CN101528926A - 过表达reg4或kiaa0101的癌症的治疗或预防 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抑制癌细胞生长的方法，其是通过将细胞与抑制REG4或KIAA0101表达的siRNA的组合物接触。本发明还包括治疗癌症的方法。本发明还提供可用于所提供的方法中的产品，包括核酸序列和载体以及包含它们的组合物。本发明还提供通过抑制REG4基因来抑制肿瘤细胞的方法，所述肿瘤细胞例如胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞和膀胱癌细胞，尤其是胰腺导管腺癌(PDAC)。本发明还涉及治疗或预防受试者中PDAC的方法，包括向所述受试者施用药学有效量的与REG4编码蛋白质结合的抗体或其片段的步骤。本发明还涉及诊断癌症的化放疗抗性的方法。本发明还提供使用所述多肽治疗癌症的治疗作用剂或方法。本发明的多肽由这样的氨基酸序列组成，该氨基酸序列包括含有QKGIGEFF/SEQ ID NO：21的多肽。可以通过用转染剂如多聚精氨酸修饰将本发明的多肽导入癌细胞。

Description

过表达REG4或KIAA0101的癌症的治疗或预防

本申请要求2006年8月18日提交的美国临时申请第60/838,649号和2006年8月18日提交的美国临时申请第60/838,749号的权益，本文通过提述将其全部公开内容纳入本文用于所有目的。

技术领域

本发明涉及生物科学领域，更具体地涉及癌症研究领域。具体而言，本发明还涉及治疗和预防癌症的方法，例如胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌。具体而言，本发明涉及一种组合物，其包含能够抑制编码REG4和KIAA0101的基因表达的核酸。在一些实施方案中，所述化合物是对应于这些基因的亚序列的小干扰RNA(siRNA)。

另一方面，本发明还涉及治疗或预防受试者体内的胰腺癌，特别是胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma)(PDAC)的方法，该方法包括向所述受试者施用药学有效量的与REG4编码蛋白结合的抗体或其片段的步骤。另外，本发明涉及一种组合物，其包含抑制KIAA0101与PCNA的相互作用的肽。在一些实施方案中，所述化合物是具有保守的PCNA结合基序(PIP框)的细胞透过性显性失活肽(cell-permeable dominant-negative peptide)。

背景技术

胰腺导管腺癌(PDAC)是西方社会中第四大癌症死亡的原因，在常见的恶性肿瘤中其致死率最高，5年存活率仅为4％(DiMagno EP等，Gastroenterology 1999；117：1464-84.；Wray CJ等，Gastroenterology 2005；128：1626-41.)。在2006年，据估计在美国诊断出约33,730例患有胰腺癌的新病例，并且他们中的32,300位很有可能死于这种疾病(Jemal A等，Cancerstatistics，2006.CA Cancer J Clin 2006；56：106-130.)。由于大多数PDAC患者是在晚期被诊断出来，目前没有有效的治疗可以用来治愈该疾病。几种方法将手术与化疗(包括5-FU或吉西他滨(gemcitabine))结合，再结合或不结合放疗，能够改善患者的生活质量(DiMagno EP等，Gastroenterology 1999；117：1464-84.；Wray CJ等，Gastroenterology 2005；128：1626-41.)，但是这些治疗对PDAC患者的长期生存的效果非常有限，因为该疾病极具侵略性并且具有化疗抗性。

造成PDAC的预后极差的原因有很多，包括早期检出PDAC的困难性(DiMagno EP等，Gastroenterology 1999；117：1464-84.；Wray CJ等，Gastroenterology 2005；128：1626-41.)。尽管在诊断成像技术例如超声内镜(“EUS”)或磁共振胰胆管镜检查(“MRCP”)中取得了进步(DiMagno EP等，Gastroenterology 1999；117：1464-84.，Wray CJ等，Gastroenterology 2005；128：1626-41.)，但是大多数患者不会接受成像程序，因为他们在达到疾病的晚期之前没有任何症状。一种精确而简便的血清学测试如用于前列腺癌的PSA(前列腺特异性抗原)能够辅助早期PDAC的检测，并且能够应用于PDAC的普查(mass-screening)。早期PDAC的手术切除能够产生相对较好的预后，如50-60％的5年存活率(Wray CJ等，Gastroenterology 2005；128：1626-41.)。因此，考虑到PDAC的生物学侵略性和对化疗的抗性，改善这种致死疾病预后最现实的策略之一是通过非侵入性血清学测试筛查早期PDAC。

目前，CA19-9是唯一可商购的用于PDAC的血清学标志，但是其远非理想的肿瘤标志，因为(i)约10-15％的个体由于他们的路易斯抗原状态(Lewisantigen status)而不分泌CA19-9，(ii)CA19-9对于胰腺癌没有特异性，在良性状态下也有升高，和(iii)其在早期患者体内通常处于正常范围内(Sawabu N等，Pancreas 2004；28：263-7.；Pleskow DK等，Ann Intern Med 1989；110：704-9.)。因此，亟需通过开发对PDAC更具特异性且更敏感的新肿瘤标志来建立筛查策略。

已有报道称REG4是REG家族的一个新成员(Hartupee JC等，BiochimBiophys Acta 2001；1518：287-93.)，并且是PDAC的肿瘤标志。属于REG(再生胰岛衍生(regenerating islet-derived))家族的分子是在组织再生和消化器炎症中发挥功能的分泌性蛋白(Hartupee JC等，Biochim Biophys Acta 2001；1518：287-93.，Watanabe T等，J Biol Chem 1990；265：7432-9.，Uno M等，Adv Exp Med Biol 1992；321：61-6.)。据报道成员们的表达水平在几种胃肠癌中有所上调，并且在癌症中作为营养因子或抗凋亡因子发挥功能(Unno M等，Adv Exp Med Biol 1992；321：61-6.；SekikawaA等，Gastroenterology 2005；128：642-53.)。

cDNA微阵列技术使得从业者能够获得正常细胞和恶性细胞中基因表达的综合概貌，并且将恶性细胞中的基因表达与相应正常细胞中的进行比较(Okabe等，(2001)Cancer Res 61：2129-37；Kitahara等，(2001)Cancer Res 61：3544-9；Lin等，(2002)Oncogene 21：4120-8；Hasegawa等，(2002)Cancer Res62：7012-7)。这种方法能够揭示癌细胞的复杂特性，并帮助理解致癌作用的机制。鉴定肿瘤中下调的基因将使对个体癌症诊断更加准确和精确，并致使开发出新的治疗靶标(Bienz和Clevers，(2000)Cell 103：311-20)。

例如，近几年，临床试验中尝试了一种使用基因特异性siRNA的新癌症疗法(Bumcrot D等，Nat Chem Biol 2006Dec，2(12)：711-9)。RNAi似乎已经在主流技术平台上取得了一席之地(Putral LN等，Drug News Perspect 2006Jul-Aug，19(6)：317-24；Frantz S，Nat Rev Drug Discov 2006Jul，5(7)：528-9；Dykxhoorn DM等，Gene Ther 2006 Mar，13(6)：541-52)。尽管如此，在RNAi用于临床应用之前，还需要面对多种挑战。这些挑战包括克服RNA的较差的体内稳定性(Hall AH等，Nucleic Acids Res 2004 Nov 15，32(20)：5991-6000，Print 2004；Amarzguioui M等，Nucleic Acids Res 2003 Jan 15，31(2)：589-95)，降低作为作用剂的毒性(Frantz S，Nat Rev Drug Discov 2006 Jul，5(7)：28-9)，以及选择合适的递送模式、所用siRNA和shRNA的确切序列和细胞类型特异性。众所周知的事实是，非特异性沉默可能存在相关的毒性，其原因包括部分同源性，或因诱导双链分子的产生而诱导干扰素应答(Judge AD等，NatBiotechnol 2005 Apr，23(4)：457-62，Epub 2005 Mar 20；Jackson AL&LinsleyPS，Trends Genet 2004Nov，20(11)：521-4)。所以，必须对靶向癌特异性基因的双链分子加以改进以消除副作用。

早些时候，本发明人使用由大约27000个基因组成的基因组范围cDNA微阵列，结合纯化癌细胞群体的激光显微解剖，对胰腺癌进行了详细且精确的表达图谱分析(Nakamura等，(2004)Oncogene，23：2385-400)。在本发明人鉴定为在胰腺癌细胞中被反式激活的基因中，本发明人在本文聚焦于作为癌症治疗分子靶标的KIAA0101(WO2004/031412)。

PCNA(增殖细胞核抗原)对于DNA复制和DNA修复，以及通过与几种细胞周期蛋白相互作用来影响细胞周期的推进是关键的(Prelich等，(1987)Nature，326：471-5；Wyman和Botchan(1995)Curr Biol，5：334-7；Warbrick等，(2000)Bioessays，22：997-1006)。晶体结构显示PCNA是一种环形同源三聚体蛋白，发挥DNA合成或代谢中涉及的DNA蛋白(例如DNA聚合酶和DNA连接酶等)的募集所必需的夹板(clamping platform)功能(Krishna等，(1994)Cell，79：1233-43)。PCNA与多种DNA复制/修复酶相互作用，数种蛋白质具有保守的PCNA结合基序(PIP框，QXXL/I/MXXF/Y)，通过该基序与PCNA相互作用(Jonsson等，(1998)EMBO J，17：2412-25)。PCNA的过表达是细胞增殖的标志，在临床上，PCNA是一种通用的增殖标志，特别是在肿瘤发育的预后中，Ki67/MIB-1也是如此(Haitel等，(1997)Am J Clin Pathol，107：229-35)。

KIA0101先前通过酵母双杂交筛选(Yu等，(2001)Oncogene 20：484-9)被鉴定为与PCNA蛋白结合的p15PAF(PCNA相关因子)，其具有保守PIP框，能够通过该保守PIP框与PCNA相互作用。然而，它的功能尚未知，而KIAA0101-PCNA相互作用为何能够参与细胞增殖或癌症发展也仍是个谜(Yu等，(2001)Oncogene，20：484-9；Simpson等，(2006)Exp Cell Res.312：73-85)。

发明概述

在本文中，本发明人基于全基因组cDNA微阵列分析以及RT-PCR和免疫组织化学分析，报道了REG4(REG家族的一个新成员)和/或KIAA0101在癌细胞中(例如，在PDAC细胞中)的过表达。另外，本发明人发现，用siRNA敲低癌症(例如，PDAC)细胞系中内源REG4和/或KIAA0101的表达导致了细胞生存力的剧烈降低。类似地，向培养基添加重组REG4和/或KIAA0101以剂量依赖的方式增强了癌症(例如，PDAC)细胞系的生长。抗REG4和/或KIAA0101的单克隆抗体可中和生长促进效果，并显著削弱了癌症(例如，PDAC细胞)的生长。这些发现暗示REG4和KIA0101对于筛选早期癌症(包括PDAC)是有希望的肿瘤标志，而中和REG4和/或KIAA0101，例如通过使用抗体、抑制性多肽或抑制性多核苷酸(例如，siRNA)来中和，可用来有效地预防或治疗由REG4和/或KIAA0101的异常(即，异常高)过表达和/或胞内信号传导所介导的癌症(包括PDAC)。

本发明的一个目的是提供可用于治疗和/或预防由REG4和/或KIAA0101的异常(即，异常高)过表达和/或胞内信号传导所介导的癌症的化合物。另一方面，本发明的一个目的是提供药物组合物和方法，其用于使用所述化合物来治疗和/或预防这样的癌症，例如，胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌或膀胱癌。

本发明人确认，对REG4或KIAA0101表达的抑制，例如使用siRNA，能够实现对癌症增殖的抑制。因此，本发明的一个目的是提供治疗或预防受试者体内胰腺癌的方法，包括向所述受试者施用包含抑制REG4表达的小干扰RNA(siRNA)的组合物。在进一步的实施方案中，本发明提供用于治疗或预防受试者体内由异常的(即，异常高的)KIAA0101过表达和/或胞内信号传导所介导的癌症的方法，所述癌症例如胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌或膀胱癌，该方法包括向所述受试者施用包含抑制KIAA0101表达的siRNA的组合物。

本发明还提供一种用于治疗或预防胰腺癌的药物组合物，其包含作为活性成分的药学有效量的抑制REG4表达的小干扰RNA(siRNA)，和药学可接受载体。本发明进一步提供药物组合物，其用于治疗或预防由异常的(即，异常偏高的)KIAA0101过表达和/或胞内信号转导所介导的癌症，例如胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌或膀胱癌，所述组合物包含作为活性成分的药学有效量的抑制KIAA0101表达的siRNA，和药学可接受载体。

本发明进一步提供抑制REG4表达的小干扰RNA(siRNA)用于制备治疗或预防胰腺癌的药物组合物的用途，和抑制KIAA0101表达的小干扰RNA(siRNA)用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗或预防由异常的(即，异常偏高的)KIAA0101过表达和/或胞内信号转导所介导的癌症，例如胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌或膀胱癌。在一些实施方案中，优选的siRNA包含作为靶序列的SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：32的核苷酸序列。

本发明涉及包含有义链和反义链的双链分子，其中所述有义链包含对应于靶序列SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：32的核糖核苷酸序列，并且其中所述反义链包含与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义链和所述反义链相互杂交形成所述双链分子，并且其中所述双链分子在被导入表达REG4基因或KIAA0101基因的细胞中时抑制所述基因的表达。

此外，确认了REG4作为自分泌或旁分泌生长因子发挥功能，介导Akt信号传导途径。另外，本发明人发现抗REG4抗体可中和REG4的细胞增殖活性，从而减弱胰腺癌细胞的生长。

因此，本发明的一个目的是提供一种治疗或预防受试者体内胰腺癌的方法，该方法包括向所述受试者施用中和REG4活性的抗REG4抗体或其片段。本发明还提供一种用于治疗或预防胰腺癌的药物组合物，所述组合物包含作为活性成分的药学有效量的中和REG4活性的抗REG4抗体或其片段，和药学可接受载体。本发明进一步提供中和REG4活性的抗REG4抗体或其片段用于制备治疗或预防胰腺癌的药物组合物的用途。在一些实施方案中，优选的抗REG4抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗REG4抗体包含VH链和VL链，每条VH链和VL链包含由框架氨基酸序列隔开的称为CDR1、CDR2和CDR3的多个CDR氨基酸序列，各条VH链和VL链中各CDR的氨基酸序列为：

VH CDR1：SYWMH(SEQ ID NO：20)，

VH CDR2：NIYPGSGSTNYD(SEQ ID NO：21)，

VH CDR3：GGLWLRVDY(SEQ ID NO：22)，

VL CDR1：SASSSVSYMH(SEQ ID NO：23)，

VL CDR2：DTSKLAS(SEQ ID NO：24)，和

VL CDR3：QQWSSNPF(SEQ ID NO：25)。

本发明还涉及治疗和/或预防胰腺癌的方法，其包括施用抗体的步骤，所述抗体包含VH链和VL链，每条VH链和VL链包含由框架氨基酸序列隔开的称为CDR1、CDR2和CDR3的多个CDR氨基酸序列，VH链和VL链中各CDR的氨基酸序列为：

VH CDR1：SYWMH(SEQ ID NO：20)，

VH CDR2：NIYPGSGSTNYD(SEQ ID NO：21)，

VH CDR3：GGLWLRVDY(SEQ ID NO：22)，

VL CDR1：SASSSVSYMH(SEQ ID NO：23)，

VL CDR2：DTSKLAS(SEQ ID NO：24)，和

VL CDR3：QQWSSNPF(SEQ ID NO：25)。

此外，本发明提供包含QKGIGEFF(SEQ ID NO：46)的抑制性多肽。在一些优选实施方案中，所述氨基酸序列是VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK(SEQ ID NO.44)或TPKWQKGIGEFFRLSP(SEQ ID NO.45)。本发明进一步提供使用这些抑制性多肽来预防和/或治疗癌症的药物或方法。

本发明还涉及治疗和/或预防癌症的方法，该方法包括施用包含QKGIGEFF(SEQ ID NO：46)的抑制性多肽或编码该抑制性多肽的多核苷酸的步骤，所述抑制性多肽例如至少具有氨基酸序列VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK(SEQ ID NO：44)或TPKWQKGIGEFFRLSP(SEQ ID NO.45)的片段的抑制性多肽。另外，本发明涉及本发明的多肽或编码该多肽的核苷酸在制备治疗和/或预防癌症的药物制剂中的用途。

当结合附图及实施例阅读以下详细说明时，本发明的这些目的和特性以及其它目的和特性将变得更加显而易见。然而，应该理解的是，本发明在前文的概述和在下文的详述均为优选的实施方案，而非对本发明或其它本发明的可选实施方案的限制。

附图简述

图1.PDAC细胞中的REG4mRNA和蛋白质表达水平。(A)REG4和TUBA(作为定量对照)的RT-PCR分析，将显微解剖的PDAC细胞中的REG4和TUBA(泳道1-9)与同样显微解剖的正常胰腺导管上皮细胞(NPD)、正常的胰和正常生命器官包括心、肺、肝、肾和脑中的REG4和TUBA进行比较。(B，C，D)在使用抗REG4抗体的免疫组织化学研究中，在PDAC细胞中观察到了强染色。观察到胞质颗粒的REG4阳性染色(B)，说明REG4的分泌，并在细胞质膜处观察到REG4的阳性染色(C)。在正常胰腺组织中，腺泡细胞表现出非常微弱的染色，但在正常导管上皮细胞和胰岛细胞中则没有(D)。

图2.通过siRNA敲低REG4的表达引起胰腺癌细胞生长的减弱。(A)通过半定量RT-PCR验证敲低对REG4转录物的影响，其中RT-PCR使用针对REG4的siRNA表达载体(REG4-si2)和阴性对照载体(siEGFP)转染的细胞。使用β2-MG定量RNA。REG4-si2显示出强敲低效果，而EGFPsi未显示任何对REG4转录物水平的影响。(B，C)，将REG4-si2载体转染入SUIT-2导致通过MTT测定法测量的活细胞数(B)和集落形成数(C)的剧烈减少，而与之相比，使用EGFPsi载体转染的细胞未显示任何REG4敲低效果。柱，与遗传霉素(Geneticin)一起温育7日之后，来自三个实验的吸光度平均值；短线，标准差。^*p＜0.01(斯氏t检验)，MTT测定法(B)。

图3.rhREG4对PDAC细胞的生长促进作用。(A)生物活性rhREG4蛋白由哺乳动物细胞(FreeStyle^TM 293)产生。通过SDS-PAGE纯化并分析rhREG4，其后用考马斯(Coomassie)染色(左图)并且使用REG4特异性的抗体进行Western印迹(右图)。(B)将PK-45P细胞与添加了1％FBS的0、0.1、1和10nMrhREG4一起温育。rhREG4处理以剂量依赖的方式刺激了PK-45P细胞的细胞增殖。数据点，三次实验的吸光度与第0天样品相比的平均比值；短线，标准差。^*p＜0.01(斯氏t检验)。(C)用0、0.1、1和10nM rhREG4处理PK-45P细胞使Akt(Ser473)的磷酸化以剂量依赖的方式提高。使用对磷酸化的Akt(Ser473)有特异性的抗体通过Western印迹检测磷酸化的Akt，并且用抗Akt的抗体对印迹进行再次探测(reprobe)以评估Akt的总水平。

图4.抗REG4单克隆抗体的中和及生长抑制作用。(A)使用SUIT-2培养基的免疫沉淀，再使用抗REG4pAb的Western印迹，评估了抗REG4抗体的结合亲和力。抗REG4mAb和pAb以高亲和力从SUIT-2培养基免疫沉淀REG4。(B)抗REG4mAb处理抵消了rhREG4的生长促进作用。在存在或缺乏抗REG4mAb的条件下用10nM rhREG4刺激PK-45P。柱，来自三次实验的吸光度与(-)培养基中生长的样品相比的平均比值；短线，标准差。^*p＜0.01(斯氏t检验)。(C)多种浓度的抗REG4mAb对SUIT-2(REG4阳性)和MIAPaCa-2(REG4阴性)生长的影响。将每一种细胞系在多种浓度抗REG4mAb的存在下温育。抗REG4mAb处理以剂量依赖的方式抑制了SUIT-2细胞生长，但是其完全不影响不表达REG4的MIAPaCa-2的细胞生长。数据点，来自三个实验的吸光度与(-)培养基中生长的样品相比的平均比例；短线，标准差。^*p＜0.01(斯氏t检验)。(D)抗REG4mAb处理抵消了由rhREG4刺激产生的Akt磷酸化。在存在或缺乏抗REG4mAb的条件下用10nMrhREG4处理PK-45P细胞。通过使用对磷酸化的Akt(Ser473)特异性的抗体进行Western印迹来评估Akt的磷酸化，再用抗Akt的抗体再次探测所述印迹以评估Akt的总水平。1，未经刺激的；2，10nM rhREG4；3，10nM rhREG4+抗REG4mAb。

图5.抗REG4抗体处理抑制体内胰腺癌细胞生长。(A)将肿瘤接种至裸鼠中，在使用抗REG4抗体(34-1mAb；n＝8)每周两次(300μg/小鼠，腹膜内)的处理过程中或使用对照抗体(正常小鼠IgG；n＝9)的处理过程中评估肿瘤体积。34-1mAb处理(以实心圆形标志和粗线表示)与对照IgG相比引起了肿瘤体积的显著降低(P＝0.0598)。(B)在用抗REG4抗体(34-1mAb)或对照抗体第一次处理之后第30天称量肿瘤。34-1mAb(以黑色框显示)处理与对照抗体相比引起了肿瘤重量的显著降低(P＝0.0489)。

图6.REG4过表达对胰腺癌γ射线抗性的贡献。(A)将pCAGGSnHC-REG4-HA转染至不表达REG4的胰腺癌细胞系PK-45P中。在选择了遗传霉素抗性细胞之后，通过Western印迹法检查细胞系的重组REG4表达。(B)预温育48小时之后，使用60Co源以1、5、10或30Gy对表达REG4的克隆(C1-6、C2-6和C10)或对照克隆(M1、M3和M6)进行γ照射。48小时之后，使用细胞计数测量活细胞，评估了吸光度-(各个照射)/吸光度-(未照射)的相对比例。(C)在0、1或5Gy γ照射之后，通过使用流式细胞仪检测亚G1(sub-G1)部分来评估γ射线诱导的凋亡。

图7.REG4过表达对胰腺癌的吉西他滨抗性的贡献。(A)预温育48小时之后，将表达REG4的克隆(C1-6、C2-6、C10)或对照克隆(M1、M3、M6)用0.1-100,000nM吉西他滨处理48小时。温育之后，通过使用细胞计数测量活细胞，并且评估了吸光度-(各个处理)/吸光度-(未处理对照)的相对比例。(B)在10nM或50nM吉西他滨处理48小时之后，通过使用流式细胞仪检测亚G1部分来评估凋亡。

图8.接受新CRT(neo-CRT)的胰腺腺癌样本中REG4的免疫染色。(A)，(B)响应于新辅助化放疗(neo-CRT)的胰腺腺癌样本显示了REG4的低表达或无表达。(C)，(D)不响应于肿瘤CRT的胰腺腺癌样本显示了REG4的强表达。

