CN101573450B

CN101573450B - 与谷氨酰环化酶相关的新基因

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Publication number: CN101573450B
Application number: CN200780034982.4A
Authority: CN
Inventors: S·席林; H·钦尼斯; J-U·拉赫菲尔德; H-U·穆德特
Original assignee: Probiodrug AG
Current assignee: Vivoryon Therapeutics AG
Priority date: 2006-09-21
Filing date: 2007-09-21
Publication date: 2015-12-16
Anticipated expiration: 2027-09-21
Also published as: CN101573450A; ZA200901123B

Abstract

本发明涉及作为谷氨酰环化酶(QC，EC？2.3.2.5)的同工酶的新谷氨酰胺肽环化转移酶样蛋白(QPCTL)，并且涉及编码这些同工酶的分离核酸，所述的分离核酸均用于发现新的治疗物质，用于测量环化酶活性并且用于确定针对这些谷氨酰环化酶同工酶的化合物的抑制活性。

Description

与谷氨酰环化酶相关的新基因

发明领域

本发明涉及作为谷氨酰环化酶(QC，EC2.3.2.5)的同工酶的新谷氨酰胺肽环化转移酶样蛋白(QPCTL)，并且涉及编码这些同工酶的分离核酸，所述的分离核酸均可用于发现新的治疗物质，用于测量环化酶活性并且用于确定化合物对这些谷氨酰环化酶同工酶的抑制活性。

发明背景

谷氨酰环化酶(QC，EC2.3.2.5)催化氨基端谷氨酰胺残基至焦谷氨酸(pGlu^*)的分子内环化，从而释放氨。QC首次由Messer在1963年从热带植物番木瓜(Caricapapaya)的乳液中分离(Messer，M.1963Nature4874，1299)。在二十四年后，相应的酶活性在动物垂体中发现(Busby，W.H.J.等1987JBiolChem262，8532-8536；Fischer，W.H.和Spiess，J.1987ProcNatlAcadSciUSA84，3628-3632)。对于哺乳动物QC，可在TRH和GnRH的前体证实QC导致Gln转化至pGlu(Busby，W.H.J.等1987JBiolChem262，8532-8536；Fischer，W.H.和Spiess，J.1987ProcNatlAcadSciUSA84，3628-3632)。此外，最初的QC定位实验显示其在牛垂体中与其催化作用的推定产物共定位，这进一步提升其在肽激素合成中的潜在功能(Bockers，T.M.等1995JNeuroendocrinol7，445-453)。相反，植物QC的生理功能较不清楚。就来自番木瓜(C.papaya)的酶而言，提出在抵抗病原性微生物的植物防御中的作用(ElMoussaoui，A.等2001CellMolLifeSci58，556-570)。最近通过序列比较鉴定了来自其它植物的推定性QC(Dahl，S.W.等2000ProteinExprPurif20，27-36)。然而，这些酶的生理功能仍不清楚。

来自植物和动物的已知QC显示对底物氨基端位置内L-谷氨酰胺的严格特异性并且发现它们的动力学特性遵守Michaelis-Menten方程(Pohl，T.等1991ProcNatlAcadSciUSA88，10059-10063；Consalvo，A.P.等1988AnalBiochem175，131-138；Gololobov，M.Y.等1996BiolChemHoppeSeyler377，395-398)。然而，比较来自番木瓜的QC的一级结构与来自哺乳动物的高度保守性QC的一级结构则没有揭示任何序列同源性(Dahl，S.W.等2000ProteinExprPurif20，27-36)。尽管植物QC似乎属于一个新家族(Dahl，S.W.等2000ProteinExprPurif20，27-36)，然而发现哺乳动物QC具有与细菌氨基肽酶的显著序列同源性(Bateman，R.C.等2001Biochemistry40，11246-11250)，从而得出如此结论，即来自植物和动物的QC具有不同进化起源。

近来，已经证实重组人QC以及来自脑提取物的QC-活性催化氨基端谷氨酰基以及谷氨酸环化。最令人惊讶的是发现在pH6.0附近有利于环化酶催化的Glu₁-转化，而Gln₁至pGlu衍生物的转化在最适pH约8.0时发生。由于可以通过抑制重组人QC活性及来自猪垂体提取物的QC的活性而抑制pGlu-Aβ相关肽形成，故QC酶是开发用于治疗阿尔茨海默病的药物的靶标。

EP02011349.4披露了编码昆虫谷氨酰环化酶的多核苷酸及其所编码的多肽。该申请还提供包含表达载体的宿主细胞，其中所述表达载体包含本发明的多核苷酸。分离的多肽和包含昆虫QC的宿主细胞用于筛选降低谷氨酰环化酶活性的物质的方法中。此类物质用作杀虫剂。

也可以用作QC同工酶的抑制剂的QC抑制剂在WO2004/098625、WO2004/098591、WO2005/039548和WO2005/075436中描述，上述文献完整并入本文中，尤其在所述抑制剂的结构、用途及其产生方面如此。

定义

酶抑制剂

可逆性酶抑制剂：包括竞争性抑制剂、非竞争性可逆抑制剂缓慢结合性或紧密结合性抑制剂、过渡态类似物和多重底物类似物。

竞争性抑制剂显示

i)与酶非共价性相互作用，

ii)与底物竞争酶活性部位，

可逆性酶抑制剂的主要作用机理和解离常数的定义可以如下展示：

酶-抑制剂[E-I]复合物的形成阻止底物结合，因而该反应不能推进至正常生理产物P。较大的抑制剂浓度[I]产生较大[E-I]，从而使得可与底物结合的游离酶更少。

非竞争性可逆抑制剂

i)在除活性部位以外的其它部位结合(变构结合部位)

ii)引起降低或终止催化活性的酶构象变化

缓慢结合性或紧密结合性抑制剂

i)是其中抑制剂与酶之间的平衡缓慢达到的竞争性抑制剂，

ii)(k_on是缓慢的)，可能归因于酶或抑制剂中必须发生的构象变化

a)往往是过渡态类似物

b)在与酶浓度(亚纳摩尔K_D值)相似的浓度上有效

c)因k_off值如此之低，故这些类型的抑制剂“几乎”是不可逆的。

过渡态类似物

是模拟酶催化反应的过渡态的竞争性抑制剂。酶催化作用因降低该过渡态的能量而发生，因此，过渡态结合作用优先于底物结合作用。

多重底物类似物

对于涉及两种或多种底物的反应，可以设计这样的竞争性抑制剂或过渡态类似物，其含有与所述两种或多种底物相似的结构特征。

不可逆性酶抑制剂：总是向右驱动未结合的酶与抑制剂及酶抑制剂复合物(E+I<--->E-I)之间的平衡，含有使抑制作用不可逆的共价键(约100kcal/摩尔)。

亲和标记物

·针对活性部位的不可逆抑制剂(竞争性不可逆抑制剂)被酶识别(可逆性，特异性结合)，随后形成共价键，并且

i)在结构上与底物、过渡态或产物相似，从而为药物与靶酶之间特异性相互作用创造条件，

ii)含有为共价键形成创造条件的反应性官能团(例如亲核基团，-COCH₂Br)。

以下反应方案描述针对活性部位的试剂以及其靶酶，其中K_D是解离常数并且k_灭活(k_inactivation)是共价键形成速率。

·基于机制的酶灭活物(也叫做自杀抑制剂)是针对活性部位的试剂(非反应性)，该试剂与其中此试剂因酶催化能力而转化成活性形式(激活)的酶活性部位结合。一旦激活，则在所述抑制剂与此酶之间形成共价键。

以下反应方案显示基于机制的酶灭活物的作用机理，其中K_D是解离复合物，k₂是与酶结合时激活抑制剂的速率，k₃是激活的抑制剂P从该酶中解离的速率(产物仍可以有反应性)并且k₄是激活的抑制剂与酶之间形成共价键的速率。

灭活(共价键形成，k₄)必须在解离(k₃)之前发生，否则活性抑制剂现在释放至环境内。对于有效灭活系统和不希望的最小残余副反应而言，分配比率k₃/k₄，即释放产物对灭活产物比，应当最小化。大的分配比率(支持解离)导致非特异性反应。

非竞争性酶抑制剂：从非竞争性抑制剂(仅与ES复合物结合的抑制剂)的定义可以写出以下方程：

所述ES复合物以等于Ks的解离常数解离所述底物，而ESI复合物不解离该底物(即具有等于零的Ks值)。预期Michaelis-Menten型酶的K_m降低。增加底物浓度导致ESI(不能够发展成反应产物的复合物)浓度增加，因此不能解除抑制作用。

根据本发明，优选竞争性酶抑制剂。

最优选竞争性可逆性酶抑制剂。

术语“k_i”或“K_I”和“K_D”是描述抑制剂与酶结合并随后从酶中释放的结合常数。另一种度量是“IC₅₀”值，该值反映在给定底物浓度上产生50％酶活性的抑制剂浓度。

如本文中所用，术语“QC”包括与谷氨酰胺肽环化转移酶(QPCT)同义的谷氨酰环化酶(QC)；和与谷氨酰胺肽环化转移酶样蛋白(QPCTL)同义的QC样酶。QC和QC样酶具有相同或相似的酶活性，这种酶活性又定义为QC活性。就此方面而言，QC样酶可以在其分子结构上基本与QC不同。

将“QC-活性”定义为谷氨酰环化酶(QC，QPCT)和QC样酶(QPCTL)的催化活性。这些酶存在于哺乳动物身体的多种组织(包括肾脏、肝脏、肠、脑)和体液(如CSF)内，其中所述酶以高度特异性催化处于生物学活性肽的氨基端处的谷氨酰胺或谷氨酸。

尤其，如本文中所用的术语“QC活性”定义为在释放氨的情况下氨基端谷氨酰胺残基至焦谷氨酸(pGlu^*)的分子内环化或氨基端L-高谷氨酰胺或L-β-高谷氨酰胺至环状焦高谷氨酰胺衍生物的分子内环化。因而参见方案1和2。

方案1：QC对谷氨酰胺的环化

方案2：QC对L-高谷氨酰胺的环化

如本文中所用的术语“EC”包括谷氨酰环化酶(QC，QPCT)和QC样酶(QPCTL)作为谷氨酸环化酶(EC)的副活性(sideactivity)，该活性又定义为EC活性。

如本文中所用的术语“EC活性”定义为谷氨酰环化酶(QC，QPCT)和QC样酶(QPCTL)使氨基端谷氨酸残基发生分子内环化成为焦谷氨酸(pGlu^*)。因此参见方案3。

方案3：QC(EC)对不带电的谷氨酰基肽的氨基端环化

术语“QC抑制剂”或“谷氨酰环化酶抑制剂”是本领域技术人员通常已知的并且意指这样的酶抑制剂，其抑制谷氨酰环化酶(QC，QPCT)或QC样酶(QPCTL)的催化活性或其谷氨酰基环化酶(EC)活性，优选地通过该抑制剂与所述酶直接相互作用而进行。

如本文中所定义的术语“选择性QC抑制剂”意指这样的酶抑制剂，其抑制谷氨酰环化酶(QC，QPCT)的催化活性，但不抑制或以较低的能力抑制至少一种QC样酶(QPCTL)。优选这样的选择性QC抑制剂，该抑制剂以比其抑制至少一种QC样酶(QPCTL)的ki值低一个数量级的ki值抑制谷氨酰环化酶(QC，QPCT)。更优选地，所述选择性QC抑制剂抑制谷氨酰环化酶(QC，QPCT)的ki-值比其抑制至少一种QC样酶(QPCTL)的ki值低二个数量级。甚至更优选这样的选择性QC抑制剂，其中它们抑制谷氨酰环化酶(QC，QPCT)的ki-值比其抑制至少一种QC样酶(QPCTL)的ki值低三个数量级。最优选不抑制QC样酶(QPCTL)的选择性QC抑制剂。

如本文中所定义的术语“选择性QPCTL-抑制剂”意指这样的酶抑制剂，其抑制至少一种QC样酶(QPCTL)的催化活性，但不抑制或以较低的能力抑制谷氨酰环化酶(QC，QPCT)的活性。优选这样的选择性QPCTL-抑制剂，该抑制剂抑制至少一种QC样酶(QPCTL)的ki值比其抑制谷氨酰环化酶(QC，QPCT)的ki值低一个数量级。更优选地，所述选择性QPCTL-抑制剂抑制至少一种QC样酶(QPCTL)的ki-值比其抑制谷氨酰环化酶(QC，QPCT)的ki值低二个数量级。甚至更优选这样的选择性QPCTL-抑制剂，其中它们抑制至少一种QC样酶(QPCTL)的ki-值比其抑制谷氨酰环化酶(QC，QPCT)的ki值低三个数量级。最优选不抑制谷氨酰环化酶(QC，QPCT)活性的选择性QC抑制剂。

QC抑制的能力

就与QC抑制作用相关而言，在优选的实施方案中，本方法或医学用途利用这样的物质，其具有10μM或更小、更优选1μM或更小、甚至更优选0.1μM或更小或0.01μM或更小、或最优选地0.01μM或更小的QC抑制作用K_i。实际上，构思了具有在更小微摩尔水平、优选在纳摩尔水平并且甚至更优选在皮摩尔水平范围内的K_i值的抑制剂。因此，尽管出于便利目的，将活性物质在本文中描述为“QC抑制剂”，然而应当理解此类命名不意图将本发明的主题限于具体作用机理。

QC抑制剂的分子量

通常而言，本方法或医学用途的QC抑制剂会是小分子，例如，具有1000g/摩尔或更小、500g/摩尔或更小、优选400g/摩尔或更小并且甚至更优选350g/摩尔或更小以及甚至300g/摩尔或更小的分子量。

如本文中所用的术语“对象”指已经作为治疗、观察或实验对象的动物，优选哺乳动物，最优选人。

如本文中所用的术语“治疗有效量”意指在研究员、兽医、医生或临床医生探究的组织系统、动物或人中激发生物应答或医学应答的活性化合物或药用物质的量，所述的生物应答或医学应答包括改善正在治疗的疾病或病症的症状。

如本文中所用，术语“可药用的”包括人用途和兽医用途兽：例如术语“可药用的”包括兽医可接受的化合物或在人医学和卫生保健中可接受的化合物。

Guillain-Barré综合征(GBS)

可选名称是Landry-Guillain-Barré综合征、急性特发性多神经炎、传染性多发性神经炎或急性炎性多发性神经病。

Guillain-Barré综合征是在身体防御(免疫)系统错误攻击神经系统的部分时发生的一种严重病症。这引起造成肌无力的神经炎症，其中后者继续恶化。

Guillain-Barré综合征是自身免疫性疾病。未知Guillain-Barré综合征的明确病因。该综合征可以在任何年龄发生，不过在30和50岁的两种性别的人群中最常见。它常常继发轻微感染，通常是呼吸道(肺部)感染或消化道(胃肠道长)感染。通常，最初感染体征在Guillain-Barré的症状开始前已经消失。Guillain-Barré综合征引起损伤神经部分的炎症。这种神经损害引起麻刺感、肌无力和麻痹。此炎症通常影响神经的覆盖层(髓鞘)。这种损害叫做脱髓鞘。脱髓鞘减慢神经信号传导作用。对神经其它部分的损害可以造成神经停止工作。

Guillain-Barré的症状极迅速恶化。它可以仅经几小时内即达到最严重的症状。肌无力或肌肉功能丧失(麻痹)影响身体两侧。若肌无力在腿部开始并且随后扩展至臂部，则这种肌无力叫做上行性麻痹。

患者可以觉察到麻刺感、足痛或手痛和笨拙。当肌肉功能丧失加重时，该患者可能需要辅助呼吸。

无法治愈Guillain-Barré综合征。然而，众多疗法可用于帮助减轻症状，治疗并发症并加速恢复。当症状严重时，患者需要住院以辅助呼吸、治疗和理疗。使用称作单采血浆术的方法来取出患者血液并代之以不含抗体的静脉内流体或捐赠的血液。高剂量的免疫球蛋白疗法是用来降低Guillain-Barré症状的严重性和持续时间长度的另一种方法。其它疗法旨在预防并发症。

慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)

一种与GBS相似但以慢性过程为特征的疾病叫做慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)。对于CIDP，还没有一般适用的定义，不过观察到其与GBS相反，其进展期持续超过4周，往往超过6个月，并且往往在患者中留下缺损。因GBS和CIDP造成严重局部麻痹的机制可能包括继发于周围神经元脱髓鞘作用的T淋巴细胞介导性免疫反应和炎症。该假设被患者血清及脑脊液中观察到的补体复合物或细胞因子的量升高所支持。目前将脱髓鞘过程，尤其在神经根区域内的脱髓鞘过程视为神经传导阻滞发展中的决定性机制。一种理论以血/脑脊液(CSF)屏障障碍作为本病发展中早期相对重要的步骤为基础。另一种理论声称在血/CSF屏障的泄露因本病而发展并且引起CSF中蛋白质含量增加。总之，不直接涉及免疫系统的非特异性血清组分可以从血液中渗入CSF，引起神经元或胶质细胞功能失调和/或调节神经元活性。另一种机制是CSF流速降低，这可能解释CSF中的蛋白质含量增加。该解释不要求血液/CSF屏障选择性受损或改变。尽管所提及的全部效应对于GBS和CIDP过程可能是重要的，然而它们对症状的实际贡献仍没有阐明。还不可能建立CSF中增加的蛋白质浓度与特定电生理研究结果或临床现象之间的联系。最近已经描述在GBS患者和多发性硬化患者的CSF中与动作电位依赖性钠通道相互作用的因子(Wüz等1995，MuscleandNerve18，772-781)。Brinkmeier(Brinkmeier等1996，MuscleandNerve19，54-62)报道所述的因子具有小于3kDa分子量，并且在更严格的实验条件下小于1kDa。基于这项观察和所述因子活性即便在CSF与蛋白酶温育后也不明显降低的事实，作者得出结论；所述因子既非抗体也非细胞因子。

多发性硬化(MS)

多发性硬化是影响中枢神经系统(脑和脊髓)的自身免疫性疾病。多发性硬化对女性的影响通常超过男性。该病症最常见在20岁-40岁之间开始，不过可以在任何年龄上发作。确切病因未知，不过据信MS是因包围神经细胞的保护性材料-髓鞘损害所致。本病是进行性疾病，意味着这种损害随时间加重。炎症摧毁髓鞘，留下多个疤痕组织区(硬化)。当身体自身的免疫细胞攻击神经系统时，炎症出现。此炎症造成神经冲动变慢或阻滞，产生MS症状。炎症的反复发作或突发可以沿脑和脊髓中任何区域出现。症状多变，因为每次侵袭的位置和程度不同。通常，持续数日、数周或数月的发作与症状出现次数下降或无症状(缓解)交替出现。反复(复发)是常见的，不过无缓解时期的持续进展也可以出现。

还不清楚何种物质启动攻击。MS患者一般比健康人具有较高的免疫细胞数，这提示免疫应答可能发挥作用。最常见的理论涉及病毒或遗传缺陷或其组合。该疾病似乎还存在遗传连锁。与其它地区相比，MS更可能出现在欧洲北部、美国北部，南澳大利亚和新西兰。地理学研究表明可能存在相关的环境因子。具有MS家族历史的人和在MS发病率较高地区生活的那些人具有较高的本病风险。

目前已知无法治愈多发性硬化。然而，存在可以减慢本疾病的众多疗法。治疗目的是控制症状和维持正常生活质量。

发明简述

本发明提供具有谷氨酰环化酶活性的蛋白质，其组成与谷氨酰环化酶相关的蛋白质家族的新成员，所述蛋白质包括全长蛋白、可变剪接形式、亚基和突变体以及编码它们的核苷酸序列。本发明还提供筛选底物、相互作用性蛋白质、上述蛋白质的激动剂、拮抗剂或抑制剂的方法，并且还涉及包含所述蛋白质和/或突变体、其衍生物和/或类似物和/或其配体的药物组合物。

与谷氨酰环化酶(SEQIDNO：1的核酸序列，SEQIDNO：10的蛋白质序列)具有显著序列相似性的这些新蛋白质是来自人的蛋白质(QPCTL)(又称作人isoQC)(GenBank登录号NM_017659)、来自小鼠的蛋白质(GenBank登录号NM_027455)、来自食蟹猴(Macacafascicularis)的蛋白质(GenBank登录号AB168255)、来自猕猴(Macacamulatta)的蛋白质(GenBank登录号XM_001110995)、来自猫的蛋白质(GenBank登录号XM_541552)、来自大鼠的蛋白质(GenBank登录号XM_001066591)、来自奶牛的蛋白质(GenBank登录号BT026254)或其具有至少50％/75％序列相同性/相似性、优选70％/85％序列相同性/相似性、最优选90％/95％序列相同性/相似性的类似物。

蛋白质序列在SEQIDNO：11-18中给出。还披露了编码这些蛋白质的核酸序列(SEQIDNO：2-9)。表1显示所述的新蛋白质与已知的谷氨酰环化酶之间的相似性。表2显述所述的新蛋白质与已知的谷氨酰环化酶之间的相同性。

表1：新的谷氨酰胺肽环化转移酶样蛋白与谷氨酰环化酶的蛋白质序列的相似性

QPCTL来源	人isoQC(SEQ ID NO：11)	人QC(SEQ ID NO：10)
			人isoQC(SEQ ID NO：11)	-	71.98％
食蟹猴(SEQ ID NO：13)	99.48％	72.24％
			猕猴(SEQ ID NO：14)	99.48％	72.24％
家犬(C_familiaris)(SEQ ID NO：15)	95.82％	72.31％
			褐家鼠(R_norvegicus)(SEQ ID NO：16)	95.30％	70.77％
小鼠(M_musculus)(SEQ ID NO：17)	95.04％	70.77％
			家牛(B_taurus)(SEQ ID NO：18)	96.08％	72.31％

表2：新的谷氨酰胺肽环化转移酶样蛋白与谷氨酰环化酶的蛋白质序列的相同性

QPCTL来源	人isoQC(SEQ ID NO：11)	人QC(SEQ ID NO：10)
			人isoQC(SEQ ID NO：11)	-	45.24％
食蟹猴(SEQ ID NO：13)	98.17％	44.99％
			猕猴(SEQ ID NO：14)	98.17％	44.99％
家犬(C_familiaris)(SEQ ID NO：15)	88.51％	45.13％
			褐家鼠(R_norvegicus)(SEQ ID NO：16)	84.33％	45.38％
小鼠(M_musculus)(SEQ ID NO：17)	84.07％	44.62％
			家牛(B_taurus)(SEQ ID NO：18)	84.60％	45.64％

在不同来源的QPCTL之间存在95-99％的高度相似性和84-98％的高度相同性(见图2)。基于同人谷氨酰环化酶和鼠谷氨酰环化酶的序列相似性(见图1)，可以预测这些QPCTL可能具有的功能包括，但不限于，作为酶。克隆、表达、生物化学表征和分子表征已经证实这种假设。

QPCTL在脑、前列腺和肺组织中的表达模式与在下文所述疾病中的功能相一致。作为谷氨酰环化酶的酶活性显示QPCTL激活性或抑制性分子具有多种治疗用途，如下文所述。

本文中所述的QPCTL活性及其表达模式与它们通过生物化学介质如激素、肽和趋化因子的酶修饰作用而作为免疫系统和神经内分泌系统的生理调节物发挥功能性作用相兼容。先前基于使用抑制剂而对QC描述的众多功能可以部分地归因于QC的作用和相似蛋白质如QPCTL的作用。因此，认为发现QC、QPCTL或其它相关酶的选择性及强效抑制剂是实现这些酶和任何新鉴定的谷氨酰胺肽环化转移酶以及其它活性化合物的有效且安全药用用途的关键，其中所述的其它活性化合物修饰此类蛋白质的功能。

本发明因此提供新的蛋白质或多肽，编码它们的核酸、已经用所述核酸加以修饰以表达这些蛋白质的细胞、针对这些蛋白质的抗体、用于找到新治疗物质的筛选方法，其中所述的新治疗物质是这些蛋白质的活性的抑制剂(或它们是QC的抑制剂而不是所述蛋白质的抑制剂)和通过此类筛选方所找到的治疗物质。所述的新蛋白质和编码它们的核酸可以用来找到治疗某些疾病(例如神经变性病、生殖病、炎性疾病和代谢病)的新治疗物质并且还用在制备具有治疗价值或诊断价值的抗体。

根据本发明的一个方面，提供新的、成熟的生物活性蛋白质，优选人类来源。此类蛋白质可以通过标准技术从合适的动物(包括人)组织或生物流体中少量地分离；然而，较大的量更方便地在经基因工程化以表达所述蛋白质的细胞的培养物中制备。

根据本发明的另一个方面，提供编码本发明多肽的分离核酸分子，所述的分离核酸分子包括其mRNA、DNA、cDNA、基因组DNA。

根据本发明的又一个方面，也提供核酸探针，其包含长度足够与本发明的核酸序列特异性杂交的核酸分子。

根据本发明的再一个方面，提供使用重组技术的方法以产生用于体外科学研究(例如合成DNA和制造DNA载体)的此类多肽。用于产生此类多肽的方法包括在促进表达所述蛋白质的条件下培养经DNA载体转染的重组原核和/或真核宿主细胞，其中所述DNA载体含有编码此种多肽和/或成熟蛋白的核酸序列，并且随后回收这种蛋白质或表达产物的片段。

根据又一个方面，本发明提供使用QPCTL多肽和多核苷酸治疗疾病的方法。

根据本发明的又一个方面，提供利用此类多肽或编码此类多肽的多核苷酸找到如此化合物的方法，其中所述的化合物抑制所述成熟蛋白的生物学活性，例如QC活性或EC活性的，并且因此也提供此类抑制剂。

根据更具体的方面，本发明提供分离的核酸，该核酸编码(a)选自SEQIDNO：11-18的QPCTL多肽，或编码(b)多肽，其具有与所述QPCTL多肽的氨基酸序列具有至少约75％相似性的氨基酸序列并显示相同生物学功能，或该核酸是SEQIDNO：2-9之一的可变剪接变体；或该核酸是包含来自编码(a)或(b)的所述核酸的至少14个连续核苷酸的探针；或该核酸与前述任一项的核酸互补。

根据另一个具体方面，本发明提供这样的多肽，其可以任选地是糖基化的，并且其(a)具有SEQIDNO：10-18任一所示的成熟蛋白、优选SEQIDNO：11-18任一所示的成熟蛋白的氨基酸序列；(b)具有与(a)的成熟蛋白之一具有至少约75％相似性并显示相同生物学功能的成熟蛋白的氨基酸序列；(c)具有如此成熟蛋白的氨基酸序列，其中所述的熟蛋白质与SEQIDNO：10-18任一的成熟蛋白、优选SEQIDNO：11-18任一所示的成熟蛋白具有至少约50％相同性；或(d)其是(a)的免疫学反应片段

根据又一个具体方面，本发明提供了筛选能够抑制本发明至少一种成熟蛋白的酶活性的化合物的方法，所述的成熟蛋白优选地选自SEQIDNO：11-18的蛋白质，所述的方法包括在存在一种或多种所述测试化合物或其盐的情况下温育所述成熟蛋白和该成熟蛋白的合适底物，测量该成熟蛋白的酶活性，将此活性与不存在测试化合物的情况下所确定的可相比的活性比较，并选出降低所述酶活性的一或多种测试化合物。

此外，本发明涉及基于QC抑制剂、选择性QC抑制剂或选择性QPCTL抑制剂的用途的诊断试剂盒和方法。

本领域技术人员而言从以下详细描述中应当显而易见本发明的这些方面和其它方面。

附图简述

图1显示人QC(hQC)，人isoQC(hisoQC)、鼠QC(mQC)和鼠isoQC(misoQC)的序列比对结果。使用在PBIL(BioinformatiqueLyonnais)(http://npsa-pbil.ibcp.fr)的ClustalW以默认设置开展多重序列比对。连接锌离子的残基的保守性以粗体和加下划线方式对人QC(hQC；GenBankX71125，SEQIDNO：10)、人isoQC(hisoQC，GenBankNM_017659，SEQIDNO：11)、鼠QC(mQC，GenBankNM_027455，SEQIDNO：79)和鼠isoQC(misoQC，GenBankBC058181，SEQIDNO：17)显示。

