙氨酸在研钵中混匀后，将白色固体混合物移入一个250ml三口烧瓶中，在氩气保护和机械搅拌的条件下，加热反应混合物至160℃反应45小时，得到黄色固体。加入200ml甲醇，超声溶解大部分固体。过滤，向滤液中逐滴加入四氢呋喃，分级沉淀，得到赖氨酸、精氨酸和苯丙氨酸的共聚产物，由元素分析法测得产物中碳原子的含量为46.38％，氮原子的含量为18.66％，氢原子的含量为7.72％，经确定，最终产物为(Lys)_0.7-(Arg)_0.2-(Phe)_0.1，该产物由凝胶渗透色谱法测得其分子量Mw为1.25×10⁴g/mol。

实施例9：

将实施例1～8制备的超支化聚氨基酸非病毒基因载体，分别采用GelRed作为DNA荧光染料分子，把超支化聚氨基酸与DNA分别按不同的氮磷比复合之后用凝胶电泳法测定其结合能力，测定结果表明：按实施例1～8制备的基因载体皆能有效诱导DNA分子的缔合。

实施例10：

按实施例1和实施例2制备的超支化聚氨基酸非病毒基因载体，分别体外转导293T、COS 7和HeLa细胞，转染4小时后，用荧光素酶检测系统测试荧光素酶报告基因在以上三种细胞中的表达，其结果如附图1、2、3所示。结果表明：该超支化聚氨基酸非病毒基因载体(Lys)_0.85-(Arg)_0.15和(Lys)_0.7-(Arg)_0.3对这三种细胞均有很高的转导效率。

实施例11：

按实施例3～8制备的超支化聚氨基酸非病毒基因载体，分别体外转导HEK293细胞，转染36小时后，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。结果表明：超支化聚氨基酸非病毒基因载体能有效转导该细胞。

实施例12：

按实施例1和实施例2制备的超支化聚氨基酸非病毒基因载体，分别体外转导水稻愈伤组织细胞，转染48小时后，荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白在水稻伤愈组织细胞中得到表达。

Claims

1.一种超支化聚氨基酸，其特征在于其化学组成具有以下通式：

式中Lys、Arg、His分别为赖氨酸、精氨酸、组氨酸，X为除上述氨基酸之外的任何一种或几种氨基酸，其中a，b，c，d为摩尔分数，0.2≤a≤0.95、0≤b≤0.8、0≤c≤0.8、0≤d≤0.3，且a+b+c+d＝1。

2.权利要求1所述的超支化聚氨基酸的制备方法，包括如下步骤：将赖氨酸或赖氨酸盐与权利要求1所述的超支化聚氨基酸的化学组成中含有的其它氨基酸或其氨基酸盐混合均匀后，在130～180℃反应2～64小时后得到黄色固体，此粗产品经沉淀法纯化后得到超支化聚氨基酸；赖氨酸或赖氨酸盐与权利要求1所述的超支化聚氨基酸的化学组成中含有的任一种其它氨基酸或其氨基酸盐的摩尔比为1∶0～20，其中的1∶0表示权利要求1所述的超支化聚氨基酸的化学组成中的b、c或d为0时对应的氨基酸或其氨基酸盐原料用量为0。

3.权利要求1或2所述超支化聚氨基酸作为基因载体的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述基因载体为用于人体或动物细胞基因转导的载体。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述基因载体为用于植物细胞基因转导的载体。