图9.胰腺癌细胞中KIAA0101的过表达结果。(A)半定量RT-PCR验证了与同为显微解剖的胰腺导管细胞和正常胰腺组织相比，KIAA0101表达在显微解剖的胰腺癌细胞中被上调。以TUBA的表达充当定量对照。(B)Northern印迹分析显示了胰腺癌细胞系中KIAA0101的强表达(泳道1-6)，而在包括心、肺、肝、肾和脑的生命器官中未观察到表达(泳道7-11)。(C)使用抗KIAA0101抗体的免疫组织化学研究。在胰腺癌细胞的细胞核中观察到了强染色(箭头x400)，而在正常胰腺组织中的腺泡细胞和正常导管上皮未显示染色。

图10.通过siRNAs敲低KIAA0101对胰腺癌细胞生长的影响结果。(A)将对KIAA0101转录物有特异性的两种siRNA表达载体(#759si)和作为阴性对照的EGFP siRNA表达载体(EGFPsi)转染至KLM-1细胞中。通过RT-PCR验证对KIAA0101转录物的敲低作用，以β2MG表达作为定量对照。使用#759si的转染显示了强敲低效果，而EGFPsi未显示任何对KIAA0101转录物水平的影响。(B)与使用未显示KIAA0101敲低作用的siRNA表达载体转染的细胞相比，使用#759si载体的转染导致通过集落形成数测得的活细胞数的剧烈下降。(C)使用#759si载体的转染导致通过MTT测定法测得的活细胞数的剧烈下降。MTT测定法Y轴上的ABS表示使用微量培养板读数器测量的在490nm的吸光度，并且以630nm作为参照。

图11.用KIAA0101的外源过表达促进癌细胞和转化NIH3T3的生长的结果。(A)对组成性表达外源KIAA0101的六种PK-45P衍生细胞(克隆1-6)和使用模拟载体(mock vector)(模拟1-4)转染的那些细胞的Western印迹分析。用抗HA标签抗体验证了外源导入的KIAA0101表达。以ACTB充当加样对照。(B)MTT测定的生长测量值说明六种KIAA0101克隆(1-6，实线)的生长与两种模拟克隆相比(1-4，虚线)显然更加迅速。X轴和Y轴代表接种之后的日期点和相对生长速率，其中相对生长速率以该直径的吸光度计算，通过与作为对照的第1天吸光度值比较。为每个平均值绘有代表标准差的误差棒。这些实验(experience)全部以一式三份进行。(C)自不表达内源KIAA0101小鼠同源物的NIH3T3建立了三种KIAA0101过表达克隆和三种模拟克隆。将三种KIAA0101过表达的NIH3T3克隆(1-3)和模拟NIH3T3克隆分别接种至8周龄裸鼠的右胁和左胁中。四周之后，仅KIAA0101过表达的NIH3T3细胞在裸鼠的右胁形成了团块(mass)。(D)通过抗KIAA0101抗体对各个肿瘤进行免疫染色，显示了外源KIAA0101的表达。

图12.KIAA0101蛋白与几种DNA复制蛋白相关。(A)与对照样品相比，在SDS-PAGE凝胶上分离后银染色的免疫沉淀级分显示，几种蛋白质与KIAA0101蛋白一起从癌细胞裂解物中被免疫沉淀。在凝胶内用胰蛋白酶消化之后，通过MALDI-TOF系统分析每个差别条带(differential band)；将它们鉴定为PCNA、POLD1(聚合酶δp125亚基)和FEN1(瓣状内切核酸酶(flapnuclease)-1)。(B)这些相互作用通过免疫沉淀实验得到了确认。所有这些蛋白质均涉及DNA复制，POLD1和FEN1还与PCNA以及KIAA0101结合。

图13.细胞透过性显性失活肽抑制KIAA0101和PCNA间相互作用。(A)设计了含有PIP框({q}KG{i}GE{ff}/SEQ ID NO：21的括号中所示)的两种显性失活肽(PIP20、PIP16)，及其突变肽(PIP20mt、PIP16mt)，所述突变肽中的PIP框保守残基被丙氨酸替代({a}KG{a}GE{aa}/SEQ ID NO：37的括号中所示)，并且将它们与精氨酸(R)重复序列缀合以促进细胞透过性。(B)体外研究，免疫沉淀验证了PIP20处理对PCNA和KIAA0101间相互作用的抑制，但是PIP20mt和乱序肽(scramble peptides)不影响PCNA和KIAA0101间的相互作用。(C)PIP20处理以依赖于剂量的方式抑制了表达KIAA0101的KIAA0101细胞生长。另一方面，PIP20不影响不表达人KIAA0101同源物的小鼠正常细胞系NIH3T3细胞的生长。(D)通过缺失N末端和C末端的四个残基而保留PIP框基序设计了短PIP肽(PIP16和PIP16mt)，PIP16处理强烈抑制了癌细胞生长，然而，PIP16也影响NIH3T3生长。

优选实施方案详述

小干扰RNA：

本发明部分基于一个令人惊讶的发现，即抑制REG4和/或KIAA0101的表达可有效抑制多种癌细胞的细胞生长，包括胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌中涉及的那些细胞。具体而言，惊讶地发现了通过抑制REG4基因能够预防或抑制PDAC。本申请中描述的发明部分基于这些发现。

本发明提供用于抑制细胞生长的方法。在提供的方法中，包括使细胞与包含抑制REG4或KIAA0101表达(即，转录或翻译)的小干扰RNA(siRNA)的组合物接触的那些方法。本发明还提供用于抑制受试者体内肿瘤细胞生长的方法。这样的方法包括向受试者施用包含小干扰RNA(siRNA)的组合物，所述小干扰RNA与来自REG4或KIAA0101的序列特异性杂交。本发明的另一个方面提供用于抑制生物样品的细胞中REG4基因或KIAA0101基因表达的方法。

所述基因的表达可以通过将双链核糖核酸(RNA)分子以足以抑制REG4基因或KIAA0101基因表达的量导入细胞来抑制。本发明的另一个方面涉及包括核酸序列和载体的产品，还涉及包含它们的组合物，它们可以用于例如上文提供的方法中。所述提供的产品包括具有以下特性的siRNA分子，即当被导入表达REG4基因或KIAA0101基因的细胞中时，该siRNA分子抑制所述基因的表达。这样的分子包括包含有义链和反义链的那些分子，其中所述有义链包含对应于REG4或KIAA0101靶序列的核糖核苷酸序列，并且其中所述反义链包含与所述有义链互补的核糖核苷酸序列。所述分子的有义链和反义链相互杂交形成双链分子。

如用于本文，术语“生物”或者“生物体”指任何由至少一个细胞组成的活的实体。活生物体可以像例如单个真核细胞那样简单，或者像哺乳动物包括人类那样复杂。

如用于本文，术语“生物样品”指完整的生物或它的组织、细胞或组成部分(例如体液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑膜液、脑脊髓液、唾液、羊膜液、羊膜脐带血、尿、阴道液和精液)的亚群(subset)。“生物样品”还涉及自完整生物或它的细胞、组织或组成部分的亚群制备的匀浆、裂解物、提取物、细胞培养物或组织培养物，或它们的级分或部分。最后，“生物样品”涉及培养基，例如已有生物在其中繁殖的营养肉汤或凝胶，其包含细胞成分，例如蛋白质或核酸分子。

本发明描述了抑制细胞生长的方法。细胞生长可以通过将细胞与REG4或KIAA0101的小干扰RNA(siRNA)的组合物接触来抑制。可以进一步将细胞与转染增强剂(transfection-enhancing agent)接触。细胞可以在体外，在体内，或回体(ex vivo)提供。受试者可以是哺乳动物，例如，人、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马或牛(cow)。所述细胞可以是胰腺导管细胞。或者，所述细胞可以是肿瘤细胞(即，癌细胞(cancer cell))，例如，癌瘤细胞(carcinomacell)或腺癌细胞。例如，所述细胞可以是胰腺癌细胞，特别是胰腺导管腺癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞或膀胱癌细胞。“抑制细胞生长”的意思是经过处理的细胞与未经处理的细胞相比增殖速率较低或者具有降低的生存力。细胞生长是通过本领域已知的增殖测定法测量的。

除非另有具体说明，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文可以互换使用，并且通过它们公认的单字母编码来描述。该术语适用于其中的一个或多个核酸通过酯键键合连接的核酸(核苷酸)多聚体。多核苷酸或寡核苷酸可以由DNA、RNA或它们的组合所构成。

如用于本文，术语“双链分子”指抑制靶基因表达的核酸分子，包括，例如，短干扰RNA(siRNA；例如，双链核糖核酸(dsRNA)或小发夹RNA(shRNA))和短干扰DNA/RNA(siD/R-NA；例如DNA和RNA的双链嵌合体(dsD/R-NA)或DNA和RNA的小发夹嵌合体(shD/R-NA))。

术语“siRNA”的意思是阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。使用将siRNA导入细胞的标准技术，包括其中DNA是模板、RNA由该模板转录的那些方法。siRNA包括有义REG4或KIAA0101核酸序列，和/或反义REG4或KIAA0101核酸序列。siRNA可以包含两个互补分子，或者可以这样构建，使单一转录物同时具有来自靶基因的有义序列和互补的反义序列，例如，发夹，其在一些实施方案中导致微小RNA(miRNA)的产生。siRNA可以是dsRNA或shRNA。

如用于本文，术语“dsRNA”指两个RNA分子的构建体，这两个RNA分子包含彼此互补的序列，并且藉由所述互补序列在一起退火形成双链RNA分子。两条链的核苷酸序列不仅可以包含选自靶基因序列的蛋白编码序列的“有义”或“反义”RNA，还可以包含具有选自靶基因非编码区的核苷酸序列的RNA分子。

术语“shRNA”如用于本文指具有茎环结构的siRNA，其包含彼此互补的第一区和第二区，即有义链和反义链。两个区的互补程度和方向足以使两个区之间发生碱基配对，所述第一区和第二区通过环区连接在一起，所述环是因为在环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而产生的。shRNA的环区是介于有义链和反义链之间的单链区，也可以称作“间插单链(intervening single-strand)”。

如用于本文，术语“siD/R-NA”指由RNA和DNA二者组成的双链多核苷酸分子，包括RNA和DNA的杂合体和嵌合体，其阻止靶mRNA的翻译。这里，杂合体表示这样的分子，其中由DNA组成的多核苷酸和由RNA组成的多核苷酸相互杂交形成双链分子；而嵌合体表示组成所述双链分子的链中的一条或两条可以含有RNA和DNA。可以使用将siD/R-NA导入细胞的标准技术。siD/R-NA包括CX有义核酸序列(也称为“有义链”)和/或CX反义核酸序列(也称作“反义链”)。siD/R-NA可以这样构建，使单个转录物同时具有来自靶基因的有义核酸序列和互补反义核酸序列，例如发夹。siD/R-NA可以是dsD/R-NA或shD/R-NA。

如用于本文，术语“dsD/R-NA”指两个分子的构建体，所述两个分子包含彼此互补的序列并且已经藉由所述互补序列退火在一起形成双链多核苷酸分子。两条链的核苷酸序列可以不仅仅包含选自靶基因序列的蛋白编码序列的“有义”或“反义”多核苷酸序列，还可以包含具有选自靶基因非编码区的核苷酸序列的多核苷酸。构成dsD/R-NA的两个分子中的一个或两个由RNA和DNA二者组成(嵌合分子)，或者一个分子由RNA组成而另一个由DNA组成(杂合双链)。

术语“shD/R-NA”如用于本文指具有茎环结构的siD/R-NA，其包含彼此互补的第一区和第二区，即有义链和反义链。所述区的互补程度和方向足以使它们之间发生碱基配对，第一区和第二区通过环区连接，所述环是因为在环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而产生的。shD/R-NA的环区是介于有义链和反义链之间的单链区，也可以称作“间插单链”。

使用所述方法来改变REG4或KIAA0101被异常上调(例如，作为细胞恶变的结果)的细胞中的基因表达。siRNA与靶细胞中REG4或KIAA0101转录物的结合导致细胞生成的REG4或KIAA0101的减少。寡核苷酸的长度是至少约10个核苷酸，并且可以与天然存在的REG4或KIAA0101转录物一样长。优选地，所述寡核苷酸的长度小于约75、约50或者约25个核苷酸。最优选地，所述寡核苷酸的长度是约19至约25个核苷酸。在哺乳动物细胞中抑制REG4或KIAA0101表达的REG4或KIAA0101的siRNA寡核苷酸的实例包括含有靶序列的寡核苷酸，例如分别含有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：32的核苷酸的寡核苷酸。

用于设计能够抑制靶细胞中基因表达的双链RNA的方法是已知的。(参见例如，美国专利No.6,506,559，将其全部内容通过引用并入本文)。例如，用于设计siRNA的计算机程序可以从Ambion网站(www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)获得。可以从Ambion，Inc.获得的计算机程序是基于以下方案来选择用于siRNA合成的核苷酸序列的。

siRNA靶位点的选择

1.从转录物的AUG起始密码子开始，向下游扫描AA二核苷酸序列。记录每次AA的出现并将3′相邻的19个核苷酸作为潜在的siRNA靶位点。Tuschl等，Genes Dev 13(24)：3191-7(1999)不推荐针对5′和3′非翻译区(UTRs)以及起始密码子附近区域(75个碱基之内)设计siRNA，因为这些区域可能富含调节蛋白结合位点。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可能干扰siRNA内切核酸酶复合物的结合。

2.将所述潜在靶位点与适当的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)比较，从考虑的对象中排除任何与其它编码序列具有显著同源性的靶序列。建议使用BLAST，其能够在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/的NCBI服务器上访问。

3.选择合格的靶序列进行合成。通常沿着基因的长度选择数个靶序列来评估。

本发明还包括分离的核酸分子，其包括靶序列的核酸序列，例如SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：32的核苷酸，或与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：32的核苷酸的核酸序列互补的核酸分子。如用于本文，“分离的核酸”是这样的核酸，它离开了它的原始环境(例如天然环境，若该核酸为天然存在的)，并且因此人为地改变了(synthetically altered from)其天然状态。在本发明中，分离的核酸包括DNA、RNA和它们的衍生物。当分离的核酸是RNA或其衍生物时，核苷酸序列中的碱基“t”应该用“u”代替。

如用于本文，术语“互补”指核酸分子的核苷酸单元之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，术语“结合”的意思是两个核酸或两个化合物或两个关联的核酸或两个关联的化合物或它们的组合之间的物理或化学相互作用。当多核苷酸包含修饰的核苷酸和/或非磷酸二酯键时，这些多核苷酸也可以按照相同的方式彼此结合。通常，互补核酸序列在适当的条件下杂交形成含有少数错配或不含错配的稳定双链体。就本发明而言，认为具有5个或更少错配的两个序列是互补的。另外，本发明的分离的核苷酸的有义链和反义链能够通过杂交形成双链核苷酸或发夹环结构。

在优选的实施方案中，这样的双链体的每10个配对含有不多于1个错配。在特别优选的实施方案中，其中双链体的链完全互补，这样的双链体不含错配。对于REG4而言所述核酸分子的长度小于1518个核苷酸，或者对于KIAA0101而言所述核酸分子的长度小于1508个核苷酸。例如，所述核酸分子的长度小于约500、约200或约75个核苷酸。本发明还包括包含一个或多个本文所述的核酸的载体，和包含所述载体的细胞。本发明的分离的核酸可用于针对REG4或KIAA0101的siRNA，或编码所述siRNA的DNA。当将所述核酸用于siRNA或其编码DNA时，优选有义链长于约19个核苷酸，并且更优选长于21个核苷酸。

本发明的双链分子可以包含一个或多个修饰的核苷酸和/或非磷酸二酯键。本领域熟知的化学修饰能够增加所述双链分子的稳定性、可用性和/或细胞对该双链分子的摄取。本领域技术人员将知道本发明分子可包含的其它类型的化学修饰(WO03/070744；WO2005/045037)。在一个实施方案中，修饰可以用于提供更好的抗降解性或更好的摄取。这些修饰的实例包括硫代磷酸酯键、2’-O-甲基核糖核苷酸(特别是在双链分子的有义链上)、2’-脱氧-氟代核糖核苷酸、2’-脱氧-核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、5’-C-甲基核苷酸和反向脱氧脱碱基残基的掺入(inverted deoxyabasic residue incorporation)(US20060122137)。

在另一个实施方案中，修饰可以用于增强双链分子的稳定性或增加寻靶效率。修饰包括双链分子两条互补链之间的化学交联、双链分子一条链的3’或5’末端的化学修饰、糖修饰、核碱基修饰和/或主链修饰、2-氟代修饰的核糖核苷酸和2’-脱氧核糖核苷酸(WO2004/029212)。在另一个实施方案中，修饰可以用于增加或减少针对靶mRNA中和/或互补双链分子的链中的互补核苷酸的亲和力(WO2005/044976)。例如，未修饰的嘧啶核苷酸可以用2-硫代、5-炔基(5-alkynyl)、5-甲基或5-丙炔基(5-propynyl)嘧啶替代。另外，未修饰的嘌呤可以用7-脱氮(7-deza)、7-烷基或7-烯基嘌呤替代。在另一个实施方案中，当双链分子是具有3’突出端的双链分子时，3’-末端核苷酸的突出核苷酸可以由脱氧核糖核苷酸替代(Elbashir SM等，Genes Dev 2001 Jan 15，15(2)：188-200)。关于进一步的细节，可以利用公开文献如US20060234970。本发明不限于这些实例，可以将任何已知化学修饰应用于本发明的双链分子，只要所得分子保留了抑制靶基因表达的能力。

此外，本发明的双链分子可以包含DNA和RNA二者，例如dsD/R-NA或shD/R-NA。具体而言，具有一条DNA链和一条RNA链的杂合多核苷酸，或DNA-RNA嵌合多核苷酸，可表现出提高的稳定性。可以形成DNA和RNA的混合，即，由一条DNA链(多核苷酸)和一条RNA链(多核苷酸)组成的杂合型双链分子，或在任一单链(多核苷酸)或两条单链(多核苷酸)上同时包含DNA和RNA的嵌合型双链分子等，来增强所述双链分子的稳定性。DNA链和RNA链的杂合体可以是这样的杂合体，其中有义链是DNA而反义链是RNA，或者相反，只要在导入表达靶基因的细胞中时，该杂合体具有抑制所述基因表达的活性。优选地，有义链多核苷酸是DNA而反义链多核苷酸是RNA。同样，嵌合型双链分子可以是其中的有义链和反义链均由DNA和RNA组成，或者有义链或反义链中的任一条由DNA和RNA组成，只要在导入表达靶基因的细胞中时，所述双链分子具有抑制该基因表达的活性。

为了增强双链分子的稳定性，所述分子优选包含尽可能多的DNA，而为了诱导对靶基因表达的抑制，所述分子在某个范围内必须是RNA以诱导对表达的充分抑制。嵌合型双链分子的优选实例是双链分子的上游部分区域(即，有义链或反义链内靶序列或其互补序列的侧翼区)是RNA。优选地，所述上游部分区域表示有义链的5’侧(5’端)和反义链的3’侧(3’端)。也就是说，在优选的实施方案中，反义链3’端一侧的侧翼区(a region flanking to the3’-end of the antisense strand)由RNA组成，或者有义链5’端一侧的侧翼区(aregion flanking to the 5’-end of the sense strand)和反义链3’端一侧的侧翼区均由RNA组成。例如，本发明的嵌合型或杂合型双链分子包含以下组合。

有义链：            5’-[DNA]-3’

                    3’-(RNA)-[DNA]-5’：反义链，

有义链：            5’-(RNA)-[DNA]-3’

                    3’-(RNA)-[DNA]-5’：反义链，和

有义链：            5’-(RNA)-[DNA]-3’

                    3’-(RNA)-5’：反义链。

上游部分区域优选是由9-13个核苷酸组成的域，从双链分子的有义链或反义链内的靶序列或其互补序列的末端算起。此外，这种嵌合型双链分子的优选实例包括链长为19-21个核苷酸的那些嵌合型双链分子，其中多核苷酸的至少上游的半区(对于有义链为5’侧区域而对于反义链为3’侧区域)是RNA，而另一半是DNA。在这样的嵌合型双链分子中，抑制靶基因表达的效果比反义链整体为RNA时强得多(US20050004064)。

在本发明中，双链分子可以形成发夹，例如短发夹RNA(shRNA)和由DNA及RNA组成的短发夹(shD/R-NA)。shRNA或shD/R-NA是RNA序列或RNA和DNA的混合物，其形成紧密的发夹转角(hairpin turn)，能够用于藉由RNA干扰来沉默基因表达。shRNA或shD/R-NA在单链上包含有义靶序列和反义靶序列，其中所述序列通过环序列隔开。通常，发夹结构被细胞机制(cellular machinery)切割成dsRNA或dsD/R-NA，其后所述dsRNA或dsD/R-NA与RNA诱导性沉默复合物(RISC)结合。这种复合物结合并切割与所述dsRNA或dsD/R-NA的靶序列匹配的mRNA。

本发明部分基于这样的发现，胰腺导管腺癌(PDACa)中编码REG4的基因与非癌胰腺组织相比是过表达的，并且在胰腺癌、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞和膀胱癌细胞中编码KIA0101的基因与非癌的各组织相比是过表达的。REG4的cDNA长度为1518个核苷酸。另一方面，KIAA0101的cDNA长度为1508个核苷酸。REG4的核酸和多肽序列(Genbank登录号：AY126670)分别示于SEQ ID NO：1和2，KIAA0101的核酸和多肽序列(Genbank登录号：NM_014736)分别示于SEQ ID NO：39和40。

本发明公开了转染包含SEQ ID NO：5的siRNA导致PDAC细胞系的生长抑制。另外，转染包含SEQ ID NO：32的siRNA导致胰腺癌细胞系的生长抑制。

抑制细胞生长的方法

本发明涉及通过抑制REG4或KIAA0101的表达来抑制细胞生长，即，癌细胞生长。例如，通过特异性靶向REG4基因或KIAA0101基因的小干扰RNA(siRNA)来抑制REG4或KIAA0101的表达。REG4靶包括，例如，SEQID NO：5的核苷酸，而KIAA0101靶类似地包括SEQ ID NO：32的核苷酸。

术语“特异性抑制”就抑制性多核苷酸和多肽而言指作用剂或配体抑制REG4和/或KIAA0101的表达或生物学功能的能力。特异性抑制通常导致与本底相比对REG4和/或KIAA0101表达(例如，转录或翻译)或测得的生物学功能(例如，细胞生长或增殖，凋亡抑制，来自REG4的胞内信号传导，例如，与REG4有关的EGF受体/Akt/AP-1信号传导途径的活化；与KIAA0101有关的与PCNA或其它胞内蛋白质的结合)至少约2倍的抑制，优选高于约10倍，并且最优选高于100倍的抑制。表达水平和/或生物学功能可以在比较经过处理和未经处理的细胞的情况下测量，或在比较细胞群体在处理前和处理后的情况下测量。在一些实施方案中，REG4和/或KIAA0101的表达或生物学功能被完全抑制。通常，特异性抑制是使用适当的统计学检验时在REG4/KIAA0101的表达或生物学功能上有统计学意义的降低(例如，p≤0.05)。

在非哺乳动物细胞中，已经证明了双链RNA(dsRNA)对基因表达施加强有力且特异性的沉默作用，将其称为RNA干扰(RNAi)(Sharp PA.Genes Dev.1999Jan 15；13(2)：139-41.)。dsRNA被一种含有RNase III基序的酶加工成20-23个核苷酸的dsRNA，称为小干扰RNA(siRNA)。siRNA与多组分核酸酶复合物一起特异性靶向互补mRNA(Hammond SM等，Nature.2000Mar16；404(6775)：293-6；Hannon GJ.Nature.2002Jul 11；418(6894)：244-51.)。在哺乳动物细胞中，已经证明由20或21聚体dsRNA组成、具有19个互补核苷酸和3’末端的非互补胸苷或尿苷二聚体(dimmer)的siRNA具有基因特异性敲低作用，而不引发基因表达的整体改变(Elbashir SM等，Nature.2001May24；411(6836)：494-8.)。

