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CN101547701A - 增强salicornia brachiata提取物的抗结核活性 - Google Patents

增强salicornia brachiata提取物的抗结核活性 Download PDF

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CN101547701A CNA2005800154598A CN200580015459A CN101547701A CN 101547701 A CN101547701 A CN 101547701A CN A2005800154598 A CNA2005800154598 A CN A2005800154598A CN 200580015459 A CN200580015459 A CN 200580015459A CN 101547701 A CN101547701 A CN 101547701A
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Abstract

本发明涉及增强从Salicornia brachiata中分离的活性组分的抗结核活性。本发明也公开了所述组分的无毒性质以及鉴别蔗糖肯定为该组分的主要成分。纯蔗糖不表现出具有抗结核活性，因而表明该组分的活性存在于一种或多种次要成分中。所述次要成分表现为相对低分子量的实体，以及公开了从大量蔗糖中分离出该次要成分的色谱分析技术以便详细地探索该次要成分的活性和结构，如果发现的先导物是新颖的，则也探索其合成的可能性。

Description

增强SALICORNIA BRACHIATA提取物的抗结核活性
发明领域
本发明涉及海蓬子属物种的抗结核提取物。更具体地，本发明涉及增强沿印度古吉拉特海岸天然生长的Salicornia brachiata的根提取物的1:1氯仿-甲醇组分的抗结核活性。
发明背景
目前在全世界使用的抗结核化学治疗药物主要包括合成药物，例如异烟肼(即异烟酸酰肼)，其单独地或与PAS钠(即对氨基水杨酸钠)、Isonex、Erbazide(异烟肼的甲磺酸钙)、环丝氨酸、盐酸吗啉米特、利福平、乙胺丁醇/盐酸乙胺丁醇、Sparfloxicin等联合应用，这些药物是在抗生素链霉素的合成之后发展的。
虽然通过使用上述药物以及卡介苗接种对结核病有疗效，但仍发现了多个缺点，尤其是关于这些药物的副作用以及需要长期的摄入/治疗持续时间。观察到的另一个问题是即使治疗后，一些分枝杆菌继续存在于个体体内。因此必须创造上述的此类药物的可替代品，以便减少剂量或摄入持续时间，或解决对所述药物的耐药性问题。
参考由AstraZeneca press在BioSpace(2005)出版的Raritan，N.J.的题目为“Novel Antibiotic shows promise in shortening treatmentduration of Tuberculosis(新的抗生素表现出缩短结核治疗持续期的可能性)”的科学论文，其中Raritan，N.J.描述了属于抗TB剂新家族的、称为二芳基喹啉(DARQ)的化合物作为更好的和有前途的药物，该化合物单独应用或与目前由世界卫生组织推荐的三联鸡尾酒方案(triplecocktail regimen)联合应用。与当前所用的方案相比，含有DARQ的混合物方案以一半的时间清除了小鼠体内的感染。文献还进一步表明，在过去的40年中，没有新的抗结核药物被引入临床，且虽然医生拥有有效的起作用的一线TB药物，但是在将这些药物给予需要它们的患者，以及有效地治疗患有耐药性疾病的患者方面仍然存在困难。然而，此药物正在小鼠体内进行测试，还需要做相当多的工作以充分确定此化合物的临床可能性。
类似的文献也可参考由结核控制-政府及私营部门联盟(TBControl-The Government & The Private Sector Alliance)中的Subhas，Ch.Chakrabortti编辑的Journal of Indian Medical Association结核专刊，vol.101.No.03(2003年3月)，其中，根据印度政府的RNTCP政策，在可选择的MDR疗法中现有的TB药物疗法与研究的替代疗法具有重大意义。该文献还着重指出，在印度每年有近50000人因结核病死亡，同时还有二百万登记的新案例。
还参考Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12(2002)3275：278中题目为“Heterocyclic Benzazole Derivatives withAntimycobacterial In Vitro Activity(具有体外抗分枝杆菌活性的杂环吲哚衍生物)”的论文，其中Jan Koci等人描述了合成的苯并噁唑和苯并噻唑的2-苄基硫烷(2-benzylsulfanyl)衍生物系列，并评价了其对结核分枝杆菌及非结核性分枝杆菌的体外抗分枝杆菌活性，活性表示为mmol/L的最小抑制浓度(MIC)。含有两个硝基基团(4e，4f，5e，5f)或一个硫代酰胺基团(4i，4j，5i，5j)的物质特别对非结核性的菌株表现出可观的活性。然而，对最具活性的化合物进行了毒性测试，其被评价为中度毒性。
还可参考Journal of Ethnopharmacology 79，57-67(2002)中题目为“The evaluation of forty-three plant species for in vitroantimycobacterial activities；isolation of active constituents from Psoraleacorylifolia and Sanguinaria canadensis(四十三种植物的体外抗分枝杆菌活性评价；从Psoralea corylifolia和血红根(Sanguinaria Canadensis)中分离活性成分)”的论文，其中Sandra M.Newton等人描述了根据所报道的治疗TB和/或麻风病的传统应用，选择了43种植物的提取物。分析这些提取物的抗分枝杆菌活性。采用两种分枝杆菌的模型，M.aurum和耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)，进行简单的体外筛选分析。发现来自三种植物C.mukul、P.corylifolia和血红根的粗甲醇提取物仅对M.aurum具有显著的抗分枝杆菌活性(MIC＝62.5μg/ml)。生物分析引导的分离导致从血红根的根中分离出两种已知的苯并菲啶类生物碱血根碱(sanguinarine)(1)和白屈菜红碱(chelerythrine)(2)，以及从P.corylifolia的种子中分离出已知的酚局部萜(phenolic meroterpene)化合物补骨脂酚(bakuchiol)(3)。C.mukul树脂的分离导致了抗分枝杆菌活性的降低，因此没有做进一步的工作。化合物(2)最具有抗M.aurum和耻垢分枝杆菌的活性(IC50分别为7.30μg/ml[19.02μM]和29.0μg/ml[75.56μM])。M.aurum是对所有这三种化合物最敏感的微生物。当所述的两种生物碱在不同的pH值介质中测试活性时，没有观察到抗分枝杆菌活性的显著性差异。纯化合物抗M.aurum的活性与抗M.bo_is BCG的活性相当，其中化合物(2)是最具有活性的(对于M.bo_isBCG，IC50＝14.3μg/mL[37.3μM])。这些结果支持了这些植物在传统医学中的应用。该发明的缺点是没有进行体内研究以进一步确认活性。
还参考Journal of Medicinal and Aromatic plant Sciences，22/4A-23/1A，182-184(Eng.)(2001)中题目为“Antitubercular potential ofselected plant materials(所选择的植物材料的抗结核可能性)”的论文，其中Usha K.等人描述了植物即印度楝树(neem)、圣罗勒(tulsi)、大蒜、姜和鸭嘴花(adhatoda)的抗结核可能性，通过使用被加入到痰中然后接种到LJ培养基中的100mL植物材料的含水浆液(50％w/v)进行体外培养，对这些植物进行测试。所有的植物提取物均阻止结核分枝杆菌的生长，这归因于酶的和非酶的抗氧化剂，如过氧化氢酶、过氧化物酶、总胡萝卜素、抗坏血酸、生育酚和多酚，从而防止了ROS(活性氧簇)对组织的损伤。除了需要应用大量的药剂以外，还不清楚抑制的程度及该药剂的MIC。
参考Journal of Ethno pharmacology，66，347-354(1999)中题目为“In vitro inhibition of drug-resistant and drug-sensitive strains ofMycobacterium tuberculosis by ethno-botanically selected South Africanplants(通过民族植物学选择的南非植物对耐药的和药物敏感的结核分枝杆菌菌株的体外抑制作用)”的论文，其中N.Lall等人描述了采用琼脂平板培养法(Middlebrook and Cohn，1958)对20种南非药用植物提取物进行抗结核分枝杆菌药物敏感菌株H37Rv活性的初步筛选。在此作者提出20种丙酮提取物中的14种在500μg/mL的浓度下显示了抑制活性，然而通过放射测量法，植物种类即阔叶厚壳桂(Cryptocaryalatifolia)、Euclea natalensis、Helichrysum melanacme、Nidorella anomala和法国百里香(Thymus vulgaris)的丙酮以及水提取物显示抗H37Rv株的MIC为100μg/mL。