图2显示以下isoQC的序列比对结果：来自智人(Homosapiens)的isoQC(hisoQC，GenBankNM_017659，SEQIDNO：11)、来自食蟹猴的isoQC(M_fascicularis，GenBankAB168255，SEQIDNO：13)、来自猕猴的isoQC(M_mulatta，GenBankXM_001110995，SEQIDNO：14)、来自家犬(Canisfamiliaris)的isoQC(C_familiaris，GenBankXM_541552，SEQIDNO：15)、来自褐家鼠(Rattusnorvegicus)的isoQC(R_norvegicus，GenBankXM_001066591，SEQIDNO：16)、来自小鼠(Musmusculus)的isoQC(M_musculus，GenBankBC058181，SEQIDNO：17)和家牛(Bostaurus)的isoQC(B_taurus，GenBankBT026254，SEQIDNO：18)。使用在PBIL(BioinformatiqueLyonnais)(http://npsa-pbil.ibcp.fr)的ClustalW以默认设置开展多重序列比对。对保守性连接锌离子的残基氨基酸加下划线并粗体打印。

图3显示人QC(hQC，SEQIDNO：10)和人isoQC(hisoQC，SEQIDNO：12)和金属肽酶ClanMH的其它M28家族成员的序列比对结果。使用在ch.EMBnet.org的ClustalW以默认设置开展多重序列比对。人QC(hQC；Swiss-ProtQ16769，SEQIDNO：10)内连接单个锌离子的氨基酸残基的保守性对人isoQC(isoQC；Swiss-ProtQ53HE4，SEQIDNO：12)(第19-382位残基)、来自灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)的Zn依赖性氨基肽酶(SGAP；Swiss-ProtP80561，SEQIDNO：80)和解蛋白弧菌(Vibrioproteolyticus)的成熟Zn-依赖性亮氨酰基氨基肽酶(VpAP；Swiss-ProtQ01693，SEQIDNO：81)显示。对相应氨基酸残基加下划线并粗体打印。

图4显示人QC(hQC，SEQIDNO：10)和人isoQC(hisoQC，SEQIDNO：11)的序列比对结果，显示两个推定性翻译起点(甲硫氨酸I-粗体、不加下划线；甲硫氨酸II-粗体)。使用在PBIL(BioinformatiqueLyonnais)http://npsa-pbil.ibcp.fr的ClustalW以默认设置开展多重序列比对。在人isoQC中存在的跨膜结构域由黑色棒标出。

图5显示人QC(hQC，SEQIDNO：10)和人isoQC(hisoQC，SEQIDNO：12)的序列比对结果，从甲硫氨酸II(粗体)开始。使用在ch.EMBnet.org的ClustalW以默认设置开展多重序列。参与金属结合的氨基酸加下划线并粗体打印。在人isoQC中存在的跨膜结构域由黑色棒标出。

图6显示通过RT-PCR对isoQC表达的分析。在SH-SY5Y、LN405、HaCaT和Hep-G2中检测。

泳道：bp，DNA标准；1，来自SH-SY5Y的人isoQC的PCR扩增产物；2，来自LN405的人isoQC的PCR扩增产物；3，来自HaCaT的人isoQC的PCR扩增产物；4，来自Hep-G2的人isoQC的PCR扩增产物。

图7显示通过免疫组织化学对isoQC(MetI，SEQIDNO：11)亚细胞定位的分析。在甲硫氨酸I处开始的人isoQC(见图5)在LN405中表达为带EGFP的融合蛋白(isoQC(MetI)EGFP)。使用AB3712(Chemicon)开展甘露糖苷酶II复染法。合并代表isoQC(MetI)-EGFP和甘露糖苷酶II染色法的重叠。

图8显示通过免疫组织化学对isoQC(MetI，SEQIDNO：11)亚细胞定位的分析。在甲硫氨酸I处开始的人isoQC在LN405中表达为带EGFP的融合蛋白(isoQC(MetI)EGFP)。使用MAB1273(Chemicon)开展线粒体复染法。合并代表isoQC(MetI)-EGFP和线粒体染色法的重叠。

图9显示通过免疫组织化学对isoQC(MetII，SEQIDNO：12)亚细胞定位的分析。在甲硫氨酸II处开始的人isoQC在LN405中表达为带EGFP的融合蛋白(isoQC(MetII)EGFP)。使用AB3712(Chemicon)开展露糖苷酶II复染法。合并代表isoQC(MetII)-EGFP和甘露糖苷酶II染色法的重叠。

图10显示通过免疫组织化学对isoQC(MetII，SEQIDNO：12)亚细胞定位的分析。在甲硫氨酸II处开始的人isoQC在LN405中表达为带EGFP的融合蛋白(isoQC(MetII)EGFP)。使用MAB1273(Chemicon)开展线粒体复染法。合并代表isoQC(MetII)-EGFP和线粒体染色法的重叠。

图11显示通过免疫组织化学对isoQC(MetI，SEQIDNO：11)亚细胞定位的分析。在甲硫氨酸I处开始的人isoQC在COS-7中表达为带EGFP的融合蛋白(isoQC(MetI)EGFP)。使用AB3712(Chemicon)开展甘露糖苷酶II复染法。合并代表isoQC(MetI)-EGFP和甘露糖苷酶II染色法的重叠。

图12显示通过免疫组织化学对isoQC(MetI，SEQIDNO：11)亚细胞定位的分析。在甲硫氨酸I处开始的人isoQC在COS-7中表达为带EGFP的融合蛋白(isoQC(MetI)EGFP)。使用MAB1273(Chemicon)开展线粒体复染法。合并代表isoQC(MetI)-EGFP和线粒体染色法的重叠。

图13显示通过免疫组织化学对isoQC(MetII，SEQIDNO：12)亚细胞定位的分析。在甲硫氨酸II处开始的人isoQC在COS-7中表达为带EGFP的融合蛋白(isoQC(MetII)EGFP)。使用AB3712(Chemicon)开展甘露糖苷酶II复染法。合并代表isoQC(MetII)-EGFP和甘露糖苷酶II染色法的重叠

图14显示通过免疫组织化学对isoQC(MetII，SEQIDNO：12)亚细胞定位的分析。在甲硫氨酸II处开始的人isoQC在COS-7中表达为带EGFP的融合蛋白(isoQC(MetII)EGFP)。使用MAB1273(Chemicon)开展线粒体复染法。合并代表isoQC(MetII)-EGFP和线粒体染色法的重叠。

图15显示抑制剂P150/03抑制人isoQC催化的H-Gln-AMC至pGlu-AMC的转化。假定线性竞争性抑制，根据Michaelis-Menten动态模型评价数据。抑制剂浓度如下：

测定的K_i-值是240±8nM。

图16显示使用分光光度计测量测定法测定的人isoQC-催化H-Gln-Ala-OH至pGlu-Ala-OH的转化。根据Michaelis-Menten动态模型评价数据。动力学参数对于K_M和V_max-值分别是324±28μM和7.4±0.2nM/分钟。

图17提供在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中异源表达的人isoQC蛋白质构建体的方案。在一些蛋白质中导入两个突变，在第55位置(I55N)处产生糖基化位点和在第351位置(C351A)处产生突变的半胱氨酸残基。为了表达，用酵母(YSS)的分泌信号替换包含跨膜结构域的氨基端。含有该氨基端分泌信号的构建体应当有效地分泌至培养基中。

图18显示在发生表达的酵母细胞的培养基中测定的QC活性。天然构建体因跨膜结构域而不分泌至培养基(未实施)。蛋白质因糖基化(I55N)而极高效地分泌。突变C351A也导致在培养基中检测到较高QC活性。所述构建体在图17中描述。

图19显示基于构建体YSShisoQCI55NC351AC-His，人isoQC从转基因巴斯德毕赤酵母株的培养基中纯化。此QC通过IMAC(固定化金属亲和层析，泳道3)、HIC(疏水相互作用层析，泳道4)和脱盐(泳道5)的组合进行纯化。该酶的糖基化通过酶去糖基化作用证实，其中所述的酶去糖基化作用导致蛋白质迁移性的移动(泳道6)。泳道1，蛋白质标准：泳道2，纯化前的培养基。

图20.显示基于构建GST-hisoQCC-His，人isoQC从转化的大肠杆菌(E.coli)的细胞匀浆中纯化。此QC通过IMAC(固定化金属亲和层析，泳道3)、GS亲和(泳道4)、脱盐(泳道5)和离子交换层析(泳道6)的组合进行纯化。泳道1，蛋白质标准：泳道2，纯化前的细胞匀浆。在酵母和大肠杆菌中所表达hisoQC之间分子量的差异由氨基端GST标签融合物引起。在本图的上半部分示意性地提供所表达的构架体。

图21显示由人isoQC(YSShisoQCI55NC351AC-His；比较图17)、GST-hisoQC和人QC转化二肽代用品、二肽和寡肽的特异性常数。GST-hisoQC的特异性最低，随后是YSShisoQCI55NC351AC-His。显示较高整体酶活性的人QC表现出最高的特异性。

图22显示用酵母中表达的人isoQC(hisoQC)和人QC(hQC)研究的催化作用的pH-依赖性。这两种蛋白质均显示在pH7和8之间的最适pH。拟合曲线基于影响催化作用的三个解离基团，其中一个位于酸性pH上，两个位于碱性pH上。

图23显示对转化谷氨酸的分析，其中所述的谷氨酸存在于淀粉样蛋白-β相关肽Aβ(3-11)的氨基端。使用Maldi-Tof质谱法开展该分析，底物和产物在单个带电分子的分子质量/电荷比例上相差达约18Da，这是释放的水的质量。在两种情况下，相同的蛋白质浓度存在于样品中，这清楚地表明人isoQC也转化氨基端谷氨酸，不过比人QC更慢。

图24显示使用实时PCR分析的鼠QC(mQC，SEQIDNO：79)及其同工酶misoQC(SEQIDNO：17)的组织分布。这两种酶在检验的器官中均表达。然而与外周器官相比，mQC的表达水平在脑内较高。相反，misoQC在检验的全部器官和组织以更相似的水平表达，表示misoQC是一种广泛存在的“管家”蛋白。

图25显示金属螯合化合物1，10-菲罗啉(圆圈)和EDTA(矩形)对人isoQC(hisoQC)的时间-依赖性抑制。在添加相应试剂(实心符号)后或将相应试剂与hisoQC在30℃预温育15分钟(空心符号)后直接测定残余hisoQC活性。

图26显示在HEK293细胞中表达pcDNA和天然酶hisoQC(MetI，SEQIDNO：11)、hisoQC(MetII，SEQIDNO：12)和hQC(SEQIDNO：10)后对QC活性的亚细胞定位的生物化学分析。(A)在所述细胞中单位μmole/分钟/g的比活性。(B)单位nM/分钟的绝对活性。(C)在施加检测FLAG-表位(抗DYKDDDDK-抗体，CellSignaling)、65kDa人线粒体蛋白(抗人线粒体，Chemicon)或人唾液酸转移酶ST1GAL3(Abnova)的特异性抗体开展蛋白质印迹分析后，与载体转染的对照(pcDNA)相比，h-isoQC(MetI，SEQIDNO：11)、h-isoQC(MetII，SEQIDNO：12)和拥有羧基端FLAG标签的hQC(SEQIDNO：10)在HEK293中的表达。

图27显示与EGFP(1，4)融合的人isoQC(hisoQC)信号序列(27A)甲硫氨酸I-丝氨酸53和(27B)甲硫氨酸II-丝氨酸53的亚细胞定位。抗甘露糖苷酶II抗体将高尔基复合体染色(2)并且使用检测人线粒体65kDa蛋白的抗体将线粒体染色(5)。共定位由EGFP荧光和RedX荧光叠加所显示(3，6)。

图28显示与人糖基转移酶：α-N-乙酰半乳糖胺α-2，6-唾液酸转移酶1(ST6GalNAC1；E.C.2.4.99.3)；β-1，4-半乳糖基转移酶1(b4Gal-T1，E.C.2.4.1.-)；半乳糖苷3(4)-L-岩藻糖基转移酶(FucT-III；E.C.2.4.1.65)和糖蛋白-岩藻糖基半乳糖苷α-N-乙酰半乳糖胺基转移酶(NAGAT，E.C.2.4.1.40)的公开序列相比，人isoQC(hisoQC)和鼠isoQC(misoQC)的结构域构造。氨基酸的编列于各列之下。胞浆部分加阴影，跨膜螺旋为黑色并且腔内部分以白色显示。

图29显示对不同癌细胞系中人isoQC(QPCTL)mRNA的量化。将QPCTL表达标准化至50ng总RNA。盒子内的黑色棒代表相应的中位数。

图30显示对不同黑素瘤细胞系中人isoQC(QPCTL)mRNA表达的量化。将QPCTL表达标准化至50ng总RNA。

图31显示在源自不同患者的软组织癌、胃癌和甲状腺癌的样品中人isoQC(QPCTL)mRNA的量化。将QPCTL表达标准化至50ng总RNA。盒子内的黑色棒代表相应的中位数。

图32显示对不同胃癌中针对其分化期的人isoQC(QPCTL)mRNA表达的量化。将QPCTL表达标准化至50ng总RNA。盒子内的黑色棒代表相应的中位数。

图33显示对不同甲状腺癌中人QC(QPCT)mRNA表达的量化。将QPCT表达标准化至50ng总RNA。盒子内的黑色棒代表相应的中位数。(FTC：滤泡状甲状腺癌；PTC：乳头状甲状腺癌；UTC：未分化甲状腺癌)。

图34显示不同甲状腺癌中人isoQC(QPCTL)mRNA表达的比较。将QPCTL表达标准化至50ng总RNA.盒子内的黑色棒代表相应的中位数。(FTC：滤泡状甲状腺癌；PTC：乳头状甲状腺癌；UTC：未分化甲状腺癌)。

图35显示不同刺激物对HEK293细胞中人QC(QPCT)、人isoQC(QPCTL)和CCL2的mRNA表达的影响。相对于无刺激物时的基础表达描述转录物的量。在X轴上描述所用的刺激物浓度。

图36显示不同刺激物对FTC-133细胞中人QC(QPCT)、人isoQC(QPCTL)和CCL2的mRNA表达的影响。相对于无刺激时的基础表达描述转录物的量。在X轴上描述所用的刺激物浓度。

图37显示不同刺激物对THP-1细胞中人QC(QPCT)、人isoQC(QPCTL)和CCL2的mRNA表达的影响。相对于无刺激时的基础表达描述转录物的量。在X轴上描述所用的刺激物浓度。

图38显示不同刺激物对THP-1细胞中人QC(QPCT)、CCL2、CCL7、CCL8和CCL13的mRNA表达的影响。相对于无刺激时的基础表达描述转录物的量。在X轴上描述所用的刺激物浓度。

图39显示低氧对HEK293(A)、FTC-133(b)和THP-1(C)中人QC(QPCT)、人isoQC(QPCTL)和HIF1α的mRNA水平的影响。

序列列表

SEQ ID NO	描述
		1	人QC，核酸
2	人isoQC MetI，核酸
		3	人isoQC MetII，核酸
4	食蟹猴QPCTL，核酸
		5	猕猴QPCTL，核酸

6	家犬QPCTL，核酸
		7	大鼠QPCTL，核酸
8	小鼠QPCTL，核酸
		9	牛QPCTL，核酸
10	人QC，蛋白质
		11	人isoQC MetI，蛋白质
12	人isoQC Met II，蛋白质
		13	食蟹猴QPCTL，蛋白质
14	猕猴QPCTL，蛋白质
		15	家犬QPCTL，蛋白质
16	大鼠QPCTL，蛋白质
		17	小鼠QPCTL，蛋白质
18	牛QPCTL，蛋白质
		19	人isoQC剪接形式1，核酸
20	人isoQC剪接形式2，核酸
		21	人isoQC剪接形式1，蛋白质
22	人isoQC剪接形式2，蛋白质
		23	淀粉样蛋白β肽(Aβ)(1-42)
24	Aβ(1-40)
		25	Aβ(3-42)
26	Aβ(3-40)
		27	Aβ(11-42)
28	Aβ(11-40)
		29	pGlu³-Aβ(3-42)
30	pGlu³-Aβ(3-40)
		31	pGlu³-Aβ(11-42)
32	pGlu³-Aβ(11-40)
		33	ABri
34	ADan
		35	促胃液素17

36	促胃液素34
		37	pGlu-Abri
38	pGlu-ADan
		39	pGlu-促胃液素17
40	pGlu-促胃液素34
		41	神经降压肽
42	GnRH
		43	CCL16
44	CCL8
		45	CCL2
46	CCL18
		47	CXXXC趋化分子
48	CCL7
		49	食欲肽A(OrexinA)
50	P物质
		51	QYNAD
52	pGlu-YNAD
		53	用于细胞系筛选的人isoQC正向引物
54	用于细胞系筛选的人isoQC反向引物
		55	用于分离人isoQC的正向引物
56	用于分离人isoQC的反向引物
		57	用于克隆人isoQC(同功型Met I)至载体pEGFP-N3的正向引物
58	用于克隆人isoQC(同功型Met II)至载体pEGFP-N3的正向引物
		59	用于克隆人isoQC(同功型Met I和Met II)至载体pEGFP-N3至载体pEGFP-N3的反向引物
60	用于克隆人isoQC至载体pET41a的正向引物
		61	用于克隆人isoQC至载体pET41a的反向引物
62	用于克隆人isoQC至载体pPICZαA带羧基端组氨酸标签的正向引物
		63	用于克隆人isoQC至载体pPICZαA带氨基端组氨酸标签的正向引物
64	用于克隆人isoQC至载体pPICZαA带氨基端组氨酸标签的反向引物

65	用于实时PCR分析isoQC的正向引物
		66	用于克隆人isoQC至载体pPICZαA带羧基端组氨酸标签的反向引物
67	用于实时PCR分析isoQC的反向引物
		68	用于克隆鼠isoQC cDNA的正向引物
69	用于克隆鼠isoQC cDNA的反向引物
		70	用于克隆鼠isoQC cDNA的正向引物
71	用于实时PCR分析鼠QC的正向引物
		72	用于实时PCR分析鼠QC的反向引物
73	用于实时PCR分析鼠QC的正向引物
		74	用于实时PCR分析鼠QC的反向引物
75	用于位点定向诱变hisoQC I55N的正向引物
		76	用于位点定向诱变hisoQC I55N的反向引物
77	用于位点定向诱变hisoQC C351A的正向引物
		78	用于位点定向诱变hisoQC C351A的反向引物
79	小鼠谷氨酰环化酶蛋白质
		80	灰色链霉菌SGAP
81	解蛋白弧菌VpAP
		82	用于插入天然hQC至pcDNA 3.1的正向引物
83	用于插入天然hQC至pcDNA3.1的反向引物
		84	用于扩增包含终止密码子的hisoQC以插入pcDNA 3.1内的反向引物
85	用于扩增EGFP的正向引物
		86	用于扩增EGFP的反向引物
87	用于扩增hisoQC氨基端序列以与EGFP融合的反向引物
		88	用于扩增hQC C-FLAG以插入pcDNA3.1的反向引物
89	用于扩增hisoQC C-FLAG以插入pcDNA 3.1的反向引物

发明详述

根据本发明的方面，提供SEQIDNO：2-9、19和20的分离核酸序列(多核苷酸)，其编码具有来自不同起源的QPCTL(SEQIDNO：11-18、21和22)的推导氨基酸序列的成熟多肽。

根据本发明优选的是SEQIDNO：2和3、19和20的分离核酸序列(多核苷酸)，其编码具有来自人的QPCTL(SEQIDNO：11和12、21和22)的推导氨基酸序列的成熟多肽。

根据本发明更优选的是SEQIDNO：2和3的分离核酸序列(多核苷酸)，其编码具有SEQIDNO：11和12的人QPCTL的推导氨基酸序列的成熟多肽。

根据本发明进而更优选的是SEQIDNO：19和20的分离核酸序列(多核苷酸)，其编码具有SEQIDNO：21和22的人QPCTL可变剪切形式的推导氨基酸序列的成熟多肽。

根据本发明最优选的是SEQIDNO：2的分离核酸序列(多核苷酸)，其编码具有SEQIDNO：11的人QPCTL的推导氨基酸序列的成熟多肽。

根据本发明进而最优选的是SEQIDNO：3的分离核酸序列(多核苷酸)，其编码具有SEQIDNO：12的人QPCTL的推导氨基酸序列的成熟多肽。

前述实施方案和优选性适用于QPCTL核酸以及QPCTL蛋白及任何想要的使用、诊断、治疗、筛选方法、效应物、抑制剂及本发明其它用途与方法。

使用在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上的核苷酸BLAST，利用人QC作为模板，通过相似性搜索找到本发明的多核苷酸。这种搜索导致发现位于染色体19上的推定性QPCTL，其编码区在19q13.32区域内。基于这种搜索，设计了用于使用细胞系筛选人isoQC的引物(表4)。人QPCTL的分离cDNA含有编码382个氨基酸长度的蛋白质的可读框，其中所述的可读框与人QC相关，表现45.24％的序列相同性和71.98％相似性。应用预测亚细胞定位的不同生物信息学算法(www.expasy.ch)未产生可靠结果。根据所述预测程序，预测被转向高尔基体或线粒体。

人QPCTL与金属肽酶ClanMH的M28家族成员中其它成员的氨基酸序列比对结果显示人QPCTL蛋白具有与人和小鼠QC(图1)以及细菌氨基肽酶(图3)的整体序列同源性和结构同源性。对额外的人QPCTL相关基因的数据库搜索揭示存在啮齿动物、猴、牛和犬QPCTL。这些序列与所述新型人QPCTL的比对结果显示它们表现与其人类对应物的巨大同源性。人QC(Asp-Glu-His)的锌络合残基在来自不同起源的QPCTL中保守(图2)。

人isoQC基因含有至少8个外显子。编码人isoQC蛋白质的序列位于第1至第7外显子。人isoQC定位于第19号染色体位置19q13.32处。用于人isoQC的细胞系筛选法揭示了来自肝脏(Hep-G2，肝细胞癌)、皮肤(HaCaT，角质形成细胞)和神经元组织(LN405，星形细胞瘤；SH-SY5Y，成神经细胞瘤)的细胞源(图6)中的转录物。

在几种表达宿主中测试分离的QPCTL-cDNA的功能性表达。成功应用于人QC的巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)表达没有产生有酶活性的蛋白质。在哺乳动物细胞中的表达导致检测到活性，然而，表达水平极低。因此，以技术人员的知识不可能分离有酶活性的蛋白质。仅在大肠杆菌(E.coli)中使用非常规表达条件(在存在37℃于1％葡萄糖的情况下表达4小时，使用20μMIPTG诱导表达)表达GST-QPCTL融合蛋白后才分离到有酶活性的蛋白质。所述表达条件在大肠杆菌中产生低水平表达，这是所述肽链发生功能性折叠必需的。

在另一个实施方案中，本发明涉及QPCTL敲除动物。所述动物优选是大鼠或小鼠。敲除小鼠在深入分析QPCTL基因功能中的使用是一种重要工具。

本发明的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式；DNA应当理解为包括cDNA、基因组DNA和合成性DNA。所述DNA可以是双链或单链的，并且若呈单链，则该DNA可以是编码链或非编码(反义)链。编码成熟多肽的编码序列可以与SEQIDNO：2-9中所示的编码序列相同，或它可以因遗传密码子的冗余性或简并性或单核苷酸多态性而与编码同一种成熟多肽的编码序列不同。例如，所述编码序列也可以是包含SEQIDNO：11-18任一之完整长度的RNA转录物。

编码SEQIDNO：2-9的成熟蛋白的多核苷酸可以包含，但不限于所述成熟蛋白本身的编码序列；所述成熟多肽外加额外编码序列(如前导或分泌序列或蛋白原序列)的编码序列以及所述成熟蛋白的编码序列(和任选地额外编码序列)外加非编码序列(如内含子或所述成熟蛋白的编码序列的5′和/或3′非编码序列)。

因此，术语“编码多肽的多核苷酸”或术语“编码多肽的核酸”应当理解为仅包含所述成熟蛋白的编码序列的多核苷酸或核酸以及包含额外的编码和/或非编码序列的多核苷酸或核酸。术语“多核苷酸”与“核酸”可互换地使用。

本发明还包括这样的多核苷酸，其中所述成熟蛋白的编码序列可以与辅助表达多肽并从宿主细胞分泌的多核苷酸序列在相同的可读框中融合；例如，作为控制从细胞运输多肽的分泌序列而发挥作用的前导序列可以按这种方式融合。具有这种前导序列的多肽称作蛋白原或前蛋白原并且可以由宿主细胞切除该前导序列以形成该蛋白质的成熟形式。这些多核苷酸可以具有5′延伸区域，从而编码这样的蛋白原，其是成熟蛋白外加在氨基端的额外氨基酸残基。具有如此原序列(prosequence)的表达产物称作蛋白原，其是所述成熟蛋白的非活性形式；然而，一旦此原序列被裂解，则留下有活性的成熟蛋白。因此，例如，本发明的多核苷酸可以编码成熟蛋白或编码具有原序列的蛋白质或具有原序列及前序列(前导序列)的蛋白质。

本发明的多核苷酸也可以具有与允许纯化本发明多肽的标记序列以符合可读框方式融合的编码序列。当使用哺乳动物的宿主例如COS-1细胞时，所述标记序列可以是多组氨酸标签、血凝素(HA)tag、c-myc标签或V5标签。

HA标签对应于从流感病毒血凝素蛋白衍生的表位(Wilson，I.等，Cell，37：767(1984))并且c-myc标签可以是来自人Myc蛋白的表位(Evans，G.I.等，Mol.Cell.Biol.5：3610-3616(1985))。

术语“基因”意指参与产生多肽链的DNA的节段；它包括在编码区之前和之后的区域(前导区和尾随区)以及各个编码节段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

术语“显著的序列同源性”意指至少25％、优选至少40％的氨基酸残基保守，并且至少40％的非保守残基是保守性置换。

本发明全长基因的片段可以用作针对cDNA文库的杂交探针，以分离全长cDNA和分离与该基因具有显著序列同源性并编码具有相似生物学活性或功能的蛋白质的其它cDNA。出于本申请目的，相似的生物学活性或功能意指分别定义为QC活性和EC活性的从肽、蛋白质、激素或其它底物的氨基端谷氨酰胺或谷氨酸形成焦谷氨酸酯的能力。这种类型的探针具有至少14个碱基(来自SEQIDNO：2-9之一的至少14个连续核苷酸)、优选至少30个碱基，并且这种探针可以含有例如50个或更多个碱基。优选SEQIDNO：53-61的探针。此探针也可以用来鉴定与全长转录物和/或含有完整基因(包括调节区和启动子区、外显子和内含子)的基因组克隆相对应的cDNA克隆。具有与本发明基因的序列互补的序列的标记寡核苷酸用于筛选人cDNA、基因组DNA或mRNA的文库或自其它来源或动物的相似文库，以确定与所述探针杂交的文库成员。作为实例，可以使用已知DNA序列来合成寡核苷酸探针，后者随后在文库筛选中用来分离目的基因的编码区。