通过将细胞与包含REG4或KIAA0101的siRNA的组合物接触来抑制细胞的生长。进一步将所述细胞与转染剂接触。合适的转染剂是本领域已知的。“细胞生长的抑制”指所述细胞与未曝露于所述组合物的细胞相比增殖速率较低或生存力降低。细胞生长通过本领域已知方法测量，如MTT细胞增殖测定法。

REG4或KIAA0101的siRNA分别针对REG4基因序列或KIAA0101基因序列的单个靶点。或者，所述siRNA针对REG4或KIAA0101基因序列的多个靶点。例如，所述组合物分别包含针对REG4或KIAA0101的两个、三个、四个或五个或更多个靶序列的REG4或KIAA0101的siRNA。“REG4或KIAA0101靶序列”的意思是与REG4基因或KIAA0101基因中的一部分相同的核苷酸序列(即，REG4或KIAA0101基因内与siRNA等长并且与之互补的多核苷酸)。靶序列可以包括人REG4或KIAA0101基因的5’非翻译(UT)区、可读框(ORF)或3’非翻译区。或者，siRNA是与REG4或KIAA0101基因表达的上游或下游调制子(modulator)互补的核酸序列。上游和下游调制子的实例包括：与REG4或KIAA0101基因启动子结合的转录因子，与REG4或KIAA0101多肽相互作用的激酶或磷酸酶，REG4或KIAA0101启动子或增强子。

与靶mRNA杂交的REG4或KIAA0101的siRNA通过与正常单链mRNA转录物结合，从而干扰翻译并藉此阻抑蛋白质的表达，由此减少或抑制由REG4或KIAA0101基因编码的REG4或KIAA0101多肽产物的产生。因此，本发明的siRNA分子可通过它们与来自REG4或KIAA0101基因的mRNA或cDNA在严紧条件下特异性杂交的能力来定义。

就本发明而言，术语“杂交”或“特异性杂交”用于指两个核酸分子在“严紧杂交条件”下杂交的能力。短语“严紧杂交条件”指这样的条件，在该条件下核酸分子将与其靶序列杂交(通常是在复杂的核酸混合物中)，而不与其它序列可检测地杂交。严紧条件依赖于序列并且在不同的环境下将有所不同。较长的序列在较高的温度特异性地杂交。对核酸杂交的详尽指导可在Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization withNucleic Probes，“Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid assays”(1993)中找到。通常，将严紧条件选择为在限定离子强度pH的条件下低于特异性序列热解链点(T_m)约5-10℃。T_m是在平衡时，与靶互补的探针中有50％与靶序列杂交(由于靶序列过量存在，在T_m下，在平衡时50％的探针被占据)的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)。严紧条件也可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，正信号是至少两倍于本底的杂交，优选10倍于本底的杂交。示例性严紧杂交条件可以是如下所示：50％甲酰胺，5x SSC和1％SDS，42℃温育，或者，5x SSC、1％SDS，65℃温育，并在0.2x SSC和0.1％SDS中在50℃清洗。

本发明的siRNA的长度小于约500、约200、约100、约50或约25个核苷酸。优选所述siRNA的长度是约19至约25个核苷酸。用于产生REG4siRNA的示例性核酸序列包括作为靶序列的SEQ ID NO：5的核苷酸序列。类似地，用于产生KIAA0101siRNA的核酸序列包括作为靶序列的SEQ IDNO：32的核苷酸序列。此外，为了增强siRNA的抑制活性，可以将核苷酸“u”添加至靶序列反义链的3’端。所添加“u”的数目是至少大约2个，通常是大约2个至大约10个，优选大约2个至大约5个。添加的“u”在siRNA反义链的3’端形成单链。

所述细胞是任何表达或过表达REG4或KIAA0101的细胞。所述细胞是上皮细胞如胰腺导管细胞。或者，所述细胞是肿瘤细胞如癌、腺癌、胚细胞瘤、白血病、骨髓瘤或肉瘤。所述细胞是胰腺癌细胞，特别是胰腺导管腺癌细胞，前列腺癌细胞，乳腺癌细胞和膀胱癌细胞。

将REG4或KIAA0101的siRNA以能够与mRNA转录物结合的形式直接导入细胞中。或者，编码REG4或KIAA0101的siRNA的DNA在载体中。

载体的产生例如通过将REG4或KIAA0101靶序列克隆入表达载体，与REG4或KIAA0101序列侧翼的调节序列以允许两条链表达的方式(通过DNA分子的转录)可操作地连接(Lee，N.S.等，Nature Biotechnology 20：500-5.)。对REG4或KIAA0101mRNA而言为反义的RNA分子通过第一启动子(例如，位于克隆的DNA 3’的启动子序列)转录，而对REG4或KIAA0101mRNA而言为有义链的RNA分子通过第二启动子转录(例如，位于克隆的DNA 5’的启动子序列)。所述有义链和反义链在体内杂交生成用于沉默REG4或KIAA0101基因的siRNA构建体。或者，应用两个构建体来制备siRNA构建体的有义链和反义链。克隆的REG4或KIAA0101可以编码具有二级结构例如发夹的构建体，其中单一转录物同时具有来自靶基因的有义序列和互补的反义序列。

由任意核苷酸序列组成的环序列可以位于有义序列和反义序列之间，以形成发夹环结构。因此，本发明还提供具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’的siRNA，其中[A]是核糖核苷酸序列，其对应于与来自REG4或KIAA0101的mRNA或cDNA特异性杂交的序列。在优选的实施方案中，[A]是对应于SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：32的核苷酸序列的核糖核苷酸序列。

[B]是由3-23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列，并且

[A’]是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。

[A]区与[A’]杂交，其后形成由[B]区组成的环。环序列的长度可以优选是大约3至大约23个核苷酸。环序列，例如，可以选自以下序列(www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html)。此外，由23个核苷酸组成的环序列也提供活性siRNA(Jacque，J.M.等，(2002)Nature 418：435-438.)。

CCC、CCACC或CCACACC：Jacque，J.M.等，(2002)Nature，Vol.418：435-8。

UUCG：Lee，N.S.等，(2002)Nature Biotechnology 20：500-5.Fruscoloni，P.等，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(4)：1639-44.

UUCAAGAGA：Dykxhoorn，D.M.等，Nature Reviews Molecular CellBiology 4：457-67。

例如，优选的具有本发明发夹环结构的siRNA示于下文。在以下结构中，环序列可以选自下组：CCC、UUCG、CCACC、CCACACC和UUCAAGAGA。优选的环序列是UUCAAGAGA(DNA为“ttcaagaga”)。

5’-GACAGAAGGAAGAAACTCA-[B]-TGAGTTTCTTCCTTCTGTC-3’(对于SEQ ID NO：5的靶序列)

REG4或KIAA0101序列侧翼的调节序列是相同或不同的，由此使得它们的表达能够独立调节，或者在时间或空间上调节。siRNA的胞内转录是通过将REG4或KIAA0101基因模板克隆入载体来实现的，所述载体包含例如来自核内小RNA(snRNA)U6或人H1RNA启动子的RNA聚合酶III转录单元。对于向细胞中导入载体，可以使用转染增强剂。FuGENE(RocheDiagnostices)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)和Nucleofector(Wako pure Chemical)可用作转染增强剂。

根据标准方法在体外测试了REG4或KIAA0101mRNA不同部分的寡核苷酸及其互补寡核苷酸降低肿瘤细胞中REG4或KIAA0101产生的能力(例如，使用胰腺细胞系例如胰腺癌细胞系或胰腺导管腺癌(PDAC)细胞系)。使用REG4或KIAA0101的特异性抗体或其它检测策略，检测与在缺乏候选组合物的条件下培养的细胞相比，接触候选siRNA组合物的细胞中的REG4或KIAA0101基因产物的减少。其后检测在体外基于细胞或无细胞的测定法中可减少REG4或KIAA0101产生的序列对细胞生长的抑制作用。对于在体外基于细胞的测定法中抑制细胞生长的序列，在大鼠或小鼠中加以体内测试，以确认在患有恶性肿瘤的动物体内REG4或KIAA0101产生的减少和肿瘤细胞生长的减少。

治疗恶性肿瘤的方法

分别通过施用REG4或KIAA0101的siRNA来治疗定性为过表达REG4或KIAA0101的肿瘤患者。使用siRNA治疗抑制患者中REG4或KIAA0101的表达，所述患者患有或者有风险发生，例如，胰腺癌特别是胰腺导管腺癌(PDAC)、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞和膀胱癌细胞。通过具体肿瘤类型的标准方法来鉴定这些患者。例如通过CT、MRI、ERCP、MRCP、计算机断层显像或超声来诊断胰腺癌、胰腺导管腺癌(PDAC)、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞和膀胱癌细胞。如果治疗产生了临床收益如REG4或KIAA0101表达的降低，或受试者中肿瘤的大小、患病率或转移潜能的降低，那么所述治疗是有效的。当预防性施用治疗时，“有效的”意味着治疗延缓或阻止肿瘤的形成，或阻止或减轻肿瘤的临床症状。可结合任何已知的诊断或治疗具体肿瘤类型的方法来确定有效性。

通过编码本发明的siRNA的标准载体和/或基因递送系统(例如通过递送合成siRNA分子)向患者施用siRNA来进行siRNA治疗。通常，使合成siRNA分子化学稳定化以防止体内核酸酶降解。用于制备化学稳定化RNA分子的方法是本领域熟知的。通常，这些分子包含经修饰的主链和核苷酸以防止核糖核酸酶的作用。也可进行其它修饰，例如，缀合胆固醇的siRNA显示了更好的药理学特性(Song等Nature Med.9：347-351(2003))。

合适的基因递送系统可以包括脂质体、受体介导的递送系统或病毒载体如疱疹病毒、反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒等。将治疗性核酸组合物配制在药学可接受载体中。治疗组合物也可以包括如上所述的基因递送系统。药学可接受载体是适合于向动物施用的、生物兼容的媒介物，例如生理盐水。化合物的治疗有效量是能够在受治疗动物中产生医疗上的理想结果的量，所述理想结果例如REG4或KIAA0101基因产物产生的减少，细胞生长(例如增殖)的降低，或肿瘤生长的降低。

非消化道施用，如静脉内、皮下、肌内和腹膜内递送途径可以用于递送REG4或KIAA0101的siRNA组合物。对于胰腺、前列腺、乳腺和膀胱肿瘤的治疗，直接灌注入癌症组织或癌症部位附近是有用的。

用于任何一位患者的剂量依赖于许多因素，包括患者体格(size)、体表面积、年龄、待施用的具体核酸、性别、施用时间和途径、一般健康状况，和同时正在施用的其它药物。静脉内施用核酸的剂量是从大约10⁶至10²²个拷贝的核酸分子。

所述多核苷酸通过标准方法施用，如通过注射至组织(如肌肉或皮肤)的间质间隙中，导入循环或体腔，或通过吸入或吹入。将多核苷酸注射或通过其它方式与药学可接受液体载体一起递送至动物，所述药学可接受液体载体例如液体载体，其是水性或部分水性的。将所述多核苷酸与脂质体(例如，阳离子或阴离子脂质体)结合。所述多核苷酸包括靶细胞表达所必须的遗传信息，例如启动子。

抗REG4抗体和抗原结合蛋白：

抗体

本发明人已经证明了抗REG4的单克隆抗体中和了REG4的生长促进作用并且显著削弱了PDAC细胞的生长。所述结果揭示了与表达REG4的细胞相关的疾病(例如，胰腺癌)的治疗可以使用结合REG4的抗体来方便地进行。

本发明涉及用于治疗或预防由REG4异常过表达所介导的癌症包括胰腺癌的药物组合物，所述组合物包含：作为活性成分的药学有效量的与REG4编码的蛋白质结合的抗体或其片段，或抗原结合蛋白；和药学可接受载体。本发明还涉及抗REG4抗体或抗原结合蛋白用于生产治疗或预防胰腺癌的药物组合物的用途。本发明的药物组合物包含抗REG4抗体或抗原结合蛋白，和药学可接受载体。

“分离的”或“纯化的”多肽是这样的多肽，其基本上不含来自衍生出所述多肽的细胞或组织来源的细胞物质如糖、脂质或其它污染蛋白质，或者当其为化学合成时，基本上不含化学前体或其它化学物质。术语“基本上不含细胞物质”包括这样的多肽制备物，其中所述多肽与从中分离或重组产生该多肽的细胞的细胞成分是分离的。

因此，基本上不含细胞物质的多肽包括具有少于约30％、20％、10％或5％(按干重计)异源蛋白质(在本文也称作“污染蛋白质”)的多肽制备物。在多肽是重组产生的情况下，还优选基本上不含培养基，其包括这样的多肽制备物，其含培养基少于该蛋白质制备物体积的约20％、10％或5％。在多肽是通过化学合成产生的情况下，优选基本上不含化学前体或其它化学物质，其包括这样的多肽制备物，其所含的蛋白质合成中涉及的化学前体或其它化学物质少于所述蛋白质制备物体积的约30％、20％、10％、5％(按干重计)。例如，可以通过在对蛋白质制备物进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳并对凝胶进行考马斯亮蓝染色之后出现单一条带来证明具体蛋白质制备物含有分离的或纯化的多肽。在优选的实施方案中，本发明的抗体或其片段是分离的或纯化的。

“分离的”或“纯化的”核酸分子是与存在于该核酸分子天然来源中的其它核酸分子分离的核酸分子。“分离的”或“纯化的”核酸分子，如cDNA分子，可以基本上不含其它细胞物质，或培养基(当其是通过重组技术产生时)，或者基本上不含化学前体或其它化学物质(当其为化学合成时)。在优选的实施方案中，编码本发明的抗体或其片段的核酸分子是分离的或纯化的。

“抗体”和“免疫球蛋白”是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体对特定抗原表现出结合特异性，但是免疫球蛋白同时包括抗体和抗原特异性尚未定义的其它抗体样分子。例如，后一类型的多肽由淋巴系统以低水平产生或由骨髓瘤以增高的水平产生。

“天然抗体和免疫球蛋白”通常是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间有所不同。每条重链和轻链还具有间距规则的链内二硫桥。每条重链在一端具有可变域(VH)，其后是多个恒定域(CH)。每个轻链在一端具有可变域(VL)，并且在另一端具有恒定域(CL)；轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，轻链可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定氨基酸残基形成了轻链和重链可变域之间的界面(Chothia等，(1985)J Mol Biol.；186：651-63；Novotny和Haber，(1985)Proc Natl Acad Sci USA.；82：4592-6)。

术语“可变”指可变域的特定部分在序列上于抗体之间具有广泛的差异，并且可以将其使用在每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性中。然而，可变性不是平均分布在整个抗体可变域中的。它集中在同时存在于轻链和重链可变域中的称为互补决定区(CDR)或超变区的三个区段中。将可变域中保守性更高的部分称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变域各包含四个框架区，框架区大多采用一种通过三个CDR连接的β-折叠构型，CDR形成环来连接所述β-折叠结构，在一些情况下形成该β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR被框架区与其它链的CDR紧密保持在一起，对抗体的抗原结合位点形成起贡献(Kaba等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，Naional Institute of Health，Bethesda，Md.)。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但是其显示多种效应物功能，例如抗体对抗体依赖性细胞毒性的参与。

用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各具有单个抗原结合位点，并产生一个余下的“Fc”片段。胃蛋白酶处理产生一个具有两个抗原结合位点的F(ab’)₂片段。“Fv”是含有完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这个区由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。正是在这种构型中，由每个可变域的三个CDR相互作用来确定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。所述六个CDR合起来赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使单个可变域(或仅包含三个抗原特异性CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管比完整结合位点的亲和力低。

Fab片段也包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH-1)。Fab’片段不同于Fab片段之处在于在重链CH-1结构域的羧基末端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文针对恒定域半胱氨酸残基含有游离巯基的Fab’的称谓。F(ab’)₂抗体片段最初是作为Fab’片段对产生的，其中Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。

来自任何脊椎动物种类的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以基于它们恒定域的氨基酸序列归类于两种截然不同的类型之一，这两种类型称为κ(kappa)和λ(lambda)。

依赖于它们重链恒定域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白归于不同种类。存在五大类的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它们中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同种类免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是已知的。

术语“单克隆抗体”如用于本文指获得自基本上为同种抗体的群体的抗体，即，除了可能天然发生的突变可能以少量存在之外，组成所述群体的单个抗体都是相同的。单克隆抗体具有高度特异性，其针对单一抗原位点。另外，常规(多克隆)抗体制备物通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体，与之相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性，单克隆抗体的有利之处在于它们能够通过杂交瘤培养来合成，不受其它免疫球蛋白的污染。因此，修饰语“单克隆”表示所述抗体这样的特性，即获得自基本上为同种的抗体群体，而不应理解为所述抗体需要通过任何特定方法产生。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过最先由Kohler和Milstein，(1975)Nature.；256：495-7描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法(Cabilly等，(1984)Proc Natl Acad Sci USA.；81：3273-7)制备。

本文的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体或免疫球蛋白，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及这样的抗体的片段，只要这些片段显示期望的生物学活性(Cabilly等，同上；Morrison等，(1984)Proc NatlAcad Sci USA.；81：6851-5)。最典型地，嵌合抗体或免疫球蛋白包含人和鼠类的抗体片段，通常是人的恒定区和小鼠可变区。

非人(例如，鼠类)抗体的“人源化”形式是含有最少的源自非人免疫球蛋白的序列的特定嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段。这些片段还包括Fv、Fab、Fab’、F(ab’)₂、或抗体的其它抗原结合性亚序列。大体上说，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受者抗体)，其中将来自所述受者的互补决定区(CDR)的残基用具有理想的特异性、亲和力和能力的源自非人物种(供者抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基代替。

在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基可以由相应的非人残基代替。在本发明中，所述人源化抗体中的几个、两个或优选一个框架可以由非人残基的框架代替。此外，人源化抗体可以包含既不存在于受者抗体中，也不存在于引入的CDR或框架序列中的残基。进行这些修饰是为了进一步改进和优化抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上完整的至少一个，通常是两个可变域，其中全部或基本上全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，并且全部或基本上全部的框架区是人免疫球蛋白共有序列的框架区。

人源化抗体最好也将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区的一部分。进一步的细节参见Jones等，(1986)Nature.；321：522-5；Riechmann等，(1988)Nature.；332：323-7；Presta，(1992)CurrOpin Struct Biol.2：593-6。

“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一的多肽链中。优选地，Fv多肽还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其使sFv能够形成理想的用于抗原结合的结构。已经记载了许多方法来识别这样的化学结构，用于将来自抗体V区的天然情况下聚集、但在化学上分离的多肽轻链和多肽重链转化成sFv分子，所述sFv分子将折叠成基本上类似于抗原结合位点结构的三维结构(美国专利Nos.5,091,513、5,132,405和4,946,778；Pluckthun in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，vol.113，Rosenberg和Moore编，Springer-Verlag，NewYork，pp.269-315(1994))。

抗原结合蛋白

本发明还包括特异性结合REG4或KIAA0101的抗原结合蛋白或非抗体性结合蛋白(non-antibody binding protein)(例如，配体)。非抗体性配体包括使用非免疫球蛋白性蛋白支架的抗体模拟物，包括Adnectins、Avimers、单链多肽结合分子和抗体样结合肽模拟物，更详细的讨论如下。

已经开发了以类似于抗体的方式靶向并结合靶物的其它化合物。这些“抗体模拟物”中的某些使用非免疫球蛋白性蛋白支架作为抗体可变区的替代性蛋白框架。

例如，Ladner等(美国专利No.5,260,203)描述了单多肽链结合分子，其结合特异性类似于聚集的、但在分子水平是分离的抗体轻链和重链可变区的结合特异性。单链结合分子含有通过肽接头连接的抗体重链和轻链可变区的抗原结合位点，并且将折叠成与双肽抗体类似的结构。单链结合分子相对于常规抗体表现出几种优势，包括更小的尺寸、更好的稳定性并且更容易进行修饰。

Ku等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(14)：6552-6556(1995))公开了基于细胞色素b562的抗体替代物。Ku等(1995)生成了一个文库，其中将细胞色素b562的两个环随机化并选择其对牛血清白蛋白的结合。发现这些突变体个体选择性结合BSA，与抗BSA抗体类似。

Lipovsek等(美国专利Nos.6,818,418和7,115,396)公开了一种抗体模拟物，其特征为纤连蛋白或纤连蛋白样蛋白支架和至少一个可变环。这些基于纤连蛋白的抗体模拟物被称为Adnectins，它们展现出许多与天然或工程抗体相同的特征，包括对任何靶向的配体的高亲和力和特异性。任何用于开发新的或改进的结合蛋白的技术均可以用于这些抗体模拟物。

这些基于纤连蛋白的抗体模拟物的结构类似于IgG重链可变区的结构。因此，这些模拟物表现出与天然抗体在本质上和亲和力上都类似的抗原结合性质。另外，这些基于纤连蛋白的抗体模拟物相对于抗体和抗体片段表现出某些益处。例如，这些抗体模拟物的天然折叠稳定性不依赖于二硫键，并且因此这些抗体模拟物在通常会破坏抗体的条件下是稳定的。此外，因为这些基于纤连蛋白的抗体模拟物的结构类似于IgG重链，可以在体外采用用于环随机化和改组的方法，其类似于体内抗体亲和力成熟的过程。

Beste等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(5)：1898-1903(1999))公开了一种基于脂笼蛋白支架的抗体模拟物()。脂笼蛋白由β-桶组成，其在所述蛋白的末端具有四个超变环。Beste(1999)对所述环进行了随机诱变，并选择了其与例如荧光素的结合。三个变体表现出与荧光素的特异性结合，其中一个变体显示的结合与抗荧光素抗体的结合类似。进一步的分析揭示全部随机化位置都是可变的，说明

将会适合作为抗体的替代物使用。

是小单链肽，通常为160-180个残基，其相对于抗体提供了几个优势，包括生产成本的降低、储藏稳定性的增加和免疫反应的减少。

Hamilton等(美国专利No.5,770,380)公开了一种合成抗体模拟物，其中使用刚性的非肽有机支架——杯芳烃(calixarene)，其附接了多个用作结合位点的可变肽环。所述肽环相对于彼此全部从杯芳烃的同一侧几何伸出。由于这种几何构象，所有环均可用于结合，增加了对配体的结合亲和力。然而，与其它抗体模拟物比较，基于杯芳烃(clixarene)的抗体模拟物不是全部由肽组成，因此它较不容易受到蛋白酶的攻击。所述支架也不是纯粹由肽、DNA或RNA中的任一种组成，意味着这种抗体模拟物在极端环境条件下相对稳定并且寿命较长。另外，由于基于杯芳烃的抗体模拟物相对较小，其产生免疫应答的可能性较低。

Murali等(Cell.Mol.Biol.49(2)：209-216(2003))讨论了用于将抗体减小成更小的肽模拟物的方法学，他们将其称为“抗体样结合肽模拟物”(ABiP)，也可作为抗体替代物使用。