还参考Journal of Planta Medica，67(8)，685-694.(Eng.)(2001)中题目为“Antimycobacterial plant terpenoids(抗分枝杆菌的植物萜类)”的综述，其中Cantrell，Charles L.等人概述了最近的关于在体外生物分析中具有中度至高度抗结核分枝杆菌活性的植物来源的萜类化合物的报道。在此综述中，讨论了单萜、倍半萜、双萜及三萜和固醇类、其结构类似物以及半合成衍生物，特别强调了抗分枝杆菌活性所需的结构特征。
还参考Ma，Junrui的题目为“Compositions containing herbalmedicine for pulmonary tuberculosis(用于肺结核的含草药的组合物)”的第CN 1265315A号专利(6 September，2000，4pp)(Chinese)(2001)，该专利包含了治疗肺结核的不同形式的组合物(气溶胶、吸入剂、片剂、胶囊、粉剂、口服浓缩剂和液体)，该组合物包括大风子(Taraktogenos)，黄连、百部、冬虫夏草、黄芩、金银花、连翘、地丁、知母、丹参、乌梅、白果、白芨(Anacamptis pyoamidalis Richard)、黄精、甘草、何首乌(Polygonum multiflorum thumb)、夏枯草(Brunella vulgaris)、大蓟(Cirsium japonicum)、侧柏(Thuja orientalis)的叶、地榆(Sguisorbaofficinalis)、白芷(Heracleum)、穿心莲(common Andrographis)、鱼腥草(Houttuynia)、茵陈(herba artemisiae)和厚朴(Magnolia officinalis)。然而该专利的缺点在于为了阐明植物抗结核分枝杆菌的有益结果的目的，使用了多种草药，而没有提及单独的草药或全体草药组合的MIC水平。
参考由F.Salie，PFK Eagles和HMJ Leng在Journal ofEthanopharmacology 52(1996)，27-33pp中发表的题目为“Preliminaryantimicrobial screening four South African asteraceae species(四种南非菊科物种的初步抗菌活性筛选)”的论文，其中作者调查了西开普(Western Cape)的植物群-在南非的开普植物界的一部分。作者描述了四种Asteraceae物种(Arctopis auriculanta、Eriocephalus africanus L.、Felicia erigeroides DC.和Helichrysum crispum(L.)D.Don.)对耻垢分枝杆菌显示出不同程度的选择性抗菌活性。鉴定了Arctopis auriculanta叶子的MIC为8500μg/mL。此发明的缺点在于MIC值非常高。
还参考国际互联网上benefits@coqui.net关于海蓬子属(salicornia)植物的论述，其中报道了海蓬子属植物用作食用油的来源，以及干的粉碎的茎用作燃料团块或者刨花板。然而，没有提到该植物的任何生物活性。
还参考由P.K.Ghosh等人于2002年3月26日提交的第10106334号美国专利申请，其中描述了使用盐生植物在除去种子后，从剩余的干物质中得到植物盐制品的方法，以最大化衍生于该植物的价值。然而此申请并未提供任何植物在药物/医学目的中的应用。
还参考Wealth of India，第IX卷RH-SO，Raw Material第169页，其中记载了印度的多种生物资源及其应用，除了将所述物种用作饲料外，还记载了Salicornia Linn及其分类学。该植物还记载于Hooker的《印度植物志》(Flora of India)(1889)中，然而，两本著作中均没有提到与海蓬子属相关的任何种类的生物活性。它是一年生或多年生无叶肉质草药或灌木的小属，生长在亚洲、非洲、欧洲和北美的盐沼中。仅一个物种生长在印度。参见D.E.P.VI(2)，387：1，399：II，60，Fl.Br.Ind.，V.12：Kirt.和Basu，Pl.800。已知在印度的许多地区，其具有不同的名字：古吉拉特：-Muchul，泰卢古：-Kagalu，泰米尔和Malayalam：Umari Keerai。
它是多年生的多分枝草本植物，具有30-45cm的节印(jointedstamp)。多见于盐沼中以及从孟加拉到古吉拉特的海岸。在分枝上而不是在slander上节长6-12mm。花嵌生在节的空腔中，每侧有三朵花，膜状果实。
该植物是用于提取碳酸钠的碱、泥或saji的来源。称为saji或苏打灰的该植物的灰分以前用于制作肥皂和玻璃。风干的植物含有6.98％的蛋白质(N x 6.25)和8.97％的灰分。其含有高百分比的氯化钠离子，构成总的水溶性盐的86％。可水提取的矿物为Cl＝10.02m、Na＝5.6、S＝0.70、P＝1.13、C＝0.72、Ca＝0.01、Mg＝0.02％(Parekh and Rao.curr.Sci.1965，34；247)。该植物为强盐性性质，在酸洗后，生长较低的嫩枝可食用。该枝条有时用于调味用菜(pet-herb)中。所述植物也用作骆驼饲料(Mc canr，J.Bombay nat.Hist.Soc，.1951-52.50，870)。灰分用于治疗兽疥癣和疥疮，也被认为是通经药(emmengogue)及堕胎药(Kirt.& Basu，III 2082)。
参考由Rathod等人于2004年4月22日提交的第10/829,400号美国专利申请和于2003年8月29日提交的第PCT/IN03/00292号PCT专利申请。其中公开了在印度古吉拉特海岸天然生长的Salicorniabrachiata的抗结核分枝杆菌活性。该申请的主要缺点在于所述分离HPLC太复杂，以及几乎没有提供的关于活性组分中成分性质的线索。此外，体外研究中，当剂量为6.25μg/mL时，最大抑制率仅为75％。
发明目的
本发明的主要目的是提供来自海蓬子属物种的生物活性组分。
本发明的另一目的是将抗TB活性的来源定位在Salicornia brachiata的根提取物的F2组分中，如申请人先前在其待审的于2004年4月22日提交的第10/829,400号美国专利申请和2003年8月29日提交的第PCT/IN03/00292号PCT专利申请中所公开的。
另一目的是改进色谱分离条件，以解析在通过半制备HPLC进行分离的现有技术中所报导的所述活性组分中的各个峰。
另一目的是将从所述活性组分中得到的不同亚组分与其活性相联系。
另一目的是证实最具活性的亚组分在体外和在受感染的小鼠体内对结核病的有效性。
另一目的是显示最具活性的亚组分的MIC为≤3.125μg/mL。
另一目的是显示将活性亚组分以50mg/kg体重的剂量对受感染的小鼠口服给药后，该受感染的小鼠具有延长的存活持续时间。
另一目的是显示通过采用VERO细胞系的细胞毒性研究，最具有活性的亚组分未观察到毒性。
另一目的是显示已进行所述活性组分给药的健康小鼠仍然健康并体重增加，从而表明所述活性亚组分的无毒特性。
另一目的是表征所述活性亚组分的成分。
另一目的是显示蔗糖为所述亚组分的主要组分，并且还显示出存在着与蔗糖共洗脱的次要成分。
另一目的是证实蔗糖本身没有抗TB活性，并且活性存在于次要成分中，该次要成分单独地或与其它次要成分和/或主要成分结合而起作用。
另一目的是将所述最具活性的亚组分用作可能的结核病治疗药物，无论是使用其本身还是通过进一步纯化以进一步增强活性。
另一目的是分离次要成分并对其抗TB活性进行单独地研究。
发明概述
因此，本发明提供了来自海蓬子属物种的提取物的生物活性组分。
本发明也提供了增强从成熟Salicornia brachiata的根获得的氯仿-甲醇(1:1)组分的抗结核活性的方法，该氯仿-甲醇(1:1)组分已在待审的于2004年4月22日提交的第10/829,400号美国专利申请和2003年8月29日提交的第PCT/IN03/00292号PCT专利申请中公开。
生物活性组分，其中所述海蓬子属物种包括Salicornia brachiata。
生物活性组分，其中所述Salicornia brachiata为完全成熟的植物。
生物活性组分，其中所述提取物包括来自海蓬子属植物部分的提取物，所述植物部分选自不含根的完整植物、根、穗、外壳和种子。
生物活性组分，其中所述生物活性组分包含F1、F2、F3、F4和F5。
生物活性组分，其中所述生物活性组分F2还包含亚组分SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6和SF7。
生物活性组分，其中SF3-K为SF3的亚组分。
生物活性组分，其中即使在高达50℃的温度下，SF3-K能稳定4小时。
生物活性组分，其中根据带有RI检测的HPLC，SF3K的主要成分包含含量至75-80％的程度的蔗糖。
生物活性组分，其中所述生物活性组分具有抗结核活性。
生物活性组分，其中所述生物活性组分用作抗结核剂。
