CN101560197B - 从人工栽培的红豆杉枝叶中提取紫杉醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种从人工栽培的红豆杉枝叶中制备紫杉醇的方法。为了得到紫杉醇，国内外开展了种植矮壮化的红豆杉树、组织培养、半合成和全合成紫杉醇等方法获取紫杉醇原料，但组织培养法获得的产量很小，培养液价格昂贵，全合成得率很小，且疗效不及天然源紫杉醇，成本高，难以商业化应用。本发明是以人工栽培的曼地亚红豆杉、云南红豆杉、南方红豆杉或东北红豆杉的枝叶为原料，经甲醇浸泡提取、依次用石油醚和乙酸丙酯萃取，然后用常压正相硅胶柱层析法及反相高压液相色谱分离法得到99.6％以上的高纯度紫杉醇。该方法工艺简单、成本低、溶剂、洗脱剂可以回收，适合于工业化生产，且保护了植物资源。
Description
技术领域
本发明内容属于生化物品制备技术领域，涉及一种从人工栽培的红豆杉枝叶中提取紫杉醇的方法。
背景技术
紫杉醇(paclitaxel，taxol)是一种由红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)植物的树皮、枝叶提取的化学结构复杂、作用机制独特的抗肿瘤药物。天然紫杉醇的来源极为有限，其主要来源于红豆杉或紫杉树皮(Wani等，J.Am.Chem.Soc.1971，93，2325)。红豆杉树种生长极其缓慢，一颗生长百年的老树一般只能剥25kg树皮，若提取1kg纯紫杉醇提供1万2千例癌病患者使用，相当于需3万株红豆杉树的树皮。为了得到紫杉醇，国内外开展了种植矮壮化的红豆杉树、组织培养、半合成和全合成紫杉醇等方法获取紫杉醇原料。但组织培养法获得的产量很小，培养液价格昂贵，全合成得率很小，且疗效不及天然源紫杉醇，成本高，难以商业化应用。半合成方法仍然需要天然红豆杉分离出的紫杉醇半合成的前体10-去乙酰基巴卡丁III等作为起始原料。为了保护天然的红豆杉资源，维护生态环境，用生长快的、有效成分含量较高的人工种植的红豆杉提取紫杉醇是最为有效的途径(高锦明等，紫杉醇资源开发研究，西北林学院学报，1997，12(3)：94；高锦明等，抗癌新药紫杉醇的构效关系，西北农业大学学报，1997，25(5)：96；高锦明等，紫杉醇资源、生物活性和化学合成，世界林业研究，1997，10(6)：38；Gragg等，J.Nat.Prod.，1993，56，1657；Kingston，Phytochemistry，2007，68，1844)。
Miller(J.Org.Chem.，1981，46，1469)用(Taxus wallichiana)树干和树叶，用甲醇提取、浓缩，在己烷和水中分配，用氯仿萃取，浓缩，经几次硅胶柱色谱分离；经二次逆流分配；最后用HPLC分离纯化得到184个组分，所得的紫杉醇纯度99.1％。整个提取纯化过程有八个步骤。Senilh等(J.Nat.Prod.，1984，47，131)用甲醇提取欧洲紫杉(T.baccata)树皮，浓缩后，在二氯甲烷和水中分配，经硅胶柱色谱分离，然后经氧化铝柱色谱分离；再经中压硅胶柱色谱分离；最后用制备高压液相色谱纯化。
Nalr(USP 5,279,949，1994)发明了用红豆杉(T.media cv.Hicksii)的新鲜枝叶提取紫杉醇及其类似物。新鲜枝叶用含水甲醇提取，水溶性组分离心与含紫杉醇的固体沉淀分离，过滤后的滤液用活性炭脱色用硅藻土过滤，滤液挥发至干，经硅胶柱，液相分离得到产物。或者将硅藻土过滤的滤液真空下脱甲醇后，用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩，经硅胶柱纯化得到产物。Nalr(USP 5,478,736，1995)用甲醇和丙酮萃取新鲜枝叶，可得到较高的紫杉醇产量。二次柱色谱分离，低压硅胶柱色谱分离粗紫杉醇，反相色谱最后纯化。
