CN101549155B - 猪圆环病毒ⅱ型灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于兽医生物新医药技术领域，涉及一种猪圆环病毒II型(PCV2)灭活疫苗及其制备方法。该疫苗所用毒种为猪圆环病毒II型DBN-SX07株，保藏号为：CGMCC No 3064，该毒株经烷化剂灭活后作为抗原，再加入油佐剂乳化配制而成。使用本发明的PCV2灭活疫苗免疫猪，可较早产生均一且有效的保护力,明显缩短PCV2感染窗口期，延长免疫持续期,减少加强免疫次数。

Description

猪圆环病毒Ⅱ型灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于兽医生物新医药技术领域，涉及一种猪圆环病毒II型灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

自1991年以来，PCV2感染引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪呼吸疾病综合征(PRDC)、猪皮肤和肾病综合征(PDNS)等多种疾病(总称为猪圆环病毒病，PCVDs)给全球养猪业造成了巨大的损失。病毒感染产生的免疫抑制能够导致现有疫苗免疫失败，造成多种病原混合(或继发)感染，并使疾病流行更加严重。

在田间，PMWS主要出现于断奶仔猪，猪群表现为进行性消瘦、发育障碍、皮肤苍白，淋巴结肿大和黄疸，其发病率为3％-50％，死亡率为8％-35％；PRDC主要出现于育肥后期，其临床症状主要为非常严重的咳嗽和呼吸困难，迁延难治且使用抗生素无效，其发病率可达30-70％，死亡率可达4-6％，发病猪群生产性能显著降低；PDNS主要发生于断奶猪和育肥猪，最常见的临床症状为皮肤出现红疹，常见于后躯、后肢、背侧耳廓和腹部，其发病率可达2-14％，死亡率可达15-40％。

目前，PCVDs的治疗原则主要是对症治疗和减少合并感染，但效果并不理想。有研究表明，PCV2中和抗体可抑制病毒复制，中和抗体水平愈高则病毒复制速度愈慢，PCVDs的发生机率也愈低。还有研究提示，高滴度的母源PCV2抗体可以预防仔猪感染PCV2。由此可见：特异性疫苗可用于控制本病。

近年来，人们一直在致力于PCV2疫苗的开发应用研究，并开发出了各种形式的PCV2疫苗，特别是灭活疫苗对猪有一定的免疫保护作用，但是应用效果仍不理想，主要表现在：

(1)抗原浓度较低：PCV2在细胞中的生长滴度较低，一般仅为10³TCID₅₀/ml左右，而疫苗产量和抗原剂量又是PCV2灭活疫苗得以大规模应用的关键，因此降低生产成本、提高疫苗质量与产量成为目前急待解决的棘手问题；

(2)疫苗生产工艺较粗糙：每个病毒都有适合自己的最佳生产工艺，而在PCV2灭活疫苗的制备过程中多数人忽略了对生产工艺的优化和完善，因而直接降低或破坏了PCV2抗原的免疫活性，导致了免疫效果的降低。

发明内容

针对当前PCV2疫苗在应用方面存在的不足，本发明提供一种病毒滴度高、免疫原性好、免疫持续期长的猪圆环病毒II型灭活疫苗(DBN-SX07株)。用本发明的疫苗免疫猪，可较早产生均一且有效的免疫力，明显缩短PCV2感染窗口期，延长免疫持续期，从而减少加强免疫次数，降低免疫成本。

本发明的另一目的在于提供该猪圆环病毒II型灭活疫苗的制备方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供一种猪圆环病毒II型灭活疫苗，该疫苗的毒种为猪圆环病毒II型DBN-SX07株，保藏号为：CGMCC No.3064，上述毒种经烷化剂灭活后作为抗原，按比例加入油佐剂乳化配制而成。

本发明中用于灭活病毒的烷化剂可为β-丙内酯、甲醛和戊二醛等烷化剂，但为更好的达到本发明的效果，本发明优选0.5‰-1‰的甲醛溶液。

本发明的猪圆环病毒II型灭活疫苗，抗原与油佐剂的比例为1∶1-1∶5。

其中，油佐剂包含90-98wt％的白油、2-10wt％的司本-80。将重量百分比为90-98％白油与2-10％司本-80混合，100毫升混合液中加入1-2克硬脂酸铝即得本发明的油佐剂。