在本发明的一个实施方案中，当将本发明的抗结核组分对含有OADC的7H10 Middlebrook’s培养基上的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H37Rv进行测试时，所述抗结核组分(此后称为SF3-K)的MIC值为≤3.125μg/mL。
在另一实施方案中，当用BACTEC方法进行体外评价时，SF3-K在50μg/nL和100μg/mL的剂量时显示对结核分枝杆菌H37Rv的完全抑制作用，并还显示生长指数的剂量依赖性。
在另一实施方案中，SF3-K在用VERO细胞系进行的测试中，即使其剂量高达100μg/mL，即超过由权利要求1所述方法评估的SF3-K的MIC值的十倍，也不表现细胞毒性。
在另一实施方案中，SF3-K在体内也具有活性，并且当感染后将SF3-K以等于50mg/kg体重的剂量口服给药12天时，其使受感染小鼠的平均存活时间(MST)增加5天。
在另一实施方案中，SF3-K显示出对将SF3-K以50mg/kg体重的剂量口服给药的健康小鼠无毒性。
在另一实施方案中，SF3-K显示主要包含蔗糖[根据HPLC-RI检测器为75-80％]，余下的是分子量为113、115、117的次要成分。另一成分具有143[142+H+]的m/z。
在本发明的另一实施方案中，SF3-K的抗结核活性表现为存在于总计仅为所述组分20-25％重量比的该组分的次要成分中。
因此，本发明提供了从海蓬子属物种的提取物中制备生物活性组分的方法，所述方法包括如下步骤：
(i)提供在2004年4月22日提交的第10/829,400号美国专利申请和2003年8月29日提交的第PCT/IN03/00292号PCT专利申请中所要求保护的来自Salicornia brachiata的F2组分；
(ii)将该F2生物活性组分在采用RP-18柱(Phenomenex)的半制备HPLC上进行亚分离，以03:97::CH3CN:H2O为流动相，流速为7mL/分钟，
(iii)根据在本申请中提供的半制备HPLC特征谱，在0至22分钟之间收集7个亚组分SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6和SF7；
(iv)将步骤(iii)中得到的所述亚组分进行抗结核筛选；
(v)根据亚组分的活性和所得物质的量，将亚组分SF3鉴别为最佳折衷物；
(vi)将在步骤(v)中得到的所述亚组分浓缩，并在相同的半制备柱上再次进行层析(除了将流速改为6至7mL/分钟外，保持所有条件相同)，以增强峰的纯度，所述峰在流速6mL/分钟的半制备柱上具有11.89分钟的保留时间，在分析柱上流速1mL/分钟时具有2.95分钟的保留时间；
(vii)浓缩在步骤(vi)中获得的所述组分，并经冻干得到SF3-K。
在本发明另一实施方案中，其中在步骤(vi)中获得的所述组分经冻干处理，以便以0.6％至0.9％的收率从干燥的根得到固体SF3-K。
在本发明的另一实施方案中，通过将流动相改为乙腈:水::03:97，改善了在待审的专利申请中所报导的氯仿-甲醇组分的反相色谱分离，这能够使所述组分亚分离为7个截然不同的部分(亚组分)，并根据抗结核活性和所得物质的量的联合考虑，将一个亚组分(SF3)鉴别为最适合的。
在另一实施方案中，将SF3再次色谱分离并进一步纯化，以获得在所述分析反相柱上明显为单峰的SF3-K。
在本发明另一实施方案中，在45至55℃的温度下，在旋转蒸发器上将SF3-K浓缩。
在本发明的另一实施方案中，在-50至-60℃的温度下，将所浓缩的提取物冻干8至16个小时。
在本发明的另一实施方案中，将SF3-K在炙热的午后阳光下暴露4小时，并发现其是稳定的。
在本发明的另一实施方案中，将SF3-K在Waters Amino柱上进行色谱分离，并用80:20::CH3CN:H2O洗脱，从而可将SF3-K的多种成分解析出，并根据质谱分析确定其分子量为113、342(蔗糖)、115和117。在较长的保留时间也观察到了具有m/z为143的次要成分。
在本发明的实施方案中，其中为了表征SF3-K的成分，通过采用80:20::CH3CN:H2O，将SF3-K在Waters Amino柱上进行液相色谱分析，并用UV(210nm)和RI检测器监测次要和主要成分，且用LC-MS分析所述成分来对SF3-K的成分进行解析。
得自海蓬子属物种的提取物的生物活性组分用作抗结核剂。
在本发明的实施方案中，其中所述海蓬子物种包括Salicorniabrachiata。
在本发明的实施方案中，其中Salicornia brachiata为完全成熟的植物。
在本发明的另一实施方案中，其中生物活性提取物包含来自海蓬子属植物部分的提取物，所述植物部分选自不含根的完整植物、根、穗、外壳和种子。
在本发明的另一实施方案中，其中所述生物活性组分包含F1，F2、F3、F4和F5。
在本发明的另一实施方案中，其中所述F2组分进一步包含亚组分SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6和SF7。
在本发明的实施方案中，其中所述亚组分SF3被进一步分离为SF3K。
在本发明的另一实施方案中，其中根据带有RI检测的HPLC，SF3-K的主要成分包含含量至75-80％的程度的蔗糖。
在本发明的实施方案中，其中所述组分具有抗结核活性。
在本发明的实施方案中，其中当用含有OADC(B-D，USA)的7H10Middlebrook’s培养基对SF3K进行评价时，所述组分SF3K表现出抗结核分枝杆菌H37Rv的MIC值≤3.125μg/mL。
在本发明的实施方案中，其中当用BACTEC方法进行体外评价时，SF3-K在50μg/mL和100μg/mL的剂量时显示对结核分枝杆菌H37Rv的完全抑制作用，并还显示生长指数的剂量依赖性。
在本发明的实施方案中，所述活性组分在体内也具有活性，并且当感染后将SF3-K以等于50mg/kg体重的剂量口服给药12天时，其将受感染小鼠的平均存活时间(MST)增加5天。
在本发明的实施方案中，所述组分在用VERO细胞系进行的测试中，即使其剂量高达100μg/mL，即超过SF3-K的MIC值的十倍，也不表现细胞毒性。
在本发明的实施方案中，所述组分对将SF3-K以0至50mg/kg体重的剂量口服给药的健康小鼠不表现毒性。
在本发明的实施方案中，其中即使主要成分蔗糖的剂量为100μg/mL，其同纯蔗糖一样不太可能具有任何活性。
在本发明的实施方案中，其中最突出的次要成分表现出m/z值为118[117+H]+和140[117+Na+]，对应分子量为117的成分。
在本发明的实施方案中，其中分子量117的次要成分显示出对应m/z值为58和59的子峰，同时钠盐形式的子片段被发现具有m/z值96、81、53和23。
在本发明的实施方案中，其中具有M.W.为117的成分在质谱分析条件下形成自身簇(self-cluster)，并且也与主要成分(蔗糖)成簇。
在本发明的实施方案中，其中观察到其它次要成分具有分子量113、115和142。
在本发明的实施方案中，其中也发现所述亚组分SF1、SF5、SF6和SF7在100至12.5μg/mL时具有抗结核活性，以及发现SF2和SF4在100至25μg/mL时具有抗结核活性。
治疗结核病的方法，包括将药物有效量的得自海蓬子属物种的抗结核组分任选地与合成的或天然来源的任何其它抗结核药物和药物可接受的添加剂或载体一起对患有结核病的个体给药。
在本发明实施方案中，其中所述方法包括将生物活性组分或海蓬子属物种的粗提取物对个体给药。
在本发明的实施方案中，其中海蓬子属物种包括Salicorniabrachiata。
在本发明的实施方案中，其中Salicornia brachiata为完全成熟的植物。
在本发明的实施方案中，其中所述组分包含F1、F2、F3、F4和F5。
在本发明的实施方案中，其中所述F2组分被亚分离为SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6和SF7。
在本发明的实施方案中，其中所述亚组分SF3被进一步分离为SF3K。
在本发明的实施方案中，其中SF3-K的主要成分包含蔗糖，根据带有RI检测的HPLC，蔗糖含量至75-80％的程度。
在本发明的实施方案中，其中所述组分具有抗结核活性。
在本发明的实施方案中，其中当用含有OADC(B-D，USA)的7H10Middlebrook’s培养基对SF3K进行评价时，所述组分SF3K表现出抗结核分枝杆菌H37Rv的MIC值≤3.125μg/mL。
在本发明的实施方案中，其中当用BACTEC方法进行体外评价时，SF3-K在50μg/mL和100μg/mL的剂量时显示对结核分枝杆菌H37Rv的完全抑制作用，并还显示生长指数的剂量依赖性。
在本发明的实施方案中，所述组分在体内也具有活性，并且当感染后将SF3-K以等于50mg/kg体重的剂量口服给药12天时，其使受感染小鼠的平均存活时间(MST)增加5天。其中所述组分在用VERO细胞系进行的测试中，即使剂量高达100μg/mL，即超过SF3-K的MIC值的十倍，也不表现细胞毒性。
在本发明的实施方案中，其中所述组分对将SF3-K以0至50mg/kg体重的剂量口服给药的健康小鼠不表现毒性。
在本发明的实施方案中，其中即使主要成分蔗糖的剂量为100μg/mL，其同纯蔗糖一样不太可能具有任何活性。
在本发明的实施方案中，其中最显著的次要成分表现出m/z值为118[117+H]+和140[117+Na+]，对应分子量为117的成分。