Polysciences公司从太平洋紫杉树皮中分离紫杉醇。先甲醇或乙醇提取树皮，浓缩；浓缩液用二氯甲烷萃取，浓缩干燥至粉末；粉末用丙醇和里格罗因(1∶1)溶解，不溶组分过滤除去；滤液浓缩，溶于30％丙醇里格罗因溶液，经Florisil柱过滤；从柱中流出的紫杉醇组分结晶纯化二次；结晶的紫杉醇再用硅胶柱中分离，结构相似的产物三尖杉宁碱从紫杉醇中分离出来；从柱中流出的紫杉醇重结晶二次，得到紫杉醇。Rao等(USP5,380,916，1992)介绍了用臭氧处理难分离的杂质组分三尖杉宁碱而得紫杉醇。经反相制备色谱法分离粗产品后，仍含有很难分开的三尖杉宁碱，通入臭氧氧化后，经过反相制备色谱分离得到纯度较高的紫杉醇。该方法要使用二甲硫醚处理溶液中残留的臭氧及重结晶得到紫杉醇纯品。Kingston等(J.Nat.Prod.，1992，55，259)使用氧化剂四氧化锇处理紫杉醇和三尖杉宁碱的混合物。紫杉醇不与四氧化锇反应，三尖杉宁碱的C-13侧链末端双键被氧化，易与紫杉醇分开。Durand(USP 5,723,635，1998)利用离心分配色谱法分离纯化紫杉醇。用C18反相色谱柱从粗产物中分离纯化紫杉醇，一次处理量较大。主要有四个步骤：在制备规模下，用反相色谱法处理紫杉醇粗提物；从吸附剂上洗脱紫杉醇和其它产物；从洗脱的柱子中回收紫杉醇和类似物；使用臭氧处理最终产物，从而分离除去紫杉醇的类似物。
Rao(USP 5,380,916，1995)用95％甲醇提取树皮，浓缩，氯仿和水萃取。连续萃取3次，氯仿相浓缩，在C18填料层析柱上用乙腈和水梯度洗脱，分段接收含紫杉醇较高的馏分，用热水稀释后，用反相柱再收集馏分，经重结晶得到高纯度的紫杉醇及其类似物。陈建民等发明了一种从种植红豆杉叶枝中制备紫杉醇的方法(ZL 1427002)。用乙醇浸泡，乙酸丁酯萃取，浓缩，得到1％紫杉醇粗原料，再经硅胶柱层析，以环己烷和乙酸乙酯梯度洗脱，收集含10％以上紫杉醇的馏分，浓缩后经反相高压液相色谱法分离，得到高纯度紫杉醇。
对于红豆杉提取紫杉醇的分离纯化多为使用低级醇溶剂浸提树皮，提取液先进行脱脂后氯仿萃取；氯仿层浓缩，经柱层析得到紫杉醇及其类似物。常用的色谱柱层析法需要多次正、反相液相色谱法、离心分配色谱法等，还包括结晶法、氧化去杂质法。分离过程步骤繁琐，达到99％以上纯度的紫杉醇一次得率较低。溶剂、洗脱液等毒性大，造成严重的污染。此外，紫杉醇与三尖杉宁碱、7-表-紫杉醇和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的性质相似，难以分离(Yang等，J.Chromatogr.A，1998，813，201)。从紫杉醇样品中有效剔除这些结构类似物是提取高纯度紫杉醇的关键所在。
发明内容
本发明的目的是提供一种从人工栽培的红豆杉枝叶中制备紫杉醇的方法，该方法工艺简单，易于分离掉紫杉醇的结构类似物，所得的紫杉醇纯度高。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种从人工栽培的红豆杉枝叶中制备紫杉醇的方法，其依次包括如下步骤：
A、将红豆杉枝叶粉碎后，在40～50℃下用75％～95％甲醇浸泡3次，每次4小时，将滤液浓缩后用体积比为4∶1～1∶1石油醚/水萃取；分出下层水相；
B、用乙酸丙酯萃取下层水相；乙酸丙酯萃取液浓缩，得到紫杉醇含量在2％～5％以上紫杉醇粗提物；
C、将2％以上紫杉醇粗提物同硅胶混合制备干样，填充了干样到硅胶(200～300目)的色谱柱上端，分别用4∶1的石油醚-乙酸乙酯、1∶1的石油醚-乙酸乙酯、1∶5的石油醚-乙酸乙酯及乙酸乙酯洗脱，按段将紫杉醇含量在15％～40％之间的洗脱液馏分集中起来，经浓缩、干燥，制得中间产品；