本发明设想还提供与本文上述序列杂交的多核苷酸，其中所述序列之间存在至少70％、优选至少90％并且更优选至少95％相同性或相似性，并且所述序列因此编码具有相似生物学活性的蛋白质。此外，如本领域已知、当氨基酸序列含有针对序列中每一个残基的相同或保守型氨基酸置换物时，在两个多肽之间存在“相似性”。相同性和相似性可以使用序列分析软件(例如在PBIL(BioinformatiqueLyonnais)http://npsa-pbil.ibcp.fr)上的ClustalW)进行测量。本发明特别提供在严格性条件下与本文上述多核苷酸杂交的此类多核苷酸。如本文中所用，术语“严格性条件”意指允许多核苷酸序列与SEQIDNO：2-9的多核苷酸序列之间在至少约70％相同性存在的情况下杂交。

合适严格性条件可以由例如预杂交溶液和杂交溶液中盐和甲酰胺的浓度、或由杂交温度定义，并且是本领域熟知的。尤其，严格性可以通过降低盐浓度、通过增加甲酰胺浓度和/或通过升高杂交温度而提高。

例如，在高度严格性条件下的杂交可以在约37℃-42℃上使用约50％甲酰胺，而在降低严格性条件下的杂交可以在约30℃-35℃上使用约35％-25％甲酰胺甲酰胺。用于在高度严格性条件下杂交的一个特定条件组合使用42℃，50％甲酰胺、5×SSPE、0.3％SDS和200μg/ml剪切和变性鲑精DNA。对于在降低严格性下的杂交，可以在35％甲酰胺中在降低的温度35℃上使用与上文所述相似的条件。可以通过计算目的核酸的嘌呤/嘧啶比并据此调节温度而进一步缩小与特定严格性水平相对应的温度范围。本领域熟知在上述范围和条件上的变化。优选地，杂交应当仅在序列之间存在至少95％并且更优选至少97％相同性时才发生。与优选实施方案中的上文所述多核苷酸杂交的多核苷酸编码这样的多肽，其显示与SEQIDNO：2-9的cDNA之一所编码的成熟蛋白基本上相同的生物学功能或活性。

如所提及，合适的多核苷酸探针可以具有至少14个碱基、优选30个碱基并且更优选至少50个碱基，并如本文以上所述，将与本发明的多核苷酸杂交，其中所述的本发明多核苷酸与所述探针具有相同性并且可以保留或可以不保留活性。例如，此类多核苷酸可以用作分别与EQIDNOS：2-9的多核苷酸杂交的探针，例如用于回收这种多核苷酸，或用作诊断性探针或用作PCR引物。因此，本发明包括这样的多核苷酸，其与分别编码SEQIDNO：11-18的多肽的多核苷酸或其片段和与此类核苷酸编码的多肽具有至少70％相同性、优选至少90％的相同性，其中所述的片段优选地具有至少30个碱基并且更优选至少50个碱基。

如本领域熟知，遗传密码子是冗余的，即某些氨基酸由多于一个的核苷酸三联体(密码子)编码，并且本发明包括使用与本文序列中具体例举的密码子不相同的密码子编码相同氨基酸的那些多核苷酸序列。这种多核苷酸序列在本文中称做“等效”多核苷酸序列。本发明还包括本文以上所述的多核苷酸的变体，所述变体编码这样的片段，如具有SEQIDNO：11-18任一项的推导氨基酸序列的多肽之一的成熟蛋白、类似物和衍生物的部分或全部。所述多核苷酸的变体形式可以是该多核苷酸的天然存在性等位变体或该多核苷酸的非天然存在性变体。例如，所述核酸中的变式可以是仅因遗传密码子简并性而产生的氨基酸密码子序列差异，或可以存在缺失变体、置换变体和添加或插入变体。如本领域已知，等位变体是多核苷酸序列的变异形式，其可以具有基本上不改变所编码多肽的生物学功能的一个或多个核苷酸的置换、缺失或添加。

本发明也包括具有SEQIDNO：11-18的推导氨基酸序列的多肽，以及此类多肽的片段、类似物和衍生物。当指SEQIDNO：11-18的多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”意指基本上保留与此类多肽相同的生物学功能或活性的多肽。类似物可以例如包括这样的蛋白原，该蛋白原可以因该蛋白原部分裂解而激活以产生活性的成熟蛋白。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽；然而，它们优选地是糖基化或非糖基化重组多肽。

SEQIDNO：11-18任一之多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)这样的一种片段、衍生物或类似物，其中一个或多个氨基酸残基替换为保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)并且这种置换的氨基酸残基可以是或可以不是遗传密码子编码的氨基酸残基，或(ii)这样的一种片段、衍生物或类似物，其中一个或多个氨基酸残基包含取代基，或(iii)这样的一种片段、衍生物或类似物，其中额外的氨基酸与成熟蛋白融合，如前导序列或分泌序列或用于纯化所述成熟多肽机或蛋白原序列的序列。此类片段、衍生物和类似物是本领域技术人员基于本文中教授内容而能够提供的。

本发明的多肽和多核苷酸应当处于分离的形式下，并且优选地将它们纯化至基本上均一或纯粹。基本上均一意指至少约85％的纯度。

术语“分离”用来意指材料已经从其最初环境(例如若该材料是天然存在的，则其天然环境)中移出。例如，在活的动物中存在的天然存在性多核苷酸或多肽不视为分离的，不过当相同的多核苷酸或多肽基本上与天然系统中全部共存性材料分开时，则视其是分离的。对于DNA，本术语包括例如这样的重组DNA，其中所述的重组DNA并入载体、自主复制性质粒或病毒或者原核生物基因组或真核生物基因组，或作为独立于其它序列的独立分子存在性分子(例如由聚合酶链反应(PCR)或限制性核酸内切酶消化产生的cDNA或基因组片段或cDNA片段)。本术语还包括作为编码额外多肽序列(如融合蛋白)的杂合基因的部分的重组DNA。该术语还包括这样的重组DNA，其包含SEQIDNO：2-9中所示核苷酸的一部分，所述的部分编码QPCTL的可变剪接变体。在SEQIDNO：19-22中例举多种可变剪接变体。

本发明的多肽包括SEQIDNO：11-18的任一多肽(尤其成熟蛋白)以及与SEQIDNO：11-18的多肽之一具有至少75％相似性(例如优选至少50％并且更优选至少70％相同性)的多肽、更优选与SEQIDNO：11-18的多肽之一具有至少85％相似性(例如优选至少70％相同性)并且最优选与SEQIDNO：11-18的任一多肽具有至少95％的相似性(例如优选至少90％相同性)。此外，本发明多肽应当优选地包含此类多肽的明确部分，所述的明确部分含有至少30个氨基酸并且更优选至少50个氨基酸的序列。

本发明多肽的片段或部分可以用作中间体以通过肽合成法产生相应的全长多肽。本发明多核苷酸的片段或部分也可以用来合成本发明的全长多核苷酸。

本发明也包括含有此类多核苷酸的载体，用所述载体进行遗传工程化的宿主细胞并且使用这些载体和宿主细胞通过重组技术产生多肽。宿主细胞用这样的载体进行遗传工程化(转导或转化或转染)，其中所述载体可以例如是克隆载体或表达载体。所述载体可以是质粒、病毒粒子、噬菌体等形式。工程化的宿主细胞可以是在常规营养培养基中培养，其中所述的常规营养培养基改进用于激活启动子、选择转化体或扩增本发明基因。如技术人员熟知，培养条件如温度、pH等是随所选择用于表达的宿主细胞而通常使用的那些培养条件。

本发明的多核苷酸可以用于通过重组技术产生多肽。因此，例如，可以在表达多肽的多个表达载体的任一载体中包含所述的多核苷酸。此类载体包括染色体性、非染色体性和合成性DNA序列，例如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；从质粒与噬菌体DNA的组合中衍生的载体；病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、鸡痘病毒和伪狂犬病毒。然而，可以使用任何其它载体，只要它在宿主中可复制和有活力。

可以通过多种方法将适宜DNA序列插入所述载体。一般而言，所述DNA序列通过本领域熟知的方法插入适宜的限制性核酸内切酶位点，其中所述方法处于本领域技术人员的能力范围内。

表达载体中的DNA序列与指导mRNA合成的适宜表达控制序列(启动子)有效连接。作为此类启动子的代表性实例，可以提到：LTR或SV40启动子、大肠杆菌lac或trp、噬菌体λ的P.sub.L启动子和已知在原核细胞或真核细胞或其病毒中控制基因表达的其它启动子。

所述表达载体也应当含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。该载体也可以包含用于扩增表达的适宜序列。此外，此表达载体优选地含一种或多种选择标记基因以提供选择已转化宿主细胞的表型属性，对于真核细胞培养，标记基因例如是二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或在大肠杆菌中，例如是四环素抗性或氨苄青霉素抗性。

含有如本文以上所述的适宜DNA序列以及适宜启动子或控制序列的载体可以用来转化适宜宿主以使该宿主表达蛋白质。作为适宜宿主的代表性实例，可以提到的是：细菌细胞如大肠杆菌、链霉菌(Streptomyces)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)；真菌细胞如酵母；昆虫细胞，如果蝇(Drosophila)S2和夜蛾(Spodoptera)Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等.对适宜宿主的选择因本文中教授内容而处于本领域技术人员的能力范围内。

如从CLONTECH95/96目录第215-216页，CLONTECH，1020EastMeadowCircle，PaloAlto，Calif.94303显而易见，本领域熟知核酸序列的合成性产生。因此，本发明也包括用于产生本发明蛋白质的表达载体。本发明还包括了包含如上文概述的一个或多个序列的重组构建体。该构建体可以包含其中已经以正向或反向插入本发明序列的载体，如质粒或病毒载体。在这个实施方案的优选方面，所述构建体还包含与本发明序列有效连接的调节序列，所述调节序列包括例如启动子。为数众多的合适载体和启动子是本领域技术人员已知的并且可商业获得的。以举例方式提供以下载体：细菌载体：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescriptSK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNHI8A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR54和pRIT5(Pharmacia)；以及真核载体：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTI、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。然而，可以使用任何其它的合适质粒或载体，只要它在宿主中可复制和有活力。

启动子区可以是选自使用CAT(氯霉素乙酰转移酶)载体或具有选择标记的其它载体的任何所需的基因。

两种适宜载体是pKK232-8和pCM7。具体提到的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP.sub.R、P.sub.L和trp。真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶、SV40早期和晚期启动子、来自逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白-I启动子。选择适宜载体和启动子则完全处于本领域技术人员的能力范围内。

表达载体组件一般可以包括：1)作为选择标记的新霉素磷酸转移酶(G418)或潮霉素B磷酸转移酶(hyg)基因、2)复制起点、3)T7和SP6噬菌体启动子序列、4)lac操纵基因序列、5)乳糖操纵子阻遏物基因(lacIq)和6)多克隆位点接头区。这种复制起点(oriC)可以从pUC19(LTI，Gaithersburg，Md.)衍生。

根据下文实施例1和2中描述的PCR方法，使用PCR引物生成具有适宜限制性位点的编码SEQIDNO：2-9的多肽之一的核苷酸序列，其中所述的PCR引物具有旨在克隆isoQCMetI和MetII至载体EGFP-N3内的限制性位点EcoRI(作为5′引物)和SalI(作为3′引物)，或用于克隆isoQC至载体pET41a的位点SpeI(作为5′引物)和EcoRI(作为3′引物)。将PCR插入物进行凝胶纯化并且用相容性限制性酶消化。根据标准方案连接所述插入物和载体。

在又一个实施方案中，本发明提供含有上述构建体的宿主细胞。该宿主细胞可以是是高等真核生物细胞，如哺乳动物细胞，或低等真核生物细胞如酵母细胞，或所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。可以通过磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖介导转染法、脂质体转染法或电穿孔法(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，BasicMethodsinMolecularBiology，(1986))实施向宿主细胞导入所述构建体。

优选地以常规方式在宿主细胞中使用此类构建体来产生由重组序列编码的基因产物。或者，本发明的多肽可以通过常规肽合成仪合成地产生或通过化学连接如此制备的合适片段而产生。

成熟蛋白可以在合适启动子的控制下表达在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中。也可以使用无细胞翻译系统来利用从本发明的DNA构建体中衍生的RNA产生此类蛋白质。随原核宿主和真核宿主使用的适宜克隆载体和表达载体由Sambrook，等，MolecularCloning：ALaboratoryManual，SecondEdition，ColdSpringHarbor，N.Y.，(1989)描述。

通过将增强子序列插入载体内而提高高等真核生物对编码本发明多肽的DNA的转录。

增强子包括作用于启动子以提高其转录的DNA顺式作用元件，通常其长度是约10-300bp。增强子的实例包括在复制起点晚期侧100-270bp的SV40增强子、细胞巨化病毒早期启动子/增强子、复制起点晚期侧的多型瘤增强子和腺病毒增强子。

通常，重组表达载体将包含复制起点和促使宿主细胞转化的选择标记(例如大肠杆菌氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母(S.cerevisiae)TRP1基因)和从高表达基因衍生以指导下游结构基因转录的启动子。此类启动子可以从编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶、或热休克蛋白等的操纵子衍生。异源结构序列以适宜方式与翻译起始序列和终止序列和优选地与前导序列装配，其中所述的前导序列能够指导翻译的蛋白质分泌至周质间隙或胞外培养基内。任选地，所述异源序列可以编码包含氨基端识别肽的融合蛋白，其中所述的氨基端识别肽赋予所需的特征，如稳定所表达的重组产物和简化其纯化。

通过插入编码所需蛋白质的结构性DNA序列连同与功能性启动子位于有效阅读相内的合适翻译起始与终止信号而构建用于细菌的表达载体。

该载体将包含一个或多个表型选择标记和复制起点以确保维持该载体并且根据需要在宿主内提供扩增。用于转化的合适原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、鼠伤寒沙门氏菌和假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)中的多个物种，不过也可以选用其它原核宿主。

作为代表性而非限制性实例，用于细菌用途的有用表达载体可以包含从含有熟知克隆载体pBR322(ATCC37017)的遗传元件的市售质粒中衍生的选择标记和细菌复制起点。此类商业化载体包括，例如，pKK223-3(PharmaciaFineChemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(PromegaBiotec，Madison，Wis.，U.S.A.)。这些pBR322“主链”部分与适宜启动子和待表达的结构性序列组合。

在转化合适的宿主株系并培育该宿主株系至适宜细胞密度后，通过合适方式(例如，温度变换或化学诱导)诱导所选的启动子并且将细胞培养额外的时间段。

细胞一般通过离心收集并随后通过物理或化学手段破坏，留下所得粗提物用于进一步纯化。

可以通过任何便利方法破坏蛋白质表达中所用的微生物细胞，所述方法包括冻融循环法、超声处理法、机械破坏法和利用细胞裂解剂；此类方法是本领域技术人员熟知的。

多种哺乳动物细胞培养系统也可以用来表达重组蛋白质。哺乳动物表达系统的实例包括Gluzman，Cell，23：175(1981)描述的猴肾成纤维细胞系COS-7。能够表达相容性载体的其它细胞系包括例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物的表达载体一般包含复制起点、合适的启动子和增强子并且还包含任意必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5′侧翼非翻译序列。从SV40剪接体衍生的DNA序列和聚腺苷酸化位点可以用来提供所需非转录的遗传元件。

多肽可以通过包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸提取法、阴离子或阳离子交换层析法、磷酸纤维素层析法、疏水相互作用层析法、亲和层析法、羟基磷灰石层析法和凝集素层析法在内的方法从重组细胞培养物回收。若所述多肽表达在细胞表面上，则可以辅助回收，不过这不是前提条件。也可以回收裂解的产物，其中所述的裂解产物在所述多肽的较长形式表达后受到裂解。根据需要，可以使用本领域已知的蛋白质再折叠步骤来实现成熟蛋白的构象。高效液相色谱(HPLC)可以用于最终纯化步骤。

本发明的多肽可以是纯化的天然产物或通过重组技术从原核或真核宿主(例如通过培养的细菌、酵母、高等植物、昆虫或哺乳动物细胞)产生。根据在重组产生方法中使用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。本发明的多肽也可以包括一个初始甲硫氨酸氨基酸残基。

在优选的实施方案中，本发明的蛋白质是分离和纯化的，从而基本上不含有来自其它蛋白质的杂质。例如，本发明的蛋白质应当占样品中存在的总蛋白质的至少80％(重量)、更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选占总蛋白质的至少98％(重量)。

这些蛋白质可以是在水、另一种合适溶剂如二甲基亚砜(DMSO)或乙醇或者合适溶剂的混合物中的溶液形式。

溶剂混合物的实例包括在水中的10％(重量)乙醇和在水中的2％(重量)DMSO。溶液还可以包含盐、缓冲剂、离液剂、去垢剂、防腐剂等。或者，所述蛋白质可以是固体形式，如冻干粉末或结晶固体，此形式也可以包含残余溶剂、盐等。

如本文中所用，术语“抗体”包括多克隆抗体、亲和纯化的多克隆抗体、单克隆抗体和抗原结合片段，如F(ab′)₂和Fab′蛋白酶解片段。也包括基因工程完整抗体或片段，如嵌合抗体、Fv片段、单链链抗体等以及合成性抗原结合肽和多肽。非人抗体可以通过移植非人CDR至人框架和恒定区上或通过并入完整的非人可变结构域(任选地通过替换暴露的残基而用人样表面覆盖所述非人可变结构域，其中所得产物是“镶嵌(veneered)”抗体)进行人源化。在一些情况下，人源化抗体可以保留人可变区框架结构域内的非人残基以增强正确结合特征。通过使抗体人源化，可以提高生物学半寿期并且可降低在施用至人后的不利免疫反应。

用于产生或选择本文中有用抗体的可选技术包括体外使淋巴细胞暴露于人isoQC蛋白质或其肽，并且在噬菌体或相似载体中选择抗体展示文库(例如通过使用固定化或标记的人isoQC蛋白质或肽)。

可以通过筛选在噬菌体(噬菌体展示)上或在细菌(如大肠杆菌)上展示的随机文库而获得编码具有潜在性人isoQC多肽结合结构域多肽的基因。编码此类多肽的核苷酸序列可以按照本领域熟知的众多方法获得。

如本领域技术人员显然明白，多克隆抗体可以通过用人isoQC多肽或其片段接种多种温血动物如马、奶牛、山羊、绵羊、犬、鸡、兔、小鼠和大鼠而产生。人isoQC多肽的免疫原性可以通过使用佐剂如铝佐剂(氢氧化铝)或弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，或表面活性物质如溶血卵磷脂、Pluronic多元醇、多聚阴离子、肽、油乳剂、KLH或二硝基酚加以提高。在用于人类的佐剂中尤其优选卡介苗BCG(bacilliCalmette-Guerin)和短小棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)。用于免疫的多肽也包括融合多肽，如isoQC或其部分与免疫球蛋白多肽或与麦芽糖结合蛋白的融合物。多肽免疫原可以是全长分子或其部分。若所述的多肽部分是″半抗原样的″，则这个部分可以与大分子载体如匙孔(虫戚)血蓝蛋白(KLH)，牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素有利地联合或连接用于免疫。也可以使用本领域熟知的方法产生针对isoQC的抗体。此类抗体可以包括，但不限于多克隆、单克隆、嵌合和单链抗体、Fab片段和由Fab表达文库产生的片段。

中和抗体(即阻断或调节在活性部位处相互作用的那些抗体)尤其优选用于治疗性用途。

为产生与QPCTL特异性结合的抗体，结合性蛋白或肽，可以筛选单链抗体、Fab片段、其它抗体片段、非抗体蛋白结构域或肽的文库。所述文库可以使用噬菌体、其它重组DNA方法或肽合成法产生(Vaughan，T.J.等NatureBiotechnology14：309-314(1966))。此类文库通常使用旨在鉴定显示与QPCTL特异性结合的序列的本领域熟知方法进行筛选。

优选的是，用来诱导抗QPCTL抗体的寡肽、肽或片段具有由至少约5个氨基酸并且更优选由至少约10个氨基酸组成的氨基酸序列。还优选这些寡肽、肽或片段与天然蛋白质的氨基酸序列的一部分相同。QPCTL氨基酸的短片段也可以与另一种蛋白质(如KLH)的那些短段融合，并且可以产生针对该嵌合分子的抗体。

针对QPCTL的单克隆抗体可以使用任意的熟知技术制备，其中所述的熟知技术通过培养的连续细胞系产生抗体分子。这些技术包括但不限于杂交瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术和EBV-杂交瘤技术，不过可以优选由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。

此外，可以使用旨在产生“嵌合抗体”的技术，如将小鼠抗体基因剪接至人抗体基因以获得具有适宜抗原特异性和生物学活性的分子，参见Neuberger，M.S.等Nature312：604-608(1984)。可以改进对产生单链抗体所描述的技术来使用本领域已知的方法产生QPCTL特异性单链抗体。可以通过从免疫球蛋白随机组合文库中的链改组作用而产生具有相关特异性，但是不同独特型组成的抗体(BurtonD.R.Proc.Natl.Acad.Sci.88：11120-11123(1991))。

如文献中所披露，抗体也可以通过诱导淋巴细胞群体中的体内生产或通过筛选免疫球蛋白文库或淘选出高度特异性结合的试剂而产生(Orlandi，R.等Proc.Natl.Acad.Sci.86：3833-3837(1989))。

也可以产生含有针对QPCTL的特异性结合位点的抗体片段。例如，此类片段包括，但不限于通过胃蛋白酶消化抗体分子所产生的F(ab′)₂片段和通过还原F(ab′)₂片段的二硫桥而产生的Fab片段。或者，可以构建Fab表达文库来迅速和容易地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段(Huse，W.D.等Science254：1275-1281(1989))。

可以使用多种免疫测定法来鉴定具有所需特异性的抗体。本领域熟知使用具有已确立特异性的多克隆或单克隆抗体的竞争性结合测定法或免疫放射测定法的众多方案。此类免疫测定法一般包括测量QPCTL与其特异性抗体之间的复合物形成。优选利用对两个非干扰性QPCTL表位有反应的单克隆抗体的基于双位点单克隆抗体的免疫测定法。不过也可以使用竞争性结合测定法。

如较早提及，可以在疾病治疗中使用QPCTL。

适用于本发明的该方面的药物组合物包括这样的组合物，其中以实现与所述疾病之一相关的预期目的有效量包含活性成分。治疗有效量的确定完全处于本领域技术人员的能力范围内并且可以最初在细胞培养测定法(如癌细胞培养测定法中)或在动物模型中建立，所述的动物模型通常是小鼠、大鼠、兔、犬或猪。动物模型也可以用来确定适宜的施用浓度范围和途径，所述信息随后通常用来确定用在人类中的施用剂量和途径。

治疗有效量指活性成分例如QPCTL或其片段、DPRP抗体或QPCTL激动剂、拮抗剂或抑制剂可缓解疾病具体症状或状况的量。例如，待施用的量可以在与预期靶底物接触时有效环化该靶底物的氨基端Glu或Gln。治疗效力和毒性可以类似地通过标准药学方法在细胞培养中或用实验动物确定，如通过计算ED50(在50％群体中治疗性有效的剂量)或LD50(在50％群体中致死的剂量)统计量。中毒效应/治疗效应的剂量比是治疗指数，并且其可以表述为LD50/ED50比。优选显示大的治疗指数的药物组合物。从细胞培养测定法和动物研究中获得的数据在订出人用途的剂量范围中使用。在此类组合物中所含的剂量优选地处于这样的循环浓度范围内，其包括毒性微小或无毒性的ED50。所述剂量在该范围内根据所用剂型、患者敏感性和施用途径而变化。

确切剂量一般会由医学从业者考虑与要求治疗的对象相关的因素加以确定，同时调整剂量和施用方法以提供足够水平的活性部分并且维持想要的效果。待考虑的因素包括疾病状态的严重性、对象一般健康状况、对象年龄、体重和性别、饮食、施用时间和频率、药物联合、反应灵敏度和对治疗的耐受性/应答。根据具体制剂的半寿期和清除率，长效药物组合物可以每隔3-4日或甚至每隔2周施用。

本发明的又一个方面提供这样的多核苷酸分子，其具有与SEQIDNO：2-9的多核苷酸mRNA转录物为反义的序列。施用反义多核苷酸分子可以阻断由SEQIDNO：2-9的QPCTL基因所编码蛋白质的产生。本领域已知用于制备反义多核苷酸分子和施用此类分子的技术。例如，可以将反义多核苷酸分子包裹到脂质体内以便细胞融合。

尤其，SEQIDNO：2-9的QPCTL基因在脑、前列腺、肺、心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织中的表达为该基因在下文所述疾病的病理学中的潜在作用提供证据。因此，在又一个方面，本发明涉及用于检测与适宜QPCTL活性或表达水平相关的疾病的诊断性测定法。特异性结合QPCTL的抗体可以用于诊断以QPCTL表达为特征的病症或在用于监测患者的测定法中使用，其中所述的患者用QPCTL或用QPCTL的激动剂或拮抗剂(抑制剂)治疗。用于诊断目的抗体可以按照与上文对治疗物质所描述的那些抗体相同的方式制备。对于QPCTL诊断性测定法包括利用所述抗体和标记物来检测人体液中或细胞或组织的提取物中QPCTL的方法。所述抗体可以在修饰或不修饰的情况下使用，并且它们可以通过与报告分子共价或非共价地连接而加以标记。本领域已知类型广泛的报告分子。也可以使用已经加以修饰从而无催化活性的重组QPCTL蛋白作为显性负向抑制剂。此类修饰包括例如对活性部位突变。

本领已知用于测量QPCTL的多种方法，包括ELISA、RIA和FACS，并且所述方法提供诊断改变的或异常的QPCTL表达水平。通过将取自正常哺乳动物对象、优选人的体液或细胞提取物在适于形成复合物的条件下与抗QPCTL抗体合并而建立QPCTL表达的正常值或标准值。用于检测生物学样品中QPCTL的方法将包括步骤a)提供生物学样品；b)将该生物学样品与抗QPCTL抗体在适于QPCTL与该抗体之间形成复合物的条件下合并；和c)检QPCTL与该抗体之间的复合物形成，因而确定QPCTL在此生物学样品中的存在。

随后可以通过多种方法、优选通过光量法定量复合物形成的量。表达在对象、对照和来自活检组织的疾病样品中的QPCTL量与所述标准值比较。标准值与对象值之间的偏差建立用于诊断疾病的参数。

在本发明的另一个实施方案中，出于诊断目的，使用编码QPCTL的多核苷酸，其中所述的多核苷酸可以包括寡核苷酸序列、互补性RNA和DNA分子和PNA。这些多核苷酸可以用来检测和定量活检组织中的基因表达，在所述活检组织中QPCTL的表达可以与所述疾病之一相关。所述诊断性测定法可以用来区别QPCTL不存在、存在和过量表达并用来监测治疗性介入期间对QPCTL水平的调节。此外，可以使用QPCTL基因的药物基因组学、单核苷酸多态性(SNP)分析作为筛选突变的方法，其中所述的突变指示疾病预后或对药物的改良应答。

可以使用QPCTL多核苷酸和多肽序列、其片段、QPCTL的抗体和QPCTL的激动剂、拮抗剂或抑制剂作为研究工具来鉴定分子识别事件并且鉴定与QPCTL蛋白相互作用的蛋白质、多肽和肽。具体实例是噬菌体展示肽文库，其中可以在单轮次淘选中筛选出大于10⁸个肽序列。本领域已知此类方法和其它方法并且它们可以用来鉴定抑制或增强SEQIDNO：11-18的任一QPCTL的活性的化合物。

偶联的关系代表功能性相互作用如复合物或途径，并且与QPCTL相互作用的蛋白质可以通过酵母双杂交系统、蛋白质组学(差异性2D凝胶分析和质谱法)和基因组学(通过微阵列或基因表达连续分析法SAGE的差异性基因表达)鉴定。