在本发明的实施方案中，其中具有分子量117的次要成分显示出对应m/z值为58和59的子峰，同时钠盐形式的子片段被发现具有m/z值96、81、53和23。
在本发明的实施方案中，其中具有M.W.117的成分在质谱分析条件下形成自身簇，并且也与主要成分(蔗糖)成簇。
在本发明的实施方案中，其中观察到其它次要成分具有分子量113、115和142。
在本发明的实施方案中，其中所述组分以选自片剂、锭剂、胶囊、粉剂、溶液的形式静脉内或口服给药。
药物组合物，包含分离自海蓬子属物种提取物的生物活性组分、任选地连同合成的或天然来源的任何其它抗结核药物以及药物可接受的添加剂和载体。
在本发明实施方案中，其中所述海蓬子属物种包括Salicorniabrachiata。
在本发明的实施方案中，其中Salicornia brachiata为完全成熟的植物。
在本发明的实施方案中，其中所述提取物包含来自海蓬子属植物部分的提取物，所述植物部分选自不含根的完整植物、根、穗、外壳和种子。
在本发明的实施方案中，其中所述组分包含F1，F2、F3、F4和F5。
在本发明的实施方案中，其中所述F2组分进一步包含亚组分SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6和SF7。
在本发明的实施方案中，其中所述亚组分SF3被进一步分离为SF3K。
在本发明的实施方案中，其中SF3-K的主要成分包含蔗糖，根据带有RI检测的HPLC，蔗糖含量至75-80％的程度。
在本发明的实施方案中，其中所述组分具有抗结核活性。
在本发明的实施方案中，其中当用含有OADC(B-D，USA)的7H10Middlebrook’s培养基对SF3K进行评价时，所述组分SF3K表现出抗结核分枝杆菌H37Rv的MIC值≤3.125μg/mL。
在本发明的实施方案中，其中当用BACTEC方法进行体外评价时，所述组分SF3-K在50μg/mL和100μg/mL的剂量时显示对结核分枝杆菌H37Rv的完全抑制作用，并还显示生长指数的剂量依赖性。
在本发明的实施方案中，SF3-K也在体内具有活性，并且当感染后将SF3-K以等于50mg/kg体重的剂量口服给药12天时，其使受感染小鼠的平均存活时间(MST)增加5天。
在本发明的实施方案中，其在用VERO细胞系进行的测试中，即使剂量高达100μg/mL，即超过SF3-K的MIC值的十倍，也不表现细胞毒性。
在本发明的实施方案中，其对将SF3-K以0-50mg/kg体重的剂量口服给药的健康小鼠不表现毒性。
在本发明的实施方案中，其中即使主要成分蔗糖的剂量为100μg/mL，其同纯蔗糖一样不太可能具有任何活性。
在本发明的实施方案中，其中最突出的次要成分表现出m/z值为118[117+H]+和140[117+Na+]，对应分子量为117的成分。
在本发明的实施方案中，其中具有分子量117的次要成分显示出对应m/z值为58和59的子峰，同时钠盐形式的子片段被发现具有m/z值96、81、53和23。
在本发明的实施方案中，其中具有M.W.117的成分在质谱分析条件下形成自身簇，并且也与主要成分(蔗糖)成簇。
在本发明的实施方案中，其中观察到其它次要成分具有分子量113、115和142。
在本发明的实施方案中，其中也发现所述亚组分SF1、SF5、SF6和SF7在100至12.5μg/mL时具有抗结核活性，以及发现SF2和SF4在100至25μg/mL时具有抗结核活性。
在本发明的实施方案中，其中所述组合物具有选自片剂、锭剂、溶液、胶囊、粉剂和溶液的形式。
附图的简要说明
图1为所述组分F2在254nm的分析HPLC特征谱。采用RP-18柱(Phenomenex)并以1:1::CH3CN:MeOH为无梯度洗脱溶剂系统，流速为1mL/分钟。
图2为所述组分F2在220nm的分析HPLC特征谱，采用RP-18柱(Phenomenex)并以03:97::CH3CN:H2O为无梯度洗脱溶剂系统，流速为1mL/分钟，这是本发明的起始点。
图3为所述组分F2在220nm的半制备HPLC特征谱，采用RP-18柱(Phenomenex)并以03:97::CH3CN:H2O为无梯度洗脱溶剂系统，流速为6mL/分钟。
图4为SF3-K在220nm的分析HPLC特征谱，采用RP-18柱(Phenomenex)并以03:97::CH3CN:H2O为无梯度洗脱溶剂系统，流速为1mL/分钟。
图5为通过将SF3-K以50mg/Kg体重的剂量对小鼠口服给药12天，防止结核分枝杆菌H37Rv的感染。
图6为采用MTT分析的VERO细胞系方法的SF3-K细胞毒性研究。
图7为SF3-K的TOCSY谱(2D)，这表明从存在于SF3-K的主要成分蔗糖中分离出次要成分。
图8为通过BACTEC体外筛选方法，在5天内与蔗糖相比，SF3-K对结核分枝杆菌H37Rv生长抑制的数据。
图9为在BACTEC中，在50μg/mL和100μg/mL浓度这两种不同的剂量水平时，SF3-K对结核分枝杆菌H37Rv生长抑制的重复实验数据。
图10为SF3-K在LC-MS条件下的HPLC-UV特征谱。HPLC是采用Waters Amino柱，以CH3CN:H2O::80:20为流动相来完成的。
图11-a、b、c和d为在图10的LC-MS条件下运行，在HPLC-UV中鉴别的SF3-K的各个峰的质谱。图11-b为蔗糖峰的质谱，其在SF3-K的LC-MS运行过程中在7.0分钟时在UV下未检测出。
图12为SF3-K的质谱-ES+扫描。
图13-a和b分别为表示m/z＝118和m/z＝140的子组分的MS-MS。
图14-a和b分别为在KBr压片上的SF3-K和标准蔗糖的FT-IR谱。
发明的详细说明
本发明涉及海蓬子属物种的分析和研究，以便获得具有抗结核活性的其生物活性组分或粗提取物。在海蓬子属中，Salicornia brachiata为印度原产的物种，并大量地存在于印度Western Coast的沿海淤泥滩上，并且据报道也存在于东/南海岸。海蓬子属的其它种类为Salicornia bigelovi、Salicornia depressa和Salicornia maritima(存在于美国东北部)、Salicorniaherbecea、Salicornia fruiticosa和Salicornia europaea(存在于欧洲许多国家)，它们可能具有相同的活性。迄今为止在世界范围内尚未报导来自Salicornia brachiata或来自其它海蓬子属物种的化合物具有抗结核活性。对属于藜科chenopodiaceae的Salicornia brachiata植物进行鉴别并在完全成熟阶段采集。海蓬子属物种生长在亚洲/非洲、欧洲和北美的盐沼中。
本发明因此提供了来自海蓬子属物种的粗提取物的新生物活性组分。本发明也涉及具有抗结核活性的海蓬子属物种植物提取物的制备方法，所述方法包括在完全成熟时采集植物；用自来水接着用去离子水洗涤该植物；除去全部的外来物质；分离并处理该植物材料以得到所需部分；干燥；切碎并研磨到某一粒度；在溶剂中浸泡和提取所有的可溶性物质；通过常规技术浓缩该提取物；将所浓缩的提取物冻干以得到固体残余物；单独地用丁醇、氯仿、甲醇和水或者其组合将该提取物分离为5个组分；测试所述粗提取物和所述组分的体外和体内抗结核活性、尤其是抗结核分枝杆菌H37Rv的活性；以及记录所述组分的HPLC特征谱以用作指纹图谱。
植物材料优选地在20-35℃的温度下进行洗涤和干燥，直到水分含量为0.5-1.5％。在浸泡前，优选地将该植物材料进行研磨，并且选择用16-20筛目大小的筛子筛过的材料以用于进一步处理。所述提取物和所述组分均在体外和体内测试抗结核活性。
所述植物分类群为一年生的、小型直立的、30-40cm高的分枝植物。其具有多汁和有节的茎、对生分枝和短的茎节间。叶子缩小成鳞片状，形成具有退化的叶片和锋利尖端的短叶鞘。
花为trinate，与所述分枝的上部嵌入在空腔中。种子穗由含有三朵花的聚伞花序组成。在聚伞花序中中间的花明显地比两侧的花更高，导致呈三角构造。一个或两个雄蕊、清晰的花柱、锥状柱头、胚钩(embryo hook)两端向下。种子是直立的、扁平的、膜状的和无胚乳的。
本发明的所述方法包括：
1.在完全成熟阶段采集Salicornia brachiata植物材料。
2.在25-37℃的室温下洗涤和干燥该植物材料，同时将水分保持在0.5-1.5％。
3.通过研磨减少该植物材料的大小，并选择16-20网目筛大小的材料。
4.将该植物材料浸泡在去离子水中，加热至80℃-90℃的温度，并用新的去离子水以24小时的间隔重复该浸泡步骤5次。
5.通过常规的/草药浓缩器技术浓缩所述提取物。
6.在-50℃至-60℃的温度下，将所浓缩的提取物冻干8-16小时，以便回收粗品，收率为18-20％。
7.将所述提取物分离为5个组分，丁醇中的F1(收率5-15％)、50％甲醇-氯仿中的F2(收率13-30％)、甲醇中的F3(收率34-51％)、50％甲醇-水中的F4(收率9-15％)和水中的F5(收率3-9％)。
8.对全部5个组分的体外和体内抗结核活性进行测试。
9.将以上活性组分之一F2组分在半制备HPLC系统上亚分离为7个亚组分，并且对全部7个亚组分的体外抗结核活性进行测试。
10.在半制备HPLC系统上纯化所述活性亚组分SF3的主要成分，并且在体外，随后在体内测试所纯化的亚组分SF3-K的抗结核活性。
11.采用用于鉴定所述化合物的多种光谱分析表征所纯化的亚组分SF3-K。
