CN101554152B - 一种冷冻精液稀释液及其配制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于提高牛冷冻精液冻融后品质及受精率的新型冷冻精液稀释液及其配制方法。制得的该冷冻精液稀释液每100毫升中含有：柠檬酸钠：0.9～1.2克，蔗糖：3～5克，卵黄：18～22毫升，甘油：4～7毫升，维生素E：6～9毫克，维生素C：500～700毫克，壮观霉素：35毫克，庆大霉素8万单位。本发明首次把VE，VC联合加入到了精液稀释液中，可以明显提高精子冻后活率和顶体完整率及精浆中抗氧化物酶的活力，从而提高精子冻融后的品质及受精率。
Description
技术领域
本发明涉属于牛人工授精的改良技术范畴，尤其涉及一种用于牛冷冻精液提高牛精子冻后品质的冷冻精液稀释液及其配制方法。
背景技术
家畜精液的冷冻成功为人工授精技术的发展产生了极其深远的影响，首先它为扩大优秀种公畜的利用率和延长利用时间奠定了基础，其次为人工授精和低温生物学的发展提供了广阔的空间。由于冷冻精液在运输上比较方便，不论从时间还是从空间上，都使种公畜的配种效能得到充分发挥，加速了家畜品种改良的步伐。虽然各国都展开了对牛、猪、马、鸡等冷冻精液的研究，但是现在只有牛冷冻精液的人工授精技术广泛应用于生产实践。在家畜冷冻精液的稀释液研制方面，所有稀释液和保存环境的主要作用都是为了给精子提供足够的营养物质供精子代谢需要，防止精子迅速冷冻造成损伤，进行缓冲以防止pH的变化，维持适当的渗透压，平衡电解质，抑制细菌的生长，扩大稀释倍数以增加输精次数，并且提高精子冻后活率，提高良种家畜和精液的利用效率。
近几年来，随着我国经济的发展，人民生活水平的提高，牛奶逐渐走进了千家万户，所以奶牛的数量近年来在我国猛速发展。可是我国优秀高产奶牛良种化程度不高，群体规模小，产量低下成为奶牛发展的制约的因素。所以用高产奶公牛的冷冻精液对我国的低产奶牛进行改良已经成为当务之急。
为了不断提高奶牛冷冻精液的冷冻效果，在过去的60多年中，国内外专家一直在努力探索和寻找最适宜的冷冻保护剂，提高奶牛和肉牛冷冻精液的冷冻效果。国内外研究表明，精液经过冷冻-解冻处理后精子DNA损伤加剧，导致精子冻融后精子品质及受精率降低，这一直是困扰精子受精能力的一个问题。因此冷冻精液品质的高低成了制约奶牛、肉牛人工受精成功率的重要因素。但是在生产实践中，时常有精子冻融后活力不高，受精率低下，影响人工授精的效果。因此，根据目前的趋势，利用实验室的条件对奶牛的精液稀释液配方进行研究，开发出新的精液稀释液，这样既可以提高精子冻融后的存活率及受精率，又加快了我国奶牛的改良力度，为迅速提高奶牛的改良和产奶量，增加奶牛业的经济效益，拉动地方和区域经济发展具有积极的作用。
以下是申请人检索的相关参考文献：
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发明内容
针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种用于提高牛冷冻精液冻融后品质及受精率的新型冷冻精液稀释液及其配制方法。制得的该冷冻精液稀释液可以明显提高精子冻后活率和顶体完整率及精浆中抗氧化物酶的活力，从而提高精子冻融后的品质及受精率。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种冷冻精液稀释液，其特征在于，制得的该冷冻精液稀释液每100毫升中含有：柠檬酸钠：0.9克～1.2克，蔗糖：3克～5克，卵黄：18毫升～22毫升，甘油：4毫升～7毫升，维生素E：6毫克～9毫克，维生素C：500毫克～700毫克，壮观霉素：35毫克，庆大霉素8万单位(IU)。
上述冷冻精液稀释液的配制方法，其特征在于，包括下列步骤：
准确称取权利要求1配方中的柠檬酸钠、蔗糖、卵黄、维生素E、维生素C和甘油，加蒸馏水至100毫升，在磁力搅拌器上充分搅拌均匀，得到混合溶液，然后放入4℃冰箱过夜；