本发明还提供了该猪圆环病毒II型灭活疫苗的制备方法，其步骤如下：

(1)生产用毒的制备

取猪圆环病毒II型DBN-SX07株毒种接种PK15a，按常规条件培养、收获，作为生产用毒；

(2)生产用毒的灭活

将烷化剂按比例加入生产用毒中，37℃条件下灭活16-24小时，期间振荡4-5次；

(3)乳化

按比例加入油佐剂，乳化配制成灭活疫苗。

其中，本发明所用的猪圆环病毒II型DBN-SX07株由福州大北农生物技术有限公司分离和鉴定，为当前中国流行毒株。该毒株已于2009年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(简称CGMCC)，保藏号为：CGMCC No.3064，分类命名为猪圆环病毒II型Porcine circovirus type 2。

本发明中的猪圆环病毒II型DBN-SX07株基因组由1767个碱基组成，含有ORF1和ORF2编码区，与已知序列的其它PCV2毒株序列有差异。该毒株具有如下特性：

(1)动物回归试验结果表明，攻毒猪(≥3/5)可出现明显的PCV2病毒血症和一过性的体温升高，且攻毒后21天迫杀解剖可见多种淋巴组织出现不同程度的肿大和充血，肺出现不同程度的水肿和肉变，肾发黄表面有坏死灶等；

(2)具有良好的细胞增殖活性，按常规方法培养，其病毒滴度可达10^6.0TCID₅₀/ml以上；

(3)具有较广的抗原谱，可与来自中国20省市的PCV2抗体阳性猪血清进行有效的中和。

本发明的猪圆环病毒II型灭活疫苗及其制备方法有益效果如下：

(1)免疫效果好、成本低：用常规病毒培养方法培养猪圆环病毒II型DBN-SX07株，其病毒滴度可达10^6.0-6.5TCID₅₀/ml，显著高于目前文献报道水平，用此毒种制备的本发明疫苗，免疫效果好、生产成本低；

(2)猪圆环病毒II型DBN-SX07株抗原谱较广，可以应用于中国大部分地区；

(3)猪圆环病毒II型DBN-SX07株具有良好的免疫原性，能够诱导产生较高水平的特异性抗体，产生较文献报道水平高1-2个滴度的PCV2ELISA抗体，可有效预防PCV2的感染，保护率可达90％以上；

(4)将猪圆环病毒II型DBN-SX07株按本发明的制备方法配制成灭活疫苗，与文献报道的猪圆环病毒II型灭活疫苗进行效力比较。结果表明，用本发明的猪圆环病毒II型疫苗免疫猪，可较早(提前约1周)产生良好的免疫效果，明显缩短PCV2感染窗口期，延长免疫持续期(延长约1个月)，减少加强免疫次数，降低免疫成本。

具体实施方式

实施例1猪圆环病毒II型DBN-SX07株灭活疫苗的制备

(1)生产用毒的制备

取所需数量的、细胞覆盖率达到80％以上的细胞转瓶，弃去生长培养基，以5％(V/V)的比例接入猪圆环病毒II型DBN-SX07株毒种，37℃吸附1小时后加入维持液进行培养。24小时后用300mM的D-氨基葡萄糖于37℃处理20min，经无菌PBS(pH7.4)两次洗涤后加入维持液于37℃下旋转培养48小时后反复冻融3次，经离心或过滤除去细胞碎片，冻存于-40℃以下。

(2)生产用毒的灭活

将检验合格的病毒液按0.5‰(V/V)的比例加入甲醛溶液，混匀后置37℃灭活16小时，期间振荡4-5次。

(3)乳化

将灭活后的生产用毒按1∶1的比例(抗原：油佐剂)加入油佐剂，乳化配制成灭活疫苗。

所用的油佐剂配制为90wt％白油和10wt％司本-80组成的油佐剂混合液中加入硬脂酸铝，其中硬脂酸铝加入量为1克/100毫升油佐剂混合液。

本实施例共制备出3批猪圆环病毒II型DBN-SX07株灭活疫苗，批号分别定为200701、200702、200703，制备的疫苗物理性状检验、安全检验、效力检验等均合格。

其中，所用毒种的质量标准：

①病毒含量：取病毒液用无血清培养基做10倍系列稀释，选取10^-5、10^{- 6}、10^-73个稀释度，分别接种96孔细胞板，每个稀释度接种5孔，37℃吸附1小时后加入维持液进行培养。24小时后用300mM的D-氨基葡萄糖于37℃处理20min，经无菌PBS(pH7.4)两次洗涤后加入维持液培养48小时，同时设不接种病毒的细胞为空白对照。运用间接免疫荧光法(IFA)测定每个稀释度含有荧光的孔数，最后按Reed-Muench计算TCID₅₀。每毫升病毒含量应≥10^6.0TCID₅₀。