根据本发明，所述植物在分类学上进行了鉴别并在完全成熟阶段从野外采集需要的材料。用去离子水充分地洗涤该材料，以除去泥浆、尘粒和外来物质。在室温下，在阴凉处将干净的植物材料干燥3至4周。将该植物材料研磨并筛滤以获得16-20粒度的粉末，在去离子水中浸泡并在80-90℃的水浴中加热5-6小时。用新的去离子水重复提取循环5次并在真空下在Buckner漏斗内过滤。然后将所有的滤液混合并用公知的技术进行浓缩以获得粗提取物。将该浓缩的提取物冻干以得到干的粉末形式的粗提取物。该提取物最初在体外进行测试，在多次重复阳性测试后，进一步在体内测试该提取物的抗结核活性。用不同极性的溶剂混合物将所述提取物分离为5个组分，且测试了每一组分的体外和体内抗结核活性。将活性组分之一F2亚分离为7个亚组分，并在体外和体内测试抗结核活性。纯化活性亚组分SF3并得到SF3-K。在体外和体内测试所纯化亚组分SF3-K的抗结核活性，并最后用多种分光镜分析法进行表征。
实施例1
在成熟阶段时或在成熟阶段前(11月至3月)，从印度的坎贝湾处采集野生的Salicornia brachiata，更精确地，在北纬21°46’和东经72°11’至北纬20°42’和东经71°01’(北纬21°75’和东经度72°17’至北纬21°09’和东经72°00’)的区域进行采集，如在2004年4月22日提交的第10/829,400号美国专利申请和2003年8月29日提交的第PCT/IN03/00292号PCT专利申请中所公开。然后用如下溶剂对该植物的不同部分进行进一步处理以便制备粗提取物：在室温下用甲醇-水(95:5)、甲醇-水(1:1)以及在80-90℃下用纯水。将这些粗提取物进行抗结核活性的生物分析。多个部分的生物活性结果见下：
 
Sr 植物部分 溶剂系统 在不同天数时的小鼠存活率％                  
1 根 甲醇-水(1:1) 17％的小鼠高达28天
2 根 水(100％) 17％的小鼠高达35天
3 不含根的全部植物 水(100％) 17％的小鼠高达24天
4 种壳 甲醇-水(95:5) 17％的小鼠高达23天
从上述结果中推断出根的水提取物比从其它植物部分中制备的提取物具有更高的活性，因此选择根的水提取物进行分离工作以获得如以上专利中所公开的F1至F5组分。对全部的5个组分的体外抗结核活性进行评价并发现所有组分在50μg/mL时具有活性。选择上述组分之一F2组分进行进一步分离以获得分离的活性部分，如在以上专利申请的实施例1中进一步公开的。其活性和HPLC特征谱被确定为相同的(图1)。为了改进F2组分中成分的分离，将色谱条件进行如下改进：流动相为03:97::CH3CN:H2O(无梯度的)，所用柱为5μRP-18分析柱(Phenomenex，U.S.A.)，流速为1mL/分钟，运行时间为20分钟以及UV检测波长为220nm。如从图2的HPLC特征谱中所见，所述组分的成分被较好地解析。
实施例2
在10μRP-18半制备柱(Phenomenex，U.S.A.)上对1g的实施例2的F2组分进行处理，流速为6mL/分钟，运行时间为28分钟以及UV检测波长为220nm。HPLC图显示于图3中。随后，用总量为1g的F2组分完成50次进样，所收集的7个亚组分(SF1-SF7)显示于图3中。在旋转蒸发器中浓缩所述亚组分，随后在-58℃下冻干。单独的亚组分的重量分别为238mg、312mg、160mg、5mg、9mg、1mg和8mg，分别对应SF1至SF7。
实施例3
将实施例2的所述亚组分SF1至SF7在体外进行抗结核分枝杆菌H37Rv的测试。始终发现SF3亚组分在抑制结核分枝杆菌H37Rv在含有OADC的7H10 Middlebrook’s培养基上生长和菌落形成能力方面具有活性，这表明在图3中以箭头显示的峰可能为对应最具有活性成分的峰(根据活性流程图)。
实施例4
采用如实施例2中所述的相同条件，将38mg实施例2的SF3亚组分在半制备HPLC柱上进行再次色谱分析。收集该亚组分的四个亚-亚-组分。在除去溶剂后，第三个亚组分重25.3mg。在分析RP-18柱上产生图4的HPLC。
实施例5
将含有实施例4的纯化合物的有帽玻璃瓶大约在中午时候在炙热的夏季阳光下放置4小时，以检查在印度气候条件下的热稳定性。在阳光下暴露后检测HPLC特征谱，该特征谱与图4的特征谱相同。这表明SF3-K具有足够的热稳定性，能经受住出于生物活性测定目的的贮存和运输。
实施例6
当根据实施例3的方法进行评价时，实施例4的SF3-K表现出抗结核分枝杆菌H37Rv的MIC值≤3.125μg/mL，在生物测定步骤(BioassayProcedures)中单独提供了所述实施例3的方法的细节。
实施例7
采用另一种称为BACTEC的方法在体外对SF3-K的活性进行了进一步的测定，在生物测定步骤(Bioassay Procedures)中单独提供了所述方法的细节。在50μg/mL和100μg/mL的浓度下测定对结核分枝杆菌生长的抑制作用。观察到对生长的完全抑制作用。
实施例8
在小规模的有限研究中，在结核病的实验模型中评价SF3-K的抗结核活性。以50mg每kg体重在结核分枝杆菌H37Rv感染的小鼠中测试SF3-K的活性。小鼠每天口服接受纯化的SF3-K一次，持续12天。对两个组的说明和治疗如下所示：
组I：受感染的，未治疗的小鼠
组II：受感染的，但是在感染后，用纯化的SF3以50mg每kg体重进行治疗，持续12天。
组I中的小鼠在感染10天后开始减轻体重。它们看起来很虚弱且皮毛褶皱，在感染14天后开始死亡。在16天内所有的小鼠死于结核。脾增大，肺中有可见的损伤。在组II中的用SF3-K治疗的所有小鼠存活时间较长，并且平均存活时间增加了5天(图5)。
实施例9
以如下的不同浓度在VERO细胞中测试SF3-K的细胞毒性(IC50)：0、12.5、25、50和100μg/mL。该范围覆盖了相当于SF-3对结核分枝杆菌H37Rv的MIC值10倍的剂量。在暴露72小时后，根据细胞将MTT转化为由在492nm处的吸光度测定的甲(formazan)产物(采用PromegaCellTitre96非放射性细胞增殖测定)来评估存活力。高达100μg/mL时未有抑制作用，这表明所述化合物无细胞毒性。所述结果显示于图6中。将指定为X和Y的两种细胞毒性化合物用来进行对比。
实施例10
也在用SF3-K处理的健康小鼠上进行了毒性研究。将SF3-K以等于50mg/kg体重的剂量对7只小鼠(通过口服途径)每天给药一次，连续给药12天，并观察存活力和体重，直到35天为止。没有小鼠死亡并且体重增加。
实施例11
在500MHz Varian NMR仪器上记录SF3-K的TOCSY(总相关光谱)质子NMR光谱(图7)。除了环状峰之外，所有其它的峰均可归于蔗糖，并且采用纯蔗糖(Sigma)的单独NMR实验已证实了这一点。根据具有RI检测的HPLC，蔗糖在SF3-K中的百分比约为75-80％，从而表明包含的所述次要成分不超过20-25％。还根据SF3-K与具有相等重量的标准蔗糖(Sigma)的1H NMR对比，表明在质子信号面积方面约有5％的不同。同样地，根据具有UV检测的HPLC，在次要成分中，具有分子量117和分子量142的化合物之间的比例约为4:1。此实施例表明SF3-K主要为蔗糖，且存在一种或多种生成环状峰的次要成分。
实施例12
采用BACTEC方法，用对照品、来自Sigma的纯蔗糖(100μg/mL)和SF3-K(50μg/mL)在体外进行抗H37Rv的实验。从图8中可看出，用蔗糖未观察到抑制作用，其行为与所看见的用对照品的行为类似，而SF3-K表现出明显的抑制作用。如果蔗糖除了为稀释剂外无任何作用，那么预计SF3-K中所述活性成分的MIC值比实施例6中所表明的值更低，因为如实施例11所表明的，在SF3-K中包含的该活性成分不超过20-25％。
实施例13
在SF3-K的两种不同剂量水平，即50μg/mL和100μg/mL时重复实施例12的实验。可从图9中所见，发现实施例12的观察结果是可重复的(图9)。此外，看到抑制作用的剂量依赖性。
实施例14
用纯蔗糖重复实施例1的采用03:97::CH3CN:H2O的HPLC条件，并在220nm下检测时在色谱图内未发现峰，而RI检测时发现了与SF3-K在220nm下UV检测或RI检测的保留时间相似的峰。此实施例表明SF3-K中的次要成分在所采用的色谱条件下与蔗糖共同洗脱出，而所述次要成分的存在从实施例11的TOCSYNMR和实施例12和13的活性数据中得到证实。
实施例15