Silverman等(Nat.Biotechnol.(2005)，23：1556-1561)公开了一些融合蛋白，它们是包含多个称为“avimers”的结构域的单链多肽。avimers是一类通过体外外显子改组和噬菌体展示从人胞外受体结构域开发出的结合蛋白，它们在对多种靶分子的亲和力和特异性方面在某种程度上类似于抗体。与单表位结合蛋白相比，这样得到的多结构域蛋白可以包含多个独立结合结构域，这些结合域可能显示更好的亲和力(在一些情况下为亚纳摩尔)和特异性。关于构建的方法和avimers的用途的其它细节公开在例如美国专利申请公开Nos.20040175756、20050048512、20050053973、20050089932和20050221384中。

除了非免疫球蛋白蛋白框架，包含RNA分子和非天然寡聚体的化合物(例如，蛋白酶抑制剂、苯并二氮卓、嘌呤衍生物和β-转角模拟物)中也模仿了抗体性质，它们全部适用于本发明。

中和活性

存在这样的抗体和非抗体性结合蛋白质，其具有使病原体的感染性和毒素的活性丧失的功能。抗体介导的中和可以通过抗原可变区与抗原结合来实现，或者可能需要补体介导。例如，在一些情况下，抗病毒抗体需要补体介导从而使病毒丧失它的感染性。Fc区对于补体的参与是必需的。因此，这些抗体包含效应物功能，该功能需要Fc来中和病毒和细胞。

本发明部分基于这样的发现，抗REG4抗体和非抗体性结合蛋白与REG4特异性地结合，然后中和REG4的促进细胞增殖的活性，尤其是在增殖受到异常高的REG4表达或胞内信号传导所介导的癌细胞中更是如此。

术语“特异性结合”或“附接”就抗体或非抗体性结合蛋白而言指作用剂或配体在整体或部分上与目标表位(例如REG4)的优先结合，其中所述作用剂或配体结合细胞或组织上表达的REG4，或者与另一种作用剂或配体竞争结合细胞或组织上表达的REG4。当然，公认在抗体和非目标表位之间可能发生某种程度的非特异性相互作用。尽管如此，特异性结合仍然根据如下特征来区别，即其是通过对目标表位的特异性识别来介导的。特异性结合通常导致被递送分子和含有目标表位的实体(例如，测试孔或细胞)之间的结合大大强于被结合抗体和缺乏所述目标表位的实体(例如，测试孔或细胞)之间的结合。通常，作为特异性结合的结果，与含有目标表位(即REG4)的细胞和组织结合的作用剂或配体的量(每单位时间)，减去本底，与缺乏目标表位的细胞或组织相比至少增加约2倍(about 2-fold increase over background)，优选大于约10倍，并且最优选大于100倍。两个实体之间的特异性结合通常意味着至少10⁶M^-1的亲和力。大于10⁸M^-1或更高的亲和力是优选的。可以测定对于核酸以及蛋白质作用剂和配体的特异性结合。对于核酸作用剂的特异性结合可以使用本领域已知的任何测定法来测定，包括但不限于Northern印迹、凝胶移位测定法和原位杂交。对于蛋白质作用剂和配体的特异性结合可以使用本领域已知的任何结合测定法来测定，包括但不限于凝胶电泳、Western印迹、ELISA、流式细胞仪和免疫组织化学。

本发明还涉及用于抑制表达REG4的细胞的细胞生长的方法，该方法包括以下步骤：

1)将表达REG4的细胞与抗REG4抗体或抗REG4的非抗体性结合蛋白接触，和

2)中和REG4的细胞增殖活性。

在本发明的方法或药物组合物中，可以抑制任何表达REG4的细胞。例如，胰腺癌细胞(pancreatic cancer cells)作为本发明表达REG4的细胞是优选的。其中胰腺癌瘤或细胞(pancreatic carcinoma or cells)是优选的。

细胞和抗体(或非抗体性结合蛋白)可以在体内或体外接触。当在体内靶定癌细胞作为表达REG4的细胞时，本发明的方法事实上是癌症的治疗方法或预防方法。具体而言，本发明提供包括以下步骤的癌症治疗方法：

1)向癌症患者施用特异性结合REG4的抗体或非抗体性结合蛋白，和

2)利用所述结合REG4的抗体或非抗体性结合蛋白的功能抑制癌细胞生长，其中所述功能是中和REG4的细胞增殖活性。

在本发明中，抗REG4抗体或非抗体性结合蛋白的中和功能是指对REG4刺激REG4表达细胞的细胞增殖的活性加以抑制。例如，本发明人确认REG4发挥自分泌或旁分泌生长因子的功能并介导Akt信号传导途径。因此，在本发明优选的实施方案中，抗REG4抗体或非抗体性结合蛋白使REG4自分泌/旁分泌途径关闭并阻断后续的Akt磷酸化。本发明人还确认了结合REG4的抗体可利用中和功能有效地抑制REG4表达细胞，尤其是胰腺癌细胞的细胞增殖。本发明人进一步确认了REG4在胰腺癌细胞中以很高的概率高表达。此外，REG4表达水平在正常组织中是低的。将这些信息汇总可见，施用抗REG4抗体的胰腺癌治疗方法可能是有效的，几乎没有副作用的危险。

然而，对本发明的抗体和非抗体性结合蛋白没有限制，只要它们包含期望的中和功能即可。Fc部分的变体、类似物或衍生物可以通过例如对残基或序列进行各种取代来加以构建。

变体(或类似物)多肽包括插入变体，其中向Fc氨基酸序列增加了一个或多个氨基酸残基。插入可以位于所述蛋白质的一端或两端，或者可以位于Fc氨基酸序列的内部区域中。在一端或两端具有额外残基的插入变体可以包括，例如，融合蛋白，和包括氨基酸标签或标记物的蛋白质。例如，Fc分子可以任选地包含N末端Met，特别是当所述分子在细菌如大肠杆菌(E.coli)中重组表达时。

在Fc缺失变体中，Fc多肽中的一个或多个氨基酸残基被去除。缺失可以在所述Fc多肽的一端或两端进行，或者去除Fc氨基酸序列内的一个或多个残基。因此，缺失变体包括Fc多肽序列的所有片段。

在Fc取代变体中，将Fc多肽的一个或多个氨基酸残基去除，并用可选残基替代。在一个方面，取代是保守性质的，但是，本发明包括非保守的取代。

优选地，亲本多肽Fc区是人Fc区，例如，人IgG1(A和非A同型)的天然序列的人Fc区或人IgG3 Fc区。在一个实施方案中，具有改进的ADCC的变体比具有天然序列IgG1或IgG3 Fc区和所述变体的抗原结合区的抗体显著更有效地介导ADCC。优选地，所述变体包含或其组成基本上为对Fc区第298、333和334位残基中的两个或三个的取代。免疫球蛋白重链中的残基编号方式是Kabat等(见上文)中的EU标准(EU index)，明确将其通过引证并入本文。最优选地，将第298、333和334位的残基加以取代(例如用丙氨酸)。此外，为了生成具有改进的ADCC活性的Fc区变体，将通常设计制造对FcγRIII(其被认为是介导ADCC的重要FcR)具有改进的结合亲和力的Fc区变体。例如，可以向亲本Fc区的氨基酸位置256、290、298、312、326、330、333、334、360、378或430中的任何一个或多个位置引入氨基酸修饰(例如，插入、缺失或取代)以生成这样的变体。对FcγRIII具有改进的结合亲和力的变体可以进一步具有降低的对FcγRII的结合亲和力，特别是降低的对FcγRIIB抑制受体的亲和力。

无论如何，可以考虑任何变体氨基酸插入、缺失和/或取代(例如，1-50个氨基酸，优选1-25个氨基酸，更优选1-10个氨基酸)，并且它们均在本发明的范围之内。保守氨基酸取代将通常是优选的。此外，变化可以是以改变的氨基酸的形式，例如肽模拟物或D-氨基酸。

因此，属于这些种类的人源抗体(human-derived antibody)在本发明中是优选的。人抗体可以使用从人体或移植了人抗体基因的嵌合体动物收集的产抗体细胞来获得(Ishida I等，(2002)Cloning and Stem Cells.，4：91-102.)。

此外，抗体Fc区可以与任意可变区连接。具体而言，不同动物种的可变区与人恒定区连接的嵌合抗体是已知的。或者，也可以通过将人源可变区与任意恒定区连接来获得人-人嵌合抗体。此外，还已知CDR移植技术，其中将组成人抗体可变区的互补决定区(CDR)用异源抗体的CDR代替(“Immunoglobulin genes”，Academic Press(London)，pp260-274，1989；Roguska MA等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，91：969-73.)。

通过取代CDR，替换了抗体结合特异性。即转入了人REG4结合抗体的CDR的人源化抗体将识别人REG4。所述转入后的抗体也可称为人源化抗体。如此获得的、具有效应物功能所必需的Fc区的抗体，可以用作本发明的抗体，而不考虑它们可变区的来源。例如，包含人IgG Fc的抗体在本发明中是优选的，即使它们的可变区包含源自另一类或另一物种的免疫球蛋白的氨基酸序列。

或者，可以使用缺乏Fc区的抗体片段，只要它们包含期望的中和功能。例如，在本发明中，也可以使用Fv、Fab、Fab’、F(ab’)₂或抗体的其它抗原结合亚序列作为抗体。在一些实施方案中，可以将增强中和效果的作用剂与抗体或其片段缀合。

本发明的抗体的VH和VL结构域各自包含由框架区隔开的三个CDR，称为CDR1、CDR2和CDR3。不具体限制CDR的氨基酸序列，只要所述抗体能够特异性地结合REG4。CDR氨基酸序列的优选实例包括：

VH CDR1：SYWMH(SEQ ID NO：20)，

VH CDR2：NIYPGSGSTNYD(SEQ ID NO：21)，

VH CDR3：GGLWLRVDY(SEQ ID NO：22)，

VL CDR1：SASSSVSYMH(SEQ ID NO：23)，

VL CDR2：DTSKLAS(SEQ ID NO：24)，

VL CDR3：QQWSSNPF(SEQ ID NO：25)

在一个更优选的实施方案中，VH包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含与全长SEQ ID NO：18具有至少约90％、95％、98％序列同一性的氨基酸序列，并且VL包含与全长SEQ ID NO：19具有至少约90％、95％、98％序列同一性的氨基酸序列。序列同一性可以使用本领域熟知的可用软件例如BLAST或ALIGN的缺省设定来测量。

在本发明中，抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。即使在向人施用时，也可以使用上述转移有人抗体基因的动物来衍生人多克隆抗体。或者，可以使用利用遗传工程技术构建的免疫球蛋白，如人源化抗体、人-非人嵌合抗体和人-人嵌合抗体。此外，通过克隆人的抗体产生细胞来获得人单克隆抗体的方法也是已知的。

REG4或包含其部分肽的片段可以用作免疫原来获得抗体。在本发明中，REG4可以源自任何物种，优选来自哺乳动物如人、小鼠或大鼠，并且更优选地源自人。人REG4核苷酸序列和氨基酸序列是已知的。REG4的cDNA核苷酸序列在SEQ ID NO：1中记载，由该核苷酸序列编码的氨基酸序列在SEQ ID NO：2中记载(GenBank登录号AY126670)。本领域技术人员能够按常规分离包含所提供的核苷酸序列的基因，按要求制备所述序列的片段，并且获得包含目标氨基酸序列的蛋白质。

例如，可以将编码REG4蛋白或其片段的基因插入已知表达载体，并用于转化宿主细胞。可以使用任意标准方法从宿主细胞内或宿主细胞外收集期望的蛋白质或其片段，并也可将其用作抗原。此外，蛋白质、它们的裂解物和化学合成的蛋白质可以作为抗原使用。此外，表达REG4蛋白或其片段的细胞本身可以用作免疫原。

当使用肽片段作为REG4免疫原时，尤其优选选择这样的氨基酸序列，其包含预测为胞外结构域的区域。预测信号肽存在于REG4N末端的第1-25位。因此，例如，优选将不同于N末端信号肽(25个氨基酸残基)的区域作为用来获得本发明的抗体的免疫原。也就是说，优选将与REG4胞外结构域结合的抗体作为本发明的抗体。

因此，本发明中优选的抗体是这样的抗体，其装备有效应物功能所必需的Fc和能够与胞外REG4结构域结合的可变区。当目的为向人施用时，优选装备有IgG Fc。

任何哺乳动物都可以用这样的抗原来免疫。然而，优选的是考虑与细胞融合中使用的亲本细胞的兼容性。通常使用啮齿类、兔类或灵长类。

啮齿类包括，例如，小鼠、大鼠和仓鼠。兔类包括，例如，家兔。灵长类包括，例如，狭鼻(东半球)猴(catarrhine(old world)monkeys)如食蟹猴(Macaca fascicularis)、猕猴(Macaca mulatta)、狒狒(Sacred baboon)和黑猩猩。

用抗原免疫动物的方法是本领域熟知的。腹膜内和皮下抗原注射是用于免疫哺乳动物的标准方法。具体而言，可以将抗原稀释并悬浮在适量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中或生理盐水等中。如期望的，可以将抗原悬浮液与适量的标准佐剂如弗氏完全佐剂混合，并在乳化之后施用于哺乳动物。接下来，优选将与适量弗氏不完全佐剂混合的抗原以多剂量每4至21天施用一次。也可以将适当的载体用于免疫。在如上所述进行免疫之后，可以使用标准方法来检查血清的期望抗体水平的增加。

可以从经过免疫的、并检查了血清中期望抗体的增加的哺乳动物制备抗REG4蛋白的多克隆抗体。这可以通过从这些动物采血，或者通过使用任意的、常规的方法从它们的血液中分离血清。多克隆抗体包括含有多克隆抗体的血清，和可以从血清分离的包含多克隆抗体的部分。IgG和IgM可以通过使用例如与REG4蛋白结合的亲和柱从识别REG4蛋白的部分制备，其后使用蛋白A或蛋白G柱进一步纯化这种部分。在本发明中，可以将抗血清用作多克隆抗体。或者，也可以使用纯化的IgG或IgM等。

为了制备单克隆抗体，从使用抗原免疫的、经查血清中期望抗体的水平有增加(如上)的哺乳动物收集免疫细胞，并应用于细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞优选来自脾。用于与以上免疫原融合的其它优选亲本细胞包括，例如，哺乳动物骨髓瘤细胞，以及，更优选地，获得了可通过药剂选择融合细胞的特性的骨髓瘤细胞。

以上免疫细胞和骨髓瘤细胞可以使用已知方法融合，例如Milstein等的方法(Galfre，G.和Milstein，C.，(1981)Methods.Enzymol.：73，3-46.)。

通过细胞融合产生的杂交瘤可以通过在标准选择培养基如HAT培养基(包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基)中培养来选择。通常将HAT培养基中的细胞培养持续数日至数周，这段时间足以杀死除期望的杂交瘤之外的全部细胞(未融合细胞)。然后进行标准有限稀释，并筛选和克隆产生期望的抗体的杂交瘤细胞。

可以用抗原免疫非人动物来制备以上方法中的杂交瘤。此外，可以使用蛋白质、表达蛋白质的细胞或它们的悬液在体外免疫来自用EB病毒感染的细胞等的人淋巴细胞。然后将经免疫的淋巴细胞与能够无限分裂的人源骨髓瘤细胞(U266等)融合，由此获得产生期望的人抗体的杂交瘤，所述抗体能够结合所述蛋白质(未审查的公开的日本专利申请No.(JP-A)Sho 63-17688)。

然后将获得的杂交瘤移植至小鼠腹腔，并提取腹水。所得单克隆抗体的纯化可以使用例如硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或与偶连了本发明的蛋白质的亲和柱。本发明的抗体不仅可以使用在对本发明蛋白质的纯化和检测中，还可以作为本发明蛋白质的激动剂和拮抗剂的候选物。这些抗体还可以应用于与本发明的蛋白质相关的疾病的抗体疗法。在将所得抗体施用于人体时(抗体疗法)，人抗体或人源化抗体是优选的，因为它们的免疫原性低。

例如，可以用抗原免疫包含全套人抗体基因的转基因动物，所述抗原选自蛋白质、表达蛋白质的细胞或它们的悬液。其后从所述动物回收产生抗体的细胞，与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤，并且可以从这些杂交瘤制备抗蛋白质的人抗体(参见国际公布No.92-03918、94-02602、94-25585、96-33735和96-34096)。

或者，可以将产生抗体的免疫细胞如经免疫的淋巴细胞使用癌基因无限增殖化，并用于制备单克隆抗体。

以这种方法获得的单克隆抗体可以使用遗传工程方法(例如，参见Borrebaeck，C.A.K.和Larrick，J.W.，(1990)Therapeutic Monoclonal Antibodies，MacMillan Publishers，UK)制备。例如，重组抗体可以这样制备，从产生抗体的免疫细胞(如杂交瘤或经免疫的淋巴细胞)克隆编码抗体的DNA，然后将这些DNA插入适当的载体，并将这些载体转化至宿主细胞中。如上制备的重组抗体也可以在本发明中使用。

可以通过与多种分子如聚乙二醇(PEG)结合来修饰所述抗体。以这种方法修饰的抗体也可以在本发明中使用。修饰的抗体可以通过对抗体进行化学修饰来获得。这些类型的修饰方法对于本领域技术人员是常规的。也可以通过其它蛋白质来修饰所述抗体。由蛋白质分子修饰的抗体可以使用遗传工程产生。即，可以通过将抗体基因与编码修饰蛋白质的基因融合来表达目标蛋白质。

或者，这样的抗体可以作为嵌合抗体获得，其包含源自非人抗体的可变区和源自人抗体的恒定区，或者作为人源化抗体获得，其包含源自非人抗体的互补决定区(CDR)、源自人抗体的框架区(FR)和恒定区。这样的抗体可以使用已知方法产生。

可以使用分子生物学的标准技术来制备编码嵌合和CDR移植产物的DNA序列。例如，通过使用聚合酶链式反应(PCR)从产生抗体的细胞的RNA合成可变区，由此制备编码感兴趣抗体的CDR的基因(参见，例如，Larrick等，“Methods：a Companion to Methods in Enzymology”，卷2，第106页(1991)；Courtenay-Luck，“Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies”inMonoclonal Antibodies：Production，Engineering and Clinical Application；Ritter等(编著)，第166页(Cambridge University Press，1995)；和Ward等，“GeneticManipulation and Expression of Antibodies”in Monoclonal Antibodies：Principles and Applications；Birch等(编著)，第137页(Wiley-Liss，Inc.，1995))。

编码嵌合和CDR接枝产物的DNA序列可以完全或部分使用寡核苷酸合成技术来合成。定点诱变和聚合酶链式反应技术可以适宜使用。例如，可以使用寡核苷酸指导的合成(oligonucleotide-directed synthesis)，如Jones等，(1986)Nature.；321：522-5所述的。也可以使用由寡核苷酸指导的对先有(pre-existing)可变区的诱变，例如，如Verhoeyen等，(1988)Science.；239：1534-6或Riechmann等(见上文)所述。还可以使用T4DNA聚合酶酶促填补有缺口的寡核苷酸，如Queen等，(1989)Proc Natl Acad Sci USA.；86：10029-33；PCT公开WO 90/07861所述。

可以使用任何合适的宿主细胞/载体系统来表达编码CDR移植的重链和轻链的DNA序列。可以使用细菌例如大肠杆菌和其它微生物系统，尤其是用于表达抗体片段如Fab和(Fab’)₂片段，特别是Fv片段和单链抗体片段，例如单链Fvs。可以使用真核例如哺乳动物宿主细胞表达系统，尤其是用于产生较大的CDR移植抗体产物，包括完整抗体分子。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞和骨髓瘤或杂交瘤细胞系。

可以将如上获得的抗体纯化直至均一(uniform)。例如，可以根据用于纯化和分离蛋白质的常规方法来纯化或分离抗体。例如，可以使用适当选择的柱层析(包括但不限于亲和层析)、过滤、超滤、盐析沉淀、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等点聚焦等的组合来分离开(separate)和单离出(isolate)抗体(Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow和David，Lane(编辑)，Cold SpringHarbor Laboratory，1988)。

可以使用蛋白A柱和蛋白G柱作为亲和柱。使用的示例性蛋白A柱包括Hyper D、POROS和Sepharose FF(Pharmacia)。

示例性层析(不包括亲和层析)包括离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析和吸附层析(“Strategies for Protein Purification and Characterization：ALaboratory Course Manual”Daniel R.Marshak等，(1996)Cold Spring HarborLaboratory Press.)。可以根据液相层析如HPLC或FPLC的规程进行所述层析。

例如，本发明抗体的抗原结合活性可以通过使用吸光度测量法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)和/或免疫荧光法来测量。在ELISA中，将本发明的抗体固定在平板上，向所述平板添加本发明的蛋白质，其后再添加包含期望的抗体的样品，如产生所述抗体细胞培养上清或纯化的抗体。然后添加识别第一抗体并用酶(如碱性磷酸酶)标记的第二抗体，并温育平板。清洗之后，向平板添加酶底物如磷酸对硝基苯酯，测量吸光度，并评估样品的抗原结合活性。蛋白片段(C末端或N末端片段等)可以按照与蛋白质相同的方式使用。可以使用BIAcore(Pharmacia)评估抗体的结合活性。

此外，将抑制REG4活性的一种或多种抗REG4抗体用于本发明的方法和组合物。在本发明中，优选的抗REG4抗体可中和REG4的促进胰腺癌细胞增殖的活性。可以在体外或体内评估抗REG4抗体的中和功能。例如，抗REG4抗体的中和功能可以通过观察该抗体对REG4表达细胞的增殖的影响来估计。具体而言，如果在使用本领域已知的任何方法测量时，可以检测到抗体对细胞增殖的抑制，那么可确认中和功能。或者，这种功能也可以通过对Akt信号传导途径的抑制来确认(Sekikawa A等，Gastroenterology 2005；128：642-53.；Bishnupuri KS等，Gastroenterology 2006；130：137-49.)。

在本发明中，可以将抗REG4抗体和非抗体性结合蛋白作为药剂向人或其它动物施用。在本发明中，可以对其施用所述抗体的动物除人以外包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、猫、犬、绵羊、猪、牛、猴、狒狒和黑猩猩。可以将所述抗体或非抗体性结合蛋白直接施用于受试者，另外也可以使用已知的药物配制方法将其配制成剂型。例如，取决于需要，可以将它们以可注射的形式非消化道施用，所述可注射形式例如无菌溶液或含水悬液或其它任意的药学可接受流体。例如，这种类型的化合物可以与可接受的载体或溶剂(solvent)特别是无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂、溶媒(solvent)、防腐剂、粘合剂等混合成通常认可的作为药剂使用所必须的单位剂量。

可以将包含生理盐水、葡萄糖和佐剂(如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇和氯化钠)的其它等渗溶液作为可注射水溶液使用。它们也可以与合适的增溶剂一起使用，所述增溶剂如醇，特别是乙醇和多元醇(例如，丙二醇和聚乙二醇)，和非离子表面活性剂(例如Polysorbate 80^TM和HCO-50)。

芝麻油或大豆油可以用作油状溶液，并且可以与作为增溶剂的苯甲酸苄酯或苯甲醇一起使用。缓冲溶液(磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液等)、止痛剂(盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(苯甲醇和苯酚等)和抗氧化剂可以用在所述制剂中。制成的注射剂可以装入合适的安瓿中。

在本发明中，抗REG4抗体和非抗体性结合蛋白可以例如动脉内、静脉内、经皮、鼻内、经支气管、局部或肌内施用于患者。通过滴注或注射的血管内(静脉内)施用是向胰腺癌患者系统施用抗体的常规方法的实例。此外，将动脉内导管插入到向癌细胞供应营养的静脉附近以局部注射抗癌剂如抗体制剂的方法对于胰腺癌的转移性病灶以及原发性病灶是有效的局部控制疗法。