②免疫原性：将病毒含量≥10^6.0TCID₅₀/ml的病毒培养液按0.1％(V/V)的比例加入甲醛，灭活后按实施例中所述方法制成疫苗。选取3-4周龄PCV2抗原抗体阴性的健康仔猪10头，其中5头耳后根肌肉注射疫苗1ml，14天后以同样方式再次注射，另5头接种安慰剂作为阴性对照，同样条件下饲养。二免后15天，所有猪肌肉注射DBN-SX07株病毒培养液(病毒含量为10^5.0TCID₅₀/ml)3ml，每天测温观察并隔周采集血清进行血清学检测，攻毒后21天迫杀解剖。对照猪(≥3/5)在攻毒后应出现明显的PCV2病毒血症和一过性的体温升高，且攻毒后21天迫杀解剖可见多种淋巴组织出现不同程度的肿大和充血，肺出现不同程度的水肿和肉变，肾发黄表面有坏死灶等。免疫猪(≥4/5)二免后15天PCV2ELISA抗体应全部为阳性且滴度≥1∶1600，攻毒后应无明显临床症状、PCV2病毒血症及病理变化。

③纯净性：按《中国兽药典》进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。

④特异性：中和试验：将毒种用培养基稀释成10³TCID₅₀/ml，与等量PCV2特异性阳性血清混合，37℃中和1小时后，接种PK15a细胞板，接种和培养方法同①，通过间接免疫荧光法(IFA)测定，应无特异性的荧光信号出现。

所制备疫苗的质量标准：

①性状

外观  乳白色乳剂。

剂型为油包水型。取一个清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第l滴外，均应不扩散。

稳定性  取疫苗10ml加入离心管中，以3000rpm离心15min，应不分层，管底析出的水相应不大于0.5ml。

粘度  用lml吸管(下口的内径1.2mm，上口内径2.7mm)吸取25℃左右的疫苗lml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间，应在8秒以内。

②无菌检验  按《中国兽药典》进行，应无菌生长。

③安全检验  选取3-4周龄PCV2抗原抗体阴性的健康仔猪10头，分为2组，每组各5头，分别进行一次超剂量(4ml)和单剂量重复(1ml×2)接种的安全性试验，同时设不进行接种的猪5头作为空白对照，同样条件下饲养。每次接种后观察14日。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

④效力检验  选取3-4周龄PCV2抗原抗体阴性的健康仔猪10头，其中5头耳后根肌肉注射疫苗1m1，14天后以同样方式再次注射，另5头接种安慰剂作为阴性对照，同样条件下饲养。二免后15天，所有猪肌肉注射DBN-SX07株病毒培养液(病毒含量为10^5.0TCID₅₀/ml)3ml，每天测温观察并隔周采集血清进行血清学检测，攻毒后21天迫杀解剖。对照猪(≥3/5)在攻毒后应出现明显的PCV2病毒血症和一过性的体温升高，且攻毒后21天迫杀解剖可见多种淋巴组织出现不同程度的肿大和充血，肺出现不同程度的水肿和肉变，肾发黄表面有坏死灶等。免疫猪(≥4/5)二免后15天PCV2ELISA抗体滴度应≥1∶1600，攻毒后应无明显临床症状、PCV2病毒血症及病理变化。

⑤甲醛、硫柳汞含量测定按《中国兽药典》进行，应符合规定。

实施例2猪圆环病毒II型灭活疫苗的制备

(1)生产用毒的制备

取所需数量的、细胞覆盖率达到80％以上的细胞转瓶，弃去生长培养基，以5％(V/V)的比例接入猪圆环病毒II型DBN-SX07株毒种，37℃吸附1小时后加入维持液进行培养。24小时后用300mM的D-氨基葡萄糖于37℃处理20min，经无菌PBS(pH7.4)两次洗涤后加入维持液于37℃下旋转培养48小时后反复冻融3次，经离心或过滤除去细胞碎片，冻存于-40℃以下。

(2)生产用毒的灭活

将检验合格的病毒液按0.75‰(V/V)的比例加入甲醛溶液，混匀后置37℃灭活20小时，期间振荡4-5次。

(3)乳化

将灭活后的种生产用毒按1∶3的比例(抗原：油佐剂)加入油佐剂乳化配制成灭活疫苗。

所用的油佐剂配制是按照重量百分比计算，为94％白油和6％司本-80组成的油佐剂混合液中加入硬脂酸铝，其中硬脂酸铝加入量为1克/100毫升油佐剂混合液。

制备的疫苗物理性状检验、安全检验、效力检验等均合格。

所用猪圆环病毒II型DBN-SX07株毒种质量标准和所制疫苗质量标准参见实施例1。

实施例3猪圆环病毒II型灭活疫苗的制备

(1)生产用毒的制备

取所需数量的、细胞覆盖率达到80％以上的细胞转瓶，弃去生长培养基，以5％(V/V)的比例接入猪圆环病毒II型DBN-SX07株毒种，37℃吸附1小时后加入维持液进行培养。24小时后用300mM的D-氨基葡萄糖于37℃处理20min，经无菌PBS(pH7.4)两次洗涤后加入维持液于37℃下旋转培养48小时后反复冻融3次，经离心或过滤除去细胞碎片，冻存于-40℃以下。