对HPLC条件进行改进以解析SF3-K的成分，该SF3-K在先前的HPLC条件下具有如图4的色谱图。为此进行如下改变：用Waters Amino柱替换所述的RP-18柱，且流动相改为80:20::CH3CN:H2O。在LC-MS运行条件下得到的色谱图(210nm检测)显示于图10中。可从该图中所见，在3.09分钟、4.26分钟、15.92分钟和20.74分钟时获得了峰。在采用RI检测的相同条件下，用纯蔗糖(Sigma)进行的单独实验在7.70分钟时显示了峰，即蔗糖在7.70分钟时洗脱，但是在UV中未检测出。因此，试图对在4.26分钟、7.70分钟、15.92分钟和20.74分钟时洗脱的成分进行质谱表征(图11A-D)。同样地，SF3-K的质谱(ES+扫描)显示于图12中。在4.26分钟时洗脱的成分显示m/z＝114，对应[113+H]+，即其具有分子量113。在MS条件下，该化合物也形成在m/z＝227处具有峰的二聚物[(113)2+H]+。在7.70分钟时洗脱的成分具有m/z＝360(图11B)，对应[蔗糖(342)+NH4 +(18)]，即由所预期的蔗糖引起。在15.92分钟时洗脱的成分(11C)显示在m/z＝118处的MS峰，对应[117+H]+，即其具有分子量117。在MS条件下，该化合物也分别形成m/z＝235的二聚簇[(117)2+H]+和m/z＝352的三聚簇[(117)3+H]+。显示在图12的谱图中的m/z＝118[117+H]+和140[117+Na+]子峰的MS-MS显示于图13a&b。根据图13a和b的碎裂方式、图7中“无蔗糖”环状峰的NMR位置以及未见于蔗糖(图14b)的SF3-K的酰胺和羰基谱带的IR证据(图14a)，以下结构(1)可能是对应m/z＝118的可能结构之一(在SF3-K的“次要成分”中该成分显得占优势)。在20.74分钟时洗脱的成分显示了m/z在143[142+H+]，但是没有进一步地进行表征。除了这些峰之外，观察到m/z＝116[115+H]+的峰，也观察到m/z＝138[115+Na+]的峰，两个峰均在SF3-K的直接喷雾下观察到的，以及在LC-MS过程中也观察到m/z＝118的共成分(co-constituent)。可根据蔗糖自身的簇集或者其与分子量为117的次要成分的簇集对图12质谱的复杂形式进行解释。
方法
从Salicornia brachiata的干燥成熟的根制备SF3-K
如在由Rathod等人于2004年4月22日提交的审查中的第10/829,400号美国专利申请和2003年8月29日提交的第PCT/IN03/00292号PCT专利申请中所公开，在完全成熟阶段采集Salicornia brachiata，并用根来制备水提取物。用自来水接着用去离子水洗涤根，以除去泥浆、尘粒和其它外来物质，干燥，切成小片，研磨并浸泡在去离子水中。将所浸泡的根在在80℃-90℃的水浴上加热。将水溶性提取物轻轻倒出并过滤。上述过程在3至5天内完成，以便回收全部的水溶性物质。在旋转蒸发器上浓缩滤液，随后在Freeze Drier上干燥以得到固体。通过用丁醇、1:1氯仿:甲醇、甲醇、1:1甲醇:水和水相继地提取，将所述固体分离以获得5个组分。将氯仿:甲醇组分(称为F2)在采用RP-18柱(Phenomenex)的半制备HPLC上进行亚分离，以03:97::CH3CN:H2O为流动相，流速为7mL/分钟。在0至22分钟之间收集7个亚组分，将在9.9分钟和10.65分钟之间收集的亚组分标记为SF3。在50℃下在旋转蒸发器上浓缩SF3，并在相同的柱上，除了将流速改为6mL/分钟和总运行时间改为19分钟外在相同的条件下再一次进行色谱分离。在11.8至12.6分钟之间收集对应主峰的组分，即在基线之上的峰的上升阶段过程中开始收集，并在该峰的下降阶段过程中但在到达基线之前停止收集。将该亚组分在旋转蒸发器上再一次进行浓缩并冻干以得到粉末。以100g的干燥的根开始，获得0.805g的SF3-K。
采用含有OADC(B-D，USA)的7H10 Middlebrook’s培养基在体外筛选SF3-K抗结核分枝杆菌H37Rv活性
通过对结核分枝杆菌H37Rv在含有OADC(B-D，USA)的7H10Middlebrook’s培养基上的生长和菌落形成能力的抑制作用来确定SF3-K的抗结核活性。将所述培养基高压灭菌并补加OADC，将2ML的该培养基分散在无菌试管中。在无菌水中制备1mg/mL浓度的SF3-K组分的混悬液，将该混悬液以不同浓度但体积保持恒定(即0.1ml)加入含有的补给性培养基的试管中。在充分混合后，将该试管倾斜放置并冷却和固化。在37℃下将这些试管孵育24小时，以观察任何污染。如果没有污染，所述试管用结核分枝杆菌H37Rv的培养混悬液进行划线(1-5×104杆菌/试管)。在37℃下将所接种的试管与两个对照一同孵育；在一个对照中不存在抑制化合物但用结核分枝杆菌H37Rv的同一接种物进行划线，在第二个对照中以所报导的抑制结核杆菌生长的最小抑制浓度加入标准抗结核化合物。观察杆菌的生长直到孵育4周为止。含有SF3-K的试管与上述对照试管进行比较。
体外筛选的BACTEC方法
将SF3-K的含水储存液(1mg/mL)过滤灭菌。将50μL的SF3-K加入到4mL放射性测量的7H12肉汤(BACTEC12B)中，以获得终浓度为50μg/mL和100μg/mL的SF3-K。将50μL无菌水加入未加入SF3-K的对照小瓶中。最后，将104至105菌落形成单位的结核分枝杆菌H37Rv接种在所有小瓶中，即含有50μg/mL和100μg/mL SF3-K的4mL BACTEC放射性测量的7H12肉汤和不含SF3-K的对照小瓶。将所有的小瓶保持双份，并在37℃下孵育。每天记录生长指数(GI)。用蔗糖(Sigma；100μg/mL)代替SF3-K以类似的方式进行实验以确定其活性，如果有的话。
体内筛选方法
收获生长在L-J斜面上的结核分枝杆菌H37Rv并在Tween-盐水中以约1×108杆菌/mL制备均质混悬液。使用在印度勒克瑙的Central DrugResearch Institute的动物饲养场饲养的、重18至20g的雌性swiss小鼠。将该小鼠分为2组，每组7只。经侧尾静脉注射如上所述和制备的0.1mL细菌悬液，得到用结核分枝杆菌H37Rv感染的小鼠(1×107杆菌/小鼠)。在感染后48小时后开始用SF3-K(50mg/kg体重；溶于无菌水中)治疗小鼠，并通过口服途径给药12天。
主要发明步骤为：
(i)改变色谱条件，使得能够纯化F2。
(ii)将F2的亚组分与活性联系起来，并选择SF3作进一步研究。
(iii)进一步纯化SF3以获得在HPLC中产生单峰的、显然为高纯度的SF3-K。
(iv)鉴定蔗糖为SF3-K的主要成分并进一步证实其无活性。
(v)此后显示出蔗糖在检测到UV响应峰的相同位置上洗脱，而这些峰可能归因于次要成分。
(vi)由2D-NMR证实不同于蔗糖的另外MNR峰归因于次要成分，并不归因于蔗糖的功能性修饰。
(vii)制定出分离SF3-K的多种成分并尝试初步表征的方法学。
(viii)间接证实了<3.125μg/mL的SF3-K的MIC值转化为有活性的次要成分的非常低的MIC值，从而该活性次要成分需要分别进行分离和研究。
(ix)显示了SF3-K完全无毒性。
(x)在体外和体内证实了作用的有效性。
本发明的主要优点：
1.通过在称为SF3-K的特定亚组分中浓缩活性，减少来自Salicorniabrachiata的抗结核提取物的MIC值，使得MIC值≤3.125μg/mL。
2.正如通过增加存活时间所证实的，通过对H37Rv感染的小鼠的有限研究，证实体内抗结核作用的有效性。
3.通过用高于MIC值十倍的剂量进行细胞毒性研究，证明所述亚组分无毒性。
4.在用所述活性物质给药的健康小鼠中同样反映出无毒性。
5.正如通过将所述固体暴露在印度正午的阳光中所证实的，SF3-K具有足够的热和光化学稳定性，使得用UV检测的HPLC特征谱未发生改变。
6.通过重复采集所述植物和重复提取和分离，证明活性的可重复性。
7.证实SF3-K的活性存在于次要成分中，从而通过从主要的非活性成分即蔗糖中分离出游离的活性成分，有希望获得减少3至5倍的MIC值。
8.证实了由色谱方法从主要的无活性成分中分离SF3-K的次要成分的可能性，这可能导致对SF3-K的不同次要成分的抗TB活性进行详细研究，以便鉴别关键的活性成分以及与SF3-K的其它成分或者甚至目前正流行的或不久被引进的其它已知药物的增效作用，如果有的话。
9.根据质谱证实具有抗结核分枝杆菌活性的一种或多种的SF3-K次要成分为简单分子，并且以前可能未对其抗结核活性进行研究。
10.可能的是一旦完成从所有角度的详细测试，SF3-K可用作新的、无毒性的和有效的抗结核分枝杆菌的草药。
11.可能的是SF3-K可产生抗结核分枝杆菌的化学实体，该化学实体也可能易于合成。
12.迄今为止，发现公知的抗结核化合物具有复杂的结构和杂环。而在本发明分离的化合物显然非常简单，并具有低分子量(117)。

Claims (87)

1.来自海蓬子属物种提取物的生物活性组分。
2.如权利要求1所述的生物活性组分，其中所述海蓬子属物种包括Salicornia brachiata。
3.如权利要求2所述的生物活性组分，其中所述Salicornia brachiata为完全成熟的植物。
4.如权利要求1所述的生物活性组分，其中所述提取物包括来自海蓬子属植物部分的提取物，所述植物部分选自不含根的完整植物、根、穗、外壳和种子。
5.如权利要求1所述的生物活性组分，其中所述生物活性组分包括F1、F2、F3、F4和F5。
6.如权利要求6所述的生物活性组分，其中所述生物活性组分F2还包括亚组分SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6和SF7。
7.如权利要求6所述的生物活性组分，其中SF3-K为SF3的亚组分。
8.如权利要求7所述的生物活性组分，其中SF3-K在高达50℃的温度下至少稳定4小时。
9.如权利要求7所述的生物活性组分，其中根据带有RI检测的HPLC，所述SF3K的主要成分包含75％-80％含量的蔗糖。
10.如权利要求7所述的生物活性组分，其中所述生物活性组分具有抗结核活性。
11.如权利要求1所述的生物活性组分，其中所述生物活性组分用作抗结核剂。
12.如权利要求7所述的生物活性组分，其中当用含有OADC(B-D，USA)的7H10 Middlebrook’s培养基进行评估时，所述生物活性组分SF3-K显示抗结核分枝杆菌H37Rv的MIC值小于等于3.125μg/mL。