虽然剂量和施用方法因患者体重和年龄以及施用方法而不同，可以由本领域技术人员常规地选择它们。此外，可以将编码抗体的DNA插入用于基因疗法的载体，并且可以施用所述载体用于治疗。剂量和施用方法根据患者体重、年龄和状况而变化，然而，本领域技术人员能够恰当地选择它们。通常首先施用一个较低的剂量，然后逐渐增加直至获得有效作用且无不良副作用。

可以将抗REG4抗体和非抗体性结合蛋白以能够确认对REG4有中和功能的量向活体施用。例如，尽管根据症状有一定量的差异，但是抗REG4抗体剂量是每天0.1mg至250mg/kg。通常，用于成人(60kg重)的剂量是每天5mg至17.5g，优选每天5mg至10g，并且更优选每天100mg至3g。剂量方案是一至十次，历时二至十天(over a two to ten day interval)，并且例如在三到六次施用之后观察进展。

或者，施用包含编码抗体、非抗体性结合蛋白或其功能衍生物的序列的核酸从而通过基因治疗的方式来治疗或预防与表达REG4的细胞有关的疾病，如胰腺癌包括PDAC。基因疗法指通过向受试者施用表达的或可表达的核酸来进行的治疗。在本发明的这种实施方案中，核酸产生由它们编码的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段介导预防或治疗作用。

根据本发明可以使用本领域任何可用的基因治疗方法。示例性方法在下文描述。

关于基因治疗方法的综述，参见Goldspiel等，(1993)Clin.Pharm.；12：488-505；Wu和Wu，(1991)Biotherapy.；3：87-95；Tolstoshev，(1993)Ann Rev Pharmacol Toxicol.；32：573-96；Mulligan，(1993)Science.；260：926-32；Morgan和Anderson，(1993)Ann Rev Biochem.；62：191-217；TrendsBiotechnol.；11(5)：155-215。可以使用的本领域公知的重组DNA技术的方法在Ausubel等(编著)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)中描述。

在优选的方面，本发明的组合物包含编码抗体或非抗体性结合蛋白的核酸，所述核酸是表达载体的一部分，该表达载体在合适的宿主中表达所述抗体或它的片段或嵌合蛋白或重链或轻链。具体而言，这些核酸具有启动子，优选异源启动子，其与抗体编码区可操作地连接，所述启动子是诱导型或组成型的，并且任选地具有组织特异性。在另一个具体实施方案中，在使用的核酸分子中，抗体编码序列和任何其它期望的序列的侧翼具有促进在基因组内期望位点发生同源重组的区域，如此为抗体编码核酸在染色体内表达提供了可能(Koller和Smithies，(1989)Proc Natl Acad Sci USA.；86：8932-5；Zijlstra等，(1989)Nature.；342：435-8)。在具体实施方案中，表达的抗体分子是单链抗体，或者，所述核酸序列包括编码抗体重链和轻链二者或它们片段的序列。

向受试者递送核酸可以是直接的，在这种情况下，将受试者直接曝露于核酸或携带核酸的载体；或者是间接的，在这种情况下，首先在体外用核酸转化细胞，然后再移植到受试者中。这两种方法分别称作体内或回体基因治疗。

在一个具体实施方案中，直接体内施用核酸序列，在体内核酸得到表达，产生编码产物。这能够通过本领域已知的多种方法中的任一种来完成，例如，通过将这些核酸序列构建成适当核酸表达载体的一部分并施用该载体从而使这些核酸序列进入胞内(become intracellular)，例如，通过使用缺陷性或减毒(attenuated)的反转录病毒或其它病毒载体进行感染(参见美国专利No.4,980,286)；或通过直接注射裸DNA；或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；生物弹射(Biolistic)，Dupont)；或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，包入脂质体、微粒或微胶囊中；或通过将它们与已知可入核的肽连接来加以施用，通过将其与可受到受体介导的胞吞作用的配体连接来加以施用(参见，例如Wu和Wu，(1987)J Biol Chem.；262：4429-32)(其可以用于靶向特异性表达所述受体的细胞类型)，等等。

在另一个实施方案中，可以形成核酸-配体复合物，其中所述配体包含破坏内体的融合(fusogenic)病毒肽，使所述核酸能够免于溶酶体的降解。在另一个实施方案中，通过靶向特异性受体，可以在体内将所述核酸作为细胞特异性摄取和表达的目标(参见，例如，PCT公开WO 92/06180、WO92/22635、WO92/20316、WO93/14188或WO 93/20221)。或者，可以将所述核酸导入胞内，并通过同源重组整合入宿主细胞DNA中进行表达(Koller和Smithies，(1989)Proc Natl Acad Sci USA.；86：8932-5；Zijlstra等，(1989)Nature.；342：435-8)。

在一个具体的实施方案中，使用包含编码本发明的抗体或其片段的核酸序列的病毒载体。例如，可以使用反转录病毒载体(参见Miller等，(1993)Methods Enzymol.；217：581-99)。这些反转录病毒载体含有正确包装病毒基因组并整合入宿主细胞DNA所必须的组分。将编码基因治疗中要使用的所述抗体或非抗体性结合蛋白的核酸序列克隆到一种或多种帮助将所述基因递送至受试者的载体中。关于反转录病毒载体的更多细节可参见Boesen等，(1994)Biotherapy.；6：291-302，其描述了应用反转录病毒载体将mdr 1基因递送至干细胞从而使所述干细胞对化疗更具抗性。其它说明反转录病毒载体在基因治疗中的用途的参考文献有：Clowes等，(1994)J Clin Invest.；93：644-51；Keim等，(1994)Blood.；83：1467-73；Salmons和Gunzberg，(1993)Hum GeneTher.；4：129-41；Grossman和Wilson，(1993)Curr Opin Genet Dev.；3：110-4。

腺病毒是另一种能够用于基因治疗的病毒载体。对于将基因递送至呼吸上皮，腺病毒是特别有吸引力的运载体。腺病毒天然感染呼吸上皮，在呼吸上皮引起轻微疾病。基于腺病毒的递送体系的其它靶标是肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染不分裂的细胞(non-dividing cells)的优势。Kozarsky和Wilson在(1993)Curr Opin Genet Dev.；3：499-503有对基于腺病毒的基因治疗的综述。Bout等在(1994)Hum Gene Ther.；5：3-10中演示了使用腺病毒载体将基因转移至猕猴的呼吸上皮的用途。腺病毒载体在基因治疗中的用途的其它实例可以参见Rosenfeld等，(1991)Science.；252：431-4；Rosenfeld等，(1992)Cell.；68：143-55；Mastrangeli等，(1993)J ClinInvest.；91：225-34；PCT公开WO94/12649；Wang等，(1995)GeneTher.；2：775-83。在一个优选的实施方案中，使用腺病毒载体。

腺伴随病毒(AAV)也被提议用于基因治疗(Walsh等，(1993)Proc Soc ExpBiol Med.；204：289-300；美国专利号5,436,146)。

另一种基因治疗方法涉及通过如电穿孔、脂质转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染等方法将基因转移至组织培养中的细胞中。通常，转移方法包括向细胞转移选择标记。然后将所述细胞置于选择条件下以分离已经摄取并且正在表达所转移基因的那些细胞。然后将这些细胞递送至受试者。

在这种实施方式中，将核酸导入细胞，然后将所得重组细胞施用到体内。这种导入可以通过本领域已知的任何方法进行，包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用包含所述核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞(microcell)介导的基因转移、原生质体融合等。本领域已知许多用于将外源基因导入细胞的技术(参见，例如，Loeffler和Behr，(1993)Methods Enzymol.；217：599-618；Cotton等，1993，Methods Enzymol.；217：618-44；Cline MJ.Pharmacol Ther.1985；29(1)：69-92.)，并且可以根据本发明使用，条件是不破坏受体细胞必需的发育和生理机能。所述技术应该提供核酸向细胞的稳定转移，从而使所述核酸能够由所述细胞表达，并且优选能够由其细胞后代遗传和表达。

可以将所得重组细胞通过本领域已知的多种方法递送至受试者。重组血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞(progenitor cells))优选静脉内施用。预计使用的细胞量依赖于期望的效果、患者状态等，并且能够由本领域技术人员来决定。

能够导入核酸用于基因治疗目的的细胞包括任何期望的、可用的细胞类型，包括但不限于上皮细胞，内皮细胞，角质形成细胞，成纤维细胞，肌细胞，肝细胞，血细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞，单核细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，巨核细胞，粒细胞；多种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如，获得自骨髓、脐带血、外周血、胚胎肝等的。在一个优选的实施方案中，用于基因治疗的细胞是与受试者自体同源的。

在一个基因治疗中使用重组细胞的实施方案中，将编码抗体或其片段的核酸序列导入细胞，从而使它们能够由所述细胞或细胞的后代表达，然后体内施用所述重组细胞以产生治疗作用。在一个具体的实施方案中，使用干细胞或祖细胞。任何能够体外分离并保持的干细胞和/或祖细胞均有可能根据本发明的这种实施方案加以使用(参见例如，PCT公开WO 94/08598；Stemple和Anderson，(1992)Cell.；71：973-85；Rheinwald.(1980)Methods CellBiol.；21A：229-54；Pittelkow和Scott，(1986)Mayo Clin Proc.；61：771-7)。

在一个具体的实施方案中，为了基因治疗目的导入的核酸包含与编码区可操作地连接的诱导型启动子，从而使所述核酸的表达能够通过控制适当转录诱导物的有无来调控。

此外，本发明提供免疫原性组合物，用于诱导包含针对REG4的中和功能的抗体，其中所述组合物包含作为活性成分的REG4或免疫学活性的REG4片段，或能够表达它们的DNA或细胞。或者，本发明涉及REG4或免疫学活性的REG4片段、或者编码它们的DNA或细胞在制备用于诱导包含针对REG4的中和功能的抗体的免疫原性组合物中的用途。

在本发明中，对REG4以自分泌/旁分泌的方式促进细胞增殖的活性的中和可通过施用抗REG4抗体来达成。因此，如果能够体内诱导REG4抗体，那么能够实现等同于抗体施用的治疗效果。当施用包含抗原的免疫原性组合物时，能够在体内诱导目标抗体。因此本发明的免疫原性组合物在针对表达REG4的细胞的疫苗疗法中尤其有用。如此，本发明的免疫原性组合物可有效地作为例如用于胰腺癌治疗的疫苗组合物。

本发明的免疫原性组合物可以包含REG4或免疫学活性的REG4片段作为活性成分。免疫学活性的REG4片段指能够诱导抗REG4抗体的片段，所述抗REG4抗体识别REG4并且包含中和功能。在下文中，将REG4和免疫学活性的REG4片段描述为免疫原性蛋白。给定的片段是否诱导目标抗体可通过实际免疫动物并确认诱导的抗体的活性来测定。进行抗体诱导及其活性的确认可以例如使用实施例中描述的方法。

本发明的免疫原性组合物包含药学可接受的载体以及作为活性成分的免疫原性蛋白。如有必要，所述组合物也可以与佐剂组合。灭活的结核病菌、白喉毒素、皂苷等可以用作佐剂。

或者，编码免疫原性蛋白的DNA或以可表达状态保有这些DNA的细胞可以用作免疫原性组合物。使用表达目标抗原的DNA(所谓的DNA疫苗)作为免疫原的方法是公知的。DNA疫苗可以通过将编码REG4或其片段的DNA插入适当的表达载体来获得。

反转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、仙台病毒载体等可以作为载体使用。此外，可将这样的DNA直接作为裸DNA导入细胞，然后进行表达：在所述DNA中编码免疫原性蛋白的DNA功能性连接于启动子的下游。可以将裸DNA包入脂质体或病毒包膜载体中并导入细胞中。

如上所述，本发明提供用于诱导抗体的方法，所述抗体包含针对REG4的中和功能，其中所述方法包括施用REG4、免疫学活性REG4片段、或能够表达它们的DNA或细胞的步骤。本发明的方法诱导包含中和功能的抗体，其抑制表达REG4的细胞如胰腺癌的细胞生长。由此能够获得对胰腺癌等的治疗效果。

抑制KIAA0101的显性失活蛋白

本发明涉及包含QKGIGEFF(SEQ ID NO：46)的抑制性多肽。在一些优选的实施方案中，抑制性多肽包含QKGIGEFF(SEQ ID NO：46)；与所述多肽功能等同的多肽；或编码这些多肽的多核苷酸；其中所述多肽缺乏由SEQID NO：40组成的肽的生物学功能。SEQ ID NO：40中所示的氨基酸序列公开在WO2004/31412中。已知通过抑制所述氨基酸序列的表达可以控制癌细胞增殖。然而，本发明人证明的新发现是，包含在上述氨基酸序列中具有特定突变的序列的片段可抑制癌细胞增殖。

包含本发明所选氨基酸序列的多肽可以是任意长度，只要所述多肽抑制癌细胞增殖。具体而言，所述氨基酸序列的长度范围可以是8-70个残基，例如8-50，优选8-30，更具体为8-20，还更具体为8-16个残基。例如，氨基酸序列VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK/SEQ ID NO.44是作为上述所选氨基酸序列的优选。因此，包含或组成为氨基酸序列TPKWQKGIGEFFRLSP/SEQID NO.45的多肽是本发明中多肽的优选实例。本发明的多肽，其特征在于包含氨基酸序列QKGIGEFF/SEQ ID NO：46，所述多肽也可以称为“PIP结合基序(PIP框)”。

本发明的多肽可以包含两个或更多个“所选氨基酸序列”。所述两个或更多个“所选氨基酸序列”可以是相同的或不同的氨基酸序列。此外，“所选氨基酸序列”可以直接相连。或者，可以在它们之间安排任何间插序列。

另外，本发明涉及与本文具体公开的QKGIGEFF/SEQ ID NO：46多肽同源(即，享有序列同一性)的多肽。在本发明中，与QKGIGEFF/SEQ ID NO：46多肽同源的多肽是包含选自一个或几个氨基酸残基的添加、缺失、取代和插入的任何突变、并与QKGIGEFF/SEQ ID NO：46多肽在功能上等同的那些多肽。短语“与QKGIGEFF/SEQ ID NO：46多肽在功能上等同”指具有抑制KIAA0101与PCNA结合的功能。QKGIGEFF/SEQ ID NO：46序列在与QKGIGEFF/SEQ ID NO：46多肽在功能上等同的多肽的组成氨基酸序列中优选是保守的。因此，在本发明中与QKGIGEFF/SEQ ID NO：46肽在功能上等同的多肽优选在QKGIGEFF/SEQ ID NO：46序列之外的位点中具有氨基酸突变。在本发明中与QKGIGEFF/SEQ ID NO：46肽在功能上等同的多肽的氨基酸序列保留QKGIGEFF/SEQ ID NO：46序列，并且与“所选氨基酸序列”具有60％或更高、通常为70％或更高、优选80％或更高、更优选90％或更高、或者95％或更高、和更优选98％或更高的同源性。氨基酸同源性可以使用本领域公知的算法来测定，例如，设置为它们的缺省设定的BLAST或ALIGN。

或者，不具体限制可以突变的氨基酸的数目，只要保留QKGIGEFF/SEQID NO：46肽的活性。通常，可以突变多至约50个氨基酸，优选多至约30个氨基酸，更优选多至约10个氨基酸，并且甚至更优选多至约3个氨基酸。同样，不具体限制突变的位点，只要所述突变不导致对QKGIGEFF/SEQ IDNO：46肽活性的破坏。

在一个优选的实施方案中，QKGIGEFF/SEQ ID NO：46肽的活性包括在表达KIAA0101的细胞(即胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞和膀胱癌细胞)中的凋亡诱导作用。凋亡的意思是由细胞自身引起的细胞死亡，有时称为程序性细胞死亡。在经历凋亡的细胞中观察到核染色体的聚集、核的碎裂或细胞质的浓缩。用于检测凋亡的方法是公知的。例如，凋亡可以通过TUNEL染色(Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick EndLabeling(末端脱氧核苷酸转移酶生物素-dUTP切口端标记)；Gavrieli等，(1992)J.Cell Biol.119：493-501；Mori等，(1994)Anat.&Embryol.190：21-28)来确认。或者，DNA梯测定法(DNA ladder assay)、膜联蛋白V染色(AnnexinV staining)、胱天蛋白酶测定法、电子显微术或对核或细胞膜构象变化的观察可以用于检测凋亡。任何可商购的试剂盒可以用于检测细胞中的这些由凋亡诱导的行为。例如，这些凋亡检测试剂盒可以从以下供应商处以商业方法获得：

LabChem Inc.，

Promega，

BD Biosciences Pharmingen，

Calbiochem，

Takara Bio Company(CLONTECH Inc.)，

CHEMICON International，Inc，

Medical&Biological Laboratories Co.，Ltd.等。

本发明的多肽可以基于所选氨基酸序列从任何位置化学合成。在常规肽化学中使用的方法可以用于合成多肽的方法。具体而言，所述方法包括在以下文献和日本专利公布中描述的那些：

Peptide Synthesis(肽合成)，Interscience，New York，1966；The Proteins，Vol.2，Academic Press Inc.，New York，1976；

Peputido gousei(肽合成)，Maruzen(Inc.)，1975；

Peputido gousei no kiso to jikken(肽合成基础和实验)，Maruzen(Inc.)，1985；

Iyakuhin no kaihatsu(药物开发)，Sequel，Vol.14：Peputido gousei(肽合成)，Hirokawa Shoten，1991；

国际专利公布WO99/67288。

本发明的多肽也可以通过已知的遗传工程技术合成。遗传工程技术的实例如下。具体而言，将编码期望的肽的DNA导入适当的宿主细胞以制备转化细胞。本发明的多肽可以通过回收由这种转化细胞产生的多肽来获得。或者，期望的多肽可以用体外翻译系统合成，所述系统在体外重建多肽合成所必需的元件。

当使用遗传工程技术时，本发明的多肽可以与具有不同氨基酸序列的肽一起作为融合蛋白表达。表达期望的融合蛋白的载体可以这样获得，通过将编码本发明多肽的多核苷酸与编码不同肽的多核苷酸连接，并使它们处于相同的读码框中，然后将所得核苷酸导入表达载体。通过用所得载体转化适当宿主来表达所述融合蛋白。在形成融合蛋白中使用的不同的肽包括以下肽：

FLAG(Hopp等，(1988)BioTechnology 6，1204-10)，

由六个His(组氨酸)残基组成的6xHis、10xHis，

流感血凝素(HA)，

人c-myc片段，

VSV-GP片段，

p18HIV片段，

T7-标签，

HSV-标签，

E-标签，

SV40T抗原片段，

lck标签，

α-微管蛋白片段，

B-标签，

蛋白C片段，

GST(谷胱甘肽-S-转移酶)，

HA(流感血凝素)，

免疫球蛋白恒定区，

β-半乳糖苷酶，和

MBP(麦芽糖结合蛋白)。

本发明的多肽可以通过用适当的蛋白酶处理如此产生的融合蛋白，然后回收期望的多肽来获得。为了纯化所述多肽，预先用与所述融合蛋白结合的亲和层析捕获融合蛋白，然后可以将捕获的融合蛋白用蛋白酶处理。使用蛋白酶处理，使期望的多肽与亲和层析分开，并以高纯度回收期望的多肽。

本发明的多肽包括经修饰的多肽。在本发明中，术语“修饰的”指，例如，与其它物质结合。因此，在本发明中，本发明的多肽可进一步包含其它物质如细胞膜透过性物质。所述其它物质包括有机化合物如肽、脂质、糖和多种天然存在的或合成的聚合物。本发明的多肽可以具有任何修饰，只要所述多肽保留期望的抑制KIAA0101与PCNA结合的活性。在一些实施方案中，所述抑制性多肽能够直接与KIAA0101竞争与PCNA的结合。修饰也可以为本发明的多肽赋予附加功能。附加功能的实例包括可靶向性(targetability)、可递送性(deliverability)和稳定化(stablization)。

在本发明中修饰的优选实例包括，例如，导入细胞膜透过性物质。通常，胞内结构通过细胞膜与外界隔绝。因此，难以有效地将胞外物质导入细胞。可以通过用细胞膜透过性物质修饰本发明的多肽来赋予所述多肽细胞膜透过性。这样一来，通过将本发明的多肽与细胞接触，可以将所述多肽递送至细胞内从而作用于该细胞。

“细胞膜透过性物质”指能够穿透哺乳动物细胞膜而进入细胞质的物质。例如，某些脂质体与细胞膜融合，从而将内容物释放至细胞中。同时，某些类型的多肽穿透哺乳动物的细胞质膜而进入细胞内部。对于具有这种细胞进入活性的多肽，优选使用本发明中的细胞质膜等作为这样的物质。具体而言，本发明包括具有以下通式的多肽。

[R]-[D]；

其中，

[R]代表细胞膜透过性物质；[D]代表包含QKGIGEFF/SEQ ID NO：46的片段序列。在上述通式中，[R]和[D]可以直接相连，或通过接头间接相连。肽、具有多个官能团的化合物等可以用作接头。具体而言，包含-GGG-的氨基酸序列可以作为接头使用。或者，可以将细胞膜透过性物质和包含所选序列的多肽结合在微粒表面。[R]可以与[D]的任意位置结合。具体而言，[R]可以与[D]的N末端或C末端结合，或者与组成[D]的氨基酸的侧链结合。此外，可以将超过一个[R]分子与一个分子的[D]结合。[R]分子可以导入[D]分子上的不同位置。或者，[D]可以用多个连接在一起的[R]修饰。

例如，已经报道了多种天然存在的或人工合成的具有细胞膜透过性的多肽(Joliot A.和Prochiantz A.，Nat Cell Biol.2004；6：189-96)。所有这些已知的细胞膜透过性物质均可以在本发明中用于修饰多肽。在本发明中，例如，选自下组的任何物质可以用作上述的细胞膜透过性物质：

多聚精氨酸；Matsushita等，(2003)J.Neurosci.；21，6000-7.

[Tat/RKKRRQRRR](SEQ ID NO：47)Frankel等，(1988)Cell 55，1189-93.

Green和Loewenstein(1988)Cell 55，1179-88.

[Penetratin/RQIKIWFQNRRMKWKK](SEQ ID NO：48)

Derossi等，(1994)J.Biol.Chem.269，10444-50.

[Buforin II/TRS SRAGLQFPVGRVHRLLRK](SEQ ID NO：49)

Park等，(2000)Proc.Natl Acad.Sci.USA 97，8245-50.

[Transportan/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL](SEQ ID NO：50)

Pooga等，(1998)FASEB J.12，67-77.

[MAP(模式两性肽)/KLALKLALKALKAALKLA](SEQ ID NO：51)

Oehlke等，(1998)Biochim.Biophys.Acta.1414，127-39.

[K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP](SEQ ID NO：52)

Lin等，(1995)J.Biol.Chem.270，14255-8.

[Ku70/VPMLK](SEQ ID NO：53)

Sawada等，(2003)Nature Cell Biol.5，352-7.

[Ku70/PMLKE](SEQ ID NO：61)

Sawada等，(2003)Nature Cell Biol.5，352-7.

[朊病毒/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP](SEQ ID NO：54)

Lundberg等，(2002)Biochem.Biophys.Res.Commun.299，85-90.

[pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK](SEQ ID NO：55)

Elmquist等，(2001)Exp.Cell Res.269，237-44.