被鉴定为与QPCTL功能性联系的蛋白质以及相互作用方法形成了针对这些QPCTL-蛋白质相互作用的抑制剂、激动剂与拮抗剂和调节剂的筛选方法基础。

如本文中所用，术语“拮抗剂”指这样的抑制剂分子，其与QPCTL结合时减少QPCTL的生物学或免疫学活性的量或效应持续时间，例如降低该肽酶环化QPCTL底物氨基末端处Glu残基或Gln残基的酶活性。拮抗剂可以包括降低QPCTL效应的蛋白质、核酸、糖类、抗体或任何其它分子；例如，它们可以包括通过竞争型或非竞争型机制结合并失活QPCTL的小分子和有机化合物。优选QPCTL的小分子抑制剂。最优选QPCTL的竞争性小分子抑制剂。

QPCTL酶活性抑制剂的具体实例在实施例4中描述。抑制剂可以例如是QPCTL环化酶活性的抑制剂，或另外是QPCTL对蛋白质的结合活性的抑制剂，其中所述的蛋白质与QPCTL相互作用。此类抑制剂的具体实例可以例如包括配制到培养基中的抗QPCTL抗体、肽、蛋白质片段或小型肽酰基蛋白酶抑制剂或非肽有机小分子抑制剂，以便引入所需的细胞类型。可选地，此类抑制剂可以与靶向性配体连接以便由细胞介导的内吞作用或其它受体介导事件导入。此类方法在下文进一步描述，并且鉴于本文中公开的QPCTL核苷酸和氨基酸序列，其可以由本领域技术人员实施。

QPCTL的其它用途是筛选用作治疗物质的潜在拮抗剂，例如，用于抑制与QPCTL的结合以及用于筛选激动剂。QPCTL、其免疫原性片段或其寡肽可以用于任意的多种药物筛选技术中筛选作为预期激动剂或拮抗剂的化合物的文库。在此类筛选法中使用的片段可以游离在溶液中、固定至固体支持物、承载于细胞表面上或位于胞内。随后测量QPCTL与所测试物质之间结合性复合物的形成。旨在发现会抑制QPCTL的拮抗剂的其它测定法从专利号WO2004/098625、WO2004/098591和WO2005/075436的公开内容中显而易见，其中所述专利描述QC的抑制剂并且所述专利完整地并入本文中。这些QPCTL的另一个重要用途是筛选QC抑制剂来证明它们同样抑制一种或多种QPCTL而没有不希望的副作用。

所提供用于筛选小分子文库来鉴定结合QPCTL的分子的方法一般包括：a)提供小分子文库；b)将所述小分子文库与SEQIDNO：11-18的多肽或与其片段载适于复合物形成的条件下合并；和c)检测复合物形成，其中所述复合物的存在确定了与所述QPCTL结合的小分子。

一种鉴定拮抗剂的方法包括在裂解将正常发生的条件下将结合QPCTL的小分子连同生色底物(例如Ala-Pro-AFC或Ala-Pro-AMC)送递至源于细胞的提取物，其中所述的细胞以表达QPCTL的载体转化，并且随后通过监测荧光变化或UV光吸收的变化而测定对所述酶的裂解作用的抑制，因而通过分光光度法来鉴定抑制裂解作用的分子。在存在所述分子的情况下，反应速率降低或荧光或UV光吸收的总量降低则确定该小分子是降低QPCTL催化活性/酶活性的拮抗剂，一旦鉴定此类分子，则可以施用它们来减少或抑制QPCTL对氨基端Glu残基或Gln残基的环化。

根据另一个具体方面，本发明提供筛选化合物的方法，所述的化合物能够抑制本发明的至少一种成熟蛋白的酶活性，其中所述的成熟蛋白优选地选自SEQIDNO：11-18，所述方法包括在存在一种或多种测试化合物或其盐的情况下温育所述成熟蛋白和针对该成熟蛋白的合适底物，测量所述成熟蛋白的酶活性，将此活性与在缺乏测试化合物下所测定的可相比的活性比较并且选择降低所述酶活性的测试化合物或化合物。

此外，本发明也提供筛选选择性QC抑制剂(即能够抑制QC酶活性的化合物)的方法，其中所述的QC优选地是SQIDNO：10的蛋白质，其不抑制本发明的至少一种成熟蛋白的酶活性，其中所述的成熟蛋白优选地选自SEQIDNO：11-18的蛋白质，所述方法包括在存在一种或多种抑制剂或其盐的情况下温育所述成熟蛋白和合适底物，测量所述成熟蛋白的酶活性，将此活性与在缺乏所述QC抑制剂下所测定的可相比的活性比较并且选择不降低所述成熟蛋白的酶活性的化合物。

此外，本发明也提供筛选选择性QPCTL抑制剂即至少一种QPCTL蛋白的酶活性的化合物的方法，其中所述的QPCTL蛋白优选地是SQIDNO：10的蛋白质，其不抑制QC的酶活性，其中所述的QC优选选自SEQIDNO：11-18的蛋白质，所述的方法包括在存在QPCTL的一种或多种抑制剂或其盐的情况下温育所述QC，测量QC的酶活性，将此活性与在缺乏所述QPCTL抑制剂下所测定的可相比的活性比较并且选择不降低所述QPCTL蛋白的酶活性的化合物。

QC的有用抑制剂在WO2004/098625、WO2004/098591、WO2005/039548和WO2005/075436中描述，其中所述的QC抑制剂也可以用作QPCTL的抑制剂，所述文献完整地并入本文中，尤其就所述抑制剂的结构及其产生方面而言。

QPCTL-抑制剂的实例

合适本发明用途和方法的潜在QPCTL-抑制剂在WO2005/075436中披露，所述文献就QC抑制剂的结构、合成和施用方法方面完整地并入本文中。

具体地：

合适的化合物是式1^*的化合物：

式1^*

在又一个实施方案中，QPCTL的抑制剂可以是式1a的那些抑制剂，

其中R在实例1-53中定义。

实例	R	ESI-MS(M+H)
			1	甲基	199.3
2	叔丁基	241.4
			3	苄基	275.4
4	苯基	261.4
			5	4-(氟)-苯基	279.35
6	4-(氯)-苯基	295.80
			7	4-(乙基)-苯基	289.41
8	4-(三氟甲基)-苯基	329.4
			9	4-(甲氧羰基)-苯基	319.4
10	4-(乙酰基)-苯基	303.4
			11	4-(甲氧基)-苯基	291.4
12	双环[2.2.1]庚-5-烯2-基	277.5
			13	3，4-(二甲氧基)-苯基	321.5
14	2，4-(二甲氧基)-苯基	321.5
			15	3，5-(二甲氧基)-苯基	321.5
16	2-(甲氧羰基)-苯基	319.4
			17	4-(噁唑-5-基)-苯基	328.5
18	4-(吡唑-1-基)-苯基	327.4
			19	4-(异丙基)-苯基	303.5
20	4-(哌啶-1-磺酰基)-苯基	408.6
			21	4-(吗啉-4-基)-苯基	346.5
22	4-(氰基)-苯基	286.4
			23	2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-基	319.4
24	苯并[1，3]二氧杂环戊烯-5-基	305.4
			25	3，4，5(三甲氧基)-苯基	351.5
26	3-(甲氧基)-苯基	291.4

实例	R	ESI-MS(M+H)
			27	4-(乙氧基)-苯基	305.5
28	4-(苄氧基)-苯基	367.5
			29	4-(甲氧基)-苄基	305.5
30	3，4-(二甲氧基)-苄基	335.5
			31	2-(甲氧羰基)-噻吩-3-基	325.5
32	33-(乙氧基-羰基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-基	392.6
			33	2-(甲氧羰基)-4-(甲基)-噻吩-3-基	339.5
34	苯并[c][1，2，5]噻唑-4-基	319.5
			35	苯并[c][1，2，5]噻唑-5-基	319.5
36	5-(甲基)-3-(苯基)-异噁唑-4-基	342.5
			37	3，5-(二甲基)-异噁唑-4-基	280.4
38	4-(碘)-苯基	387.3
			39	4-(溴)-苯基	340.3
40	4-(甲基)-苯基	275.4
			41	萘-1-基	311.5
42	4-(硝基)-苯基	306.4
			43	丁基	241.4
44	环辛基	295.5
			45	呋喃-2-基甲基	265.4
46	四氢呋喃-2-基甲基	269.4
			47	苯并[1，3]二氧杂环戊烯-5-基甲基	319.4
48	2-(吗啉-4-基)-乙基	298.5
			49	4-(甲基巯基)-苯基	307.5
50	4-(二甲基氨基)-苯基	304.5
			51	4-(三氟甲氧基)-苯基	345.4
52	苯甲酰基	288.3
			53	嘧啶-4-基	261.1

QPCTL的其它合适抑制剂可以是式1b的抑制剂，

其中R¹和R²在实例54-95中定义。

实例	R¹	R²
			54	氰基	甲基
55	氰基	3，4-(二甲氧基)-苯基
			56	氰基	2，4-(二甲氧基)-苯基
57	氰基	3，5-(二甲氧基)-苯基
			58	氰基	2，3-二氢苯并[b][1，4]二噁英-7-基
59	氰基	苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-6-基
			60	氰基	3，4，5-(三甲氧基)-苯基
61	氰基	3-(甲氧基)-苯基
			62	氰基	4-(乙氧基)-苯基
63	氰基	4-(苄氧基)-苯基
			64	氰基	苯基
65	氰基	4-(甲氧基)-苯基
			66	氰基	4-(乙酰基)-苯基
67	氰基	4-(硝基)-苯基
			68	氰基	苄基
69	氰基	萘-1-基
			70	氰基	4-(氟)-苯基
71	氰基	4-(碘)-苯基
			72	氰基	4-(溴)-苯基
73	氰基	环辛基
			74	氰基	叔丁基
75	氰基	4-(甲基)-苯基
			76	氰基	4-(甲硫基)-苯基
77	氰基	4-(乙基)-苯基
			78	氰基	4-(二甲基氨基)-苯基

实例	R¹	R²
			79	氰基	丁基
80	氰基	三苯甲基
			81	氰基	(苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-6基)甲基
82	氰基	(四氢呋喃-2基)甲基
			83	氰基	4-(三氟甲基)-苯基
84	氰基	(呋喃-2-基)甲基
			85	氰基	2-(吗啉-4-基)-乙基
86	氰基	4-(噁唑-5-基)-苯基
			87	氰基	嘧啶-3-基
88	氰基	4-(氰基)-苯基
			89	氰基	4-(三氟甲氧基)-苯基
90	氰基	4-(哌啶磺酰)-苯基
			91	氰基	4-(1H-吡唑-1-基)苯基
92	H	3，4-(二甲氧基)-苯基
			93	甲基	3，4-(二甲氧基)-苯基
94	氰基	2，3，4-(三甲氧基)-苯基
			95	氰基	环庚基

QPCTL的其它合适抑制剂可以是式1c的抑制剂，

其中R³在实例96-102中定义。

实例	R³	ESI-MS(M+H)
			96	乙基	197.3
97	6-氟-4H-苯并[d][1，3]二噁英-8-基	321.4
			98	3-(环戊氧基)-4-(甲氧基)-苯基	359.4
99	4-(庚氧基)-苯基	359.5
			100	3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚-7-基	317.4
101	4-(丁氧基)-苯基	317.4

实例	R³	ESI-MS(M+H)
			102	3，4-(二甲氧基)-苯基	305.4

QPCTL的其它合适抑制剂可以是式1d的抑制剂，

其中所述环上的位置在103-105实例中定义。

实例	苄基取代的位置	ESI-MS(M+H)
			103	2	383.5
104	3	383.5
			105	4	383.5

QPCTL的其它合适抑制剂可以是式1e的抑制剂，

其中R⁴和R⁵在实例106-109中定义。

QPCTL的其它合适抑制剂可以是式1f的抑制剂，

其中R⁶在实例110-112中定义。

实例	R⁶	ESI-MS(M+H)
			110	H	259.4
111	氯	293.8
			112	甲氧基	289.4

QPCTL的其它合适抑制剂可以是式1g的抑制剂，

其中R⁷、R⁸和R⁹在实例113-132中定义。

QPCTL的其它合适抑制剂可以式1h的那些抑制剂，

其中n在实例133-135中定义。

实例	N	ESI-MS(M+H)
			133	3	306.4
134	4	320.5
			135	5	334.5

QPCTL的其它合适抑制剂可以是式1i的抑制剂，

其中m在136和137实例中定义。

实例	m	ESI-MS(M+H)
			136	2	307.4
137	4	335.5

QPCTL的其它合适抑制剂可以是式138-141的抑制剂。

如本文中所用，术语“激动剂”指这样的抑制剂分子，其与QPCTL结合时增加或延长QPCTL效应的持续时间。拮抗剂可以包括与QPCTL结合并调节其性能的蛋白质、核酸、糖类、抗体或任何其它分子。尽管证明小分子是QPCTL激动剂的可能性较小，然而用于鉴定结合QPCTL的这种小分子作为激动剂的方法包括将结合QPCTL的小分子的生色形式送递至用表达QPCTL的载体所转化的细胞内，并通过分光光度法测定荧光或UV光吸收变化。UV吸收或荧光的增加量，确定所述小分子是提高QPCTL活性的激动剂。

如公开的PCT申请WO84/03564中所述，可使用的另一种药物筛选技术对这样的化合物提供了高通量筛选法，其中所述的化合物对目的蛋白质具有合适的结合亲和力。在所述方法中，在固体基质(如塑料针或某些其它表面)上合成大量的不同小分子测试化合物。所述测试化合物与QPCTL或其片段反应，并且随后被洗去。结合的QPCTL随后通过本领域熟知的方法进行检测。纯化的QPCTL也可以直接包被在用于前述药物筛选技术中的平板上。可选地，可以使用非中和抗体来捕获肽并且将所述肽固定在固体支持物上。

在另一个实施方案中，可以使用竞争性药物筛选测定法，其中能够结合QPCTL的中和抗体与测试化合物竞争对QPCTL的结合。以这种方式，可以使用抗体来检测任何与QPCTL共有一个或多个抗原决定簇的肽的存在。

如上所示，通过研究结合位点，可以设计这样的配体，此配体例如对QPCTL具有比QPCTL天然配体更大的相互作用。此类拮抗剂配体将以较高的亲和力与QPCTL结合并且因而充当竞争性配体。可选地，可以设计与天然QPCTL的配体结合位点同源或类似的合成性蛋白质或重组蛋白，如可以设计对QPCTL具有高亲和力的其它分子。此类分子也应当能够替换QPCTL并提供保护性效果。

如上所示，认识QPCTL的结构能够设计合成性结合位点的同系物和类似物。此类分子将大大促进利用结合特性来靶向潜在治疗物质，并且它们也可以用来筛选潜在治疗物质。此外，它们可以用作单克隆抗体产生中的免疫原，所述的抗体本身可以用在如本文前述的诊断/或疗法中。

治疗用途

本领域已知淀粉样肽例如Aβ1-42(SEQIDNO：23)和Aβ1-40(SEQIDNO：24)由蛋白裂解酶例如氨基肽酶或二肽酰氨基肽酶以氨基端方式截短，产生Aβ-肽3-42(SEQIDNO：25)、3-40(SEQIDNO：26)、11-42(SEQIDNO：27)和11-40(SEQIDNO：28)。这些截短的Aβ肽始于氨基端处的谷氨酸残基并且因此是QC的底物(还参见WO2004/09862)并且可能还是SEQIDNO：11-18、21和22的QPCTL、优选SEQIDNO：11，12，21和22的人isoQC、最优选SEQIDNO：11和12的人isoQC的底物。所得SEDIDNOS29-32的pGlu-Aβ肽比非焦谷氨酸化的肽具有大得多的疏水性，极易于形成A-β肽聚集物，如寡聚物和原纤维(fibrill)，并且证明具有高度神经毒性。最后，SEQIDNO：29-32的Aβ-肽在阿尔茨海默病和唐氏综合征发展中扮演重要角色。

因此，可以将SEQIDNO：11-18、21和22的QPCTL、优选SEQIDNO：11，12，21和22的人isoQC、最优选SEQIDNO：11和12的人isoQC的抑制剂用于治疗淀粉样肽相关性疾病，尤其神经变性疾病，特别是阿尔茨海默病和唐氏综合征。

QPTCL在哺乳动物中的其它潜在生理性底物选自由Glu¹-ABri(SEQIDNO：33)、Glu¹-ADan(SEQIDNO：34)和Gln¹-促胃液素(17和34)(SEQIDNO：35和36)组成的组。它们的焦谷氨酸化形式(SEQIDNO：37-40)造成这样的疾病，其选自由伴有或不伴有幽门螺杆菌感染的十二指肠癌、结直肠癌、Zolliger-Ellison综合征、家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)组成的组中的那些疾病。因此，可以使用QPCTL的抑制剂来治疗这些疾病。

表3中显示QPTCL的其它潜在生理性底物。

表3：带氨基端谷氨酰胺残基的生理活性肽的氨基酸序列

肽	氨基酸序列	功能
			促胃液素17(SEQ ID NO：35)Swiss-Prot：P01350	QGPWL EEEEEAYGWM DF(酰胺)	促胃液素刺激胃粘膜产生并分泌盐酸并且刺激胰腺分泌消化酶。它也刺激胃和肠中平滑肌收缩并增加血液循环和水分泌。
神经降压肽(SEQ ID NO：41)Swiss-Prot：P30990	QLYENKPRRP YIL	神经降压肽在脂肪代谢调节中发挥内分泌或旁分泌作用。它引起平滑肌收缩。
			FPP	QEP酰胺	与促甲状腺素释放激素(TRH)相关的三肽，存在于精浆内。最近获得的体内和体外证据表明FPP在调节精子能育性方面发挥重要作用。
TRHSwiss-Prot：P20396	QHP酰胺	TRH的功能是作为垂体前叶中TSH生物合成的调节物和作为中枢神经系统和周围神经系统中的神经递质/神经调质
			GnRH(SEQ ID NO：42)Swiss-Prot：P01148	QHWSYGL RP(G)酰胺	刺激促性腺激素分泌；它刺激促黄体生成激素和促卵泡激素的分泌。
CCL16(小分子可诱导细胞因子A16)(SEQ ID NO：43)Swiss-Prot：O15467	QPKVPEW VNTPSTCCLKYYEKVLPRRL VVGYRKALNCHLPAIIFVTK RNREVCTNPNDDWVQEYIKD PNLPLLPTRNLSTVKIITAK NGQPQLLNSQ	显示对淋巴细胞和单核细胞的趋化活性，但对嗜中性粒细胞不显示趋化活性。还显示强烈的骨髓抑制活性，抑制髓系祖细胞增殖。重组SCYA16显示对单核细胞和THP-1单核细胞的趋化活性，但对驻留性淋巴细胞和嗜中性粒细胞不显示趋化活性。在通过先期表达RANTES而脱敏的THP-1细胞中诱导钙流。
			CCL8(小分子可诱导细胞因子A8)(SEQ ID NO：44)Swiss-Prot：P80075	QPDSVSI PITCCFNVINRKIPIQRLES YTRITNIQCPKEAVIFKTKR GKEVCADPKERWVRDSMKHL DQIFQNLKP	吸引单核细胞、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的趋化因子。可以在瘤形成和炎性宿主反应中发挥作用。该蛋白质可以结合肝素。
CCL2(小分子可诱导细胞因子A2)(SEQ ID NO：45)Swiss-Prot：P13500	QPDAINA PVTCCYNFTNRKISVQRLAS YRRITSSKCPKEAVIFKTIV AKEICADPKQKWVQDSMDHL DKQTQTPKT	吸引单核细胞和嗜碱性粒细胞，但不吸引嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞的趋化因子。增进单核细胞抗肿瘤活性。已经在以单核细胞浸润为特征的疾病(如银屑病、类

肽	氨基酸序列	功能
					风湿性关节炎或动脉粥样硬化)的病理发展中显示作用。可以参与在动脉粥样硬化的疾病过程期间召集单核细胞至动脉管壁内。与CCR2和CCR4结合。
CCL18(小分子可诱导细胞因子A18)(SEQ ID NO：46)Swiss-Prot：P55774	QVGTNKELC CLVYTSWQIPQKFIVDYSET SPQCPKPGVILLTKRGRQIC ADPNKKWVQKYISDLKLNA	吸引淋巴细胞但不吸引单核细胞或粒细胞的趋化因子。可以参与B细胞移行至淋巴结中的B细胞滤泡内。在淋巴结中吸引原态T淋巴细胞至树突状细胞并激活巨噬细胞，具有对原态T细胞、CD4+和CD8+T细胞的趋化活性并且因此可以在体液免疫应答和细胞介导免疫应答中均发挥作用。
			CXXXC趋化分子(神经趋化因子)(SEQ ID NO：47)Swiss-Prot：P78423	QHHGVT KCNITCSKMTSKIPVALLIH YQQNQASCGKRAIILETRQH RLFCADPKEQWVKDAMQHLDRQAAALTRNG GTFEKQIGEVKPRTTPAAGG MDESVVLEPEATGESSSLEP TPSSQEAQRALGTSPELPTG VTGSSGTRLPPTPKAQDGGP VGTELFRVPPVSTAATWQSS APHQPGPSLWAEAKTSEAPS TQDPSTQASTASSPAPEENA PSEGQRVWGQGQSPRPENSL EREEMGPVPAHTDAFQDWGPGSMAHVSVVP VSSEGTPSREPVASGSWTPK AEEPIHATMDPQRLGVLITP VPDAQAATRRQAVGLLAFLG LLFCLGVAMFTYQSLQGCPRKMAGEMAEGL RYIPRSCGSNSYVLVPV	可溶性形式对T细胞和单核细胞有趋化性，但对嗜中性粒细胞无趋化性。膜结合形式促进这些白细胞与内皮细胞粘附。可以在调节内皮处白细胞粘附和移行过程中发挥作用。与cx3cr1结合。
CCL7(小分子可诱导细胞因子A7)(SEQ ID NO：48)	QPVGINT STTCCYRFINKKIPKQRLES YRRTTSSHCPREAVIFKTKL DKEICADPTQ	吸引淋单核细胞和嗜酸性粒细胞，但不吸引嗜中性粒细胞的趋化因子。增进单核细胞抗肿瘤活性。还诱导明胶酶B。该蛋白

肽	氨基酸序列	功能
			Swiss-Prot：P80098	KWVQDFMKHL DKKTQTPKL	质可以结合肝素。与CCR1、CCR2和CCR3结合。
食欲肽A(下丘泌素-1)(SEQ ID NO：49)Swiss-Prot O43612	QPLPDCCRQK TCSCRLYELLHGAGNHAAGI LTL	在调节摄食和睡眠-清醒中发挥重要作用的神经肽，其可能通过协调这些互补性稳态功能的复杂行为应答和生理应答而发挥作用。此神经肽也在能量代谢稳态调节、自主功能、激素平衡和体液调节中发挥更广泛作用。食欲肽-A以高亲和力与OX1R和OX2R均结合。
			P物质(SEQ ID NO：50)	RPK PQQFFGLM	属于激素肽。激素肽是兴奋神经元、唤醒行为应答的活性肽，是强烈的血管扩张剂和促泌素并且(直接或间接)使多种平滑肌收缩。

肽Gln¹-促胃液素(17个和34个氨基酸长度)、Gln¹-神经降压肽和Gln¹-FPP被鉴定为QPCTL的新型生理性底物。促胃液素、神经降压肽和FPP包含在氨基端位置处的pGlu残基。该氨基端pGlu残基可以从氨基端谷氨酰胺通过QPCTL对全部上述肽的催化作用而形成。因此就其生物学功能而言，这些肽在所述氨基端谷氨酰胺残基转化成pGlu时激活。

跨上皮转导性细胞，尤其促胃液素(G)细胞，在胃中随食物抵达而协调胃酸分泌。最近研究证实多种活性产物从促胃液素前体产生，并且在促胃液素的生物合成中存在多个控制点。生物合成前体和中间体(促胃液素原和Gly-促胃液素)是推定生长因子；其产物-酰胺化促胃液素-调节上皮细胞的增殖、产酸性胃壁细胞与组胺分泌性肠嗜铬样(ECL)细胞的分化并且与ECL细胞中组胺合成和贮藏相关的基因表达，以及急剧刺激酸分泌。促胃液素还刺激产生表皮生长因子(EGF)家族成员，后者转而抑制胃壁细胞功能，还刺激表面上皮细胞生长。血浆促胃液素浓度在具有幽门螺杆菌的对象中升高，其中已知所述的对象具有增加的十二指肠溃疡病和胃癌风险(Dockray，G.J.1999JPhysiol15315-324)。

已知从胃窦G细胞释放的肽激素-促胃液素通过CCK-2受体刺激泌酸粘膜中组胺的合成和从ECL细胞的释放。动员的组胺通过与胃壁细胞上的H(2)受体结合而诱导酸分泌。近来的研究表明促胃液素的完全酰胺化形式或较少加工形式(促胃液素原和甘氨酸延伸的促胃液素)也是胃肠道的生长因子。已经确立酰胺化促胃液素的主要营养效应针对胃的泌酸粘膜，在所述的泌酸粘膜中酰胺化促胃液素引起胃干细胞和ECL细胞增殖增加，导致增加的胃窦细胞和ECL细胞质量。换句话说，加工较少的促胃液素(例如甘氨酸延伸的促胃液素)的主要营养目标似乎是结肠粘膜(Koh，T.J.和Chen，D.2000RegulPept9337-44)。

在又一个实施方案中，本发明提供增加活性的QPCTL效应物的用途，用于刺激胃肠道细胞增殖、尤其产酸性胃壁细胞增殖和组胺分泌性肠嗜铬样(ECL)细胞增殖、产酸性胃壁细胞和分泌组胺的肠嗜铬样(ECL)细胞的分化以及与ECL细胞中组胺合成和贮藏相关的基因的表达以及用于通过维持或增加活性pGlu¹-促胃液素(SEQIDNO：39和40)的浓度而在哺乳动物中急剧刺激酸分泌。

在又一个实施方案中，本发明提供QPCTL的抑制剂的用途，用于通过减少无活性Gln¹-促胃液素(SEQIDNO：35和36)至活性pGlu¹-促胃液素(SEQIDNO：39和40)的转化而治疗哺乳动物中伴有或不伴有幽门螺杆菌感染的十二指肠溃疡病和胃癌。

神经降压肽(NT)(SEQIDNO：41)是涉及精神分裂症病理生理学的特异性调节神经递质系统的神经肽，其中所述的神经递质系统先前证实在所述病症中功能失调。已经测量脑脊液(CSF)NT浓度的临床研究揭示了具有降低的CSFNT浓度的精神分裂症患者亚群，其中所述的CSFNT浓度通过有效抗精神病药物疗法得以恢复。还存在与NT系统参与抗精神病药物作用机理相一致的大量证据。中枢方式施用的NT行为性效果和生物化学效果与全身施用的抗精神病药物明显相似，并且抗精神病药物增加NT神经传递。这种研究结果的关联产生这样的假设：NT作为内源性抗精神药物发挥作用。此外，典型和非典型抗精神病药物差异性地改变黑质纹状体和中脑边缘多巴胺终末区内的NT神经传递，并且这些效应分别预知副作用易患性和疗效(Binder，E.B.等2001BiolPsychiatry50856-872)。

因此，本发明提供增加活性的QPCTL效应物的用途，用于制备抗精神病药物和/或用于哺乳动物中治疗精神分裂症。所述的QPCTL效应物维持或增加活性pGlu¹-神经降压肽的浓度。