13.如权利要求7所述的生物活性组分，其中当用BACTEC方法进行体外评估时，所述生物活性组分SF3-K在50μg/mL和100μg/mL的剂量时显示对结核分枝杆菌H37Rv的完全抑制作用，并还显示生长指数的剂量依赖性。
14.如权利要求7所述的生物活性组分，所述生物活性组分在体内具有活性，并且当感染后将SF3-K以等于50mg/kg体重的剂量口服给药12天时，所述生物活性组分使受感染小鼠的平均存活时间(MST)增加5天。
15.如权利要求7所述的生物活性组分，其中SF3-K在用VERO细胞系进行的测试中，即使剂量高达100μg/mL，即超过SF3-K的MIC值的十倍，也不表现细胞毒性。
16.如权利要求7所述的生物活性组分，其中SF3-K对将其以0mg/kg至50mg/kg体重的剂量口服给药的健康小鼠不表现毒性。
17.如权利要求7所述的生物活性组分，其中即使所述主要成分蔗糖的剂量为100μg/mL，其同纯蔗糖一样不太可能具有任何活性。
18.如权利要求7所述的生物活性组分，其中最突出的次要成分表现出m/z值为118[117+H]+和140[117+Na+]，对应分子量为117的成分。
19.如权利要求7所述的生物活性组分，其中具有分子量117的所述次要成分显示出对应m/z值为58和59的子峰，同时钠盐形式的子片段被发现具有m/z值96、81、53和23。
20.如权利要求7所述的生物活性组分，其中具有M.W.117的所述成分在质谱分析条件下形成自身簇，并且也与所述主要成分(蔗糖)成簇。
21.如权利要求7所述的生物活性组分，其中其它次要成分被观察到具有分子量113、115和142。
22.如权利要求7所述的生物活性组分，其中所述亚组分SF1、SF5、SF6和SF7也被发现在100μg/mL至12.5μg/mL时具有抗结核活性，以及SF2和SF4被发现在100μg/mL至25μg/mL时具有抗结核活性。
23.从海蓬子属物种的提取物中制备生物活性组分的方法，所述方法包括如下步骤：
(viii)提供在2004年4月22日提交的第10/829,400号美国专利申请和2003年8月29日提交的第PCT/IN03/00292号PCT专利申请中所要求保护的来自Salicornia brachiata的F2组分；
(ix)将所述F2生物活性组分在采用RP-18柱(Phenomenex)的半制备HPLC上进行亚分离，以03:97::CH3CN:H2O为流动相，流速为7mL/分钟，
(x)根据在本申请中提供的半制备HPLC特征谱，在0至22分钟之间收集7个亚组分SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6和SF7；
(xi)将步骤(iii)中得到的所述亚组分进行抗结核筛选；
(xii)根据亚组分的活性和所得物质的量，将所述亚组分SF3鉴别为最佳折衷物；
(xiii)将在步骤(v)中得到的所述亚组分浓缩，并在相同的半制备柱上进行再次色谱分析(除了将流速改为6mL/分钟至7mL/分钟以外，保持所有条件相同)，以增强所述峰的纯度，所述峰在流速6mL/分钟的半制备柱上具有11.89分钟的保留时间，在流速1mL/分钟的分析柱上具有2.95分钟的保留时间；
(xiv)将步骤(vi)中获得的所述组分浓缩，并经冻干得到SF3-K。
24.如权利要求23所述的方法，其中在步骤(vi)中获得的所述组分经冻干处理，以便以0.6％至0.9％的收率从干燥的根得到固体SF3-K。
25.如权利要求22所述的方法，其中为了表征权利要求1-19中所述的SF3-K的成分，所述SF3-K的成分是通过使其在采用80:20::CH3CN:H2O的Waters Amino柱上经液相色谱处理，并用UV(210nm)和RI检测器监测次要和主要成分，以及用LC-MS分析所述成分来进行解析。
26.从海蓬子属物种的提取物得到的生物活性组分作为抗结核剂的用途。
27.如权利要求25所述的用途，其中所述海蓬子属物种包括Salicornia brachiata。
28.如权利要求25所述的用途，其中所述Salicornia brachiata为完全成熟的植物。
29.如权利要求25所述的用途，其中所述生物活性提取物包括来自海蓬子属植物部分的提取物，所述植物部分选自不含根的完整植物、根、穗、外壳和种子。
30.如权利要求25所述的用途，其中所述生物活性组分包括F1、F2、F3、F4和F5。
31.如权利要求25所述的用途，其中所述组分F2被亚分离为SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6和SF7。
32.如权利要求25所述的用途，其中所述亚组分SF3被进一步分离为SF3-K。
33.如权利要求25所述的用途，其中根据带有RI检测的HPLC，所述SF3K的主要成分包含75％-80％含量的蔗糖。
34.如权利要求25所述的用途，其中所述组分具有抗结核活性。
35.如权利要求25所述的用途，其中当用含有OADC(B-D，USA)的7H10 Middlebrook’s培养基进行评估时，所述组分SF3-K显示抗结核分枝杆菌H37Rv的MIC值小于等于3.125μg/mL。
36.如权利要求25所述的用途，其中当用BACTEC方法进行体外评估时，所述组分SF3-K在50μg/mL和100μg/mL的剂量时显示对结核分枝杆菌H37Rv的完全抑制作用，并还显示生长指数的剂量依赖性。
37.如权利要求25所述的用途，其在体内也具有活性，并且当感染后将SF3-K以等于50mg/kg体重的剂量口服给药12天时，其使受感染小鼠的平均存活时间(MST)增加5天。
38.如权利要求25所述的用途，其在用VERO细胞系进行的测试中，即使剂量高达100μg/mL，即超过SF3-K的MIC值的十倍，也不表现细胞毒性。
39.如权利要求25所述的用途，其对将SF3-K以0mg/kg至50mg/kg体重的剂量口服给药的健康小鼠不表现毒性。
40.如权利要求25所述的用途，其中即使所述主要成分蔗糖的剂量为100μg/mL，其同纯蔗糖一样不太可能具有任何活性。
41.如权利要求25所述的用途，其中最突出的次要成分表现出m/z值为118[117+H]+和140[117+Na+]，对应分子量为117的成分。
42.如权利要求25所述的用途，其中具有分子量117的所述次要成分显示出对应m/z值为58和59的子峰，同时钠盐形式的子片段被发现具有m/z值96、81、53和23。
43.如权利要求25所述的用途，其中具有M.W.117的所述成分在质谱分析条件下形成自身簇，并且也与所述主要成分(蔗糖)成簇。
44.如权利要求25所述的用途，其中其它次要成分被观察到具有分子量113、115和142。
45.如权利要求25所述的用途，其中所述亚组分SF1、SF5、SF6和SF7也被发现在100μg/mL至12.5μg/mL时具有抗结核活性，以及SF2和SF4被发现在100μg/mL至25μg/mL时具有抗结核活性。
46.治疗结核病的方法，所述方法包括将药物有效量的得自海蓬子属物种的抗结核组分任选地与合成的或天然来源的任何其它抗结核药物和药物可接受的添加剂或载体一起对患有结核的个体给药。
47.如权利要求45所述的方法，其中所述方法包括将海蓬子属物种的生物活性组分或粗提取物对所述个体给药。
48.如权利要求45所述的方法，其中所述海蓬子属物种包括Salicornia brachiata。
49.如权利要求45所述的方法，其中所述Salicornia brachiata为完全成熟的植物。
50.如权利要求45所述的方法，其中所述组分包括F1、F2、F3、F4和F5。
51.如权利要求45所述的方法，其中所述组分F2被亚分离为SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6和SF7。
52.如权利要求45所述的方法，其中所述亚组分SF3被进一步分离为SF3-K。
53.如权利要求45所述的方法，其中根据带有RI检测的HPLC，所述SF3K的主要成分包含75％-80％含量的蔗糖。
54.如权利要求45所述的方法，其中所述组分具有抗结核活性。
55.如权利要求45所述的方法，其中当用含有OADC(B-D，USA)的7H10 Middlebrook’s培养基进行评估时，所述组分SF3-K显示抗结核分枝杆菌H37Rv的MIC值小于等于3.125μg/mL。
56.如权利要求45所述的方法，其中当用BACTEC方法进行体外评估时，所述组分SF3-K在50μg/mL和100μg/mL的剂量时显示对结核分枝杆菌H37Rv的完全抑制作用，并还显示生长指数的剂量依赖性。
57.如权利要求45所述的方法，其中所述组分在体内也具有活性，并且当感染后将SF3-K以等于1mg/kg至50mg/kg体重的剂量口服给药12天时，所述组分将受感染小鼠的平均存活时间(MST)增加5天。
58.如权利要求45所述的方法，所述组分在用VERO细胞系进行的测试中，即使剂量达到0μg/mL至100μg/mL，即超过SF3-K的MIC值的十倍，也不表现细胞毒性。
59.如权利要求45所述的方法，其中所述组分对将SF3-K以0mg/kg至50mg/kg体重的剂量口服给药的健康小鼠不表现毒性。
60.如权利要求45所述的方法，其中即使所述主要成分蔗糖的剂量为100μg/mL，其同纯蔗糖一样不太可能具有任何活性。
61.如权利要求45所述的方法，其中最突出的次要成分表现出m/z值为118[117+H]+和140[117+Na+]，对应分子量为117的成分。
62.如权利要求45所述的方法，其中具有分子量117的所述次要成分显示出对应m/z值为58和59的子峰，同时钠盐形式的子片段被发现具有m/z值96、81、53和23。