D、将步骤C所得的中间产品用体积比为30∶70的乙腈和含0.1％三氟醋酸水溶解，用高压液相色谱分离，色谱柱为C18硅胶填料，以含三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐的乙腈和含0.1％三氟醋酸水为流动相，收集洗脱液，浓缩，析出紫杉醇晶体和三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐固体的混合物。
此混合物经离心，水洗，再离心，水洗，过滤，冷冻干燥，得到纯度为99.6％以上的紫杉醇。
上述的洗脱液和流动相中的溶剂经过精馏后可重复使用。
上述的步骤A中人工栽培的红豆杉为曼地亚红豆杉、云南红豆杉或东北红豆杉。
上述的步骤D中的三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐浓度为2～15mg/mL。
上述的步骤D中的流动相乙腈-0.1％三氟醋酸水的体积比为30∶70。
上述的步骤D所得到的三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐，经过水洗，离心过滤，冷冻干燥后可重复使用。
本发明相对于现有技术，其优点如下：
该方法工艺简单、成本低、溶剂、洗脱剂可以回收，适合于工业化生产，且保护了植物资源。
附图说明：
图1是从红豆杉枝叶中提取纯化紫杉醇的工艺流程图；
图2是红豆杉枝叶粗提物的高效液相色谱图；
图3是紫杉醇含量在15％以上的高效液相色谱图；
图4是紫杉醇晶体和三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐的高效液相色谱图；
图5是分离纯度99.6％以上紫杉醇的高效液相色谱图。
具体实施方式
本发明是以人工栽培的曼地亚红豆杉、云南红豆杉、南方红豆杉或东北红豆杉的枝叶为原料，经甲醇浸泡提取、依次用石油醚和乙酸丙酯萃取，然后用常压正相硅胶柱层析法及反相高压液相色谱分离法得到高纯度紫杉醇。
本发明所采用的技术方案是：一种从人工栽培的红豆杉枝叶中提取紫杉醇的方法，依次包括如下步骤：
(1)将人工栽培的三年红豆杉的树枝叶粉碎后，在40～50℃下，用75～95％的甲醇浸泡三次，每次4小时，合并滤液，浓缩，后用体积比为4∶1石油醚/水萃取，分出下层，用等体积的乙酸丙酯萃取下层水相；
(2)将乙酸丙酯萃取液浓缩，得到紫杉醇含量在2％以上的紫杉醇浓缩液；
(3)将2％以上的紫杉醇浓缩液与硅胶伴样，并填充于硅胶柱上，用洗脱液梯度洗脱，分别加入石油醚和乙酸乙酯(4∶1)、石油醚和乙酸乙酯(1∶1)、石油醚和乙酸乙酯(1∶5)、乙酸乙酯，洗脱液流出色谱柱后分段收集馏分，按段将紫杉醇含量15％～40％之间的洗脱液馏分收集合并，经浓缩、干燥，制得中间产品；
(4)将步骤(3)和步骤(4)所得的中间产品用乙腈和含0.1％三氟醋酸水(30∶70)溶解，用C18反相高压液相色谱分离，以含三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐的乙腈和含0.1％三氟醋酸水(30∶70)为流动相，而后将分离后的含紫杉醇的流动相浓缩到一定体积，析出紫杉醇晶体和三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐固体的混合物。
(5)将步骤(4)所得的紫杉醇和三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐的混合物，经
离心，水洗，再离心，过滤，冷冻干燥，得到纯度达99.6％以上的紫杉醇。
步骤(1)中的红豆杉为曼地亚红豆杉(T.media)、云南红豆杉(T.yunnanensis)、或东北红豆杉(T.cuspidata)。
本发明提取紫杉醇的方法过程如图1所示。图1所示的工艺过程分为三个过程。