与促甲状腺素释放激素(TRH)相关的三肽存在于精浆内。最近获得体内和体外证据表明FPP在调节精子能育性方面发挥重要作用。具体而言，FPP初始地刺激无受精性(非获能性)精子″转变″并更迅速地变得能育，不过随后致获能停滞，从而精子不发生自发性顶体丢失并且因而不丧失受精能力。这些应答由腺苷模拟并实际上被其增强，其中已知腺苷调节腺苷酰环化酶(AC)/cAMP信号转导途径。已经证明FPP和腺苷均刺激非获能性细胞中cAMP的产生，不过在获能细胞中则抑制其产生，同时FPP受体某种程度地与腺苷受体和G蛋白相互作用以实现对AC的调节。这些事件影响多种蛋白质的酪氨酸磷酸化状态，其中某些蛋白质在初始“转变”中重要，其它蛋白质可能参与顶体反应本身。也存在于精浆中的降钙素和血管紧张素II对非获能性精子具有相似的体外效果并且可以增进对FPP的应答。这些分子具有相似的体内效果，通过刺激并随后维持受精能力而影响能育性。FPP、腺苷、降钙素和血管紧张素II的可获得性降低或其受体缺陷导致雄性不育(Fraser，L.R.和Adeoya-Osiguwa，S.A.2001VitamHorm63，1-28)。

在又一个实施方案中，本发明提供QPCTL的抑制剂用于制备受精抑制药物和/或在哺乳动物中降低能育性的用途。所述的QPCTL抑制剂降低活性pGlu¹-FPP的浓度，从而导致防止精子获能和失活精细胞。相反，可以证实的是增加活性的QC效应物能够在雄性中刺激能育性和能够治疗不育。

在又一个实施方案中，本发明中鉴定了QPCTL的其它生理性底物。这些生理性底物是Gln¹-CCL2(SEQIDNO：45)、Gln¹-CCL7(SEQIDNO：48)、Gln¹-CCL8(SEQIDNO：44)、Gln¹-CCL16(SEQIDNO：43)、Gln¹-CCL18(SEQIDNO：46)和Gln¹-CXXXC趋化分子(SEQIDNO：47)。详见表2。这些多肽在病理生理学状况如髓系祖细胞增殖的抑制、瘤形成、炎性宿主反应、癌症、银屑病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、体液免疫应答和细胞介导的免疫应答、白细胞粘附和在内皮处的移行过程中发挥重要作用。

最近在临床试验中研究了几种针对乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒和黑素瘤的基于细胞毒T淋巴细胞肽的疫苗。单独或与其它肿瘤抗原组合的一种有趣的黑素瘤候选疫苗是十肽ELA。这种肽是Melan-A/MART-1抗原免疫优势肽类似物，带氨基端谷氨酸。已经报道谷氨酸的氨基和γ-羧基、以及谷氨酰胺的氨基和γ-甲酰胺基容易缩合以形成焦谷氨酸衍生物。为解决这个稳定性问题，已经开发几种药学目的肽，其具有替代氨基端谷氨酸或谷氨酰胺的焦谷氨酸，而不丧失药理学特性。不过与ELA相比，所述焦谷氨酸衍生物(PyrELA)以及另外氨基端乙酰基加帽衍生物(AcELA)不能激发细胞毒T淋巴细胞(CTL)活性。即便在PyrELA和AcELA中导入了表观细微的修饰，然而这两种衍生物可能比ELA具有对特定的主要组织相容性复合物I型的较低亲和力。因此，为了保留ELA的全部活性，必须避免形成PyrELA(BeckA.等2001，JPeptRes57(6)：528-38.)。近来，发现酶谷氨酰环化酶(QC)也在黑素瘤中过量表达(RossD.T等，2000，NatGenet24：227-35.)。

因此，本发明提供QPCTL的抑制剂用于制备药物的用途，所述的药物用于治疗病理生理学状况，如髓系祖细胞增殖的抑制、瘤形成、炎性宿主反应、癌症、恶性转移、黑素瘤、银屑病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、受损的体液免疫应答和细胞介导的免疫应答、白细胞粘附和在内皮处的移行。

此外，Gln¹-食欲肽A(SEQIDNO：49)被鉴定为本发明范围内的QPCTL的生理性底物。食欲肽A是在调节摄食和睡眠-清醒中发挥重要作用的神经肽，其可能通过协调这些互补性稳态功能的复杂行为应答和生理应答而发挥作用。此神经肽也在能量代谢稳态调节、自主功能、激素平衡和体液调节中发挥作用。

在又一个实施方案中，本发明提供QPCTL的抑制剂用于制备药物的用途，所述的药物用于治疗摄食和睡眠-清醒受损、能量代谢稳态调节受损、自主功能受损、激素平衡受损和体液调节作用受损。

在几种蛋白质中的多谷氨酰胺延伸物导致神经变性病，如帕金森病和肯尼迪病。其机制很大程度依然未知。多谷氨酰胺重复序列的生物化学特性提出一种可能的解释：在谷氨酰基-谷氨酰基键处的内分解裂解，随后形成焦谷氨酸盐，这可能通过增进多谷氨酰基蛋白质的代谢稳定性、疏水性、淀粉样蛋白生成性和神经毒性而有助于病理发展(Saido、T；MedHypotheses(2000)Mar；54(3)：427-9)。因此，本发明因而提供QPCTL的抑制剂用于制备治疗帕金森病和亨廷顿病的药物的用途。

QPTCL的又一种底物是肽QYNAD(SEQIDNO：51)。其焦谷氨酸化形式pGlu-Tyr-Asn-Ala-Asp(pEYNAD)(SEQIDNO：52)是具有阻断电压门控钠通道的活性的有效药物。钠通道以高密度表达在有髓鞘的轴突上并且在哺乳动物脑和脊髓中沿轴突传导动作电位方面发挥专门作用。因此，预期钠通道参与多发性硬化(MS)、Guillain-Barré综合征和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病的病理生理学的若干方面。

在又一个实施方案中，本发明提供QPCTL的抑制剂用于制备药物的用途，所述的药物用于治疗炎性自身免疫性疾病，尤其用于治疗多发性硬化、Guillain-Barré综合征和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病，其中阻断电压门控钠通道的肽pEYNAD的形成受到抑制。

另外，本发明提供诊断性测定法，其包含QC抑制剂。

在另一个实施方案中，本发明提供诊断任一前述疾病和/或病况的方法，包括步骤

-收集来自疑似患有所述疾病和/或病况的对象的样品。

-使该样品与QC抑制剂接触，并且

-确定该对象是否患有所述疾病和/或病况。

优选地，所述诊断方法中的样品是血样、血清样品、脑脊液样品或尿样。

优选地，所述诊断方法中的对象是人。

优选地，所述诊断方法中的QC抑制剂是选择性QC抑制剂。

还优选用于所述诊断测定法中的是选择性QPCTL抑制剂。

本发明还涉及用于实施诊断方法的诊断试剂盒，其中所述的诊断方法包括作为检测手段的前述诊断性测定法和确定方法。

实施例1：人isoQC的制备

细胞系和培养基

非洲绿猴肾细胞系COS-7、人成神经细胞瘤细胞系SH-SY5Y、人星状细胞瘤细胞系LN405、人角质形成细胞瘤细胞系HaCaT和人肝细胞癌细胞系Hep-G2在适宜的细胞培养基(DMEM，10％FBS用于COS-7、SH-SY5Y、LN405、HaCaT)、(RPMI1640，10％FBS用于Hep-G2)中，在5％CO₂(HaCaT、Hep-G2、COS-7)或10％CO₂(SH-SY5Y、LN405)的增湿气氛下在37℃培养。

使用RT-PCR分析人isoQC表达

使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)从SH-SY5Y、LN405、HaCaT和Hep-G2细胞分离总RNA并且将其通过SuperScriptII(Invitrogen)进行逆转录。随后，用HerculaseEnhancedDNA-聚合酶(Stratagene)，使用引物isoQCh-1(有义，SEQIDNO：53)和isoQCh-2(反义，SEQIDNO：54)在25μl反应中对产生的cDNA产物的1∶12.5稀释物扩增人isoQC。利用StrataprepPCR纯化试剂盒纯化Hep-G2的PCR产物并且通过测序证实。

结果

使用RT-PCR分析人isoQC表达

发现人isoQC的转录物存在于细胞系SH-SY5Y(图6，泳道1)、LN405(图6，泳道2)、HaCaT(图6，泳道3)和Hep-G2(图6，泳道4)。Hep-G2的PCR产物通过测序证实。

人isoQC的分离

使用RT-PCR从Hep-G2细胞分离人isoQC全长cDNA。简而言之，Hep-G2细胞的总RNA由SuperScriptII(Invitrogen)逆转录。随后，用HerculaseEnhancedDNA-聚合酶(Stratagene)，使用引物isoQChu-1(有义，SEQIDNO：55)和isoQChu-2(反义，SEQIDNO：56)在25μl反应中对产生的cDNA产物的1∶12.5稀释物扩增人isoQC。将所得PCR-产物亚克隆至载体pPCRScriptCAMSK(+)(Stratagene)并且通过测序证实。

实施例2：哺乳动物细胞培养中isoQC的制备和表达

编码人isoQC-EGFP融合蛋白的质粒载体的分子克隆

全部克隆方法使用标准分子生物学技术进行。为在人细胞中表达人isoQC-EGFP融合蛋白，使用载体pEGFP-N3(Invitrogen)。在甲硫氨酸I或在甲硫氨酸II处开始的原态人isoQC的cDNA以符合可读框的氨基端方式与编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒融合。引物isoQCEGFP-1MetI(SEQIDNO：57)和isoQCEGFP-3(SEQIDNO：59)用于扩增始于甲硫氨酸I的人isoQC并且引物isoQCEGFP-2MetII(SEQIDNO：58)和isoQCEGFP-3(SEQIDNO：59)用于扩增始于甲硫氨酸II的人isoQC。利用限制性位点EcoRI和SalI，将片段插入载体pEGFP-N3(Invitrogen)并且正确的插入通过测序证实。随后，使用EndoFreeMaxi试剂盒(Qiagen)分离载体用于细胞培养目的。

hisoQC的氨基端序列的克隆方法

此外，利用用于扩增的EGFP-1(有义)(SEQIDNO：85)和EGFP-2(反义)(SEQIDNO：86)，将载体pEGFP-N3(Invitrogen)的EGFP序列导入载体pcDNA3.1(Invitrogen)。所述片段导入pcDNA3.1的XhoI位点。使用isoQCEGFP-1MetI(有义，SEQIDNO：57)和hisoQCSSEGFPpcDNA(反义)(SEQIDNO：87)作为针对始于甲硫氨酸I的hisoQC氨基端片段的引物并且使用isoQCEGFP-2MetII(有义，SEQIDNO：58)和hisoQCSSEGFPpcDNA(反义)(SEQIDNO：87)作为针对始于甲硫氨酸II的hisoQC氨基端片段引物，将始于甲硫氨酸I和II的各自在第53位丝氨酸处结尾的hisoQC氨基端序列以羧基端方式与载体pcDNA3.1中的EGFP融合。所述片段插入载体pcDNA3.1的EcoRI和NotI限制性位点。随后，使用EndoFreeMaxi试剂盒(Qiagen)分离载体用于细胞培养目的。

用于天然表达hisoQC和hQC的克隆方法

在使用引物hQC-1(有义)(SEQIDNO：82)和hQC-2(反义)(SEQIDNO：83)针对hQC、使用引物isoQCEGFP-1MetI(有义，SEQIDNO：57)和hisoQCpcDNA(反义)(SEQIDNO：84)针对始于甲硫氨酸I的hisoQC、并且使用引物isoQCEGFP-2MetII(有义)(SEQIDNO：58)和hisoQCpcDNA(反义)(SEQIDNO：84)针对始于甲硫氨酸II的hisoQC进行扩增后，将天然hQC插入载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen)的HindIII和NotI限制性位点并且将天然hisoQC插入载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen)的EcoRI和NotI限制性位点。

用于FLAG标签化的hisoQC和hQC的克隆方法

带羧基端FLAG标签的人QC在使用引物hQC-1(有义)(SEQIDNO：82)和hQCC-FLAGpcDNA(反义)(SEQIDNO：88)扩增后克隆至载体pcDNA3.1的HindIII和NotI限制性位点。带羧基端FLAG标签的人isoQC在使用isoQCEGFP-1MetI(有义)(SEQIDNO：57)和hisoQCC-FLAGpcDNA(反义)(SEQIDNO：89)作为针对始于甲硫氨酸1的hisoQC的引物并且使用isoQCEGFP-2MetII(有义)(SEQIDNO：58)和hisoQCC-FLAGpcDNA(反义)(SEQIDNO：89)作为针对始于甲硫氨酸2的hisoQC的引物扩增后插入载体pcDNA3.1。

实施例3：对哺乳动物细胞中人isoQC的免疫组织化学染色

COS-7和LN405的转染和组织化学染色

为表达始于甲硫氨酸I或甲硫氨酸II的人isoQC-EGFP融合蛋白，将COS-7和LN405在含有盖玻片的6孔培养皿中培养。将细胞培育至80％汇合，使用Lipofectamin2000(Invitrogen)根据制造商手册进行转染并且在转染溶液中温育5小时。此后，将所述溶液替换为适宜的生长培养基并且过夜培育细胞。

次日，细胞用D-PBS(Invitrogen)洗涤两次并且使用冰冷的甲醇在-20℃固定10分钟，随后使用D-PBS在室温进行3个洗涤步骤持续10分钟。为使高尔基带染色，将COS-7和LN405与兔抗甘露糖苷酶II多克隆抗体(Chemicon)以1∶50抗体稀释度在D-PBS中温育3小时。为使COS-7和LN405中的线粒体染色，将细胞与小鼠抗人线粒体单克隆抗体(Chemicon)以1∶100抗体稀释度在D-PBS中室温下温育3小时。随后，细胞用D-PBS洗涤三次持续10分钟。用于高尔基带染色的细胞与缀合于罗丹明-RedX(Dianova)的山羊抗兔IgG第二抗体在室温于黑暗中温育45分钟。用于线粒体染色的细胞与缀合于罗丹明-RedX(Dianova)的山羊抗小鼠IgG第二抗体在室温于黑暗中温育45分钟。此后，细胞用D-PBS在室温洗涤三次持续5分钟，并且细胞用D-PBS在室温洗涤三次持续5分钟并且将盖玻片至少用Citiflour封装(mounted)于显微镜载玻片上。在荧光显微镜(Carl-Zeiss)下观察细胞。

结果

1.LN405的转染和组织化学染色

始于甲硫氨酸I和甲硫氨酸II的人isoQC-EGFP融合蛋白在细胞系LN405中的表达(绿色荧光)导致所得蛋白质的区室化。使用甘露糖苷酶II抗体对LN405的高尔基带的复染(红色荧光)并随后用甘露糖苷酶II叠加人isoQC-EGFP，表明人isoQC-EGFP融合蛋白定位在高尔基体区室内(合并图像的黄颜色)(图7，9)。因此，显而易见的是始于甲硫氨酸II处的人isoQC足以导致人isoQC融合蛋白的高尔基体定位。

由于叠加后缺少合并图像的黄颜色，故始于甲硫氨酸I和II的人isoQC-EGFP融合蛋白表达(绿色荧光)和线粒体复染(红色荧光)没有揭示始于甲硫氨酸I或II的人isoQC-EGFP融合蛋白定位在线粒体中(图8，10)。

2.COS-7的转染和组织化学染色

与始自甲硫氨酸I和甲硫氨酸II的人isoQC-EGFP融合蛋白在细胞系LN405中的表达类似，始于甲硫氨酸I和甲硫氨酸II的人isoQC-EGFP融合蛋白在COS-7中的表达导致所得蛋白质的区室化(绿色荧光)。始于甲硫氨酸I和甲硫氨酸II的人isoQC-EGFP融合蛋白在细胞系LN405(绿色荧光)中的表达(绿色荧光)导致所得蛋白质的区室化。使用甘露糖苷酶II抗体对COS-7细胞的高尔基带的复染(红色荧光)并随后用甘露糖苷酶II叠加人isoQC-EGFP，表明人isoQC-EGFP融合蛋白定位在COS-7的高尔基体区室内(合并图像的黄颜色)(图11，13)。同样，始于甲硫氨酸II处的人isoQC-EGFP足以导致高尔基体定位。

如所期望，由于叠加后缺少合并图像的黄颜色，故COS-7中始于甲硫氨酸I和II的人isoQC-EGFP融合蛋白的表达(绿色荧光)和线粒体复染(红色荧光)没有导致始于甲硫氨酸I或II的人isoQC-EGFP融合蛋白定位在线粒体中(图12，14)。

实施例4：人isoQC在大肠杆菌中的表达和纯化

宿主株系和培养基

使用大肠杆菌菌株DH5α以增殖质粒并且大肠杆菌菌株BL21用于表达人isoQC。将大肠杆菌菌株根据制造商说明书(Qiagen(DH5α)Stratagene(BL21))培育、转化并分析。根据制造商推荐，制备大肠杆菌所需要的培养基即Luria-Bertani(LB)培养基。

编码人QC的质粒载体的分子克隆

全部克隆方法使用标准分子生物学技术进行。为在大肠杆菌BL21中表达，使用载体pET41a(Novagen)。始于第30位密码子(从甲硫氨酸II计数)的成熟人isoQC的cDNA以符合可读框方式与编码GST标签的质粒融合。在利用引物hisoQCpET41a-1(SEQIDNO：60)和hisoQCpET41a-2(SEQIDNO：61)(表4)扩增后，导入肠激酶的氨基端蛋白酶裂解位点和羧基端(His)₆标签。在亚克隆后，利用限制性位点SpeI和EcoRI将所述片段插入所述表达载体。

在大肠杆菌BL21中的表达和纯化

编码人isoQC的构建体转化至BL21细胞(Stratagene)并在37℃在选择性LB琼脂平板上培育。在37℃于含有1％葡萄糖的LB培养基中实施蛋白质表达。在达到OD₆₀₀大约0.8后，用20μMIPTG在37℃诱导isoQC表达4小时。细胞通过离心(4000×g，20分钟)从培养基分离，重悬在PBS(140mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa₂HPO₄，1.8mMKH₂PO₄，pH7.3)中并通过一个冻融循环随后通过一个FrenchPress进行裂解。此细胞裂解物使用含磷酸盐的缓冲液(50mMNa₂HPO₄，500mMNaCl，pH7.3)稀释至终体积1.5L并且在4℃在13,400×g上离心1小时。离心后，使用Bradford方法测定所得上清液的蛋白质浓度，根据需要，将所述溶液再次稀释以获得0.6mg/ml的最终总蛋白质浓度。利用一个4-步骤方案纯化GST-isoQC融合蛋白(表5)。纯度由图20中的SDS-PAGE分析显示。

实施例5：用于谷氨酰环化酶活性的测定法

荧光测定法

用微量平板NOVOStar读数仪(BMGLabtechnologies)在30℃开展全部测量。使用H-Gln-βNA以荧光测量方式评价QC活性。样品由在终体积250μl中的0.2mM生荧光底物、0.05MTris/HCl(pH8.0)中的0.25U焦谷氨酰基氨基肽酶(Qiagen，Hilden，Germany)和适度稀释的QC等分试样组成。激发/发射波长是320/410nm。测定反应通过添加谷氨酰环化酶启动。QC活性在测定条件下从β-萘胺的标准曲线中测定。一个单位定义为在所述条件下每分钟催化1μmolpGlu-βNA从H-Gln-βNA中形成的QC的量。

在第二种荧光测定法中，使用H-Gln-AMC作为底物测定QC活性。利用微量平板NOVOStar读数仪(BMGLabtechnologies)在30℃实施反应。样品由在终体积250μl中多种浓度的生荧光底物、0.05MTris/HCl(pH8.0)中的0.1U焦谷氨酰基氨基肽酶(Qiagen)和适度稀释的QC等分试样组成。激发/发射波长是380/460nm。测定反应通过添加谷氨酰环化酶启动。QC活性在测定条件下从7-氨基-4-甲基香豆素的标准曲线中测定。使用GraFit软件评价动力学数据。

isoQC的分光光度计测量测定法

使用本测定法来测定绝大多数QC底物的动力学参数。使用连续式方法(Schilling，S.等，2003BiolChem384，1583-1592)，利用谷氨酸脱氢酶作为辅助酶，以分光光度测量方式分析QC活性。样品由终体积250μl中的相应QC底物、0.3mMNADH、14mMα-酮戊二酸和30U/ml谷氨酸脱氢酶组成。反应通过添加QC而启动并且通过监测在340nm处吸光度的下降而进行8-15分钟。在测定条件下评价初速度并且从氨的标准曲线中测定酶活性。使用微量平板Sunrise读数仪在30℃测量全部样品。使用GraFit软件评价动力学数据。

抑制剂测定法

对于抑制剂检验，样品组成与上文所述相同，除了添加推定的抑制性化合物以外。为快速检验QC抑制作用，样品含有4mM的各种抑制剂和1K_M的底物浓度。为详细研究所述抑制作用并测定K_i-值，首先研究所述抑制剂对所述辅助酶的影响。在每种情况下，对检测的两种酶均无影响，因此能够可靠地确定QC抑制作用。使用GraFit软件，通过将一组进程曲线拟合至竞争性抑制的通用方程而评价抑制常数。

结果

通过人isoQC的转化作用评价了多种不同底物(表3)。全部所分析的底物均被isoQC转化，显示与人QC相似的相对宽松的整体特异性(Schilling，S.等，2003BiolChem384，1583-1592)。如先前对人QC所观察(Schilling，S.等，2003BiolChem384，1583-1592)，对携带与氨基端谷氨酰基残基毗邻的大体积疏水性氨基酸的底物(例如Gln-AMC)观察到最高特异性常数(k_cat/K_M)。相反，在相同位置内带负电荷的残基导致特异性显著降低，如对Gln-Glu所观察那样，从而指示isoQC中带负电荷的活性部位。与人QC相比，两种重组isoQC显示较低的酶活性(图21)。差异至多到一个数量级。根据isoQC的特异性，如此假设是合理的：该酶负责体内转化不同底物，即isoQC参与众多不同生理性底物的产生。

人isoQC活性受咪唑衍生物竞争性抑制(表6，图15)。咪唑和苯并咪唑的抑制常数K_i与先前对人QC所获得的值极相似。然而，对强效QC抑制剂P150/03观察到K_i下降10倍。因此，螯合部分即咪唑环的结合模型似乎很相似。假设地，该种情况因QC和isoQC的活性部位锌离子被咪唑碱性氮络合引起。P150/03的K_i值差异清楚地表明这两种酶的活性部位显示难以觉察的差异。因此，可以产生对一种酶同功型显示出选择性的抑制剂。选择性抑制剂有益于治疗所述疾病。

表3：动力学评价对人QC和人isoQC的肽底物。人isoQC在大肠杆菌BL21(hisoQCdt)或巴斯德毕赤酵母(YSShisoQC)中表达。底物以氨基酸单字编码显示。

底物

K_M(mM)hisoQCdt

K_M(mM)YSShisoQC

k_cat(s^-1)hisoQCdt

k_cat(s^-1)YSShisoQC

k_cat/K_M(mM^-1*s^-1)hisoQCdt

k_cat/K_M(mM^-1*s^-1)YSShisoQC

Q-βNA

0,03±0,002

0,035±0,0005

3,37±0,12

8,16±0,87

93,26±6,68

228,70±22,22

QAMC

0,01±0,0009

0,03±0,0064

1,07±0,03

3,72±0,44

62,57±5,68

102,87±29,22

QQ

0,11±0,027

0,11±0,007

2,72±0,25

6,08±0,17

24,50±4,009

54,32±4,61

QE

0,7±0,13

0,61±0,064

2,64±0,21

5,33±0,43

3,85±0,56

8,75±0,87

QG

0,42±0,04

0,36±0,047

1,65±0,04

3,24±0,18

3,93±0,31

9,01±1,75

QGP

0,21±0,016

0,23±0,02

4,01±0,14

8,98±0,07

18,82±1,26

38,42±3,55

QYA

0,22±0,01

0,08±0,022

7,7±0,4

16,47±0,72

66,48±13,07

206,9±57,54

QFA

0,11±0,016

0,104±0,025

7,49±0,28

11,68±2,39

33,03±2,38

116,99±34,37

QEYF

0,03±0,004

0,04±0,004

3,34±0,15

5,64±0,39

109,57±21,03

122,56±5,6

QEDL

0,63±0,052

0,16±0,01

6,41±0,15

9,24±0,65

10,2±0,84

55,04±5,14

表4：所用引物

引物	序列5’→3’	应用
			IsoQCh-1(SEQ ID NO：53)	GGTCTACACCATTTGGAGCGGCTGGC	细胞系筛选
IsoQCh-2(SEQ ID NO：54)	GGGTTGGAAGTACATCACTTCCTGGGG	细胞系筛选
			IsoQChu-1(SEQ ID NO：55)	ACCATGCGTTCCGGGGGCCGCGGG	hisoQC的分离
IsoQChu-2(SEQ ID NO：56)	ACGCTAGAGCCCCAGGTATTCAGCCAG	hisoQC的分离
			IsoQC EGFP-1 Met I(SEQ ID NO：57)	ATATATGAATTCATGCGTTCCGGGGGCCGC	将人isoQC(Met I)克隆至载体pEGFP-N3
IsoQC EGFP-2 Met II(SEQ ID NO：58)	ATATATGAATTCATGGAGCCACTCTTGCCGCCG	将人isoQC(Met II)克隆至载体pEGFP-N3
			IsoQC EGFP-3(SEQ ID NO：59)	ATATATGTCGACGAGCCCCAGGTATTCAGCCAG	将人isoQC(Met I和Met II)克隆至载体pEGFP-N3
HisoQC pET41a-1(SEQ ID NO：60)	ATATACTAGTGATGACGACGACAAGTTCTACACCATTTGGAGCG	将人isoQC克隆至载体pET41a
			HisoQC pET41a-2(SEQ ID NO：61)	TATAGAATTCCTAGTGATGGTGATGGTGATGGAGCCCCAGGTATTCAGC	将人isoQC克隆至载体pET41a
hisoQC HIS C-TermpPICZAA-1(SEQ ID NO：62)	ATA TGA ATT CTT CTA CAC CAT TTG GAG C	将人isoQC克隆至载体PPICZαA
			hisoQC HIS N-TermpPICZAA-1(SEQ ID NO：63)	ATA TGA ATT CCA TCA CCA TCA CCA TCA CTT CTACAC CAT TTG GAG CGG C	将人isoQC克隆至载体PPICZαA
hisoQC HIS N-TermpPICZAA-2(SEQ ID NO：64)	5’-ATA TAT GCG GCC GCC TAG AGC CCC AGG TATTCA GC-3’	将人isoQC克隆至载体PPICZαA
			isoQCm RTs(SEQ ID NO：65)	CCA GGA TCC AGG CTA TTG AG	isoQC的实时PCR分析
hisoQC HIS C-TermpPICZAA-2	ATA TAT GCG GCC GCC TAG TGA TGG TGA TGGTGA TGG AGC CCC AGG TAT TCA GCC AG	将人isoQC克隆至载体PPICZαA