[Pep-1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV](SEQ ID NO：56)

Morris等，(2001)Nature Biotechnol.19，1173-6.

[SynB 1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR](SEQ ID NO：57)

Rousselle等，(2000)Mol.Pharmacol.57，679-86.

[Pep-7/SDLWEMMMVSLACQY](SEQ ID NO：58)

Gao等，(2002)Bioorg.Med.Chem.10，4057-65.

[HN-1/TSPLNIHNGQKL](SEQ ID NO：59)

Hong和Clayman(2000)Cancer Res.60，6551-6。

在本发明中，上文作为细胞膜透过性物质实例列出的多聚精氨酸由任意数目的精氨酸残基组成。具体而言，例如，其由连续的5-20个精氨酸残基组成。精氨酸残基的优选数目是11(SEQ ID NO：60)。

包含QKGIGEFF/SEQ ID NO：46的药物组合物

本发明的多肽抑制癌细胞的增殖。因此，本发明为癌症提供治疗和/或预防剂，其包含作为活性成分的包含QKGIGEFF/SEQ ID NO：46的多肽；或编码该多肽的多核苷酸。或者，本发明涉及用于治疗和/或预防癌症的方法，其包括施用本发明的多肽的步骤。此外，本发明涉及本发明的多肽在制造治疗和/或预防癌症的药物组合物中的用途。能够通过本发明治疗或预防的癌症不受限制，只要在癌细胞中KIAA0101的表达有所上调。例如，本发明的多肽可用于治疗胰腺癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌或睾丸肿瘤。其中，胰腺癌作为本发明中治疗或预防的靶标是尤其优选的。

或者，本发明的抑制性多肽可以用于诱导癌细胞的凋亡。因此，本发明提供细胞的凋亡诱导剂，其包含作为活性成分的包含QKGIGEFF/SEQ ID NO：46的多肽；或编码该多肽的多核苷酸。本发明的凋亡诱导剂可以用于治疗细胞增殖性疾病如癌症。能够通过本发明治疗或预防的癌症不受限制，只要在癌细胞中KIAA0101的表达有所上调。例如，本发明的多肽可以用于治疗胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、肾癌或睾丸肿瘤。其中，胰腺癌作为本发明中治疗或预防的靶标是尤其优选的。或者，本发明涉及诱导细胞凋亡的方法，其包括施用本发明的多肽的步骤。此外，本发明涉及本发明的多肽在制造在细胞中诱导凋亡的药物组合物中的用途。

本发明的抑制性多肽在表达KIAA0101的细胞如胰腺癌中诱导凋亡。同时，在大多数正常器官中未观察到KIAA0101表达。在一些正常器官中，KIAA0101的表达水平与癌组织相比相对较低。因此，本发明的多肽可以特异性地在癌细胞中诱导凋亡。

当向人和其它哺乳动物如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、犬、绵羊、猪、牛、猴、狒狒和黑猩猩施用本发明的多肽(作为制成的药物)来治疗癌症或诱导细胞凋亡时，可以将分离的化合物直接施用，或者使用已知用于制备药物的方法配制成适当的剂型。例如，如有必要，所述药物可以作为糖衣片剂、胶囊、酏剂和微胶囊口服施用，或者以注射形式进行非消化道施用，所述注射形式是无菌溶液或含水悬液或任何其它药学可接受液体。例如，所述化合物可以与药理学可接受的载体或介质，具体而言是无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、矫正药(corrigent)、赋形剂、媒介物、防腐剂和粘合剂混合成制备通常认可的药物所必须的单位剂型(unitdosage form)。取决于这些制剂中活性成分的量，可以在指定的范围内决定合适的剂量。

可以混合在片剂和胶囊中的添加剂的实例是粘合剂如明胶、玉米淀粉、西黄蓍胶和阿拉伯树胶；介质如结晶纤维素；膨胀剂如玉米淀粉、明胶和褐藻酸；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精；和矫正药如薄荷、冬青油和樱桃。当单位剂型是胶囊时，在上述成分中可以进一步包括液态载体如油。注射用无菌混合物可以使用介质如注射用蒸馏水根据对常规药物的认识来配制。

生理盐水、葡萄糖和含有佐剂如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇和氯化钠的其它等渗溶液可以用作注射用水溶液。它们可以与合适的增溶剂联用，所述增溶剂例如醇，具体而言是乙醇和多元醇如丙二醇和聚乙二醇，非离子表面活性剂如Polysorbate 80TM和HCO-50。

芝麻油或大豆油可以用作油性液体，并且还可以与作为增溶剂的苯甲酸苄酯或苯甲醇一起使用。此外，它们可以进一步以下物质一起配制：缓冲液如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液；止痛剂如盐酸普鲁卡因；稳定剂如苯甲醇和苯酚；以及抗氧化剂。如此制成的注射剂可以装入合适的安瓿中。

本领域技术人员熟知的方法可以用于向患者施用本发明的药物化合物，例如，通过动脉内、静脉内或皮下注射，以及类似地通过鼻内、经气管、肌内或口服施用。剂量和施用方法取决于患者的体重和年龄以及施用方法而不同。然而，本领域的技术人员能够按照常规选择它们。编码本发明的多肽的DNA可以插入用于基因治疗的载体，并且可以施用该载体用于治疗。尽管剂量和施用方法依赖于患者的体重、年龄和症状而有所不同，但是本领域的那些技术人员能够适当地选择它们。例如，当向正常成人(体重60kg)口服施用时，尽管取决于症状有些许变化，与本发明的多肽结合从而调节它们的活性的化合物的剂量是每天约0.1mg至约100mg，优选每天约1.0mg至约50mg，更优选约1.0mg至约20mg。

当向正常成人(体重60kg)以注射形式非消化道施用所述化合物时，尽管取决于患者、靶器官、症状和施用方法而存在些许变化，但方便的是静脉注射每天约0.01mg至约30mg的剂量，优选每天约0.1mg至约20mg，更优选每天约0.1mg至约10mg。类似地，可以按照从60kg体重所用剂量换算的量向其它动物施用所述化合物。

药物组合物：

因此，本发明包括可用于预防和/或治疗癌症的药物和方法。这些药物和方法至少包含可有效实现削弱或阻止疾病细胞增殖的量的下述物质：抑制REG4或KIAA0101表达的siRNA、中和REG4活性的抗体、包含QKGIGEFF/SEQ ID NO：46的多肽、与所述多肽在功能上等同的多肽、或编码本发明的那些多肽的多核苷酸。更具体地，在本发明的上下文中，治疗有效量的意思是有效阻止接受治疗的受试者已有症状的发展或减轻接受治疗的受试者的已有症状的量。

用本发明的方法治疗的个体包括任何罹患癌症的个体，所述癌症例如胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌。这样的个体可以是，例如，脊椎动物如哺乳动物，包括人、犬、猫、马、牛或山羊；或任何其它动物，特别是商业上重要的动物或驯养的动物。就本发明而言，标志蛋白表达的升高指一种或两种标志蛋白的平均细胞标志蛋白浓度在正常平均细胞标志蛋白浓度以上至少10％，优选15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或更多。

在本发明的上下文中，合适的药物制剂包括适于口服、直肠、鼻、局部(包括含服和舌下)、阴道或非消化道(包括肌内、皮下和静脉内)施用的那些，或适于通过吸入或吹入施用的那些。优选地，施用是静脉内的。所述制剂任选地包装成离散的剂量单位。

适用于口服施用的药物制剂包括胶囊、扁囊剂(cachets)或片剂，每种都含有预定量的活性成分。合适的制剂还包括粉末、颗粒、溶液、悬液和乳剂。可将活性成分任选地作为大丸糖剂(bolus electuary)或糊剂(paste)施用。用于口服施用的片剂和胶囊可以含有常规的赋形剂，例如，填充剂如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇，纤维素制备物如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，粘合剂，润滑剂，和/或湿润剂。如果需要，可以添加崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，或褐藻酸或其盐如褐藻酸钠。

片剂可通过压缩或成型来制备，任选与一种或多种配方成分压缩或成型。压缩片剂可通过如下方法制备：将自由流动形式的活性成分，如粉末或颗粒，任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性剂和/或分散剂混合，在适当的机器中进行压缩。成型片剂可通过如下方法制备：在适当的机器中对利用惰性液体稀释剂湿润的粉末化合物的混合物进行成型。所述片剂可根据本领域已知的方法进行包衣(coated)。口服液体制备物可以是例如水性或油性的悬液、溶液、乳剂、糖浆或酏剂的形式；或者也可以作为干燥产物提供，在使用前用水或其它适宜的媒介物(vehicle)复溶。这些液体制备物可含有常规添加剂如悬浮剂，乳化剂，非水性媒介物(可包括食用油)，pH维持剂，和/或防腐剂。片剂可任选地配制以提供其中活性成分的缓释或控释。片剂的包装可以包含每月服用的一片药物。

适于非消化道施用的制剂包括水性和非水性的无菌注射溶液，其中任选地含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂(bacteriostat)和使得该制剂与目标接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性的无菌悬液，其中含有悬浮剂和/或增稠剂。所述制剂可以以单位剂量或多次剂量容器(unit dose or multi-dosecontainer)提供，例如密封的安瓿和小瓶；还可以在冷冻-干燥(冻干的)条件下保存，仅需要在即将使用前添加无菌液体载体例如盐水、注射用水。或者，可提供所述制剂用于连续输注(continuous infusion)。可以从前述类型的无菌粉末、颗粒及片剂制备即配即用的注射溶液和悬液。

适于直肠施用的制剂包括含有标准载体如可可脂或聚乙二醇的栓剂(suppository)。适于口内局部施用，例如含服或舌下施用的制剂包括锭剂(lozenge)和软锭剂(pastille)，其中锭剂在调味基质，如蔗糖和阿拉伯胶(acacia)或西黄蓍胶中包含活性成分，而软锭剂在基质，如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中包含活性成分。鼻内施用时，本发明的化合物可以用作液体喷雾剂、可分散粉末，或以滴剂(drop)的形式。滴剂可用水性或非水性基质配制，该基质中也含有一种或多种分散剂、增溶剂和/或悬浮剂。

通过吸入施用时，可以由吹入器、雾化器、加压包装(pressurized pack)或其它输送气溶胶喷雾的便利装置方便地递送化合物。压缩的包装可含有合适的推进剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压气溶胶的情况下，可通过提供定量输送的阀门来确定剂量单位。

或者，通过吸入或吹入施用时，化合物可以采取干粉组合物的形式，例如该化合物与适宜粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末组合物可以以单位剂型提供，这些单位剂型例如胶囊、药筒(cartridge)、凝胶(gelatin)或发泡包装(blister pack)，借助吸入器或吹入器，可由上述剂型施用所述粉末。

其它的制剂包含可释放治疗剂的可植入装置及粘性贴片(adhesivepatches)。

需要时，可以采用适于活性成分进行缓释的上述制剂。药物组合物中还可以含有其它活性成分，如抗微生物剂，免疫抑制剂和/或防腐剂。

应该理解，除了以上具体描述的成分，本发明的制剂还可包括本领域针对所讨论制剂类型而言常规使用的其它作用剂。例如，适于口服施用的制剂可包括调味剂。

对于本领域技术人员显而易见的是，依赖于例如施用途径、施用的测试化合物浓度或处理中是否使用了包括蛋白质、编码所述测试化合物的核酸或能够分泌测试化合物的细胞作为活性成分，某些赋形剂可能是更优选的。

本发明的药物组合物可以按照本身已知的方式制备，例如，通过常规的混合、溶解、制粒(granulating)、锭剂制备(dragee-making)、水磨(levigating)、乳化、胶囊化、包埋(entrapping)或冻干方法。恰当的制剂取决于所选的施用途径。

剂量给药和计划(Dosing and Scheduling)

为本发明的药物决定有效剂量范围完全在本领域技术人员的能力范围之内，特别是在本文的详细公开的启发下。可以首先由细胞培养测试法和/或动物模型来估计测试化合物的治疗有效剂量。例如，可以在动物模型中配制剂量以达到某个循环浓度范围，该范围中包括在细胞培养物中测定的IC₅₀(50％的细胞显示期望效果的剂量)。测试化合物的毒性和治疗功效也可以通过标准药物规程在细胞培养物或实验动物中测定，例如，测定LD₅₀(对群体的50％致死的剂量)和ED₅₀(在群体的50％中有治疗效果的剂量)。毒性作用和治疗作用的剂量比为治疗指数(即，LD₅₀和ED₅₀的比)。呈现高治疗指数的化合物是优选的。从这些细胞培养测试法和动物研究获得的数据可用来为在人中的使用配制剂量范围。这些化合物的剂量可能处于这样的循环浓度范围内，其中包括ED₅₀，具有非常小的毒性或者无毒。依赖于采用的剂型和应用的施用途径，剂量可以在这个范围内变化。确切的制剂、施用的途径和剂量可以由独立的医师参考患者的状况来选择。参见，例如，在Fingl等，(1975)”The Pharmacological Basis of Therapeutics“(《治疗的药理学基础》)中的第1章第1页。剂量和间隔可以单独地调整以提供足以维持期望效果的活性测试化合物血浆水平。

特别地，对于上述每一种状况，组合物(例如多肽和有机化合物)可以口服施用或藉由注射施用，按照范围在每天约0.1至约250mg的剂量。用于成年人的剂量范围通常是每天约5mg至约17.5g，优选每天约5mg至约10g，并且最优选每天约100mg至约3g。片剂或其它以离散单位提供的包装规格的单位剂型可以方便地包含在该剂量有效的量，或是作为多个这样的剂量有效的量，例如，含有约5mg至约500mg，通常为约100mg至约500mg的单位。

采用的剂量将依赖于多种因素，包括受试者的年龄和性别，受治疗的准确病症及其严重程度。施用的途径也可以依赖于症状及其严重程度而变化。无论如何，合适的和最优的剂量可以由本领域技术人员考虑上述因素按照常规计算。

通常，如下决定一种或多种REG4或KIAA0101抑制剂的有效量：首先施用低剂量或少量的某种REG4和/或KIAA0101抑制剂，然后逐渐增加施用的剂量，和/或按照需要添加第二种REG4和/或KIAA0101抑制剂，直到在治疗的受试者中观察到期望的效果，即抑制或防止由异常REG4和/或KIAA0101过表达或胞内信号传导所介导的癌症，并且毒性副作用最小或无毒性副作用。可用来为本发明药物组合物的施用决定合适的剂量和给药时间安排的方法在例如Goodman和Gilman′s The Pharmacological Basis ofTherapeutics，11th Ed.，Brunton等，，Eds.，McGraw-Hill(2006)和Remington：The Science and Practice of Pharmacy，21st Ed.，University of the Sciences inPhiladelphia(USIP)，Lippincott Williams&Wilkins(2005)中有述，将这两篇文献通过引用纳入本文。

基因治疗

抑制REG4或KIAA0101表达的siRNA、中和REG4活性的抗体、确定为抑制KIAA0101/PCNA结合间相互作用的细胞透过性显性失活肽可以使用基因治疗来治疗性递送给患有癌症的患者。或者，包含所述中和抗体或本发明的QKGIGEFF/SEQ ID NO：46的多肽也可以用作直接改变REG4活性或KIAA0101/PCNA结合的肽。在一些方面，基因治疗实施方案包括核酸序列，其编码合适的本发明鉴定的肽。在优选的实施方案中，所述核酸序列包括在靶细胞中表达所述肽所必须的调控元件。可以装配所述核酸以将其稳定插入靶细胞的基因组(参见例如，Thomas和Capecchi，(1987)Cell 51：503对同源重组表达盒载体(homologous recombination cassettes vectors)的描述)。

核酸向患者中的递送可以是直接的，在这种情况下使患者直接曝露于所述核酸或携带核酸的载体；或是间接的，在这种情况下，首先在体外用所述核酸转化细胞，然后再移植至患者体内。这两种方法分别称为体内基因治疗或回体基因治疗。

关于基因治疗方法的综述，参见Goldspiel等，(1993)Clinical Pharmacy12：488-505；Wu和Wu，(1991)Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev，(1993)Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.33：573-96；Mulligan，(1993)Science 260：926-32；和Morgan和Anderson，(1993)Ann.Rev.Biochem.62：191-217；(1993)Trends Biotechnol.11(5)：155-215。能够使用的本领域公知的重组DNA技术方法在Ausubel等(编著)，1993，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY；和Kriegler，(1990)，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，StocktonPress，NY中有述。

诊断癌症的化放疗抗性

术语“诊断”旨在包含预测和可能性分析。本方法意欲在临床上用于作出有关癌症的治疗模式(treatment modalities)(包括治疗性介入(therapeuticintervention))、诊断标准如疾病阶段，以及疾病监控和监视的相关决定。

诊断癌症的化放疗抗性的方法

发现外科样品中REG4的表达在患有化放疗(chemo-radiation therapy)抗性胰腺癌的患者体内有特异性的升高。因此，本文鉴定的REG4基因以及其转录和翻译产物可作为癌症的化放疗抗性的标志物应用，并且通过测量细胞样品中REG4基因的表达，能够诊断癌症的化放疗抗性。具体而言，本发明提供以下方法，用于通过测定受试者中REG4的表达水平来诊断癌症的化放疗抗性：

[1]用于诊断受试者中癌症的化放疗抗性的方法，其包括以下步骤：测定源自受试者的生物样品中REG4基因的表达水平，其中所述表达水平与该基因的正常对照水平相比增加说明受试者患有化放疗抗性癌症或处于化放疗抗性的危险中。

[2][1]的方法，其中所述表达水平比正常对照水平高至少10％。

[3][1]的方法，其中所述表达水平通过选自下组的任一方法测定：

(a)检测所述基因的mRNA；

(b)检测所述基因编码的蛋白质；和

(c)检测所述基因编码的蛋白质的生物活性。

[4][3]的方法，其中所述表达水平通过检测探针与该基因的基因转录物的杂交来测定。

[5][4]的方法，其中所述杂交步骤在DNA阵列上进行。

[6][3]的方法，其中所述表达水平这样来测定，检测针对REG4基因编码蛋白的抗体的结合作为该基因的表达水平。

[7][1]的方法，其中所述生物样品包含活组织检查样品(biopsy)、痰(sputum)或血液。

[8][1]的方法，其中所述源自受试者的生物样品包含上皮细胞。

[9][1]的方法，其中所述源自受试者的生物样品包含癌细胞。

[10][1]的方法，其中所述源自受试者的生物样品包含癌性上皮细胞。

[11][1]的方法，其中所述癌是胰腺癌。

待由本方法诊断的受试者优选是哺乳动物。示例性哺乳动物包括，但不限于，例如，人、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马和牛。

优选从待诊断的受试者收集生物样品来进行诊断。任何生物材料可以用作测定用的生物样品，只要其包含REG4的目标转录或翻译产物。生物样品包括，但不限于，机体组织和体液，如血液、痰和尿。优选地，生物样品含有细胞群体，该细胞群体包含上皮细胞，更优选癌性上皮细胞或源自疑似为癌性的组织的上皮细胞。另外，如有必要，可以从获得的机体组织和体液纯化细胞，然后再用作生物组织。

根据本发明，测定源自受试者的生物样品中REG4的表达水平。表达水平可以使用本领域已知的方法在转录(核酸)产物水平测定。例如，可以使用探针通过杂交方法(例如，Northern杂交)定量REG4的mRNA。检测可以在芯片或阵列上进行。阵列的使用对于检测包括REG4在内的多种基因(例如，多种癌特异性基因)的表达水平是优选的。本领域技术人员能够利用REG4的序列信息(SEQ ID NO：1 GenBank登录号AY126670)制备这样的探针。例如，可以使用REG4的cDNA作为探针。如有必要，探针可以用合适的标记物加以标记，所述标记物如染料、荧光剂和同位素，基因的表达水平可以根据杂交的标记物的强度来检测。

另外，REG4的转录产物可以使用引物通过基于扩增的检测方法(例如，RT-PCR)来定量。这些引物也可以基于基因的可用序列信息来制备。例如，实施例中使用的引物(SEQ ID NO：3和4)可以用于通过RT-PCR或Northern印迹的检测，但本发明不限于此。具体而言，用于本方法的探针或引物在严紧、中等严紧或低严紧条件下与REG4的mRNA杂交。如用于本文，短语“严紧(杂交)条件”在“小干扰RNA”部分已有说明。

或者，为了本发明的诊断可以检测翻译产物。例如，可以测定REG4蛋白的量。用于测定作为翻译产物的蛋白质的量的方法包括免疫测定法，其中使用特异性识别所述蛋白质的抗体。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。另外，所述抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于检测，只要该片段保留了对REG4蛋白的结合能力。制备这些用于蛋白质检测的抗体类型的方法是本领域公知的，在本发明中可以采用任何方法制备这样的抗体及其等同物。

作为另一种基于其翻译产物检测REG4基因表达水平的方法，可以使用抗REG4蛋白的抗体藉由免疫组织化学分析来观察染色强度。即，观察到强染色说明蛋白质存在的增加，同时也说明REG4基因的高表达水平。另外，翻译产物可以基于其生物活性来检测。

如果生物样品中REG4基因的表达水平比REG4基因的对照水平增加了例如10％、25％或50％，或增加至超过1.1倍、超过1.5倍、超过2.0倍、超过5.0倍、超过10.0倍或更多，那么可以认为该生物样品中REG4基因的表达水平是增加的。

通过使用先前从疾病状态(癌性或非癌性)已知的一个/多个受试者收集并储存的样品，可以在测定测试生物样品的同时测定对照水平。或者，可以通过分析先前测定的来自疾病状态已知的受试者的样品中REG4基因的表达水平，基于所述分析获得的结果，通过统计学方法来确定对照水平。另外，对照水平可以是来自先前测试的细胞的表达模式(expression pattern)数据库。此外，根据本发明的一个方面，可以将生物样品中REG4基因的表达水平与多个对照水平比较，这些对照水平是从多个参考样品测定的。优选使用的对照水平是从这样的参考样品测定的，所述参考样品所来源组织类型与患者来源生物样品的组织类型相似。此外，优选使用疾病状态已知的群体中REG4基因表达水平的标准值。所述标准值可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，可以使用平均值±2S.D.或平均值±3S.D.作为标准值。

在本发明的上下文中，将从已知为非癌性的生物样品测定的对照水平称为“正常对照水平”。另一方面，如果对照水平是从化放疗抗性的生物样品测定的，那么将其称为“化放疗抗性对照水平”。

当REG4基因的表达水平与正常对照水平相比有增加，或者类似于化放疗抗性对照水平，那么受试者可以被诊断为患有化放疗抗性癌症，或处于化放疗抗性的危险中。

测试生物样品的表达水平和对照水平之间的差异可以相对于对照核酸(例如，持家基因)的表达水平标准化，所述对照核酸的表达水平已知不随细胞的癌性或非癌性状态而改变。示例性对照基因包括，但不限于，β-肌动蛋白、甘油醛3磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1。

在以下实施例中将描述本发明的多个方面，这些实施例不意在限制权利要求书中描述的本发明的范围。

除非另有说明，本文使用的全部技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的意思相同。尽管在下文描述了合适的方法和材料，但是在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述类似或等同的方法和材料。

在下文的实施例中将对本发明进行进一步描述，这些实施例并非对权利要求书中描述的发明范围的限制。

实施例1：

1.通用方法

临床样品

在获得知情同意的条件下，从7位进行了胰腺导管腺癌治愈性切除术(curative resection)的患者获得了术前和术后(治愈性切除术后3或4周)血清样品。还从在同一中心切除的外科手术样本获得了PDAC的常规石蜡包埋组织切片。组织微阵列样品获得自ISU ABXIS(Seoul，Korea)，其中一式两份点样有31种PDAC组织和2种内分泌肿瘤组织。