第一过程：利用人工栽培的新鲜或干燥的红豆杉枝叶粉碎后，在40～50℃用75％～95％甲醇浸泡三次，每次4小时，原料和甲醇的投料体积比1∶3～1∶8浸泡液过滤去除滤渣，滤液(HPLC分析见图2)置于旋转蒸发仪或浓缩罐中浓缩，加入体积比为1∶1石油醚/水萃取，搅拌30min，放置约20～30min，形成上层淡绿色清液及下层深绿色胶状液，分出上层石油醚相，连续萃取3次。下层水相用同体积的乙酸丙酯萃取后，乙酸丙酯萃取液，放置0.5～1小时后，将乙酸丙酯层与水层分开，取乙酸丙酯层蒸发浓缩干燥得到暗绿色或棕色粉末，所得紫杉醇含量在2％以上。
第二过程：将紫杉醇含量在2％以上的粗提物，用丙酮溶解，与硅胶(200-300目)混合制备干样。将干样置于硅胶柱上端，用石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂梯度洗脱，用相同体积的容器接收得到相同体积的馏分1-20。馏分9-15蒸干后，为黄色或绿黄色固体粉末，其紫杉醇含量在15.0～40.0％之间(图3)。该过程中紫杉醇含量在15.0～40.0％之间的馏分合并蒸干，用乙腈和含0.1％三氟醋酸水(30∶70)溶解，进行紫杉醇的下一步纯化。
第三过程：用C18反相高效液相色谱柱，注入25％紫杉醇粗提物10克乙腈水溶液，以含三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐的乙腈和含0.1％三氟醋酸水(30∶70)为流动相，承接得到馏分1-35。该过程中，馏分15-25在旋转蒸发仪中真空浓缩到一定体积后，析出紫杉醇和三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐的混合物(图4)，再通过离心，水洗，再离心，过滤，冷冻干燥，得到纯度为99.9％以上的紫杉醇(图5)。
本发明方法与现有的紫杉醇提取工艺相比步骤少、工艺简单、生产成本低，有利于紫杉醇的工业化大生产，且不破坏天然资源、有利于生态环境保护；不使用毒性较大的试剂、溶剂，符合环保要求；紫杉醇的一次得率高，纯度可达99.6％以上。
本发明所用的石油醚、乙酸丙酯、乙酸乙酯、甲醇、三氟醋酸、醋酸、三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐等均为分析纯。乙腈为HPLC级，使用的水为HPLC级和去离子水。
原料、中间产品及紫杉醇的分析均采用美国Waters高压液相色谱仪，色谱柱为美国Waters产品SymmetryShield RP 18硅胶色谱柱(50×4.6mm)，安装加拿大Missisawaga公司生产的Warters产品SymmetryShieldC18保护柱(3.9×20mm)，填料尺寸均为3.5μm，Waters 996二级管阵列检测器(210～500nm)，流动相为乙腈+水+0.1％TFA，乙腈比例从20％上升到80％，流速为1ml/min，自动进样，进样量为10μL。色谱柱用恒温箱，柱温为20℃，计算机操作，色谱软件为Millennium32。
高纯度紫杉醇制备采用美国Waters高压液相色谱仪系统，色谱柱为美国JM Science公司生产的Shiseido Capcell Pak C18，填料尺寸为5μm、色谱柱尺寸为4.6mm×250mm或4.6cm×150cm，分析波长为227nm，流动相为含三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐的乙腈+0.1％TFA水(30+70)，流速为1.0ml/min，自动进样，每20min收集。
高分辨质谱分析在英国Micromass公司生产的Micromass WatersQ-TOF Global质谱仪上进行，+ESI源。
实施例1：
如图1所示，从人工栽培的红豆杉枝叶中提取紫杉醇的方法为：