引物	序列5’→3’	应用
			(SEQ ID NO：66)
isoQCm RTas(SEQ ID NO：67)	TTC CAC AGG GCC GGG GGG C	isoQC的实时PCR分析
			isoQCm MetI s(SEQ ID NO：68)	ATG AGT CCC GGG AGC CGC	鼠isoQC cDNA的克隆
isoQCm MetI as(SEQ ID NO：69)	CTA GAG TCC CAG GTA CTC	鼠isoQC cDNA的克隆
			isoQCm kurz s(SEQ ID NO：70)	AGT TCC TGC CCC TGC TGC TG	鼠isoQC cDNA的克隆
mQC RT s(SEQ ID NO：71)	ATC AAG AGG CAC CAA CCA AC	mQC的实时PCR分析
			mQC RTas(SEQ ID NO：72)	CTG GAT AAT ATT TCC ATA G	mQC的实时PCR分析
mQC RT氨基端s(SEQ ID NO：73)	ACA GCT GGG AAT CTG AGT C	mQC的实时PCR分析
			mQC RT氨基端as(SEQ ID NO：74)	GAG CAG AAT AGC TTC CGG GCG	mQC的实时PCR分析
Iso-I55Ns(SEQ ID NO：75)	CTG CGG GTC CCA TTG AAC GGA AGC CTC CCCGAA	位点定向诱变hisoQC I55N
			Iso-I55Nas(SEQ ID NO：76)	TTC GGG GAG GCT TCC GTT CAA TGG GAC CCGCAG	位点定向诱变hisoQC I55N
Iso-C351As(SEQ ID NO：77)	ACG GTA CAC AAC TTG GCC CGC ATT CTC GCTGTG	位点定向诱变hisoQC C351A
			Iso-C351Aas(SEQ ID NO：78)	CAC AGC GAG AAT GCG GGC CAA GTT GTG TACCGT	位点定向诱变hisoQC C351A
hQC-1(SEQ ID NO：82)	ATATATAAGCTTATGGCAGGCGGAAGACAC	将天然hQC插入pcDNA 3.1
			hQC-2(SEQ ID NO：83)	ATATGCGGCCGCTTACAAATGAAGATATTCC	将天然hQC插入pcDNA 3.1
hisoQC pcDNA as(SEQ ID NO：84)	ATATATGCGGCCGCCTAGAGCCCCAGGTATTCAGC	扩增用于插入pcDNA3.1的包含终止密码子的hisoQC
			EGFP-1(SEQ ID NO：85)	ATATCTCGAGTCCATCGCCACCATGGTGAGC	扩增EGFP

引物	序列5’→3’	应用
			EGFP-2(SEQ ID NO：86)	ATATCTCGAGTTACTTGTACA GCTCGTCCAT	扩增EGFP
hisoQC SS EGFPpcDNA as(SEQ ID NO：87)	ATATGCGGCCGCATGTCGACGCTCCAAATGGTGTAGAACGC	扩增hisoQC氨基端序列
			hQC C-FLAG pcDNAas(SEQ ID NO：88)	ATATGCGGCCGCTTACTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCCAAATGAAGATATTCCAA	扩增hQC C-FLAG
hisoQC C-FLAGpcDNA as(SEQ ID NO：89)	ATATGCGGCCGCCTACTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCGAGCCCCAGGTATTCAGC	扩增h-isoQC C-Flag
			Hs_QPCT_1_SG	QuantiTect 引物 Assay(200)，Qiagen，Hilden	qPCR hQC
Hs_QPCTL_1_SG	QuantiTect 引物 Assay(200)，Qiagen，Hilden	qPCR h-isoQC
			CCL2-F(SEQ ID NO：90)CCL2-R(SEQ ID NO：91)	GCCTCCAGCATGAAAGTCTCCAGATCTCCTTGGCCACAAT	qPCR CCL2
CCL7-F(SEQ ID NO：92)CCL7-R(SEQ ID NO：93)	ATGAAAGCCTCTGCAGCACTTGGCTACTGGTGGTCCTTCT	qPCR CCL7
			CCL8-F(SEQ ID NO：94)CCL8-R(SEQ ID NO：95)	TCACCTGCTGCTTTAACGTGATCCCTGACCCATCTCTCCT	qPCR CCL8
CCL13-F(SEQ ID NO：96)CCL13-R(SEQ ID NO：97)	ATCTCCTTGCAGAGGCTGAAAGAAGAGGAGGCCAGAGGAG	qPCR CCL13
			HIF1α-F(SEQ ID NO：98)HIF1α-R(SEQ ID NO：99)	CACAGAAATGGCCTTGTGAACCAAGCAGGTCATAGGTGGT	qPCR HIF1α
AIM1-F(SEQ ID NO：100)	TCCTTTCATCCTGGAACCTG	qPCR AIM1

引物	序列5’→3’	应用
			AIM1-R(SEQ ID NO：101)	CGCCTCTTCTGTTTCACCTC
AIM2-F(SEQ ID NO：102)AIM2-R(SEQ ID NO：103)	AAGCGCTGTTTGCCAGTTATCACACGTGAGGCGCTATTTA	qPCR AIM2
			MAGEA1-F(SEQ ID NO：104)MAGEA1-R(SEQ ID NO：105)	GTCAACAGATCCTCCCCAGACAGCATTTCTGCCTTTGTGA	qPCR MAGEA1
MAGEA2-F(SEQ ID NO：106)MAGEA2-R(SEQ ID NO：107)	AGGTGGAGAGCCTGAGGAATCTCGGGTCCTACTTGTCAGC	qPCR MAGEA2
			MAGEA10-F(SEQ ID NO：108)MAGEA 10-R(SEQ ID NO：109)	AAGCGAGGTTCTCGTTCTGATGACCTCTTGCTCTCCCTGT	qPCR MAGEA10
MAGEB2-F(SEQ ID NO：110)MAGEB2-R(SEQ ID NO：111)	CTTCAAGCTCTCCTGCTGCTCGACCCTGACTTCCTGGTTA	qPCR MAGEB2
			MART1-F(SEQ ID NO：112)MART1-R(SEQ ID NO：113)	GCTCATCGGCTGTTGGTATTATAAGCAGGTGGAGCATTGG	qPCR MART1
MCL1-F(SEQ ID NO：114)MCL1-R(SEQ ID NO：115)	ATGCTTCGGAAACTGGACATATGGTTCGATGCAGCTTTCT	qPCR MCL1
			TYR-F(SEQ ID NO：116)TYR-R(SEQ ID NO：117)	TACGGCGTAATCCTGGAAACATTGTGCATGCTGCTTTGAG	qPCR TYR
TYRP1-F	CCGAAACACAGTGGAAGGTT	qPCR TYRP1

引物	序列5’→3’	应用
			(SEQ ID NO：118)TYRP1-R(SEQ ID NO：119)	TCTGTGAAGGTGTGCAGGAG
TYRP2-F(SEQ ID NO：120)TYRP2-R(SEQ ID NO：121)	GGTTCCTTTCTTCCCTCCAGAACCAAAGCCACCAGTGTTC	qPCR TYRP2

表5：在大肠杆菌中表达后GST-isoQC融合蛋白的纯化。纯化的融合蛋白用于测定QC活性。

纯化步骤	1	2	3	4
					方法	Ni²⁺-IMAC(EBA)	GST标签AC	GF(脱盐)	IEX(UNO S)
柱类型(Amersham BiosciencesAB.Sweden)	螯合性SepharoseFast Flow	谷胱甘肽Sepharose4 Fast Flow	SephadexG-25 Fine	“连续床”基质BIO-Rad
					柱尺寸	d＝2.5cml＝42cmCV＝206cm³	d＝1.6cm1＝10cmCV＝20cm³	d＝2.6cml＝10cmCV＝53cm³	d＝1.2cml＝5.3cmCV＝6cm³
平衡过程缓冲液/剂pH体积	PBS7.310CV	PBS7.310CV	25mMMes6.010CV	25mM Mes6.010CV
					中间(洗涤)缓冲液pH体积	PBS0.5mM组氨酸7.310CV	PBS7.310CV	-	25mM Mes6.010CV
洗脱缓冲液pH体积	PBS100mM组氨酸7.31.5CV	50mM Tris10mM谷胱苷肽(还原型)8.0(反向流)	25mMMes6.01CV	25mM Mes梯度洗脱NaCl6.0CV

表6：咪唑衍生物对人QC和人isoQC的竞争性抑制的K₁-值。人isoQC在大肠杆菌BL21(hisoQCdt)或巴斯德毕赤酵母(YSShisoQC)中表达。

抑制剂	Ki(μM)hisoQCdt	Ki(μM)YSShisoQC	Ki(μM)hQC
				咪唑	220±1	235±13	103±2
苯并咪唑	200±8	250±5	138±4
				1-苄基咪唑	7.3±0.5	6.2±0.2	7.1±0.1
1-甲基咪唑	80±5	82±3	39.7±0.2
				PBD150 1-(3，4-二甲氧基-苯基)-3-(3-咪唑-1-基-丙基)-硫脲	0.48±0.03	0.519±0.001	0.0584±0.0002

实施例6：人isoQC在巴斯德毕赤酵母中表达和纯化

宿主株系和培养基

使用大肠杆菌菌株DH5α以增殖质粒并且巴斯德毕赤酵母株X-33用于在酵母中表达人isoQC。将大肠杆菌株和巴斯德毕赤酵母株根据制造商说明书(Qiagen(DH5α)，invitrogen(X-33))培育、转化并分析。根据制造商推荐，制备大肠杆菌所需要的培养基即Luria-Bertani(LB)培养基。如毕赤酵母手册(invitrogen，目录号K1740-01)中描述，制备巴斯德毕赤酵母所需要的培养基即BMMY、BMGY、YPD、YPDS并准备好抗生素即Zeocin的浓度。该手册也包括用于操作酵母的全部相关描述。

编码人QC的质粒载体的分子克隆

全部克隆方法使用标准分子生物学技术进行。为在巴斯德毕赤酵母X-33中表达，使用pPiCZαA(Invitrogen)。始于第30位密码子(从甲硫氨酸II计数)的成熟人isoQC的cDNA以符合可读框方式与编码α-因子的质粒融合，其中所述的α-因子指导蛋白质进入分泌途径。在利用引物hisoQCHISC-TermpPICZAA-1(SEQIDNO：62)或hisoQCHISN-TermpPICZAA-1(SEQIDNO：63)作为有义引物以及hisoQCHISN-TermpPICZAA-2(SEQIDNO：64)和hisoQCHISC-TermpPICZAA-2(SEQIDNO：66)(表4)作为反义引物扩增后，利用限制性位点NotI和EcoRI，将所述片段插入所述表达载体。取决于所述构建体，在第55位(Ile)和第351位(Cys)密码子内导入突变。此诱变根据标准PCR技术进行，随后使用DpnI(快速改变II位点定向诱变试剂盒，Stratagene，目录号200524)消化亲代DNA。在图17中示意性地显示所产生的构建体。

巴斯德毕赤酵母的转化和小规模表达

1-2μg质粒DNA用于根据制造商说明书(BioRad)通过电穿孔法转化感受态巴斯德毕赤酵母细胞。在含有100μg/mlZeocin的平板上进行选择。为在isQC表达时检验重组酵母克隆，将重组体在含有2mlBMGY的10ml锥形管中培育24小时。此后，将酵母离心并重悬于含有0.5％甲醇的2mlBMMY中。通过每隔24小时添加甲醇而维持所述浓度72小时。随后，测定上清液中的QC活性。选择表现最高活性的克隆用于进一步实验和发酵。根据所表达的构建体，培养基中的isoQC-活性不同(图18)。

hisoQC在巴斯德毕赤酵母的表达和纯化

为在巴斯德毕赤酵母中大规模表达isoQC，保持如小规模表达中所述的条件，然而，总体积是8L。表达在摇瓶中进行。在表达后，细胞通过离心(1500xg，20分钟)从培养基分离并且抛弃沉淀物。上清液的pH-值调整至中性，再次离心并用于第一纯化步骤。利用一个3-步骤方案纯化(表7)。纯度由图19中的SDS-PAGE分析显示。

表7：在巴斯德毕赤酵母中表达后hisoQC(YSShisoQCN55IC351AC-His)的纯化。纯化的融合蛋白用于确定QC活性和pH依赖性。

纯化步骤	1	2	3
				方法	Ni²⁺-IMAC	HIC	GF(脱盐)
柱类型(AmershamBiosciences AB，Sweden)	螯合性SepharoseFast Flow	丁基Sepharose4 Fast Flow	Sephadex G-25 Fine
				柱尺寸	d＝2.5cml＝42cmCV＝206cm³	d＝1.6cml＝15.5cmCV＝23cm³	d＝2.6cml＝10cmCV＝53cm³
平衡过程缓冲液pH体积	50mM NaH₂PO₄7.010CV	30mM NaH₂PO₄1M(NH₄)₂SO₄7.010CV	50mM Bis-Tris100mM NaCl6.810CV
				中间(洗涤)缓冲液pH体积	50mM NaH₂PO₄0.5mM组氨酸7.010CV	30mM NaH₂PO₄1M(NH₄)₂SO₄7.06CV	-
洗脱缓冲液pH体积	50mM NaH₂PO₄100mM组氨酸7.01.5CV	30mM NaH₂PO₄7.05CV	50mM Bis-Tris100mM NaCl6.81CV

结果

人isoQC成功地在甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母中表达。产生了几种不同构建体，以便选择酵母中的最佳表达条件(图17)。如图18中所示，被表达并在表达性细胞的培养基中存在的QC活性根据所表达的构建体而变化。糖基化位点的导入引起正确的分泌，如可以从构建体YSShisoQCN55IC351AC-His和YSShisoQCN55IC-His观察到。鉴于在培养基中的最高活性，将构建体YSShisoQCN55IC351AC-His大规模表达并纯化。如表7中所述实施，纯化收率是59％。表观均一的蛋白质是糖基化的，如通过迁移率向较低分子量的移位(图19)显示。糖基化不影响酶的催化活性。

实施例7：hisoQC的pH依赖性

使用(在实施例5中描述的)H-Gln-βNA的荧光测定法来研究催化特异性的pH依赖性。以7μM的底物浓度(即在[S]＜＜K_M)进行反应。因此，观察到的特异性常数可以直接从底物转化进程曲线的初速度推导出来。在这些研究中，反应缓冲液由使用HCl或NaOH调整至所需pH的0.075M乙酸、0.075MMes和0.15MTris组成。该缓冲液确保极广pH范围内的恒定离子强度。使用以下等式评价所获得的酶动力学数据：

k_cat/K_M(pH)＝k_cat/K_M(界限值)*1/(1+[H⁺]/K_HS+K_E1/[H⁺]+K_E1/[H⁺]*K_E2/[H⁺])，

其中k_cat/K_M(pH)指(观察到的)pH-依赖性动力学参数。k_cat/K_M(界限值)指pH非依赖性(“限制性”)值。K_HS、K_E1和K_E2分别指酸性pH范围内的解离基团和所述酶中两个解离基团的解离常数。使用GraFit软件(用于windows的5.0.4版本，ERITHACUSSOFTWARELtd.，Horley，UK)评价所获得的酶动力学数据，对全部动力学数据开展评价。

结果

hisoQC在pH7-8上显示特异性的最适pH。因此，催化的最适pH与人QC极相似。所述数据根据基于三个解离基团的模型的拟合则导致对hisoQC和hQC的pH依赖性的良好解释(图22)。因此，两种酶反应的催化受相似的解离基团影响，整体上显示相似的催化机制。

在表8中显示所确定的pKa-值。明显见到在hisoQC和hQC之间仅一个pKa显著地差异。在hQC中，该pKa对应于底物解离常数的pKa。hQC与hisoQC之间难以觉察的差异可能因isoQC催化过程中发生的结构性变化(诱导契合)引起，从而影响pH依赖性。

实施例8：对谷氨酰基环化酶活性的研究

已经描述人QC酶催化氨基端谷氨酸环化成焦谷氨酸。因此，QC参与pGlu修饰的淀粉样肽的产生。

为研究谷氨酸的环化，纯化人QC和人isoQC并且监测pGlu修饰的淀粉样蛋白Aβ(3-11)[pGlu-Aβ(3-11)]从Aβ(3-11)的形成。反应由20μl底物(Aβ(3-11)，pH6.5的50mMMes缓冲液中的2.5mM贮存液)和80μl酶(0.62mg/mlhQC贮存液；pH6.5的50mMMes缓冲液中的0.61mg/mlhisoQC贮存液)组成。在0小时、6小时、24小时、48小时和72小时后取出样品(15μl)并将其煮沸5分钟以终止反应。通过Maldi-Tof质谱法分析底物转化。底物和产物在其分子质量方面相差18Da，这是环化期间释放的水的质量。

如图23中所示，人QC和人isoQC(YSShisoQCI55NC351AC-His)催化Aβ(3-11)转化成pGlu-Aβ(3-11)。然而，基于两个样品中的相同蛋白质浓度，可以得出结论：与hQC相比，hisoQC对氨基端谷氨酸的转化慢得多。因此，用谷氨酰基底物还观察到谷氨酰基底物转化的较低特异性常数。用灭活的酶在这些条件下未观察到环化作用(Schilling，S.等，2004FEBSLett.563，191-196)。

实施例9：鼠isoQC的组织特异性

使用定量实时PCR技术研究鼠QC和鼠isoQC的组织分布。在从几种不同器官和组织中分离cDNA之前，使用特异性引物引物(isoQCmMetIs(SEQIDNO：68)、isoQCmMetIas(SEQIDNO：69)(表4)分离鼠isoQC可读框，该可读框从鼠isoQC的染色体编码区推导。

将所述可读框克隆至载体pPCR-ScriptCAMSK(+)(PCR-ScriptCAM克隆试剂盒，Stratagene)并且用作实时PCR测定法中的阳性对照并用于制备测定条件下的标准曲线。使用来自3-6月龄小鼠的cDNA，实现对misoQC表达的组织特异性的表征。使用RNA分离试剂盒(Macherey和Nagel)从30mg组织中分离总RNA。RNA浓度和纯度通过凝胶电泳(琼脂糖凝胶)和分光光度法评估。为合成cDNA，使用1μgRNA。根据供应商推荐，使用逆转录酶SuperscriptIIRT(Invitrogen)进行反应，所述cDNA贮存在-80℃。

使用“LightCycler”(Corbettreserach)，利用“QuantiTectSYBRGreenPCR”(Qiagen)定量性分析不同组织中的转录物浓度。DNA标准(克隆的小鼠cDNAisoQC)用于定量。根据以下等式计算拷贝数：(X^g/_μlDNA)/(质粒长度bp*660)*6.022*1023＝Y^分子/_μl。所述DNA标准含有10⁷-10^1分子/_μl范围的4个浓度，和界限浓度(10°)。在表8中显示反应方案。在图24中显示结果。

使用mQCRT氨基端(SEQIDNO：73)和mQCRT氨基端(SEQIDNO：74)作为引物，使用相同方案以扩增小鼠QC。

表8：使用Roto-GeneRG3000(Corbettreserach)的定量实时PCR反应方案

结果

如图24中所示，鼠QC和鼠isoQC表达在检验的全部器官中。与鼠QC相反，不同器官之间鼠isoQC表达的变异较小，表明转录调节作用的较低严格性。mQC表达的数据与先前对牛QC的分析对应，其中使用Northern-Blot分析所述牛QC(Pohl，T.等1991ProcNatlAcadSciUSA88，10059-10063)。在丘脑、海马和皮质中观察到QC表达最高。因此，QC表达主要在神经元组织中检测到。在外周器官如脾脏和肾脏中极少检测到QC表达。misoQC也表达在神经元组织中，不过与mQC相比处于较低水平。相反，isoQC和QC在外周器官中的表达水平之间极为相似。

基于转录物浓度的结果，得出结论：联合活性(isoQC和QC)应当在脑中最高。因此，最高QC-蛋白质水平存在于遭受淀粉样变性病如阿尔茨海默病、家族性英国型痴呆和家族性丹麦型痴呆侵袭的器官中。

实施例10：通过杂环螯合剂抑制人isoQC

结果

先前使用杂环螯合剂如1，10-菲罗啉和二吡啶羧酸研究了对不同来源的QC的时间-依赖性抑制作用(6，9)。相似地，h-isoQC也时间依赖性地被杂环螯合剂1，10-菲罗啉(图25)和二吡啶羧酸(未显示)灭活，这清楚指出金属依赖活性。此外，EDTA也抑制h-isoQC(图25)。这与QC形成鲜明对比，因为EDTA均未给人QC、猪QC或鼠QC造成可觉察的抑制。然而，EDTA对hisoQC的甚至更强抑制表明存在金属依赖性催化。

实施例11：使用细胞分级分离法研究的hisoQC的亚细胞定位

细胞分级分离法

转染后次日，将表达性HEK293细胞用D-PBS洗涤并通过在4℃在500×g上离心5分钟而收集。随后，抛弃D-PBS并将细胞重悬于1ml破裂缓冲液(50mMTris，50mMKCl，5mMEDTA，2mMMgCl₂，用HCl调节至pH7.6)中并且在Potter细胞匀浆机中通过30次压榨被破碎。混悬液在4℃在700×g上离心10分钟。获得的沉淀重悬于300μl破裂缓冲液中并命名为残片级分(D)。所得的上清液进一步在4℃在20,000×g上离心30分钟。沉淀显示为重膜级分(HM)并且重悬于200μl破裂缓冲液中。所得的上清液使用超速离心机(Beckmann)在4℃在100,000×g上离心1小时。获得的沉淀重悬于200μl破裂缓冲液中并称作轻膜级分(LM)。将上清液命名为可溶性级分(S)。将残片级分、重膜级分和轻膜级分超声处理10分钟。使用Bradford方法测定全部级分的蛋白质含量。随后，分析了级分的QC活性并使用蛋白质印迹法对级分的标记蛋白质染色。

结果

为进一步确证，对衍生自hisoQC和hQC表达的QC活性分布开展生物化学分析。始于甲硫氨酸I和II的天然hisoQC和hQC分别表达在HEK293细胞中。在细胞分级分离后，使用荧光测定法，利用H-Gln-βNA作为底物，测定每种级分中的QC活性。用空载体(pcDNA)转染的细胞中，几乎测量不到特异性QC活性。当表达天然hisoQC(MetI)和hisoQC(MetII)时，轻易可检测到QC活性，而最高活性存在于重膜级分(MetI：40±2μmole/分钟/g；MetII：36±1.5μmole/分钟/g)和培养基(MetI：30±2μmole/分钟/g；MetII：54±3μmole/分钟/g)中。相反，hQC在培养基(1339±76μmole/分钟/g)中显示最高特异性QC活性，随后在重膜级分(251±21μmole/分钟/g)中显示次高特异性QC活性(图26A)。

此外，计算了绝对活性，表明hisoQC(MetI)和hisoQC(MetII)的表达主要引起胞内QC活性增加，在即残片(MetI：1032±9nM/分钟；MetII：1110±10nM/分钟)和重膜级分(MetI：374±20nM/分钟；MetII：281±12nM/分钟)中QC活性增加。培养基内仅存在少量QC活性(MetI：27±2nM/分钟；MetII：53±3nM/分钟)。相反，由hQC表达推导的QC活性在培养基中(1138±65nM/分钟)和在胞内区室中(残片：1089±14nM/分钟；重膜级分：583±38nM/分钟)显示高活性，支持如通过组织化学分析所显示的hisoQC高尔基体定位(图26B)。

通过表达天然酶获得的数据进一步得到通过表达拥有羧基端FLAG标签的hisoQC(MetI和MetII)和hQC的支持(图26C)。与高尔基复合体和线粒体的标记蛋白质相比，所得的FLAG标签化蛋白质的蛋白质印迹分析法揭示hisoQC(MetI)和hisoQC(MetII)主要在胞内定位于所述残片级分和重膜级分内，而hQC富集于培养基内，不过也存在于所述残片级分和重膜级分中。对高尔基复合体和线粒体的标记蛋白质显像表明这些区室存在于所述残片级分和重膜级分中。此外，65kDa线粒体蛋白也以较小部分在可溶性部分中存在。

实施例12：对hisoQC高尔基体滞留信号的分析

为弄清预测的氨基端跨膜螺旋何时负责在高尔基复合体中滞留hisoQC，将始于MetI和MetII处的包括所述跨膜螺旋的信号肽以符合可读框方式与EGFP克隆。所得载体hisoQC(MetI)SSEGFP和hisoQC(MetII)SSEGFP在LN405细胞中表达并且使用共聚焦激光扫描显微镜以类似于全长hisoQCEGFP融合蛋白的方式进行检查。hisoQC(MetI)SSEGFP的表达导致如对全长hisoQC(MetI)EGFP融合蛋白所观察到的相同的高尔基复合体定位。再次地，没有观察到hisoQC(MetI)SSEGFP至线粒体的运输(图27A)。此外，氨基端截短肽hisoQC(MetII)SSEGFP的表达也导致该蛋白质富集于高尔基复合体中。与hisoQC(MetI)SSEGFP类似，不能记录到线粒体EGFP荧光(图27B)。因此，hisoQC的氨基端序列导致该蛋白质以共翻译方式转运至ER膜并导致滞留在高尔基复合体中。此外，由于hisoQC(MetII)SSEGFP表达，将高尔基体滞留信号大致定位是位于第19位甲硫氨酸和丝氨酸第53位之间(从开始MetI计数氨基酸)。

额外的拓扑学分析揭示hisoQC氨基端与糖基转移酶功能同源的可能性。糖基转移酶是II型跨膜蛋白，拥有短的胞浆序列，后续跨膜螺旋和一个大的腔内催化结构域。显而易见，这种结构域构造与对misoQC和hisoQC所找到的结构域构造基本上相同(图28)。对于众多糖基转移酶而言，确定了高尔基体滞留信号位于所述跨膜结构域内。此外，对于这些酶中的某些酶而言，发现截短所述的胞浆序列不影响该蛋白质的活性或定位。总之，提供这样的证据，即hisoQC是II型跨膜蛋白，显示与糖基转移酶相似的高尔基复合体内滞留。

实施例12：检测不同人癌细胞系和组织中的QPCTLmRNA

qPCR分析

基本上如实施例9中所述，使用定量实时PCR(qPCR)技术开展对人癌细胞系中人QPCTL表达的分析。为测QPCTLmRNA，使用引物测定法的引物，该引物覆盖用于包括外显子/外显子区以排除基因组DNA的共同扩增。按照制造商推荐进行QPCR。在表9中描述反应混合物并且在表8中显示PCR程序。

表9：qPCR混合物的组成

成分	体积(μl)
		2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix(2,5mM MgCl₂)	7.5
10x QuantiTect引物测定法	1.5
		cDNA(≤100ng/反应)	1
纯水	5

使用“LightCycler”(Corbettreserach)，利用“QuantiTectSYBRGreenPCR”(Qiagen)定量性分析不同组织中的转录物浓度。DNA标准(克隆的cDNAisoQC小鼠)用于定量。根据以下等式计算拷贝数：(X^g/_μlDNA)/(质粒长度bp*660)*6.022*1023＝Y^分子/_μl。所述DNA标准含有10⁷-10¹分子/μl范围的4个浓度，和界限浓度(10°)。

使用Rotor-Gene操作软件(Corbettreserach)评价qPCR的结果。

结果

QPCTL在不同癌细胞系中的表达

在所检验的癌细胞系中，人黑素瘤细胞显示QPCTL转录物的最高表达(约7000个拷贝/50ng总RNA)，同时人软组织肉瘤细胞系显示QPCTL的最低表达(365个拷贝/50ng总RNA)。胰腺癌显示有2100个拷贝，甲状腺癌显示有3500个拷贝，而胃癌有4100个拷贝(中位数)(图29)。

QPCTL在不同黑素瘤细胞系中的表达

近来已经证实黑素瘤细胞拥有较高的QPCT表达(Gillis，J.S.，J.Transl.Med.4(2006)，4：27)。因此，分析不同黑素瘤细胞系中的QPCTL表达。如图30中所示，在全部黑素瘤细胞系中均检测到QPCTL表达。细胞系之间的变异从Mel_ZL_11系中的2025个拷贝/50ng总RNA变化至Mel_ZL12系中的18043个拷贝/50ng总RNA。

表10：QPCT和QPCTL与肿瘤相关抗原(taa)的相关性以及QPCT与QPCTL彼此之间的相关性。

此外，QPCT和QPCTL表达与肿瘤相关抗原(taa)的表达相关。通过数据库检索和发表的结果而选出黑素瘤特异性肿瘤相关抗原。其中，AIM1和AIM2(AbsentInMelanoma(在黑素瘤中缺乏))、MAGEA1-A2、-A10和MAGEB2(黑素瘤抗原家族A和B)、MART1(T-细胞识别的黑素瘤抗原)、TYR(酪氨酸酶)、TYRP1和TYRP2(酪氨酸酶相关蛋白)和MCL-1(髓细胞性白血病)是黑素瘤中的肿瘤相关抗原。使用SPSS统计软件比较数据。