(2)生产用毒的灭活

将检验合格的病毒液按1‰(V/V)的比例加入甲醛溶液，混匀后置37℃灭活24小时，期间振荡4-5次。

(3)乳化

将灭活后的种生产用毒按1∶5的比例(抗原：油佐剂)加入油佐剂乳化配制成灭活疫苗。

所用的油佐剂配制是按照重量百分比计算，为98％白油和2％司本-80组成的油佐剂混合液中加入硬脂酸铝，其中硬脂酸铝加入量为1克/100毫升油佐剂混合液。

制备的疫苗物理性状检验、安全检验、效力检验等均合格。

所用猪圆环病毒II型DBN-SX07株毒种质量标准和所制疫苗质量标准参见实施例1。

实施例4疫苗效力比较试验

(1)检验用毒

猪圆环病毒II型：DBN-SX07株，每毫升病毒含量为10^5.0TCID₅₀，攻毒时采用肌肉注射。

(2)试验疫苗

实施例1制备的批号分别为200701、200702、200703疫苗。

(3)效力比较试验

应用猪圆环病毒II型灭活疫苗(DBN-SX07株)3批实验室产品进行试验，耳后根肌肉接种3-4周龄PCV2抗原抗体阴性的健康仔猪各10头，每头1.0ml，14日后各组以同样的方式重复注射，另选取10头条件相同的猪，接种安慰剂作为阴性对照。于首次免疫后1周、2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周、14周、16周、18周、20周、22周、24周分别采血测定PCV2抗体滴度，监测PCV2抗体消长情况，并与目前文献报道进行比较。

(4)效力比较试验结果

猪圆环病毒II型灭活疫苗(DBN-SX07株)首次免疫后3周即可产生均一且有效的保护力，6周PCV2ELISA抗体水平达高峰，并可持续8周，24周后PCV2抗体水平下降到保护线以下。3批疫苗间结果无明显差异，详细结果见表1。

根据国内外文献报道可知，猪圆环病毒II型灭活疫苗首次免疫后4周方可产生均一且有效的保护力，6周PCV2ELISA抗体水平达高峰，并可持续6周，20周后PCV2抗体水平下降到保护线以下。免疫持续期约为4个月。

免疫后PCV2抗体的消长情况表明，本发明的疫苗效力具有明显优势：

①产生保护力的时间较早

用本发明的疫苗免疫猪，其产生均一且有效的保护力的时间比文献报道早约1周，因此可明显缩短PCV2感染窗口期；

②PCV2抗体高峰持续时间长

用本发明的疫苗免疫猪，PCV2抗体高峰持续时间比文献报道长约2周，因此可以更有效的预防PCV2的感染；

③免疫持续期较长

用本发明的疫苗免疫猪，免疫持续期比文献报道长约1个月，因此可以提供为时更长的有效保护期，减少加强免疫次数。

表1本发明疫苗免疫后PCV2ELISA抗体检测结果

Claims (5)

1.一种猪圆环病毒II型灭活疫苗，其特征在于毒种为猪圆环病毒II型(Porcinecircovirus type 2)DBN-SX07株，保藏号为：CGMCC No 3064，上述毒种经烷化剂灭活后作为抗原，按比例加入油佐剂乳化配制而成。

2.如权利要求1所述的猪圆环病毒II型灭活疫苗，其特征在于所述的烷化剂为0.5‰-1‰的甲醛溶液。

3.如权利要求1所述的猪圆环病毒II型灭活疫苗，其特征在于抗原与油佐剂的比例为1∶1-1∶5。

4.如权利要求1所述的猪圆环病毒II型灭活疫苗，其特征在于所述的油佐剂包含90-98wt％的白油、2-10wt％的司本-80。

5.一种如权利要求1-4任一项所述的猪圆环病毒II型灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤如下：

(1)生产用毒的制备

取猪圆环病毒II型DBN-SX07株毒种接种PK15a，按常规条件培养、收获，作为生产用毒；

(2)生产用毒的灭活

将烷化剂按比例加入生产用毒中，37℃条件下灭活16-24小时，期间振荡4-5次；

(3)乳化

按比例加入油佐剂，乳化配制成灭活疫苗。