(1)取人工栽培的曼地亚红豆杉干枝叶1kg，用破碎机粉碎，5L圆底烧瓶中，加入90％甲醇3L，搅拌均匀，在40～50℃下浸泡三次，每次4～6小时。放置过程中搅拌3～6次，浸泡完成后，过滤，去除废渣，将滤液浓缩至呈浅绿色粘稠液，体积约为50ml。向溶液加入2L石油醚，混合均匀后加入2L水，搅拌30min，放置约25min，形成上层淡绿色清液及下层深绿色胶状液，分出上层石油醚相，如此连续萃取3次，除去脂溶性色素等杂质。向分出的下层水相中加入2L乙酸丙酯，搅拌30min，放置约25min，连续萃取3次，合并三次乙酸丙酯萃取液。
(2)将乙酸丙酯萃取液减压蒸发至干，形成棕色粉末，重量为12.6克，经测定紫杉醇含量为3.28％，下层混悬液中不含紫杉醇。
(3)将含量3.28％以上乙酸丙酯粉末，用丙酮溶解，同硅胶混合制备干样。干样置于硅胶柱上端，分别用0.3L的石油醚-乙酸乙酯(4∶1)、0.3L的石油醚-乙酸乙酯(1∶1)、0.5L的石油醚-乙酸乙酯(1∶5)和0.2L乙酸乙酯洗脱，用相同体积的容器接收得到相同体积的馏分1-20。馏分6-8中，含有较多7-表-10-去乙酰基紫杉醇及7-表紫杉醇，馏分9-15蒸干后，为黄色或绿黄色固体粉末。馏分9-15中紫杉醇含量在15.0％～35.0％之间。
(4)称取含量27.5％紫杉醇样品10克，用50ml的乙腈和含0.1％三氟醋酸水(30∶70)溶解，经C18反相高压液相色谱法分离纯化，加入27.5％紫杉醇乙腈-水溶液，以含三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐(3mg/mL)的乙腈和含0.1％三氟醋酸水(30∶70)为流动相，流速为1ml/min，收集馏分1-35。馏分1-14蒸干后分析表明为杂质组分，含有较多量三尖杉宁碱，少量紫杉醇(2.8％以下)及7-表-10-去乙酰基紫杉醇。馏分15-25，浓缩到一定体积，析出紫杉醇晶体和三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐固体的混合物。
(5)将步骤(4)所得到的紫杉醇和三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐的混合物，通过离心，水洗，离心，过滤，冷冻干燥，如此重复3次，得到产品2.82克。HPLC测定表明，紫杉醇纯度为99.9％以上(图5)。
洗脱液和流动相中的溶剂经过精馏后可重复使用。水洗所得的三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐，浓缩，冷冻干燥后可重复使用。
该产品为白色结晶，旋光度[α]D 25＝-54.6(c＝0.2，MeOH)，熔点为236～237℃，500MHz核磁共振图谱验证与紫杉醇标样相同，高分辨质谱(HR-ESI-MS)m/z 854.3397([M+H]+)，相应的分子式为C47H51NO14。该产品与标准样品在HPLC分析中保留时间一致。
实施例2：
(1)取人工栽培的3年树龄的曼地亚红豆杉的鲜枝叶100kg，用破碎机粉碎后置于2m3的提取罐中，然后加入90％甲醇550L，搅拌均匀，在40～50℃下间歇搅拌浸泡4小时。浸泡完成后，放出提取罐中的溶液，然后用同样方法浸泡3次。放出的甲醇溶液合并，置于浓缩罐中浓缩，至体积约为25L。提取罐中，向该溶液加入约250L石油醚，混合均匀后加250L水搅拌1小时，放置约30min形成两层，分出下层。向下层溶液加入约250L乙酸丙酯，混合均匀后，搅拌1小时，放置约30min形成两层。
(2)放出下层乙酸丙酯萃取液，减压蒸发至干，形成棕色粉末1032克，经测定紫杉醇含量为3.31％。