细胞系

PDAC细胞系PK-45P和SUIT-2分别由Cell Resource Center forBiomedical Research，Tohoku University(Sendai，Japan)和Kyushu MedicalCenter(Fukuoka，Japan)提供。MIAPaCa-2购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)。将这些细胞系中的PK-45P和SUIT-2培养在RPMI1640(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中，将MIAPaCa-2培养在Dulbecco′sModified Eagle′s Medium(Dulbecco改进的Eagle培养基)(Sigma-Aldrich)中，这些培养基中含有10％胎牛血清(Cansera International，Ontario，Canada)和1％抗生素/抗真菌剂溶液(Sigma-Aldrich)。将细胞保持在37℃含5％CO₂的湿润空气中。将FreeStyle^TM 293细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)悬浮在FreeStyle^TM293表达培养基(Invitrogen)中，并且在锥形瓶(Corning，NY)中于定轨摇床上以125rpm摇动培养。将细胞保持在37℃含有8％CO₂的湿润空气中。胰腺癌细胞系MIA-PaCa2和Panc-1，以及正常啮齿动物细胞系NIH3T3购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)，将它们培养在Delbecco改进的Eagle培养基或RPMI1640(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中。胰腺癌细胞系PK-59、KLM-1、PK-45P和PK-1由Cell Resource Center for BiomedicalResearch，Tohoku University(Sendai，Japan)提供，并且保存在RPMI1640(Sigma-Aldrich)中；所述两种培养基均补充有10％胎牛血清(CanseraInternational，Ontario，Canada)和1％抗生素/抗真菌剂溶液(Sigma-Aldrich)。将细胞保持在37℃含有5％CO₂的湿润空气中。

2.REG4的半定量RT-PCR

对PDAC细胞、胰腺癌细胞和正常胰腺导管上皮细胞的纯化如前所述(Nakamura T等，Oncogene 2004；23：2385-400.)；对来自纯化细胞群体的RNA和来自正常人心、肺、肝、肾、脑、胰腺的RNA(BD Biosciences，Palo Alto，CA)以及来自正常胰腺导管细胞的RNA进行两轮基于T7的体外转录的扩增(Epicentre Technologies，Madison，WI)和后续的单链cDNA合成。使用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)根据制造商的建议提取来自人胰腺癌细胞系的总RNA。将提取的RNA用DNA酶I(Roche，Mannheim，Germany)处理，并且使用寡聚(dT)引物与Superscript II反转录酶(Invitrogen)反转录成单链cDNA。通过监控作为定量对照的α-微管蛋白(TUBA)，本发明人制备了每种单链cDNA的适当稀释物用于后续的PCR扩增。引物序列为

用于TUBA的5’-AAGGATTATGAGGAGGTTGGTGT-3’(SEQ ID NO：9)

和5’-CTTGGGTCTGTAACAAAGCATTC-3’(SEQ ID NO：10)；

用于REG4的5’-CCAATTGCTATGGTTACTTCAGG-3’(SEQ ID NO：3)

和5’-GAAAAACAAGCAGGAGTTGAGTG-3’(SEQ ID NO：4)。

用于KIAA0101(NM_014736，氨基酸序列示于SEQ ID No.；40，由SEQID No.；39中所示的核苷酸序列编码)的

5’-AGCTTTGTTGAACAGGCATTT-3’(SEQ ID No.；26)

和5’-GGCAGCAGTACAACAATCTAAGC-3’(SEQ ID No.；27)，

用于β2MG的5’-CACCCCCACTGAAAAAGAGA-3’(SEQ ID No.；28)

和5’-TACCTGTGGAGCAAGGTGC-3’(SEQ ID No.；29)。

全部反应均包括在GeneAmp PCR系统9700(PE Applied Biosystems，Foster，CA)上进行的下列步骤：94℃2分钟的初始变性，其后是23个循环(对于TUBA)或28个循环(对于REG4)的94℃30秒、58℃30秒和72℃1分钟；或者：95℃5分钟初始变性步骤，接着是23个循环(β2MG)或28个循环(对于KIAA0101)的95℃30秒、55℃30秒和72℃30秒。

3.REG4的抗体

将带有组氨酸标签的全长人REG4的表达载体转染入293T细胞，并通过使用TALON纯化试剂盒(Clontech，San Diego，CA)从它的培养基中纯化重组REG4(REG4-His)。通过用弗氏完全佐剂乳化抗原溶液来制备注射用REG4-His蛋白。在家兔中用REG4-His蛋白激发产生多克隆抗REG4抗体(pAb)(Medical&Biological Laboratories，Nagoya，Japan)，并且将免疫血清根据标准规程在亲和柱上纯化。小鼠单克隆抗体(mAb)也是通过将REG4-His与弗氏完全佐剂一起接种至BALB/C小鼠中而产生。将它们的淋巴细胞与骨髓瘤细胞P3U1融合，生成单克隆杂交细胞，并通过标准技术进行验证。

4.KIAA0101的抗体和重组蛋白

使用KOD-Plus聚合酶(TOYOBO)生成了编码全长KIAA0101(111个氨基酸，NP_055551)(SEQ ID No.；15)的cDNA片段并将其克隆至pET21载体(Novagen)中。将COOH末端与多组氨酸标签融合的重组KIAA0101蛋白在大肠杆菌BL21 Codon Plus(Stratagene)中表达，并用Ni-NTA树脂(QIAGEN)在天然条件下根据供应商的规程进行纯化。进一步的纯化通过使用装配了MonoS HR 5/5(Amersham)的高效液相层析AKTA探测器(High PerformanceLiquid Chromatography AKTA explorer)(Amersham)进行。用所述蛋白质免疫家兔，并根据基础方法学在填充了偶联有重组KIAA0101蛋白的Affi-Gel 10活化亲和介质(Bio-Rad)的亲和柱上纯化免疫血清。将经亲和纯化的抗KIAA0101多克隆抗体用于对KIAA0101蛋白质的检测。

5.REG4的免疫组织化学染色

将切片在柠檬酸盐缓冲液pH 6.0中脱蜡并在108℃高压蒸汽处理15分钟。通过在稀释于甲醇的0.33％过氧化氢中温育30分钟来淬灭内源过氧化物酶活性。与胎牛血清温育封闭之后，将切片与抗REG4pAb一起在室温温育1小时(1∶1000)。用PBS清洗之后，用过氧化物酶标记的抗小鼠免疫球蛋白(Envision试剂盒，Dako Cytomation，Carpinteria，CA)进行免疫检测。最后，用3，3’-二氨基联苯(Dako)使反应物显色，并用苏木精复染细胞。

通过全基因组的cDNA微阵列分析，本发明人鉴定了多个在PDAC细胞中过表达的基因(Hartupee JC等，Biochim Biophys Acta 2001；1518：287-93.)。在它们之中，本发明人关注REG4，本发明人通过RT-PCR确认，在所检查的九个显微解剖PDAC细胞群体中有七个过表达REG4(图1A)。PDAC细胞中REG4的mRNA水平明显高于正常胰腺和生命器官包括心、肺、肾和脑的REG4mRNA水平。

对另一系列PDAC组织使用抗REG4的pAb进行的免疫组织化学分析揭示了在杯形细胞样小泡(Goblet cell-like vesicle)(图1B)或在癌细胞的细胞表面(图1C)的REG4强信号，而正常胰腺中的腺泡细胞显示的REG4染色微弱，并且导管细胞和胰岛细胞无信号显示。成体生命器官包括心、肺、肾和脑也未显示任何染色(数据未显示)。此外，点样有另外31种PDAC组织的组织微阵列显示，31种PDAC中的14种表达了高水平的REG4，在总共64个PDAC中的35个(55％)显示了抗REG4抗体的阳性染色。良好分化的PDAC(G1)与分化较少的PDAC(G2、G3和G4)相比显示了频率更高的REG4阳性染色(χ2检验，p＝0.0001)。

6.稳定表达REG4的细胞的建立

为了产生REG4表达载体，将REG4cDNA的完整编码区通过PCR扩增，其中使用含有限制酶位点的引物对：

5’-CGGAATTCATGGCTTCCAGAAGCATGC-3’(SEQ ID NO.；63)和

5’-ATAAGAATGCGGCCGCTGGTCGGTACTTGCACAGG-3’(SEQ  IDNO.；64)

其分别包含EcoRI和NotI限制位点(由第一条和第二条下划线标出)。将产物插入pCAGGSnHC的EcoRI和NotI位点来表达带HA标签的蛋白。使用FuGENE6(Roche)根据制造商推荐的规程，将所述质粒转染入REG4阴性的PDAC细胞系PK-45P细胞。用0.5mg/ml遗传霉素(Invitrogen)选择细胞群体，并将克隆的PK-45P细胞通过有限稀释进行亚克隆。为了评估带HA标签的REG4的表达水平，将几个克隆收集到裂解缓冲液中，所述裂解缓冲液包含50mM Tris-HCl pH 7.4、150mM NaCl、0.25％脱氧胆酸、1％NP-40、1mMEDTA、0.1％蛋白酶抑制剂合剂III(protease inhibitor cocktail III)(Calbiochem，San Diego，CA)。将样品离心并弃去沉淀。上清中存在的蛋白质量通过Bradford方法来测量。用10μg等分试样进行15％SDS-PAGE，并通过使用抗HA抗体(3F10)(Roche)的Western印迹进行检测。通过抗β-肌动蛋白抗体(Sigma-Aldrich)将每种蛋白的量标准化。建立了组成性表达REG4的三个克隆(C1-6、C2-6、C10)。还建立了用空pCAGGSnHC-HA载体转染的对照PK-45P细胞(M1、M3、M6)。

7.γ-射线和吉西他滨抗性测定

将每种表达REG4的克隆(C1-6、C2-6、C10)或对照克隆(M1、M3、M6)的3000个细胞接种至96孔培养皿的各个孔中，并在包含10％FBS的培养基中温育。48小时预温育之后，将细胞用60Co源以1、5、10或30Gy进行γ-照射，或用0.1-100,000nM吉西他滨处理48小时。48小时之后，使用细胞计数试剂盒-8(DOJINDO)测量活细胞。为了估计％抑制值，计算了吸光度-(各种处理)/吸光度-(未处理对照)的相对比。对于FACS分析，在6孔平板中每孔接种48000个细胞，在48小时预温育之后，将细胞使用60Co源以0、1或5Gy进行γ-照射，或用10nM或50nM吉西他滨处理48小时。48小时小时之后，收集细胞，用PBS清洗，用冷70％乙醇固定，用碘化丙锭(10μg/ml)和核糖核酸酶A(100μg/ml)染色，并使用FACSCalibur^TM流式细胞仪系统(BD)分析进行细胞周期分析。使用细胞周期分析软件(BD CELLQuest^TM)计算非整倍体细胞的百分比。

8.KIAA0101的免疫组织化学染色

来自胰腺癌组织的常规切片获得自在适宜的知情同意的条件下切除的外科手术样本。来自正常胰腺的切片购自Biochain(Hayward，CA)。将所述切片在Dako Cytomation Target Retrieval Solution High pH(Dako，Carpinteria，CA)中脱蜡并在108℃高压蒸汽处理15分钟。封闭内源过氧化物酶和蛋白质之后，将切片与抗KIAA0101抗体(1∶200稀释)在室温温育30分钟。用PBS清洗之后，使用过氧化物酶标记的抗兔免疫球蛋白(Envision试剂盒，Dako)进行免疫检测。最后，用3，3’-二氨基联苯(Dako)使反应物显色，并用苏木精进行复染。

9.Northern印迹分析

本发明人使用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)自几种胰腺癌细胞系提取了总RNA并进行了Northern印迹分析。在用DNA酶I(Nippon Gene，Osaka，Japan)处理之后，用Micro-FastTrack(Invitrogen)根据制造商的规程纯化mRNA。将来自胰腺癌细胞系的每种mRNA的1-μg等分试样以及从正常成人的心、肺、肝、肾、脑和胰腺分离的mRNA的1-μg等分试样(BDBiosciences，Palo Alto，CA)在1％变性琼脂糖凝胶上分离并转移至尼龙膜上。使用以下引物组通过PCR制备KIAA0101特异性的702-bp探针：正向5’-AGCTTTGTTGAACAGGCATTT-3’(SEQ ID No.；1)和反向

5’-GGCAGCAGTACAACAATCTAAGC-3’(SEQ ID No.；2)。

根据对Megaprime DNA标志系统(Amersham Biosciences，Buckinghamshire，UK)的说明书，用随机引发的(random-primed)、α32P-dCTP标志的探针进行杂交。预杂交、杂交和清洗根据供应商的建议进行。用增感屏将印迹在-80℃放射自显影10天。

10.用于敲低KIAA0101的表达小干扰RNA(siRNA)构建体和转染

为了敲低胰腺癌细胞中的内源KIAA0101表达，本发明人如前所述使用了psiU6BX3.0载体来表达针对靶基因的短发夹RNA(Taniuchi等，(2005)Cancer Res，65：105-12)。用于KIAA0101的siRNA的合成寡核苷酸的靶序列如下：#759si；5’-GCCATATTGTCACTCCTTCTA-3’(SEQ ID No.；7)和EGFPsi；5’-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3’(SEQ ID No.；8)(作为阴性对照)。将高表达KIAA0101的胰腺癌细胞系KLM-1和MIA-PaCa2涂布在10cm平板上，并使用FuGENE6(Roche)根据制造商的说明，用8μg设计为表达针对KIAA0101的siRNA的质粒进行转染。

将细胞通过0.5mg/ml(用于KLM-1)或0.8mg/ml(用于MIA-PaCa2)的遗传霉素(Sigma-Aldrich)选择5天，然后收获以分析对KIAA0101表达的敲低效果。对于集落形成测定，将表达siRNA的转染子在包含遗传霉素的培养基中培养14天。用4％低聚甲醛固定之后，将转染后的细胞用Giemasa溶液染色评估集落形成。使用细胞计数试剂盒-8(DOJINDO，Kumamoto，Japan)对细胞生存力加以定量。在含有遗传霉素的培养基中培养14天后，添加溶液至终浓度10％。在37℃温育3小时之后，用Microplate Reader 550(Bio-Rad，Hercules，CA)测量450nm的吸光度。

11.表达外源KIAA0101的细胞的建立以及它们在体外和体内的生长

通过PCR扩增制备了KIAA0101 cDNA，其中使用包括Kozak序列和NotI接头的正向引物，和包括NotI接头的反向引物。将所述PCR产物插入哺乳动物表达载体pCAGGS/HA的NotI位点，以表达带HA标签的蛋白。将pCAGGS-KIAA0101-HA或空pCAGGS/HA模拟载体通过FuGENE6(Roche)根据制造商的规程转染入PK-45P(显示KIAA0101的弱表达)和NIH3T3细胞(显示几乎无法检出的小鼠KIAA0101同源物(NP_080791)的表达)。

然后，在包含0.5mg/ml(用于PK-45P)和0.9mg/ml(用于NIH3T3)遗传霉素的培养基中选择遗传霉素抗性克隆。使用抗FLAG标签抗体(Sigma-Aldrich)和抗β-肌动蛋白抗体(Sigma-Aldrich)，通过Western印迹分析确认了每种克隆中的外源KIAA0101表达。对于生长测试，将每个表达KIAA0101的克隆(PK45P-KIAA0101)或对照克隆(PK45P-Mock)的各7500个细胞接种到24孔培养皿的各个孔中，并在包含10％FBS培养基中温育。用MTT测定法定量细胞生存力。将所述实验重复至少三次。对于体内转化，将一个稳定克隆NIH3T3-KIAA0101和一个NIH3T3模拟克隆的5×10⁶个细胞分别接种到8周裸鼠的右胁和左胁，并在四周之后采集肿瘤。称量每个肿瘤并用抗KIAA0101抗体免疫染色。

12.对结合KIAA0101的复合物的免疫沉淀和质谱分析

为了分离与KIAA0101蛋白结合的蛋白质，本发明人使用抗KIAA0101抗体进行了免疫沉淀实验。将过表达KIAA0101的胰腺癌细胞系KLM-1和PK59在裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、0.5％NP-40、蛋白酶抑制剂合剂III(Protease Inhibitor Cocktail Set III)[Calbiochem，San Diego，CA])中裂解。将等量的总蛋白质与2μg抗KIAA0101多克隆抗体或兔IgG(Santa Cruz Biotechnologies，Santa Cruz，CA)一起在40℃温育1小时。将免疫复合物与蛋白G Sepharose(Zymed Laboratories，South San Francisco，CA)一起温育1小时，再用裂解缓冲液清洗。

将共沉淀的蛋白在5-20％梯度的SDS-PAGE中分离，并通过银染色试剂盒(Wako，Osaka，Japan)染色。切下使得被抗KIAA0101多克隆抗体沉淀的蛋白区别于被对照IgG沉淀的蛋白的条带，在凝胶内用胰蛋白酶消化，并使用AXIMA-CFR MALDI-TOF质谱仪(Shimadzu Corporation，Tsukuba，Japan)分析肽质量指纹。以10-ppm质量准确度搜索肽质量，并使用数据库拟合程序IntelliMarque(Shimadzu)进行蛋白数据库搜索。通过使用抗KIAA0101、抗PCNA抗体(Santa-Cruz)、抗POLD1抗体(Santa-Cruz)和抗FEN1抗体(Santa-Cruz)的免疫沉淀来验证通过这种策略鉴定的蛋白质结合。

13.细胞透过性肽处理和KIAA0101-PCNA相互作用

为了以显性失活方式抑制KIAA0101和PCNA之间的相互作用，本发明人设计了与精氨酸(R)重复序列细胞透过性肽结合的KIAA0101的PIP框基序肽(Noguchi等，(2004)Nat Med.，10：305-9)。PIP20是RRRRRRRRRRRGGG-VRPTPKW{qKGiGEff}RLSPK(SEQ ID No.；9)(PIP框基序示于圆括号内，并用小写字体显示保守残基)。PIP20mut中用丙氨酸取代了PIP框基序中的保守残基：

RRRRRRRRRRRGGG-VRPTPKW{aKGaGEaa}RLSPK(SEQ ID No.；10)。还设计了乱序肽作为阴性对照；

RRRRRRRRRRRGGG-IFKQWPRGETKPRVLSPKGF(SEQ ID No.；11)。此外，本发明人还设计了包含PIP框基序的较短的肽PIP16：

RRRRRRRRRRRGGG-TPKW{qKGiGEff}RLSP(SEQ ID No.；12)，PIP16mut：

RRRRRRRRRRRGGG-TPKW{aKGaGEaa}RLSP(SEQ ID No.；13)。它们由Sigma-Aldrich合成，并用HPLC纯化至高于95％的等级。用系列浓度(5μM、10μM和20μM)的各种所述细胞透过性肽处理表达KIAA0101的癌细胞系KLM-1和不表达小鼠KIAA0101同源物的正常小鼠细胞系NIH3T3。在第1天和第3天，将细胞与各种肽接触，并在第5日通过MTT测定法如上所述评估活细胞数。

实施例2

1.表达siRNA的载体和集落形成测定法/MTT测定法

为了敲低PDAC细胞中的内源REG4表达，本发明人如前所述使用了psiU6BX3.0载体来表达针对靶基因的短发夹RNA(Shimokawa T等，CancerRes 2003；63：6116-20.)。用于REG4的siRNA的合成寡核苷酸的靶序列如下：REG4-si2；5’-GACAGAAGGAAGAAACTCA-3’(SEQ ID NO：5)，和EGFPsi；5’-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3’(SEQ ID NO：6)(作为阴性对照)。将PDAC细胞系SUIT-2(REG4阳性)和MIAPaCa-2(REG4阴性)涂布在6孔平板上，并使用FuGENE6(Roche，Basel，Switzerland)根据制造商的说明书用设计为表达siRNA(10μg)的质粒转染。表达siRNA的质粒通过克隆双链寡核苷酸制备。成对寡核苷酸的序列是：

5’-CACCGACAGAAGGAAGAAACTCATTCAAGAGATGAGTTTCTTCCTTCTGTC-3’(SEQ ID NO；11)和

5’-AAAACTGTCTTCCTTCTTTGAGTAAGTTCTCTACTCAAAGAAGGAAGACAG-3’(SEQ ID NO；12)用于si2；

将细胞通过0.9mg/ml(用于SUIT-2)或0.8mg/ml(用于MIAPaCa-2)的遗传霉素(Sigma-Aldrich)选择7天，然后收获以分析对REG4表达的敲低效果。对于集落形成测定，将表达siRNA的转染子在包含遗传霉素的培养基中培养7天。用甲醇固定之后，将转染后的细胞用0.1％结晶紫溶液染色以评估集落形成。在MTT测定中，使用细胞计数试剂盒-8(DOJINDO，Kumamoto，Japan)定量细胞生存力。在含有遗传霉素的培养基中培养7天后，以终浓度10％添加溶液。在37℃温育1.5小时之后，用Microplate Reader 550(Bio-Rad，Hercules，CA)测量490nm的吸光度并以630nm的吸光度作为参考。

为了检查REG4过表达在PDAC细胞生长中的作用，本发明人构建了几种表达载体，将它们设计为表达REG4特异性的siRNA，并将它们转染入高水平内源表达REG4的PDAC细胞系SUIT-2。在本发明人在SUIT-2细胞中测试的三种质粒中，REG4-si2显示了对内源REG4转录物的显著的敲低效果(图2A)，并且这种转染导致通过MTT测定法测得的活细胞减少(图2B)，以及集落数的减少(图2C)，而其它质粒(阴性对照siEGFP)的转染对REG4表达和SUIT-2的细胞生长未显示敲低作用。另一方面，REG4-si2没有影响不表达REG4的MIAPaCa-2的细胞生存力(数据未显示)，从而排除了REG4-si2“脱靶(off-targeting)”的可能性。这种表达siRNA的载体(REG4-si2)的生长抑制效果与它们的基因沉默效果具有良好的相关性，而这些数据说明了REG4在胰腺癌细胞的存活和/或生长中起关键作用。

实施例3

1.生成生物活性重组人REG4

为了制备生物活性形式的REG4，通过PCR扩增REG4cDNA的完整编码序列，其中使用包含酶切位点的引物对：

5’-CG{GAATTC}ATGGCTTCCAGAAGCATGC-3’(正向)(SEQ ID NO：7)和5’-ATAAGAAT{GCGGCCGC}TGGTCGGTACTTGCACAGG-3’(反向)(SEQ ID NO：8)，其分别包含EcoRI和NotI限制位点(示于圆括号中)。将所述产物插入pCAGGS的EcoRI和NotI位点来表达带HA标签的蛋白。将FreeStyle^TM 293细胞以每毫升1.5×10⁵个细胞接种至30ml培养基中。使用FuGene 6根据说明书用REG4-HA/pCAGGS载体转染细胞。48小时后收获培养基，并用HA琼脂糖(Sigma-Aldrich)纯化人REG4(rhREG4)。

2.免疫沉淀

清洗培养在10-cm培养皿中的SUIT-2细胞，并在无血清培养基中进一步培养2天。在10,000x g、4℃离心15分钟之后，将上清用蛋白G Sepharose(Zymed Laboratories，San Francisco，CA)在4℃处理1小时。然后将经预处理的上清添加至与抗REG4mAb预温育过的蛋白G Sepharose的混合物。在4℃伴有轻度摇动的条件下温育4小时，接着进行两个清洗步骤。将结合的蛋白洗脱并在15％SDS-PAGE上分离。电泳分离之后，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜(Amersham)并用抗REG4pAb探针检测。通过化学发光检测系统(ECL，Amersham)使蛋白条带显影。