QPCT与MAGEB2之间的相关性是显著的(p＝0.0436)。此外，QPCT与MART1(p＝0.002)，QPCTL与MART1(p＝0.008)和QPCT与TYR(p＝0.0023)之间的相关性也是统计高度显著的。所述相关性显示直接依赖性，这表明QPCT/QPCTL表达越高，肿瘤相关抗原表达越高。唯一例外是TYR与MCL1之间的相关性，其显示间接依赖性。

QPCT和QPCTL在不同肿瘤组织中的表达

在软组织肉瘤、胃癌和甲状腺癌的肿瘤组织中评价QPCT和QPCTL的表达。发现在甲状腺癌中QPCT表达最高，其次是胃癌和软组织癌(表11)。对QPCTL表达也观察到相同顺序，然而，QPCTL转录物的拷贝数总是低于对QPCT转录物所观察到的拷贝数，如Student’st-检验(p_{软组织肉瘤}＝0.001；p_胃癌＝4.8E-7；p_甲状腺癌＝0.04)(表11；图31)。

表11：QPCT和QPCTL在不同肿瘤组织中表达的比较

	软组织肉瘤(119份样品)	胃癌(47份样品)	甲状腺癌(29份样品)
				QPCT	1293	2985	8303
QPCTL	170	469	2540

对QPCT和QPCTL表达水平的进一步研究揭示组织癌(p＝2E-31)和胃癌(p＝0.015)中的皮尔森双侧显著相关性。没有对甲状腺癌中的QPCT和QPCTL表达水平观察到相关性(p＝0.46)。

QPCTL在胃癌中依赖分化期的表达

对于胃癌，研究了代表不同肿瘤分化期的样品中的QPCTL表达。肿瘤周围的正常组织充当对照。正常组织与肿瘤组织的比较，显示肿瘤组织中显著较高的QPCTL表达(p＝0.04)。未分化的胃癌显示低于正常组织的QPCTL表达。与正常组织相比，低分化和良好至中等分化的胃癌在中位数中不显示差异(图32)。

QPCT和QPCTL在不同期的甲状腺癌中的表达

就QPCT和QPCTL表达，研究不同期的甲状腺癌。分期根据世界卫生组织(WHO)的命名分类为滤泡性甲状腺癌(FTC)、乳头状甲状腺癌(PTC)和未分化甲状腺癌(UTC)。来自甲状腺肿患者的样品充当对照。

QPCTmRNA水平(中位数)在分化的甲状腺癌FTC(6700个拷贝/50ng总RNA)和PTC(16000个拷贝/50ng总RNA)中比非肿瘤组织中(甲状腺肿：2100个拷贝/50ng总RNA)更高。UTC拥有5400个拷贝/50ng总RNA并且比甲状腺肿中观察到的拷贝数高2.5倍。QPCT的mRNA拷贝数在全部甲状腺肿瘤显著高于甲状腺肿(p＝0.04，Student’st-检验)(图33)。

甲状腺癌中的QPCTLmRNA水平是均匀的。来自FTC(2600个拷贝/50ng总RNA)和UTC(2500个拷贝/50ng总RNA)的样品与甲状腺肿(2500个拷贝/50ng总RNA)相似。QPCTL在PTC中的表达略微下降至1900个拷贝/50ng总RNA(图34)。

总之，QPCT和QPCTL同等地表达在甲状腺肿内。然而，在肿瘤组织中QPCT的表达增加，而QPCTL的表达保持稳定。

实施例13：研究与不同刺激物温育后人细胞系中QPCT和QPCTL的表达

细胞系和培养基

使用人胚肾细胞系HEK293、人急性单核细胞性白血病细胞系THP-1和滤泡性甲状腺癌细胞系FTC-133进行刺激实验。细胞在适宜培养基(DMEM，10％FBS用于HEK293，RPMI1640，10％FBS用于THP-1和DMEM/F12，10％FBS用于FTC-133)中，于增湿气氛中在37℃和5％CO₂下培育。

使用生物活性肽、化学品或LPS的刺激

HEK293和FTC-133细胞作为贴壁培养物培养而THP-1细胞以悬浮方式培养。对于刺激测定法，将2×10⁵个FTC-133细胞和HEK293细胞转移至24孔平板。在HEK293的情况下，平板以I型胶原包被以确保适度粘附。此外，将2×10⁶个THP-1细胞在24孔悬浮平板中培育。全部刺激实验在无血清条件下进行。FTC-133过夜培育。此后，细胞适应无血清培养基另外24小时并且通过将条件培养基替换为新鲜无血清培养基而启动刺激。HEK293细胞过夜培育并且此后，无需适应无血清条件而启动使用相应物质的刺激，原因是在无血清条件下培养超过24小时的HEK293发生形态学变化。将THP-1细胞接种在含有相应物质的无血清培养基中。施加的刺激物和终浓度列于表12。

表12：用于研究人细胞系中调节hQC和hisoQC的刺激物

名称	终浓度
		丁酸(BA)	2mM
肝细胞生长因子(HGF)	10ng/ml
		脂多糖(LPS)	1,10μg/ml
转化生长因子β(TGFβ)	10,100ng/ml
		肿瘤坏死因子α(TNFα)	10,100ng/ml

细胞与相应刺激物温育24小时。此后，使用Nucleo-RNAII试剂盒(Macherey-Nagel)从该细胞分离总RNA并且储存直至qPCR测定。

使用低氧的刺激作用

THP-1、HEK293和FTC-133细胞分别铺种在2个25cm²组织培养平皿内。从而，每种细胞系的一个平皿充当阴性对照，在正常生长条件下培养24小时。另一个平皿置于缺氧袋子内与缺氧试剂(P，Merck)和指示剂在一起。将该袋子密封以确保隔绝空气条件。将细胞也培育24小时并且随后，使用Nucleo-RNAII试剂盒(Macherey-Nagel)分离总RNA并储存直至qPCR测定。

结果

QPCT和QPCTL在HEK293、FTC-133和THP-1中的基础表达

评价在所用细胞系HEK293，FTC-133和THP-1中基础表达而为后续刺激实验作好准备。在表13中总结QPCT和QPCTL转录物的拷贝数。

表13：不同细胞系中QPCT和QPCTL的基础表达

所选刺激物对QPCT和QPCTL表达的影响

迄今没有描述QPCT和QPCTL的启动子的调节性结合位点和导致它们调节的信号转导途径。因此，使用不同细胞系和刺激物实施刺激实验。HEK293细胞中的QPCTmRNA水平通过使用TNF-α、HGF和丁酸刺激而增加。此外，研究了对作为QPCT/QPCTL底物的CCL2的调节作用。TNF-α和丁酸增加HEK293中CCL2转录物的量。HGF对CCL2表达没有影响。相反，QPCTL不受TNF-α、HGF和丁酸调节(图35)。

此外，使用LPS和TGF-β刺激FTC-133并且检测对QPCT、QPCTL和CCL2的调节作用。在FTC-133中，LPS和TGF-β刺激QPCTmRNA表达，但是未诱导QPCTL和CCL2表达(图36)。

本实验进一步通过使用LPS(1μg/ml)、LPS(10μg/ml)、TGF-β和TNF-α刺激THP-1细胞进行确证。如对FTC-133和HEK293观察那样，使用不同刺激物，可能诱导QPCT表达，此外，使用LPS和TNF-α诱导了CCL2表达。同样，未能观察到QPCTLmRNA的诱导或阻遏(图37)。

总之，本实验揭示QPCT可以通过不同细胞系中的一组刺激物(LPS、TNF-α、HGF、丁酸和其它)加以调节。相反，QPCTL可能不受所检验刺激物刺激或阻遏，从而暗示QPCTL的管家功能。

所选刺激物对QPCT及其底物的表达的影响

由于QPCT表达由多种刺激物诱导，故提出这样的问题：QPCT诱导是否与合QPCT底物CCL2、CCL7、CCL8和CCL13的诱导一起发生。因此，使用THP-1单核细胞，分别使用LPS(1μg/ml)、LPS(10μg/ml)、TGF-β(100ng/ml)和TNF-α(100ng/ml)进行刺激。THP-1以基础水平表达全部趋化因子，这对于在阴性对照与受刺激细胞纸件进行比较是重要的。

LPS和TNF-α导致可靠地诱导THP-1细胞中全部受检验的趋化因子和QPCT。TGF-β作为刺激物不那么有效，最多诱导2倍的QPCT、CCL2、CCL7和CCL8表达。CCL13被TGF-β刺激作用阻遏(图38)。

QPCT和QPCTL表达受低氧刺激

QPCTL表达可能不被化学剂、生物活性肽或LPS调节。因此，我们检验QPCTL表达受否受低氧调节调节。如图39中总结，低氧选择性地诱导QPCTL的表达而非QPCT的表达。相比而言，低氧诱导因子1a(HIF1a)被阻遏达15％(图39A)和45％(图39C)。该数据表明QPCTL与低氧的联系。

抑制剂的合成

合成方案1：实例1-53，96-102，136-137的合成

试剂和条件：(a)NaH，DMF，4小时，室温；(b)8小时，100℃；(c)H₂N-NH₂，EtOH，8小时，回流，随后4NHCl，6小时，回流，(d)R³-NCO，EtOH，6小时，回流，(e)3，4二甲氧基-苯基-异硫氰酸酯。

合成方案2：实例54-95的合成

试剂和条件：(a)R-NCS，EtOH，6小时，回流；(b)WSCD，1H-咪唑-1-丙胺，DMF，2小时，室温。

合成方案3：实例103-105的合成

试剂和条件：(a)NaH，DMF，室温，3小时；(b)LiAlH₄，二噁烷，回流，1小时；(c)R-NCS，EtOH，回流6小时。

合成方案4：实例106-109的合成

试剂和条件：(a)EtOH，2小时，回流。

合成方案5：实例110-112的合成

试剂和条件：(a)1H-咪唑-1-丙胺，三乙胺，甲苯，12小时，回流。

合成方案6：实例113-132的合成

试剂和条件：(a)CAIBE，1H-咪唑-1-丙胺，二噁烷，0℃，12小时；(b)Lawesson试剂，EtOH，回流，8小时。

合成方案7：实例133-135的合成

试剂和条件：(a)1H-咪唑-1-丙烷酸性氯化物，CH₂Cl₂，-10℃，1小时；(b)Lawesson试剂，二噁烷，回流，8小时。

合成方案8：实例138的合成

试剂和条件：(a)EtOH，回流，8小时。

合成方案9：实例139的合成

试剂和条件：(a)75％浓度H₂SO₄，4小时。

合成方案10：实例140的合成

试剂和条件：(a)乙腈，回流2小时。

合成方案11：实例141的合成

试剂和条件：(a)NaH，DMF，4小时，室温；(b)8小时，100℃；(c)H₂N-NH₂，EtOH，8小时，回流，随后4NHCl，6小时，回流，(d)3，4二甲氧基-苯基-异硫氰酸酯，EtOH，6小时，回流。

分析条件

用SCIEXAPI365分光计(PerkinElmer)获得ESI-质谱。使用DMSO-D₆作为溶剂，在BRUKERAC500上记录¹H-NMR(500MHz)数据。化学位移表述为相对于四甲基硅烷向低场位移的百万分之几(ppm)。分裂模式命名如下：s(单峰)，d(双峰)，dd(双峰的双峰)，t(三重峰)，m(多重峰)和br(宽阔信号)。

详细合成描述

实例1-12和14-53

1H-咪唑-1-丙胺与乙醇中的相应异硫氰酸酯在回流下反应8小时。此后，除去溶剂并且将剩下的油溶解在二氯甲烷中。有机层用NaHCO₃饱和溶液、NaHSO₄饱和溶液和盐水洗涤两次、干燥并随后蒸发。将剩下的固体从乙酸乙酯中再结晶，以收率80-98％产生本实例硫脲。

实例13

1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-(3，4-二甲氧基苯基)硫脲

4.0mmol异硫氰酸3，4-二甲氧基苯酯和4.0mmol3-(1H-咪唑-1-基)烷基-1-胺溶解在10mL无水乙醇中。在回流下搅拌2小时后，将所述溶剂蒸发并且所得的固体从乙醇中再结晶。

收率：0.66g(51.3％)；熔点：160.0-161.0℃

¹HNMRδ1.8-2.0(m，2H)，3.4-3.5(m，2H)，3.75(s，6H)，3.9-4.0(m，2H)，6.7-6.8(m，1H)，6.9(brm，2H)，6.95(s，1H)，7.15(s，1H)，7.55(brs，1H)，7.6(s，1H)，9.3(s，1H)；MSm/z321.2(M+H)，253.3(M-C3H₃N₂·)

实例96-102

1H-咪唑-1-丙胺与乙醇中的相应异硫氰酸酯在回流下反应8小时。此后，除去溶剂并且将剩下的油溶解在二氯甲烷中。有机层用NaHCO₃饱和溶液、NaHSO₄饱和溶液和盐水洗涤两次、干燥并随后蒸发。将剩下的固体从乙酸乙酯中再结晶，以收率85-90％产生本实例脲。

实例136，137

1H-咪唑-1-烷基胺根据文献从ω-溴-烷基-酞酰亚胺和咪唑鎓盐中制备并且随后进行肼解。将所得产物转化成实例1-53的硫脲，产生88％(实例136)和95％(实例137)收率。

实例54-95

全部所实例从相应的硫脲中通过与无水二甲基甲酰胺中的水溶性碳化二亚胺(WSCD)和1H-咪唑-1-丙胺杂室温反应2小时而产生，以收率40-87％产生三取代胍类。

实例103-105

利用1当量NaH，使咪唑与DMF中相应的溴甲基苯基氰在室温反应3小时，产生1H-咪唑-1-甲基苯基氰。除去所述溶剂并且将所得的油重溶解于二噁烷中。使用1当量LiAlH₄，在相应胺中转化所述氰化物。在添加KHSO₄饱和溶液后，将二噁烷蒸发并且通过CHCl₃提取含水层。真空浓缩有机层并且将所述的胺在实例1-53的相应硫脲中转化，产生78％(实例103)和65％(实例104)和81％(实例105)收率。

实例106-109

从相应甲磺酸酯-2-甲基丙基-酞酰亚胺开始，如对实例136-137中的胺描述，合成了所述的胺。将所得产物转化成实例1-53的硫脲，以总收率25-30％产生实例106-109。

实例110-112

1H-咪唑-1-丙胺与甲苯中相应的2-氯苯并[d]噻唑在温度130℃反应24小时。在除去溶剂并从甲醇中再结晶后，以55-65％的量产生实例110-112。

实例113-118、120-124和126-132

通过添加1当量的CAIBE和N-甲基吗啉，使1H-咪唑-1-丙胺与无水二噁烷中相应的2-苯基乙酸在温度0℃反应。在2小时后，使混合物加温至室温并搅拌12小时。在除去溶剂后，将所得的油重溶解于二氯甲烷中并且有机层用NaHCO₃水溶液和水洗涤、干燥并将溶剂蒸发。将剩下的油溶解在添加Lawesson试剂的二噁烷中。在搅拌12小时后，添加NaHCO₃饱和溶液，将二噁烷蒸发并且用乙酸乙酯提取含水层，将有机层分离、干燥并将溶剂蒸发。剩余固体从乙酰乙酸酯/醚中结晶，以总收率62-85％产生113-118、120-124和126-132。

实例119

N-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-2-(3，4-二甲氧基苯基)乙硫酰胺

4.0mmol三乙胺和4.0mmol3-(1H-咪唑-1-基)烷基-1-胺在20mL二噁烷中的混合物逐滴添加至30mL二噁烷中4.0mmol2-(3，4-二甲氧基苯基)乙酰氯的冰冷搅拌的溶液。使该混合物加温至室温并随后搅拌1小时。在通过减压法除去溶剂后，将残余物重溶解于50mL二氯甲烷中。有机层通过30mLNaHCO₃饱和水溶液和水洗涤。将有机溶液干燥、过滤，并将溶剂在减压下除去。在50mL无水噁烷中重溶解后，添加2.2mmolLawesson试剂，并将此混合物加热至90℃并搅拌8小时。通过减压除去溶剂，将残余物重溶解于50mL二氯甲烷中。有机层通过NaHCO₃饱和水溶液洗涤三次，随后用水洗涤三次，干燥，过滤并且随后除去有机溶剂。使用离心力-层析装置(HarrisonResearchLtd.)，利用层厚度2mm的硅胶平板和CHCl₃/MeOH梯度作为洗脱系统，通过层析法将化合物纯化。

收率：0.14g(10.6％)；熔点：148.0-150.0℃

¹HNMRδ2.0-2.15(brm，2H)，3.4-3.5(m，2H)，3.7(s，6H)，6.75-6.8(m，2H)，4.1-4.2(m，2H)，6.8-6.9(m，2H)，6.95-7.0(m，1H)，7.4(s，1H)，7.75-7.85(brm，1H)，8.6(s，1H)，10.2(s，1H)；MSm/z320.2(M+H)，252.2(M-C3H₃N₂·)

实例125

N-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-1-(3，4-二甲氧基苯基)环丙基甲硫酰胺

11.06mmol3，4-二甲氧基苯基乙腈，34.8mmol2-溴-1-氯乙醇和1.16mmol三氯化乙基苄基铵溶解于10mLKOH水溶液(60％)。将此混合物转移至超声波清洗器内并且在室温剧烈搅拌3小时。将所得的混悬液用40mL水稀释并且用20mL二氯甲烷提取三次。将合并的有机层用盐酸的水溶液(1N)洗涤、经Na₂SO₄干燥并且在加压下除去溶剂。使用硅胶并使用乙酸乙酯/庚烷作为洗脱系统通过快速层析法纯化剩下的油，产生0.81g(34.4％)1-(3，4-二甲氧基苯基)环丙基甲腈。

将3.9mmol1-(3，4-二甲氧基苯基)环丙基甲腈和11.2mmolKOH悬浮在80mL乙二醇中。该混合物在回流下搅拌12小时。随后，添加80mL水并用醚提取含水层2次。在使用HCl(1N)调节pH值至pH＝4-5后，用醚提取含水层三次，随后将合并的有机层经Na₂SO₄干燥并除去溶剂，产生0.81g(93.5％)的1-(3，4-二甲氧基苯基)环丙基羧酸。

3.44mmol1-(3，4-二甲氧基苯基)环丙基羧酸，3.5mmolN-甲基吗啉，和3.5mmol氯甲酸异丁酯溶解在无水四氢呋喃中并在-15℃搅拌15分钟。随后，添加3.5mmol3-(1H-咪唑-1-基)烷基-1-胺并且使此混合物加温至0℃并搅拌12小时。在减压下除去溶剂并将剩下的油重溶解于氯仿中。随后，将有机层用NaHCO₃饱和水溶液洗涤2次，随后经Na₂SO₄干燥并且除去溶剂。使用装置(HarrisonResearchLtd.)，利用层厚度2mm的硅胶平板和CHCl₃/MeOH梯度作为洗脱系统，通过离心力层析法进行纯化，产生0.671g(59.3％)的N-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-1-(3，4-二甲氧基苯基)环丙烷-甲酰胺。

在30mL无水二噁烷中重溶解后，添加1.43mmolLawesson试剂，并将此混合物加热至90℃并搅拌8小时。通过减压除去溶剂，将留下的残余物溶解于50mL二氯甲烷中。有机层通过NaHCO₃饱和水溶液洗涤三次，随后用水洗涤三次，干燥，过滤并且随后除去有机溶剂。使用离心力-层析装置(HarrisonResearchLtd.)，利用层厚度2mm的硅胶平板和CHCl₃/MeOH梯度作为洗脱系统，通过层析法将化合物纯化。

收率：0.33g(46.2％)；熔点：127.0-127.5℃

¹HNMRδ1.1-1.2(t，2H)，1.55-1.6(t，2H)，2.0-2.1(m，2H)，3.5-3.6(m，2H)，3.7-3.8(s，6H)，4.1-4.2(t，2H)，6.8-6.9(m，3H)，7.65(s，1H)，7.75(s，1H)，8.8(m，1H)，9.05(s，1H；MSm/z346.0(M+H)，278.2(M-C3H₃N₂·)，177.1(M-C6H₈N₃S·)

实例133-135

1当量三乙胺和3，4-二甲氧基苯胺在二噁烷中的混合物在温度0℃上添加至相应ω-溴代烷基酸性氯化物的搅拌的溶液。使该溶液加温至室温并搅拌2小时。蒸发溶剂，并且剩下的油重溶解于二氯甲烷中。有机层用水洗涤，干燥，过滤并且在减压下溶剂。使用离心力-层析装置(HarrisonResearchLtd.)，利用层厚度2mm的硅胶平板和CHCl₃/MeOH梯度作为洗脱系统，通过层析法将化合物纯化。

将咪唑和氢化钠悬浮在中并将此混合物在惰性条件下在室温搅拌3小时。添加ω-溴-N-(3，4-二甲氧基-苯基)烷基酰胺并且将此混合物加热至100℃并搅拌8小时，此后，蒸发溶剂，添加热甲苯，并将溶液过滤。随后，在加压下除去溶剂。通过Lawesson试剂，如对实例113-132描述所述进行产生硫代酰胺转化，以总收率产生133-135。

根据上述的一般合成方案合成的其它实例的分析性数据如下所述：

实例1：1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-甲基硫脲

熔点：122-122.5℃

¹HNMRδ1.85-1.95(m，2H)，2.8(s，3H)，3.2-3.5(brd，2H)，3.8-3.9(m，2H)，6.85(d，1H)，7.15(d，1H)，7.3-7.5(brd，2H)，7.65(s，1H)；MSm/z199.1(M+H)，221.3(M+Na)，131.0(M-C3H₃N₂·)

实例2：1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-叔丁基硫脲

熔点：147.0-147.5℃

¹HNMRδ1.3-1.4(s，9H)，1.85-1.95(m，2H)，3.5(t，2H)，3.8(t，2H)，6.85(d，1H)，7.15(d，1H)，7.3-7.5(brd，2H)，7.65(s，1H)；MSm/z241.1(M+H)，173.1(M-C3H₃N₂·)

实例3：1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-苄基硫脲

熔点：127.0-128.0℃

¹HNMRδ1.85-1.95(m，2H)，3.2-3.5(brd，2H)，3.8-3.9(m，2H)，4.6(s，2H)，6.8(d，1H)，7.15(d，1H)，7.19-7.35(m，5H)，7.5-7.6(brd，2H)，7.85(s，1H)；MSm/z275.3(M+H)，207.1(M-C3H₃N₂·)

实例5：1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-苯基硫脲

熔点：166.5-167.0℃

¹HNMRδ1.95-2.05(m，2H)，3.3-3.5(brd，2H)，3.9-4.0(m，2H)，6.85(d，1H)，7.05(m，1H)7.15(d，1H)，7.25(m，2H)，7.35(m，2H)，7.6(s，1H)，7.8(brs，1H)，9.5(brs，1H)；MSm/z261.1(M+H)，193.2(M-C3H₃N₂·)

实例6：1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-(4-氟苯基)硫脲

熔点：147.0-148.0℃

¹HNMRδ1.95-2.05(m，2H)，3.3-3.5(brd，2H)，3.9-4.05(m，2H)，6.85(d，1H)，7.05-7.15(m，3H)，7.3-7.4(m，2H)，7.6(s，1H)，7.7-7.8(brs，1H)，9.4(brs，1H)；MSm/z279.3(M+H)，211.2(M-C3H₃N₂·)

实例7：1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-(4-乙基苯基)硫脲

熔点：100.0-100.5℃

¹HNMRδ1.15-1.2(t，3H)，1.9-2.0(m，2H)，2.5-2.6(m，2H)，3.3-3.5(brd，2H)，3.9-4.05(m，2H)，6.85(d，1H)，7.1-7.2(m，3H)，7.25-7.3(m，2H)，7.6(s，1H)，7.7-7.8(brs，1H)，9.4(brs，1H)；MSm/z289.3(M+H)，221.1(M-C3H₃N₂·)

实例8：1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-(4-(三氟甲基)苯基)硫脲

熔点：154.5-155.0℃

¹HNMRδ1.9-2.1(brm，2H)，3.4-3.6(brd，2H)，3.95-4.1(brm，2H)，6.85(d，1H)，7.2(d，1H)，7.6-7.8(m，5H)，8.2(brs，1H)，9.9(brs，1H)；MSm/z329.3(M+H)，261.2(M-C3H₃N₂·)

实例10：1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-(4-乙酰苯基)硫脲

熔点：170.0-171.0℃

¹HNMRδ1.9-2.1(brm，2H)，2.4-2.5(s，3H)，3.2-3.5(brm，2H)，3.9-4.1(m，2H)，6.85(d，1H)，7.15(d，1H)，7.5-7.65(brm，3H)，7.8-7.9(m，2H)，8.1(m，2H)，9.8(brs，1H)；MSm/z303.2(M+H)，235.1(M-C3H₃N₂·)

实例11：1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-(4-甲氧基苯基)硫脲

熔点：125.0-125.5℃

¹HNMRδ1.8-2.0(brm，2H)，3.2-3.5(brm，2H)，3.7(s，3H)，3.9-4.0(m，2H)，6.7-6.9(m，3H)，7.1-7.2(m，3H)，7.5(s，1H)，7.6(s，1H)，9.2(s，1H)；MSm/z291.1(M+H)，223.2(M-C3H₃N₂·)

实例14：1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-(2，4-二甲氧基苯基)硫脲

熔点：120.0-120.5℃

¹HNMRδ1.8-2.0(brm，2H)，3.4-3.5(brm，2H)，3.75(s，6H)，3.9-4.0(m，2H)，6.5(d，1H)，6.6(s，1H)，6.9(s，1H)，7.15(s，1H)，7.3(d，1H)，7.5(brs，1H)，7.6(s，1H)，9.75(s，1H)；MSm/z321.2(M+H)，253.3(M-C3H₃N₂·)

实例15：1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-(3，5-二甲氧基苯基)硫脲

熔点：142.0-143.0℃

¹HNMRδ1.8-2.0(brm，2H)，3.4-3.5(brm，2H)，3.6(s，6H)，3.95-4.0(m，2H)，6.25(m，1H)，6.6(m，2H)，6.9(s，1H)，7.2(s，1H)，7.6(s，1H)，7.8(s，1H)，9.5(s，1H)；MSm/z321.2(M+H)，253.3(M-C3H₃N₂·)

实例23：1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二噁英-7-基)-硫脲

熔点：103.0-103.5℃

¹HNMRδ1.9-2.0(brm，2H)，3.3-3.5(brd，2H)，3.9-4.0(m，2H)，4.2-4.3(m，4H)，6.7(m，1H)，6.8-6.8(m，1H)，6.9(m，2H)，7.2(s，1H)，7.6(m，2H)，9.3(s，1H)；MSm/z319.3(M+H)，251.3(M-C3H₃N₂·)

实例24：1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-(苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-6-基)硫脲

熔点：115.6-115.6℃

¹HNMRδ1.9-2.1(brm，2H)，3.4-3.5(brd，2H)，4.05-4.15(m，2H)，6.0(s，2H)，6.7(m，1H)，6.8-6.85(m，1H)，6.95(d，1H)，7.25(s，1H)，7.45(s，1H)，7.7(brs，1H)，8.5(brs，1H)，9.4(brs，1H)；MSm/z305.2(M+H)，237.2(M-C3H₃N₂·)