精液稀释前，在混合溶液中加入权利要求1配方中的壮观霉素毫克和庆大霉素，并搅拌10分钟；
用酸或碱调整精液稀释液的酸碱度在6.7～7.2之间，用0.22微米滤器对稀释液进行滤菌处理，得到冷冻精液稀释液；
使用时，用0.22微米滤器对冷冻精液稀释液进行滤菌处理，完毕后放入37.5℃水浴锅中备用，然后按照常规精液制作方法即可用于精液的解冻。
本发明首次把VE，VC联合加入到了精液稀释液中，并对稀释液的配制方法做了修正，实验数据表明，本发明的冷冻冷冻精液稀释液不仅提高了精子冻融后的活力和精子顶体完整率，并且提高了精浆中用来保护精子受精能力的过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GR)、谷胱甘肽还原酶(GSH)的冻融后活力，更加确保了此精液配方能提高精子冻后品质。
具体实施方式
按照本发明的技术方案，配制100毫升的冷冻精液稀释液需要的物质为：柠檬酸钠：0.9～1.2克，蔗糖：3～5克，卵黄：18～22毫升，甘油：4～7毫升，维生素E：6～9毫克，维生素C：500～700毫克，壮观霉素：35毫克，庆大霉素：8万单位(IU)。
其最佳的冷冻精液稀释液配方为：每100毫升中含有的物质含量为：柠檬酸钠：1.073毫克，蔗糖：4.344毫克，卵黄：20毫升，甘油：6毫升，维生素E：8毫克，维生素C：600毫克，壮观霉素：35毫克，庆大霉素8万单位(IU)。
其配制方法是：
1)称取配方中的原料：柠檬酸钠，蔗糖，卵黄，甘油，维生素E，维生素C，蒸馏水。
2)将以上的柠檬酸钠，蔗糖，卵黄，维生素C，维生素E，甘油，用蒸馏水配置成基础液，用磁力搅拌器搅拌60分钟，得到混合溶液，4℃冰箱内过夜备用。
3)精液稀释前，在混合溶液中加入配方量的庆大霉素和壮观霉素，然后在磁力搅拌器搅拌10分钟。
4)用酸或碱调整稀释液PH值为6.5～7.5，用0.22微米滤器对稀释液进行滤菌处理，得到精液稀释液。
测定本实施例配制的冷冻精液稀释液与传统配方在对牛精子冻后活率、顶体完整率、精浆抗氧化物酶。其中测定的精浆抗氧化物酶主要包括过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GR)、谷胱甘肽还原酶(GSH)。
精子活率、顶体完整率及精浆抗氧化物酶的检测方法如下：
(1)精液解冻后立即在35℃～37℃的温度下进行活率检查。评定时，用玻璃棒蘸取1滴精液，滴于载玻片上，加上盖玻片，使盖玻片和载玻片之间充满精液，然后置于400倍～600倍显微镜下观察。在显微镜视野中，通过对精液上、中、下三层液面精子活动情况综合观察，评定精子活率。
(2)取一滴解冻后的精液滴在干净的载玻片上，用另一载玻片呈45度，将精液抹向另一侧，制成抹片。自然风干后用1～2毫升福尔马林磷酸盐缓冲液固定15分钟，水洗干燥后用姬姆萨染色90分钟，然后除去抹片上的染液，风干后置于1000倍生物显微镜下观察300个精子，记录精子总数和顶体完整精子数。
(3)用测定酶的相关试剂盒(测定酶的试剂盒均来自南京建成生物技术公司)严格按照操作规程对精浆抗氧化物酶的活力进行测定。
以下是发明人给出的一个具体试验实施例，试验选用体质健壮、性欲旺盛的成年荷斯坦种公牛，按种公牛饲养管理要求进行饲养，其采精频率为每周3次。利用假阴道采集法采集公牛精液，精液采集后，立即在35℃～37℃下镜检。所采集的精液为乳白色或乳黄色，无异味，精子形态正常，活率达到0.7以上方可用于制作冷冻精液。
本试验设置了三个不同的冷冻精液稀释液配方及传统配方：
配方1：配制100毫升稀释液：柠檬酸钠：1.073毫克，蔗糖：4.344毫克，卵黄：20毫升，甘油：6毫升，维生素E：8毫克，维生素C：600毫克，壮观霉素：35毫克，庆大霉素：8万单位(IU)。
配方2：配制100毫升稀释液：柠檬酸钠：1.073毫克，蔗糖：4.344毫克，卵黄：20毫升，甘油：6毫升，维生素C：600毫克，壮观霉素：35毫克，庆大霉素：8万单位(IU)。