63.如权利要求45所述的方法，其中所述具有M.W.117的成分在质谱分析条件下形成自身簇，并且也与所述主要成分(蔗糖)成簇。
64.如权利要求45所述的方法，其中其它次要成分被观察到具有分子量113、115和142。
65.如权利要求45所述的方法，其中所述亚组分SF1、SF5、SF6和SF7也被发现在100μg/mL至12.5μg/mL时具有抗结核活性，以及SF2和SF4被发现在100μg/mL至25μg/mL时具有抗结核活性。
66.如权利要求45所述的方法，其中所述组分以选自片剂、锭剂、胶囊、粉剂、溶液的形式静脉内或口服给药。
67.药物组合物，所述药物组合物包含分离自海蓬子属物种提取物的生物活性组分、还任选地包含合成的或天然来源的任何其它抗结核药物以及药物可接受的添加剂或载体。
68.如权利要求66所述的组合物，其中所述海蓬子属物种包括Salicornia brachiata。
69.如权利要求66所述的组合物，其中所述Salicornia brachiata为完全成熟的植物。
70.如权利要求66所述的组合物，其中所述提取物包括来自海蓬子属植物部分的提取物，所述植物部分选自不含根的完整植物、根、穗、外壳和种子。
71.如权利要求66所述的组合物，其中所述组分包括F1、F2、F3、F4和F5。
72.如权利要求66所述的组合物，其中所述组分F2被亚分离为SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6和SF7。
73.如权利要求66所述的组合物，其中所述亚组分SF3被进一步分离为SF3-K。
74.如权利要求66所述的组合物，其中根据带有RI检测的HPLC，所述SF3K的主要成分包含75％-80％的含量蔗糖。
75.如权利要求66所述的组合物，其中所述组分具有抗结核活性。
76.如权利要求66所述的组合物，其中当用含有OADC(B-D，USA)的7H10 Middlebrook’s培养基进行评估时，所述组分SF3-K显示抗结核分枝杆菌H37Rv的MIC值小于等于3.125μg/mL。
77.如权利要求66所述的组合物，其中当用BACTEC方法进行体外评估时，所述组分SF3-K在50μg/mL和100μg/mL的剂量时显示对结核分枝杆菌H37Rv的完全抑制作用，并还显示生长指数的剂量依赖性。
78.如权利要求66所述的组合物，其在体内也具有活性，并且当感染后将SF3-K以等于50mg/kg体重的剂量口服给药12天时，其使受感染小鼠的平均存活时间(MST)增加5天。
79.如权利要求66所述的组合物，其在用VERO细胞系进行的测试中，即使剂量高达100μg/mL，即超过SF3-K的MIC值的十倍，也不表现细胞毒性。
80.如权利要求66所述的组合物，其对将SF3-K以00mg/kg至50mg/kg体重的剂量口服给药的健康小鼠不表现毒性。
81.如权利要求66所述的组合物，其中即使所述主要成分蔗糖的剂量为100μg/mL，其同纯蔗糖一样不太可能具有任何活性。
82.如权利要求66所述的组合物，其中最突出的次要成分表现出m/z值为118[117+H]+和140[117+Na+]，对应分子量为117的成分。
83.如权利要求66所述的组合物，其中具有分子量117的所述次要成分显示出对应m/z值为58和59的子峰，同时钠盐形式的子片段被发现具有m/z值96、81、53和23。
84.如权利要求66所述的组合物，其中具有M.W.117的所述成分在质谱分析条件下形成自身簇，并且也与所述主要成分(蔗糖)成簇。
85.如权利要求66所述的组合物，其中其它次要成分被观察到具有分子量113、115和142。
86.如权利要求66所述的组合物，其中所述亚组分SF1、SF5、SF6和SF7也被发现在100μg/mL至12.5μg/mL时具有抗结核活性，以及SF2和SF4被发现在100μg/mL至25μg/mL时具有抗结核活性。
87.如权利要求66所述的组合物，其中所述组合物具有选自片剂、锭剂、溶液、胶囊、粉剂和溶液的形式。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105147746A (zh) * 2015-10-08 2015-12-16 盐城工学院 一种海蓬子提取物的用途

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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KR101872637B1 (ko) * 2017-04-07 2018-06-28 강원대학교산학협력단 Pasakbumin A를 포함하는 결핵 치료용 약제학적 조성물 및 건강 기능성 식품
PT115324B (pt) 2019-02-20 2021-11-15 Novadelta Comercio E Ind De Cafes Lda Processo de produção de substância edível à base de plantas halófitas, uso e sistema de respetivos produtos edíveis
WO2024233632A2 (en) * 2023-05-09 2024-11-14 Heron Farms, Inc. Method of extracting salt from plant matter
CN116982553B (zh) * 2023-06-29 2024-04-19 广西壮族自治区南宁良凤江国家森林公园 一种黄果厚壳桂组织培养方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2657011A1 (fr) * 1990-01-17 1991-07-19 Secma Utilisation d'extraits de plantes de bord de mer pour la preparation de compositions pharmaceutiques, cosmetiques, alimentaires ou a usage agricole.
DE19630323C1 (de) * 1996-07-26 1997-08-21 Georgios Dr Pandalis Verwendung von Queller zur Behandlung oder Prophylaxe von Jodmangelerscheinungen
CN1242991A (zh) * 1998-07-24 2000-02-02 张发誉 誉核舒康平
CN1354972A (zh) * 2000-11-23 2002-06-26 北京赛利海蓬科技发展中心 洋海蓬子在中国沿海滩涂地种植,培育和灌溉方法
CN1158912C (zh) * 2001-07-17 2004-07-28 阮其惠 海蓬子栽培种植方法
KR20020003173A (ko) * 2001-12-01 2002-01-10 최재승 식물성 천연 칼슘 생성(生成)방법
US6929809B2 (en) * 2002-03-26 2005-08-16 Council Of Scientific And Industrial Research Preparation of nutrient rich salt of plant origin
JP4327727B2 (ja) * 2002-10-16 2009-09-09 ジョンギル イ アッケシソウ抽出物を含むミエロイド系白血病治療及び免疫増強用組成物
KR20030036464A (ko) * 2003-04-08 2003-05-09 장홍선 간청소 복용순서와 제조방법
ATE401905T1 (de) * 2003-08-29 2008-08-15 Council Scient Ind Res Pflanzenextrakte aus salicornia spezies, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung gegen tuberkulose
US20050186291A1 (en) * 2003-08-29 2005-08-25 Council Of Scientific And Industrial Research Herbal extracts of salicornia species, process of preparation thereof, use thereof against tuberculosis
AU2005247206B2 (en) 2004-05-27 2009-05-07 Council Of Scientific And Industrial Research Enhancement of antitubercular activity of extracts of salicornia brachiata

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105147746A (zh) * 2015-10-08 2015-12-16 盐城工学院 一种海蓬子提取物的用途

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