(3)将含3.31％的紫杉醇棕色粉末1kg，用丙酮溶解，同2kg的硅胶混合制备干样。干样置于装有10kg硅胶柱上，分别用30L的石油醚-乙酸乙酯(4∶1)、30L的石油醚-乙酸乙酯(1∶1)、50L的石油醚-乙酸乙酯(1∶5)和20L乙酸乙酯洗脱液，每10L收集一个馏分，用相同体积的容器接收得到相同体积的馏分1-20。馏分9-15蒸干后，为黄色或绿黄色固体粉末。馏分9-15中紫杉醇含量在15.0％～30.0％之间。
(4)将紫杉醇含量在20.3％的样品，溶解于乙腈和含0.1％三氟醋酸水(30∶70)中，经C18反相高压液相色谱法分离，以含三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐(5mg/mL)的乙腈和含0.1％三氟醋酸水(30∶70)为流动相，流速为1ml/min，收集馏分1-35。馏分15-25，浓缩，得到紫杉醇晶体和三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐固体的混合物。
(5)将此紫杉醇和三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐混合物。通过离心，水洗(300ml)，再离心，过滤，如此重复3次，冷冻干燥。得到纯度为99.7％以上的紫杉醇，收率为91％。
Claims (6)
1.一种从人工栽培的红豆杉枝叶中制备紫杉醇的方法，其特征在于依次包括如下步骤：
A、将红豆杉枝叶粉碎后，在40～50℃下用75％～95％甲醇浸泡3次，每次4小时，将滤液浓缩后用体积比为4∶1～1∶1石油醚/水萃取；分出下层水相；
B、用乙酸丙酯萃取下层水相；乙酸丙酯萃取液浓缩，得到紫杉醇含量在2％～5％紫杉醇粗提物；
C、将2％以上紫杉醇粗提物同硅胶混合制备干样，填充了干样到硅胶200～300目的色谱柱上端，分别用4∶1的石油醚-乙酸乙酯、1∶1的石油醚-乙酸乙酯、1∶5的石油醚-乙酸乙酯及乙酸乙酯洗脱，按段将紫杉醇含量在15％～40％之间的洗脱液馏分集中起来，经浓缩、干燥，制得中间产品；
D、将步骤C所得的中间产品用体积比为30∶70的乙腈和含0.1％三氟醋酸水溶解，用高压液相色谱分离，色谱柱为C18硅胶填料，以含三氟醋酸十八烷基吡啶季铵盐的乙腈和含0.1％三氟醋酸水为流动相，收集洗脱液，浓缩，析出紫杉醇晶体和三氟醋酸十八烷基吡啶季铵盐固体的混合物；
此混合物经离心，水洗，再离心，水洗，过滤，冷冻干燥，得到纯度为99.6％以上的紫杉醇。
2.根据权利要求1所述的从人工栽培的红豆杉枝叶中制备紫杉醇的方法，其特征在于：所述的洗脱液和流动相中的溶剂经过精馏后重复使用。
3.根据权利要求1所述的从人工栽培的红豆杉枝叶中制备紫杉醇的方法，其特征在于：步骤A中人工栽培的红豆杉为曼地亚红豆杉、云南红豆杉或东北红豆杉。
4.根据权利要求1所述的从人工栽培的红豆杉枝叶中制备紫杉醇的方法，其特征在于：步骤D中的三氟醋酸十八烷基吡啶季铵盐浓度为2～15mg/mL。
5.根据权利要求1所述的从人工栽培的红豆杉枝叶中制备紫杉醇的方法，其特征在于：步骤D中的流动相乙腈-0.1％三氟醋酸水的体积比为30∶70。
6.根据权利要求1所述的从人工栽培的红豆杉枝叶中制备紫杉醇的方法，其特征在于：步骤D所得到的三氟醋酸十八烷基吡啶季铵盐，经过水洗，离心，过滤，冷冻干燥后重复使用。
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| 张志强等.正相和反相柱层析组合分离纯化紫杉醇.《生物工程学报》.2000,第16卷(第1期),69-73. * |
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| CN101560197A (zh) | 2009-10-21 |
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