配方3：配制100毫升稀释液：柠檬酸钠：1.073毫克，蔗糖：4.344毫克，卵黄：20毫升，甘油：6毫升，维生素E：8毫克，壮观霉素：35毫克，庆大霉素：8万单位(IU)。
传统配方：配制100毫升稀释液：柠檬酸钠：1.073毫克，蔗糖：4.344毫克，卵黄：20毫升，甘油：6毫升，壮观霉素：35毫克，庆大霉素：8万单位(IU)。
严格按以上配方称取所含成分：柠檬酸钠、蔗糖、卵黄、甘油、维生素E和维生素C，用蒸馏水定容至100毫升；在磁力搅拌器上搅动60分钟充分搅拌均匀，得到混合溶液，然后放入4℃冰箱过夜。
精液稀释前，在混合溶液中加入壮观霉素35毫克，庆大霉素8万单位(IU)，并搅拌10分钟，用酸或碱调整稀释液的酸碱度，用PH计测定稀释液PH在6.7～7.2之间，得到精液稀释液。
使用时，用0.22微米滤器对稀释液进行滤菌处理，完毕后置入37.5℃水浴锅中，然后按照常规精液制作方法即可进行冷冻精液的解冻稀释，解冻后检测精液品质，具体指标见下表：
不同配方冷冻精液稀释液对冻融后精子品质的影响(平均数±标准差)
| 处理 | 配方一 | 配方二 | 配方三 | 传统配方 |
| 活率(％) | 39.33±0.58a | 37.33±0.58b | 38.67±1.53ab | 35.33±1.15c |
| 顶体完整率(％) | 76.33±2.08a | 74.33±1.53ac | 75.67±1.53a | 71.67±1.53bc |
| 过氧化氢酶活力(U/mL) | 4.57±0.50a | 3.99±0.12b | 4.37±0.1ab | 3.97±0.21b |
| 谷胱甘肽过氧化物酶活力(U/L) | 100.53±1.76a | 48.48±2.93d | 80.14±1.10b | 74.76±1.56c |
| 谷胱甘肽还原酶活力(U/L) | 136.67±2.06b | 121.83±1.72c | 165.98±1.73a | 117.51±1.30c |
注：同行数据后所标字母相异标示差异显著(P＜0.05)，所标字母相同标示差异不显著(P＜0.05)。
由上表可以看出，本发明所提供的冷冻精液稀释液，在精子活率、顶体完整率、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶活力等指标均显著优于其他配方(P＜0.05)。而配方一分别比配方二或三在精子活率方面提高5.6％～11.3％，比传统配方提高11.3％。在顶体完整率方面配方一高出其他配方约3.7％～5.5％，高于传统配方6.5％。在过氧化氢酶活力方面配方一高出其它配方0.5％～10.1％，高出传统配方15.1％。在谷胱甘肽过氧化物酶的活力方面配方一高出传统配方34.4％，谷胱甘肽还原酶活力方面比传统常用配方高出16.31％。所以经过以上分析得出本实施例制备的冷冻精液稀释液配制的三个配方，在精子冷冻解冻过程中对精子的品质能起到最大保护作用，其中配方一是最佳的冷冻精液稀释液配方。
Claims (2)
1.一种冷冻精液稀释液，其特征在于，制得的该冷冻精液稀释液每100毫升中含有：柠檬酸钠：1.073毫克，蔗糖：4.344毫克，卵黄：20毫升，甘油：6毫升，维生素E：8毫克，维生素C：600毫克，壮观霉素：35毫克，庆大霉素：8万单位。
2.权利要求1所述的冷冻精液稀释液的配制方法，其特征在于，包括下列步骤：
准确称取权利要求1配方中的柠檬酸钠、蔗糖、卵黄、维生素E、维生素C和甘油，加蒸馏水至100毫升，在磁力搅拌器上充分搅拌均匀，得到混合溶液，然后放入4℃冰箱过夜；
精液稀释前，在混合溶液中加入配方量的壮观霉素和庆大霉素，并搅拌10分钟；
用酸或碱调整精液稀释液的酸碱度在6.7～7.2之间，用0.22微米滤器对稀释液进行滤菌处理，得到冷冻精液稀释液。
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