实例25：1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-(3，4，5-三甲氧基苯基)硫脲

熔点：124.5-125.5℃

¹HNMRδ1.8-2.0(m，2H)，3.4-3.5(brm，2H)，3.6(s，3H)，3.7(s，6H)，3.9-4.0(m，2H)，6.65(m，2H)，6.85(s，1H)，7.2(s，1H)，7.6(s，1H)，7.7(brs，1H)，9.4(s，1H)；MSm/z351.3(M+H)，283.2(M-C3H₃N₂·)

实例26：1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-(3-甲氧基苯基)硫脲

熔点：89.5-90.0℃

¹HNMRδ1.9-2.1(brm，2H)，3.4-3.5(brm，2H)，3.7(s，3H)，3.9-4.0(m，2H)，6.6-6.7(m，1H)，6.8-6.9(m，2H)，7.1(m，2H)，7.15-7.25(brm，1H)，7.6(s，1H)，7.8(brs，1H)，9.5(s，1H)；MSm/z291.1(M+H)，223.2(M-C3H₃N₂·)

实例27：1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-(4-乙氧基苯基)硫脲

熔点：126.0-126.5℃

¹HNMRδ1.5(brm，3H)，1.9-2.0(brm，2H)，3.4-3.5(brm，2H)，3.9-4.0(brm，4H)，6.8-6.9(m，2H)，6.95(s，1H)，7.15-7.2(m，2H)，7.25(s，1H)，7.55-7.6(brs，1H)，7.8(s，1H)，9.3(s，1H)；MSm/z305.2(M+H)，237.2(M-C3H₃N₂·)

实例33：1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-(4-(甲硫基)苯基)硫脲

熔点：140.0-140.5℃

¹HNMRδ1.8-2.05(brm，2H)，2.5(s，3H)，3.3-3.5(brm，2H)，3.9-4.1(m，2H)，6.9(m，1H)，7.1-7.3(brm，5H)，7.6(s，1H)，7.75(brs，1H)，9.4(s，1H)；MSm/z307.2(M+H)，239.2(M-C3H₃N₂·)

实例42：1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-(4-硝基苯基)硫脲

熔点：165.0.166.0℃

¹HNMRδ1.9-2.05(m，2H)，3.3-3.5(brd，2H)，3.95-4.05(m，2H)，6.85(d，1H)，7.15(d，1H)，7.6(d，1H)，7.7(m，2H)，8.1(m，2H)，8.3(brs，1H)，10.1(brs，1H)；MSm/z306.2(M+H)，237.9(M-C3H₃N₂·)

实例50：1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-(4-(二甲基氨基)苯基)硫脲

熔点；146.5-147.0℃

¹HNMRδ1.9-2.0(m，2H)，2.9(s，6H)，3.4(m，2H)，3.9-4.0(m，2H)，6.7(m，2H)，6.9(s，1H)，7.05-7.1(m，2H)，7.15(s，1H)，7.4(brs，1H)，7.6(s，1H)，9.2(s，1H)；MSm/z304.2(M+H)，236.0(M-C3H₃N₂·)

实例102：1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-(3，4-二甲氧基苯基)脲

熔点：114.5-115.0℃

¹HNMRδ1.7-1.9(m，2H)，2.9-3.1(m，2H)，3.7(2s，6H)，3.9-4.0(m，2H)，6.1(t，1H)，6.7(s，2H)，6.8(s，1H)，7.15(d，2H)，7.6(s，1H)，8.2(s，1H)；MSm/z321.2(M+H)，253.3(M-C3H₃N₂·)

实例106：1-((S)-3-(1H-咪唑-1-基)-2-甲基丙基)-3-(3，4-二甲氧基苯基)-硫脲

熔点::150.5-151.5℃

¹HNMRδ0.9(d，3H)，2.3-2.4(m，2H)，2.5(s，1H)，3.7(d，6H)，4.0-4.1(brm，1H)，4.15-4.25(brm，1H)，6.75-6.8(m，1H)，6.85(m，1H)，6.9-7.0(m，1H)，7.65(s，1H)，7.75(s，2H)，9.1(s，1H)，9.5(s，1H)；MSm/z335.6(M+H)，267.1(M-C3H₃N₂·)

实例107：1-((R)-3-(1H-咪唑-1-基)-2-甲基丙基)-3-(3，4-二甲氧基苯基)-硫脲

熔点：155.0-157.5℃

¹HNMRδ0.9(d，3H)，2.3-2.4(m，2H)，2.5(s，1H)，3.7(d，6H)，4.0-4.1(brm，1H)，4.15-4.25(brm，1H)，6.75-6.8(m，1H)，6.85(m，1H)，6.9-7.0(m，1H)，7.65(s，1H)，7.75(s，2H)，9.1(s，1H)，9.5(s，1H)；MSm/z335.4(M+H)，267.2(M-C3H₃N₂·)

实例109：1-((1-((1H-咪唑-1-基)甲基)环丙基)甲基)-3-(3，4-二甲氧基-苯基)硫脲

熔点：166.5-168.5℃

¹HNMRδ0.7-0.8(brm，2H)，1.85-1.9(m，1H)，2.15-2.2(m，1H)，2.2-2.3(m，1H)，3.4-3.5(m，1H)，3.7(d，6H)，4.2(s，1H)，4.95(s，1H)，6.75-6.8(brm，1H)，6.85-6.9(brm，1H)，7.0(s，1H)，7.5(m，1H)，7.6(m，1H)，7.7(s，0.5H)，7.8(s，0.5H)，8.85(s，0.5H)，9.1(s，0.5H)，9.35(s，0.5H)，9.45(s，0.5H)；MSm/z347.2(M+H)，279.2(M-C3H₃N₂·)，137.5(M-C₉H₁₃N₄S·)

实例110：N-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)苯并[d]噻唑-2-胺

¹HNMRδ1.95-2.15(m，2H)，3.25-3.35(m，2H)，4.0-4.1(t，2H)，6.9(s，1H)，6.95-7.05(t，1H)，7.15-7.2(m，2H)，7.35-7.4(d，1H)，7.60-7.70(m，2H)，8.0-8.1(brs，1H)；MSm/z259.4(M+H)，191.3(M-C3H₃N₂·)

实例111：N-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-6-氯苯并[d]噻唑-2-胺

¹HNMRδ1.95-2.15(m，2H)，3.25-3.35(m，2H)，4.0-4.1(t，2H)，6.9(s，1H)，7.1-7.2(d，2H)，7.3-7.4(d，1H)，7.65(s，1H)，7.8(s，1H)，8.2(s，1H)；MSm/z293.3(M+H)，225.3(M-C3H₃N₂·)

实例112：N-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-胺

¹HNMRδ1.9-2.05(m，2H)，3.2-3.3(m，2H)，3.7(s，3H)，4.0-4.1(t，2H)，6.7-6.8(d，1H)，6.9(s，1H)，7.15-7.2(s，1H)，7.2-7.3(m，2H)，7.65(s，1H)，7.8(s，1H)；MSm/z289.1(M+H)，221.4(M-C3H₃N₂·)

实例115：(R)-N-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-2-苯基硫代丙酰

熔点：82.0-82.5℃

¹HNMRδ1.4-1.55(d，3H)，1.9-2.0(m，2H)，3.4-3.5(m，2H)，3.85-3.95(m，2H)，4.0-4.1(q，1H)，6.8-6.9(s，1H)，7.1(s，1H)，7.15-7.2(m，1H)，7.2-7.3(m，2H)，7.35-7.4(m，2H)，7.55(s，1H)，10.1(s，1H)；MSm/z274.4(M+H)，206.3(M-C3H₃N₂·)

实例116：(S)-N-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-2-苯基硫代丙酰

熔点：82.5-83.5℃

实例121：N-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-1-(4-氯苯基)环丁基甲硫酰胺

熔点：137.5-139.0℃

¹HNMRδ1.55-1.75(brm，2H)，1.85-1.95(brm，2H)，2.4-2.5(brm，2H)，2.7-2.85(brm，2H)，3.3-3.5(brm，2H)，3.8(m，2H)，6.9(s，1H)，7.0(s，1H)，7.3(m，2H)，7.45(s，1H)，7.5(m，2H)，9.6(t，1H)；MSm/z334.3(M+H)，266.1(M-C3H₃N₂·)

实例122：N-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-1-(4-氯苯基)环戊基甲硫酰胺

熔点：140.0-141.0℃

¹HNMRδ1.5-1.65(brm，4H)，1.8-1.9(m，2H)，2.0-2.1(m，2H)，2.6(m，2H)，3.4-3.5(m，2H)，3.7-3.8(m，2H)，6.85(s，1H)，7.0(s，1H)，7.35(m，2H)，7.4(m，2H)，7.5(s，1H)，9.4(t，1H)；MSm/z348.2(M+H)，280.2(M-C3H₃N₂·)

实例123：N-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-1-(4-甲氧基苯基)环己基甲硫酰胺

熔点：162.5-164.0℃

¹HNMRδ1.2-1.3(m，1H)，1.35-1.5(brm，5H)，1.85-2.0(brm，4H)，2.4-2.6(brm，2H)，3.4-3.5(m，2H)，3.7(s，3H)，3.8(m，2H)，6.8(m，3H)，7.0(s，1H)，7.3(m，2H)，7.5(s，1H)，9.2(t，1H)；MSm/z358.3(M+H)，2903(M-C3H₃N₂·)

实例124：N-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-1-(4-甲氧基苯基)环丙基甲硫酰胺

熔点::129.0-129.5℃

¹HNMRδ1.0-1.1(m，2H)，1.5-1.6(m，2H)，1.9-2.0(brm，2H)，3.4-3.5(m，2H)，3.7(s，3H)，3.9(m，2H)，6.9(m，3H)，7.1(s，1H)，7.2-7.3(m，2H)，7.6(s，1H)，8.9(brs，1H)；MSm/z316.0(M+H)，248.4(M-C3H₃N₂·)

实例134：5-(1H-咪唑-1-基)-N-(3，4-二甲氧基苯基)戊基硫酰胺

熔点::128.0-128.5℃

¹HNMRδ1.65-1.70(m，2H)，1.75-1.80(m，2H)，2.7-2.75(m，2H)，3.7(s，3H)，3.75(s，3H)，4.0-4.05(t，2H)，6.9-7.0(m，2H)，7.2(s，1H)，73(d，1H)，7.5(s，1H)，7.75(s，1H)，11.0(s，1H)；MSm/z320.2(M+H)，252.2(M-C3H₃N₂·)

实例136：1-(2-(1H-咪唑-1-基)乙基)-3-(3，4-二甲氧基苯基)硫脲

熔点：157.5-159.0℃

¹HNMRδ3.7(2s，6H)，3.8(m，2H)，4.2(m，2H)，6.7(m，1H)，6.85(m，1H)，6.9(m，2H)，7.15(s，1H)，7.5(brs，1H)，7.6(s，1H)，9.5(s，1H)；MSm/z307.2(M+H)，239.1(M-C3H₃N₂·)

缩写

℃摄氏度

A，Ala丙氨酸

Aβ淀粉样蛋白-β肽

ABri家族性英国型痴呆中的淀粉样肽

AC腺苷酰环化酶

ADan家族性丹麦型痴呆中的淀粉样肽

AIM在黑素瘤中缺乏

AMC氨基甲基香豆素

as反义

Asp天冬氨酸

βNAβ-萘胺

BA丁酸

bp碱基对

BSA牛血清白蛋白

C半胱氨酸

CAT氯霉素乙酰转移酶

cAMP环一磷酸腺苷

CCL2MCP-1，单核细胞趋化蛋白1

CCL7MCP-3，单核细胞趋化蛋白3

CCL8MCP-2，单核细胞趋化蛋白2

CCL13MCP-4，单核细胞趋化蛋白4

cDNA拷贝-DNA

C-His羧基端组氨酸标签

CIDP慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病

Cl氯

CSF脑脊髓液

C-terminus羧基末端

CTL细胞毒T-淋巴细胞

CV柱体积

d直径

Da道尔顿

DMSO二甲基亚砜

DNA脱氧核糖核苷酸

E酶

EBVEpsteinBarr病毒

ECL肠嗜铬样的

E.coli大肠杆菌

EC谷氨酰基环化酶

ED有效剂量

EGFP增强型绿色荧光蛋白

ES酶-底物复合物

FPP受精促进肽

FTC滤泡性甲状腺癌

g相对离心力

GBSGuillain-Barré综合征

GF凝胶过滤

Gln谷氨酰胺

Glu谷氨酸

GnRH促性腺激素释放激素(促性腺素释放素)

GST谷胱甘肽S-转移酶

H氢

h人，小时

HGF肝细胞生长因子

HIC疏水相互作用层析

HIF1a低氧诱导因子1a

His组氨酸

HPLC高效液相色谱

I抑制剂，异亮氨酸

ID身份

IMAC固定化金属亲和层析

IPTG异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷

K钾

k常数

kDA千道尔顿

k_i抑制剂常数

KLH匙孔(虫戚)血蓝蛋白

l长度

LBLuria-Bertani

LD致死剂量

LPS脂多糖

M摩尔

μl微升

μM微摩尔

MAGEA黑素瘤抗原家族A

MAGEB黑素瘤抗原家族B

Maldi-tof基质辅助激光解吸/电离飞行时间

MART1由T-细胞识别的黑素瘤抗原1

max最大值

MCL-1髓样细胞白血病1

Met甲硫氨酸

min分钟

mM毫摩尔

MS多发性硬化

mRNA信使RNA

N天冬酰胺

Na钠

NADH烟酰胺腺嘌呤二核苷酸

nm纳米

NO编号

NT神经降压肽

氨基端氨基端

O氧

OD光密度

P产物，磷光体

PBS磷酸盐缓冲盐水

PCR聚合酶链反应

pGlu焦谷氨酸

pH酸度

Pro脯氨酸

PTC乳头状甲状腺癌

Pyr焦谷氨酸酯

QC谷氨酰环化酶(谷氨酰胺肽环化转移酶)

qPCR定量实时聚合酶链反应

QPCTL谷氨酰胺肽环化转移酶样

RNA核糖核苷酸

RT逆转录作用；逆转录酶

S底物

s有义

SAGE基因表达连续分析法

SDS十二烷基硫酸钠

SDS-PAGESDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SGAP灰色链霉菌氨基肽酶

SEQ序列

SNP单核苷酸多态性

taa肿瘤相关抗原

TGF-β转化生长因子β

TNF-α肿瘤坏死因子α

TRH促甲状腺激素释放激素(促甲状腺素释放素)

TSH甲状腺刺激激素

TYR酪氨酸酶

TYRP酪氨酸酶相关蛋白

U单位

UTC未分化甲状腺癌

UV紫外线

V速度

VpAP弧菌属(Vibrio)蛋白酶解氨基肽酶

YSS酵母信号序列

Zn锌

序列表

<110>前体生物药物股份公司

<120>与谷氨酰环化酶相关的新基因

<130>PBD00060/WO

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Asp

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ArgProLeuTrpAspAspSer

355

<210>23

<211>42

<212>PRT

<213>Homosapiens

<400>23

AspAlaGluPheArgHisAspSerGlyTyrGluValHisHisGlnLys

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LeuValPhePheAlaGluAspValGlySerAsnLysGlyAlaIleIle

202530

GlyLeuMetValGlyGlyValValIleAla

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<210>24

<211>40

<212>PRT

<213>Homosapiens

<400>24

AspAlaGluPheArgHisAspSerGlyTyrGluValHisHisGlnLys

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LeuValPhePheAlaGluAspValGlySerAsnLysGlyAlaIleIle

202530

GlyLeuMetValGlyGlyValVal

3540

<210>25

<211>40

<212>PRT

<213>Homosapiens

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202530

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3540

<210>26

<211>38

<212>PRT

<213>Homosapiens

<400>26

GluPheArgHisAspSerGlyTyrGluValHisHisGlnLysLeuVal

151015

PhePheAlaGluAspValGlySerAsnLysGlyAlaIleIleGlyLeu

202530

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151015

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<220>

<223>syntheticpeptide

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151015

AsnLysGlyAlaIleIleGlyLeuMetValGlyGlyValVal

202530

<210>29

<211>40

<212>PRT

<213>human

<220>

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151015

PhePheAlaGluAspValGlySerAsnLysGlyAlaIleIleGlyLeu

202530

MetValGlyGlyValValIleAla

3540

<210>30

<211>38

<212>PRT

<213>human

<220>

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151015

PhePheAlaGluAspValGlySerAsnLysGlyAlaIleIleGlyLeu

202530

MetValGlyGlyValVal

35

<210>31

<211>32

<212>PRT

<213>human

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

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<400>31

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151015

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202530

<210>32

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<212>PRT

<213>human

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>PYRROLIDONECARBOXYLICACID

<400>32

GluValHisHisGlnLysLeuValPhePheAlaGluAspValGlySer

151015

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202530

<210>33

<211>34

<212>PRT

<213>Homosapiens

<400>33

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151015

ValGluThrLeuIleCysSerArgThrValLysLysAsnIleIleGlu

202530

GluArg

<210>34

<211>34

<212>PRT

<213>Homosapiens

<400>34

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151015

ValGluThrLeuIleCysSerArgThrValLysLysAsnIleIleGlu

202530

GluArg

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<212>PRT

<213>Homosapiens

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<212>PRT

<213>human

<400>36

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151015

LysGlnGlyProTrpLeuGluGluGluGluGluAlaTyrGlyTrpMet

202530

AspPhe

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<211>34

<212>PRT

<213>Homosapiens

<220>

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<400>37

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151015

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202530

GluArg

<210>38

<211>34

<212>PRT

<213>Homosapiens

<220>

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GluAlaSerAsnCysPheAlaIleArgHisPheGluAsnLysPheAla

151015

ValGluThrLeuIleCysSerArgThrValLysLysAsnIleIleGlu

202530

GluArg

<210>39

<211>17

<212>PRT

<213>human

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>PYRROLIDONECARBOXYLICACID

<400>39

GlnGlyProTrpLeuGluGluGluGluGluAlaTyrGlyTrpMetAsp

151015

Phe

<210>40

<211>34

<212>PRT

<213>human

<220>

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<222>(1)..(1)

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<400>40

GlnLeuGlyProGlnGlyProProHisLeuValAlaAspProSerLys

151015

LysGlnGlyProTrpLeuGluGluGluGluGluAlaTyrGlyTrpMet

202530

AspPhe

<210>41

<211>13

<212>PRT

<213>Homosapiens

<400>41

GlnLeuTyrGluAsnLysProArgArgProTyrIleLeu

1510

<210>42

<211>10

<212>PRT

<213>Homosapiens

<220>

<221>MOD_RES

<222>(10)..(10)

<223>AMIDATION

<400>42

GlnHisTrpSerTyrGlyLeuArgProGly

1510

<210>43

<211>97

<212>PRT

<213>Homosapiens

<400>43

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151015

LysTyrTyrGluLysValLeuProArgArgLeuValValGlyTyrArg

202530

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65707580

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859095

Gln

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<211>76

<212>PRT

<213>Homosapiens

<400>44

GlnProAspSerValSerIleProIleThrCysCysPheAsnValIle

151015

AsnArgLysIleProIleGlnArgLeuGluSerTyrThrArgIleThr

202530

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<210>45

<211>76

<212>PRT

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<400>45

GlnProAspAlaIleAsnAlaProValThrCysCysTyrAsnPheThr

151015

AsnArgLysIleSerValGlnArgLeuAlaSerTyrArgArgIleThr

202530

SerSerLysCysProLysGluAlaValIlePheLysThrIleValAla

354045

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505560

AspHisLeuAspLysGlnThrGlnThrProLysThr

657075

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<212>PRT

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<400>46

GlnValGlyThrAsnLysGluLeuCysCysLeuValTyrThrSerTrp

151015

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202530

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CysAlaAspProAsnLysLysTrpValGlnLysTyrIleSerAspLeu

505560

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<212>PRT

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<400>47

GlnHisHisGlyValThrLysCysAsnIleThrCysSerLysMetThr

151015

SerLysIleProValAlaLeuLeuIleHisTyrGlnGlnAsnGlnAla

202530

SerCysGlyLysArgAlaIleIleLeuGluThrArgGlnHisArgLeu

354045

PheCysAlaAspProLysGluGlnTrpValLysAspAlaMetGlnHis

505560

LeuAspArgGlnAlaAlaAlaLeuThrArgAsnGlyGlyThrPheGlu

65707580

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859095

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115120125

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130135140

LeuProProThrProLysAlaGlnAspGlyGlyProValGlyThrGlu

145150155160

LeuPheArgValProProValSerThrAlaAlaThrTrpGlnSerSer

165170175

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180185190

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GlyGlnGlyGlnSerProArgProGluAsnSerLeuGluArgGluGlu

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245250255

GlySerMetAlaHisValSerValValProValSerSerGluGlyThr

260265270

ProSerArgGluProValAlaSerGlySerTrpThrProLysAlaGlu

275280285

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<212>PRT

<213>Homosapiens

<400>48

GlnProValGlyIleAsnThrSerThrThrCysCysTyrArgPheIle

151015

AsnLysLysIleProLysGlnArgLeuGluSerTyrArgArgThrThr

202530

SerSerHisCysProArgGluAlaValIlePheLysThrLysLeuAsp

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505560

LysHisLeuAspLysLysThrGlnThrProLysLeu

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<211>33

<212>PRT

<213>Homosapiens

<400>49

GlnProLeuProAspCysCysArgGlnLysThrCysSerCysArgLeu

151015

TyrGluLeuLeuHisGlyAlaGlyAsnHisAlaAlaGlyIleLeuThr

202530

Leu

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<211>11

<212>PRT

<213>Homosapiens

<400>50

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1510

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<212>PRT

<213>Musmusculus

<400>79

MetAlaGlySerGluAspLysLeuValValGlyThrLeuHisLeuLeu

151015

LeuLeuGlnAlaThrValLeuSerLeuThrAlaGlyAsnLeuSerLeu

202530

ValSerAlaAlaTrpThrGlnGluLysAsnHisHisGlnProAlaHis

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LeuAsnSerSerSerLeuGlnGlnValAlaGluGlyThrSerIleSer

505560

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100105110

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AsnProGluAlaLysArgHisLeuValLeuAlaCysHisTyrAspSer

130135140

LysTyrPheProArgTrpAspSerArgValPheValGlyAlaThrAsp

145150155160

SerAlaValProCysAlaMetMetLeuGluLeuAlaArgAlaLeuAsp

165170175

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180185190

SerLeuArgLeuIlePhePheAspGlyGluGluAlaPheHisHisTrp

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210215220

AlaSerSerProHisProProGlySerArgGlyThrAsnGlnLeuAsp

225230235240

GlyMetAspLeuLeuValLeuLeuAspLeuIleGlyAlaAlaAsnPro

245250255

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260265270

GlnAlaIleGluLysGluLeuTyrGluLeuGlyLeuLeuLysAspHis

275280285

SerLeuGluArgLysTyrPheGlnAsnPheGlyTyrGlyAsnIleIle

290295300

GlnAspAspHisIleProPheLeuArgLysGlyValProValLeuHis

305310315320

LeuIleAlaSerProPheProGluValTrpHisThrMetAspAspAsn

325330335

GluGluAsnLeuHisAlaSerThrIleAspAsnLeuAsnLysIleIle

340345350

GlnValPheValLeuGluTyrLeuHisLeu

355360

<210>80

<211>284

<212>PRT

<213>Strepromycesgriseus

<400>80

AlaProAspIleProLeuAlaAsnValLysAlaHisLeuThrGlnLeu

151015

SerThrIleAlaAlaAsnAsnGlyGlyAsnArgAlaHisGlyArgPro

202530

GlyTyrLysAlaSerValAspTyrValLysAlaLysLeuAspAlaAla

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GlyTyrThrThrThrLeuGlnGlnPheThrSerGlyGlyAlaThrGly

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859095

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100105110

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GlyAlaGluGluLeuGlyLeuIleGlySerLysPheTyrValAsnAsn

130135140

LeuProSerAlaAspArgSerLysLeuAlaGlyTyrLeuAsnPheAsp

145150155160

MetIleGlySerProAsnProGlyTyrPheValTyrAspAspAspPro

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260265270

TrpThrLeuSerSerGlyThrGlyGluProProThr

275280

<210>81

<211>299

<212>PRT

<213>Vibrioproteolyticus

<400>81

MetProProIleThrGlnGlnAlaThrValThrAlaTrpLeuProGln

151015

ValAspAlaSerGlnIleThrGlyThrIleSerSerLeuGluSerPhe

202530

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354045

IleAlaSerGluTrpGlnAlaLeuSerAlaSerLeuProAsnAlaSer

505560

ValLysGlnValSerHisSerGlyTyrAsnGlnLysSerValValMet

65707580

ThrIleThrGlySerGluAlaProAspGluTrpIleValIleGlyGly

859095

HisLeuAspSerThrIleGlySerHisThrAsnGluGlnSerValAla

100105110

ProGlyAlaAspAspAspAlaSerGlyIleAlaAlaValThrGluVal

115120125

IleArgValLeuSerGluAsnAsnPheGlnProLysArgSerIleAla

130135140

PheMetAlaTyrAlaAlaGluGluValGlyLeuArgGlySerGlnAsp

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LeuAlaAsnGlnTyrLysSerGluGlyLysAsnValValSerAlaLeu

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180185190

IleThrAspTyrThrAspSerAsnPheThrGlnTyrLeuThrGlnLeu

195200205

MetAspGluTyrLeuProSerLeuThrTyrGlyPheAspThrCysGly

210215220

TyrAlaCysSerAspHisAlaSerTrpHisAsnAlaGlyTyrProAla

225230235240

AlaMetProPheGluSerLysPheAsnAspTyrAsnProArgIleHis

245250255

ThrThrGlnAspThrLeuAlaAsnSerAspProThrGlySerHisAla

260265270

LysLysPheThrGlnLeuGlyLeuAlaTyrAlaIleGluMetGlySer

275280285

AlaThrGlyAspThrProThrProGlyAsnGln

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aagcgaggttctcgttctga20

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gctcatcggctgttggtatt20

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ataagcaggtggagcattgg20

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aaccaaagccaccagtgttc20

Claims

1.筛选能够抑制至少一种多肽的酶活性的化合物的方法，所述多肽可以任选地是糖基化的，并且该多肽(a)由SEQIDNO:11-18任一项所示的成熟蛋白的氨基酸序列组成,所述方法包括在存在一种或多种测试化合物或其盐的情况下温育所述成熟蛋白和该成熟蛋白的合适底物，测量该成熟蛋白的酶活性，将此活性与不存在测试化合物的情况下所确定的可相比的活性进行比较，并选出降低所述酶活性的一或多种测试化合物，

其中所述测试化合物是竞争性酶抑制剂。

2.筛选不抑制至少一种多肽的酶活性的选择性QC抑制剂的方法，所述多肽可以任选地是糖基化的，并且该多肽(a)由SEQIDNO:11-18任一项所示的成熟蛋白的氨基酸序列组成,所述方法包括在存在QC的一种或多种抑制剂或其盐的情况下温育所述成熟蛋白和合适底物，测量该成熟蛋白的酶活性，将此活性与不存在所述QC抑制剂的情况下所确定的可相比的活性比较，并选出不降低所述成熟蛋白的酶活性的化合物，

其中所述选择性QC抑制剂是竞争性酶抑制剂。

3.权利要求1或2的方法，其中所述成熟蛋白由SEQIDNO:11-18之一的成熟蛋白的氨基酸序列组成。

4.筛选不抑制QC的酶活性的选择性QPCTL-抑制剂的方法，所述方法包括在存在QPCTL的一种或多种抑制剂或其盐的情况下温育所述QC，测量QC的酶活性，将此活性与不存在所述QPCTL抑制剂的情况下所确定的可相比的活性比较，并选出不降低所述QPCTL蛋白的酶活性的化合物，

其中所述选择性QPCTL抑制剂是竞争性酶抑制剂。