3.Akt磷酸化

为了评估磷酸化Akt的水平，将PK-45P细胞用0、0.1、1或10nM rhREG4在含有或不含100μg/ml抗REG4mAb的条件下处理6小时。处理之后，用冷PBS清洗细胞并收集在裂解缓冲液中，所述裂解缓冲液包含50mMHEPES pH 7.5、200mM NaCl、2.5mM EDTA、2.5mM EGTA、10mM NaF、1mM Na₃VO₄、0.5％Triton X-100、0.5mM 1，4-二硫苏糖醇、0.1％蛋白酶抑制剂合剂III(Calbiochem，San Diego，CA)。将样品离心并弃去沉淀。上清中存在的蛋白质量通过Bradford方法来测量。用20μg等分试样进行10％SDS-PAGE，并通过使用抗pSer473Akt抗体(Abcam，Cambridge，MA)的Western印迹进行检测。通过抗Akt抗体(Santa Cruz Biotechnolo gy，Inc.，CA)评估Akt蛋白的总量。

为了检查分泌性REG4对胰腺癌细胞生长的影响，本发明人通过使用哺乳动物系统(FreeStyle^TM 293-F)制备了生物活性的rhREG4蛋白(图3A)，并且通过用几种浓度(0-10nM)的rhREG4处理呈现REG4低表达的PK-45P细胞来进行细胞生长测定。图4B显示培养基中存在的REG4蛋白明显地以剂量依赖的方法刺激了细胞增殖，暗示了分泌性REG4在胞外以自分泌/旁分泌的方式行使促进细胞增殖的功能。据报道REG家族的下游靶标之一是Akt信号传导途径(Sekikawa A等，Gastroenterology 2005；128：642-53.；BishnupuriKS等，Gastroenterology 2006；130：137-49.)。为了检查我们的rhREG4是否能够激活PDAC细胞中的Akt信号传导途径，将PK-45P细胞在系列剂量的rhREG4存在下温育，并使用对473位丝氨酸磷酸化的Akt具有特异性的抗体进行Western印迹分析来检测磷酸化的Akt。rhREG4处理明显导致Akt磷酸化的增加(图3C)，而Akt的总表达水平没有因rhREG4处理而变化。这些数据说明了REG4通过PDAC细胞中的Akt信号传导途径刺激细胞生长。

为了评估抗REG4mAb的治疗潜能，本发明人通过用抗REG4mAb处理PDAC细胞进行了细胞生长测定。首先，本发明人通过使用细胞培养基的免疫沉淀检查了几种抗REG4mAb的结合亲和力。图4A显示一种抗REG4mAb(34-1)在SUIT-2培养基中以高亲和力结合内源REG4蛋白。使用PK-45P的中和测定显示抗REG4mAb克隆34-1完全抵消了rhREG4处理的生长促进作用，而对照抗体未显示任何中和活性(图4B)。且使用高水平表达内源REG4的SUIT-2细胞的生长测定显示抗REG4mAb处理以剂量依赖的方式抑制了SUIT-2细胞生长(图4C)，而抗REG4mAb不影响完全不表达REG4的MIAPaCa-2的细胞生长。

此外，本发明人还检查了用rhREG4和抗REG4mAb处理PK45P细胞对Akt磷酸化的效果，抗REG4mAb处理抑制了PDAC细胞中由rhREG4处理诱导的Akt磷酸化(图4D)，说明抗REG4mAb很有可能通过中和分泌性REG4并关闭其自分泌/旁分泌途径来抑制PDAC细胞中的Akt信号传导途径。综合起来，这些数据提示抗REG4抗体对由REG4刺激的细胞增殖具有中和活性。

为了评估抗REG4mAb的治疗潜能，本发明人通过用抗REG4mAb处理接种了PDAC细胞的小鼠进行了肿瘤生长测定。将表达REG4的PDAC细胞系SUIT2的5×10⁶个细胞接种至8周裸鼠的胁中，并每周测量两次肿瘤的长径(L)和短径(S)。通过L x L x S x 0.52计算肿瘤体积。用抗REG4小鼠mAb 34-1(每只小鼠300μg，腹膜内)进行的抗体处理从肿瘤体积达到100-200mm³时开始。每周两次腹膜内施用抗体，作为对照，也按照相同的时间安排施用非特异性小鼠IgG(Acris)。如图5A所示，34-1mAb处理抑制了肿瘤生长(P＝0.0598)，并且在第30天收集并称量肿瘤。34-1mAb处理显著抑制了肿瘤重量(图5B，P＝0.0489)。

实施例4

1.体外化放疗抗性PDAC中的REG4表达

为了研究REG4表达如何对PDAC对化放疗的抗性起贡献，我们从REG4阴性的PDAC细胞制备了三种组成性表达REG4的克隆，并在体外用γ-照射或吉西他滨处理这些克隆。Western印迹分析确认了C1-6、C2-6和C10中有外源REG4表达，而模拟克隆则不然(图6A)。与未照射的情况相比，γ-照射抑制了表达REG4的细胞和模拟细胞的细胞生存力。然而，如图6B中所示，表达REG4的细胞对γ-照射较不敏感，并且在30-Gy的γ-照射之后，表达REG4的细胞(C1-6、C10、C2-6)的生存力被抑制到未照射时的60％，而模拟细胞的生存力被抑制到低于40％(P＜0.001)。γ-照射之后的FACS分析证明了1-Glyγ-照射诱导了模拟细胞中28.7％的亚G1群体(凋亡细胞)，而对表达REG4的细胞仅为10.73％(图6C)。另外，5-Gly γ-照射诱导了模拟细胞中46.47％的亚G1群体(凋亡细胞)，而对表达REG4的细胞仅为24.68％(图6C)。这些发现暗示了PK-45P细胞中的REG4表达能够有力地贡献于对γ-照射的抗性。

接下来，用系列浓度的吉西他滨处理REG4阳性或阴性的细胞，并评估它们的生存力。如图7A所示，与模拟细胞相比，表达REG4的细胞(C1-6、C10、C2-6)对吉西他滨较不敏感。在表达REG4的细胞中，C1-6和C10的吉西他滨IC50为100nM，而显示较低REG4表达的C2-6的吉西他滨IC50为50nM(图6A)，而对于模拟细胞的IC50是大约30nM。但是这种差异不是非常明显(dominant)。此外，FACS分析显示了这样的趋势：在50nM吉西他滨处理之后，表达REG4的细胞显示了较少的凋亡细胞，但并不是统计学显著的(图7B)。较高浓度的吉西他滨处理并未揭示凋亡细胞的显著差异。这些发现说明了PK-45P细胞中的REG4表达有可能对吉西他滨抗性有贡献，但是这种贡献不是非常强。因此，PDAC细胞中REG4的表达很可能对其照射抗性起贡献，而不是对其基于吉西他滨的化疗的抗性起贡献。

2.新辅助化放疗(neo-adjuvant chemo-radiation therapy)抗性患者中的REG4表达

为了评估REG4表达和胰腺癌治疗抗性之间的关系，研究了患者的外科手术样本，这些患者在经过肿瘤辅助化放疗(肿瘤CRT)后，手术切除了他们的胰腺癌。他们接受了三维共焦放射疗法(3D confocal radiation therapy)(总共50Gy)治疗，同时接受吉西他滨治疗(1g/m2/周，持续3周)，其后是8周的随访治疗。将19个外科手术样本用抗REG4抗体免疫染色，并评估REG4表达和对新CRT的病理学响应。在19个新CRT样本中，9个样品显示了对新CRT的组织学响应，而10个没有显示。关于REG4表达，9个有响应的样本中仅有2个显示了肿瘤细胞中的REG4表达(图8A和B)，而10个无响应的样本中的7个显示了REG4表达(图8C和D)。这种REG4表达与对新CRT的响应显著相关(χ2检验，P＝0.0028)，暗示了REG4表达能够使癌细胞在细胞毒性处理如化疗和放疗的条件下存活。

实施例5

胰腺癌细胞中KIAA0101的过表达

在全基因组cDNA微阵列分析发现的多种在胰腺癌细胞内过表达的基因中(Nakamura T.，Oncogene，23：2385-400，2004.)，本发明人在本研究中关注KIAA0101。本发明人的微阵列数据已经显示，在全部本发明人检验的可提供信息的胰腺癌细胞中KIAA0101均有过表达(14个可提供信息的实例中的14个显示了高于10倍的表达信号)，并且在检验的九个显微解剖的胰腺癌细胞群体中的八个中通过RT-PCR确认了KIAA0101的过表达(图9A)。使用KIAA0101cDNA片段作为探针的Northern印迹分析鉴定了约1.2kb的转录物，该转录物在本发明人检验的所有癌细胞系中均高表达；在任何生命器官包括肺、心、肝和肾中未观察到表达(图9B)。在来自另五位患者的全部胰腺癌组织切片中，使用KIAA0101的多克隆抗体的免疫组织化学分析也显示了在胰腺癌细胞的核中的强信号(图9C)。在正常胰腺上皮细胞和腺泡细胞中以及生命器官包括肺、心、肝和肾中未观察到染色(图9C)。

实施例6

通过siRNA敲低KIAA0101对胰腺癌细胞生长的影响

为了研究癌细胞中KIAA0101过表达的生物学意义及其作为分子靶标用于癌症治疗的潜力，本发明人构建了几种对KIAA0101mRNA序列有特异性的siRNA表达载体，并将它们转染入内源表达高水平KIAA0101mRNA的KLM-1和MIA-PaCa2。在本发明人使用#759si构建体时，通过RT-PCR确认了敲低作用(图10A)。使用KLM-1的集落形成测定(图10B)和MTT测定(图10C)揭示，与用无明显敲低作用的EGFPsi转染相比，用#759si转染的细胞的数量显著降低。使用MIA-PaCa2细胞系获得了类似效果。这些发现说明了KIAA0101很可能具有某些重要的癌细胞增殖功能，而对KIAA0101功能的抑制可能在作为新的分子靶标用于癌症治疗方面具有一些潜力。

实施例7

内源过表达KIAA0101促进癌细胞生长并转化NIH3T3

为了进一步研究KIAA0101的潜在致癌性质，本发明人建立了PK45P衍生细胞系PK45P-KIAA0101的几个克隆，其中组成性表达外源KIAA0101。本发明人还制备了用模拟载体(PK45P-Mock)转染的对照PK-45P细胞并比较了它们的生长速率。Western印迹分析(图11A)验证了六个克隆中的外源KIAA0101表达。通过MTT测定法测量的生长曲线说明了所述六个PK45P-KIAA0101克隆(实线)与四个PK45P模拟克隆(虚线，图11B)相比显然生长更迅速，说明KIAA0101表达增强了癌细胞的增殖。

在本发明人检验的细胞系中，仅正常小鼠NIH3T3细胞系未显示任何KIAA0101同源物的表达，本发明人在NIH3T3中强行表达KIAA0101并研究了KIAA0101过表达是否在体内使NIH3T3转化。如图11C所示，三个NIH3T3-KIAA0101克隆在裸鼠的右胁形成了肿瘤，而NIH3T3-Mock在左胁则未形成肿瘤，并且对这些肿瘤进行的免疫组织化学染色在肿瘤细胞的细胞核处显示了KIAA0101的阳性染色(图11D)。这些结果暗示了KIAA0101能够将正常细胞转化为肿瘤细胞。

实施例8

作为KIAA0101蛋白复合物的PCNA、POLD1、FEN1的鉴定

为了进一步研究KIAA0101的生物学功能，本发明人使用针对KIAA0101的多克隆抗体进行了免疫沉淀来鉴定KIAA0101蛋白的复合物。免疫沉淀部分在SDS-PAGE凝胶上分离后经银染色表明，与对照样品的结果比较，用KIAA0101蛋白从癌细胞裂解物免疫沉淀了几种蛋白(图12A)。将每种蛋白在凝胶内用胰蛋白酶消化之后通过MALDI-TOF系统加以分析；将它们鉴定为PCNA、POLD1(聚合酶δp125亚基)和FEN1(瓣状内切核酸酶-1(flap endonuclease-1))。通过图12B所示的免疫沉淀实验确认了这些相互作用。所有这些蛋白都涉及DNA复制/修复，POLD1和FEN1还与PCNA以及KIAA0101结合(Jonsson等，(1998)EMBO J.Apr15；17(8)：2412-25；Zhang等，(1999)J Biol Chem.Sep 17；274(38)：26647-53；Bruning和Shamoo(2004)Structure.Dec；12(12)：2209-19.)，说明KIAA0101可能通过与PCNA相互作用参与DNA复制。

实施例9

通过细胞透过性显性失活肽抑制KIAA0101和PCNA之间的相互作用

为了抑制KIAA0101和PCNA之间通过KIAA0101的保守PIP框基序的相互作用，本发明人设计了含有这个PIP框的显性失活肽，并将这种肽与精氨酸(R)重复序列连接以促进细胞透过性(图13A)。体外研究中，本发明人通过免疫沉淀验证了对PCNA和KIAA0101之间相互作用的抑制。在PIP20的存在下，PCNA不被KIAA0101免疫沉淀，而其中的保守残基被丙氨酸取代的PIP20mut(图13A)和乱序肽不影响这种相互作用(图13B)。然后本发明人通过用这些肽处理癌细胞和正常成纤维细胞NIH3T3细胞评估了这些肽是否抑制了癌细胞的生长。小鼠KIAA0101(NP_080791)与人的具有高度同源性，并且人KIAA0101中的显性失活肽靶区与小鼠KIAA0101中的100％相同。图13C证明了PIP20以剂量依赖的方式抑制了癌细胞生长，而PIP20mut和乱序肽则不然。另一方面，PIP20不影响不表达人KIAA0101同源物的小鼠正常细胞系NIH3T3细胞的生长。这些发现说明了PIP20通过靶向KIAA0101而特异性抑制细胞生长。

接下来本发明人设计了缺失N端和C端侧翼区的一些残基并保留PIP框基序的短PIP肽(图13A所示的PIP16和PIP16mut)，并用它们处理癌细胞系和NIH3T3细胞。PIP16处理强力抑制了癌细胞生长，然而，PIP16也影响NIH3T3生长，而用丙氨酸取代PIP框基序的保守残基则使它失去生长抑制作用，PIP20也是如此(图13D)。这些发现说明PIP16的作用不是KIAA0101特异性的，PIP16很可能影响PCNA和其它DNA复制蛋白之间的相互作用。

讨论

本发明证明了它作为用于PDAC治疗的分子靶标的潜力。为了发明分泌性REG4在胰腺癌发生或发展中的角色和功能，本发明人通过siRNA敲低了PDAC细胞系中的内源REG4表达，且本发明人将癌细胞与重组REG4接触。我们的实验的这些发现说明了REG作为自分泌/旁分泌生长因子的功能，并且REG4经由未知的受体介导Akt信号传导途径。然而之外，REG4如何介导Akt信号传导途径尚为未知，而这正是除了REG4受体的鉴定(Kobayashi S等，J Biol Chem 2000；275：10723-6.)之外应该通过进一步的研究来调查的。

最近的研究报道了REG4和其它家族成员REG1有可能通过Akt途径作为结肠癌或胃癌的抗凋亡因子作用(Sekikawa A等，Gastroenterology 2005；128：642-53.；Bishnupuri KS等，Gastroenterology 2006；130：137-49.)，并且我们的研究通过用分泌性REG4进行处理而确认了这种激活途径，而Akt信号传导途径最有可能是与癌生长或抗凋亡相关的REG家族信号传导途径的下游途径。REG家族似乎在组织损伤或再生过程中表达，并且发挥某些重要的组织再生作用(Unno M等，Adv Exp Med Biol 1992；321：61-6.；Zhang YW等，World J Gastroenterol 2003；9：2635-41.)。考虑到REG4和其它REG成员对Akt信号传导途径的激活，它们可能与对癌症化疗或放疗的敏感性相关，因此在体外或体内研究REG表达和化放疗之间的关系值得人们感兴趣。

值得注意的是，我们的REG4特异性单克隆抗体中和了体外培养基中的分泌性REG4，使用这些中和抗体的处理通过关闭REG4自分泌/旁分泌途径并阻断后续的Akt磷酸化而显著抑制了PDAC细胞生长。这些发现暗示靶向REG4的中和抗体治疗的可行性。贝伐单抗，一种人源化的VEGF单克隆抗体，目前与含5-氟尿嘧啶的静脉内用药法组合被批准用于转移性结肠直肠癌的一线治疗。除了抗血管生成因子抗体，抗循环配体诸如HGF(Burgess T等，Cancer Res.2006；66：1721-9.)和IL-6(Trikha M等，Clin Cancer Res 2003；9：4653-65.)的抗体，正在作为抗癌药物接受审查(under review)，靶向REG4的中和抗体治疗也可以为我们提供用于PDAC和其它表达REG4的癌症的新治疗策略。

总之，本发明人在此证明了REG4作为PDAC的血清诊断标志以及作为PDAC治疗的分子靶标的可行性，并且通过将靶向REG4的新策略与其它筛选方法或其它抗癌治疗策略结合，将可改善目前PDAC不乐观的预后。

另外，本发明人鉴定了一种在胰腺癌细胞中过表达的基因KIAA0101。在RNA水平，根据本发明人对几种人类癌症进行的微阵列分析信息和一些报道(Peiwen等，(2001)Oncogene，20：484-9；Mizutani等，(2005)Cancer，103：1785-90)，许多其它癌细胞也过表达KIAA0101，并且在高增殖细胞中通常观察到它的表达。使用抗KIAA0101抗体的免疫组织化学分析显示了KIAA0101在癌细胞中高表达，并且在存在增殖细胞的正常肠粘膜隐窝和淋巴结的生发中心也有某种程度的表达。并且KIAA0101表达依赖于细胞周期，它的表达在DNA复制最活跃的S期最高(数据未显示)，这有力地暗示了KIAA0101表达与细胞增殖有关。事实上，在本发明中通过siRNA敲低KIAA0101抑制了癌细胞中的细胞增殖，并且先前的报道通过酵母双杂交体系将KIAA0101鉴定为PCNA结合蛋白(Yu等，(2001)Oncogene，20：484-9)。

PCNA对于DNA复制和DNA修复过程是关键的辅助蛋白，其沿着DNA模板滑动发挥夹板(clamp platform)的作用，与多种DNA合成或代谢酶相互作用(Wyman和Botchan，(1995)Curr Biol.，5：334-7；Warbrick，(2000)Bioessays，22：997-1006；Krishna等，(1994)Cell，79：1233-43)。本发明人在此证明了KIAA0101还直接通过它的保守PIP框基序与PCNA结合，并且KIAA0101很可能通过与PCNA结合或与其他结合PCNA的配偶体如p21竞争来协调PCNA功能(Waga等，(1994)Nature 369：574-8；Chen等，(1996)NuclAcid Res 24：1727-33；Kontopidis等，(2005)PNAS，102：1871-6)。在本发明中，本发明人关注了这种PIP框基序，并设计了与细胞透过性精氨酸重复序列(Noguchi等，(2004)Nat Med.，10：305-9)相连的显性失活肽来特异性地抑制PCNA和KIAA0101间的相互作用。PIP20以剂量依赖性的方式抑制了癌细胞生长，而PIP20mut则不然，PIP20不影响不表达KIAA0101的NIH3T3的生长，暗示了它的高特异性。

有趣的是，本发明人删除了一些位于PIP20侧翼区的残基，保留了PIP框，从而设计了较短的肽PIP16和PIP16，它们比PIP20更有力地抑制了癌细胞生长，但是它们似乎失去了KIAA0101-PCNA相互作用的特异性。PCNA通过它们的PIP框基序与多种蛋白质进行相互作用(Wyman和Botchan，(1995)Curr Biol.，5：334-7；Warbrick，(2000)Bioessays，22：195-1006；Krishna等，(1994)Cell，79：1233-43；Chen等，(1996)Nucl Acid Res 24：1727-33；Kontopidis等(2005)PNAS，102：1871-6)，那么有可能PIP16能够抑制PCNA和其他许多在细胞增殖中扮演重要角色并遍在表达的蛋白质之间的相互作用。PIP20的侧翼残基很可能对于KIAA0101和PCNA间的特异性抑制是重要的。类似地，源自p21PIP框的肽(其也可以与PCNA相互作用)能够阻滞(arrest)和杀死癌细胞，抑制依赖于PCNA的DNA复制可以是一种有希望的癌症策略(Chen等，(1996)Nucl Acid Res 24：1727-33；Kontopidis等(2005)PNAS，102：1871-6)。

胞内的蛋白-蛋白相互作用构成了许多信号传导途径中的主要调控点，但是往往证明这样的作用对于小分子化学而言是困难的靶标，因为它们通常反映了广而浅、且疏水的蛋白质界面(Walensky等，(2004)Science，305：1446-70)。尽管肽对于稳定或破坏蛋白-蛋白相互作用是有吸引力的候选物，但是它们作为体内试剂的功效由于它们二级结构的丧失、对蛋白水解性降解的易感性以及穿透完整细胞的困难性而大打折扣。但是目前关于肽修饰的报道表明了其作为可药靶标(druggable target)的可行性(Walensky等，(2004)Science，305：1446-70)，而对于被靶向的蛋白-蛋白相互作用的进一步结构分析(Kontopidis等，(2005)PNAS，102：1871-6)或DDS改善能够为药物开发提供具有更大吸引力和更有希望可行的肽抑制蛋白-蛋白相互作用。

工业实用性：

本发明人已经证明了细胞生长受到特异性靶向REG基因或KIAA0101基因的小干扰RNA(siRNA)的抑制。因此，这种新的siRNA是用于开发抗癌药物的有用靶标。例如，阻断REG4表达或阻止其活性的作用剂可能具有作为抗癌剂的治疗用处，特别是作为治疗胰腺癌如胰腺导管腺癌(PDAC)的抗癌剂的治疗用途。类似地，阻断KIAA0101表达或阻止其活性的作用剂可能具有作为抗癌剂用于治疗胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌的用处。

本发明人还证明了抗REG4的单克隆抗体中和了REG4的生长促进作用并显著削弱了PDAC细胞的生长。因此，与表达REG的细胞相关的疾病(例如胰腺癌)的治疗可以使用与REG4结合的抗体方便地进行。

本发明人还证明了KIAA0101与PCNA相互作用，并且对这种相互作用的抑制导致对癌细胞细胞增殖的抑制。因此，抑制KIAA0101与PCNA相互作用结合并阻止其活性的作用剂具有作为抗癌剂的治疗用处。

因此本发明提供可用于治疗或预防癌症的新的多肽和其他化合物。本发明的多肽由包含QKGIGEFF/SEQ ID NO：46的氨基酸序列组成。可施用本发明的多肽来抑制癌细胞的增殖或诱导癌细胞的凋亡。预期本发明的多肽可显示针对多种癌症的细胞增殖抑制作用。特别是已经确认了本发明的多肽对于胰腺癌具有细胞增殖抑制作用。

胰腺癌是一种重要的癌症，提供对胰腺癌的有效治疗方法仍是备受期待的。因此，本发明由于还提供了治疗和/或预防胰腺癌的有效方法而意义显著。

尽管已经参考具体实施方案详细描述了本发明，但是对于本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明宗旨和范围的前提下，可以对其进行多种变化和修改。

序列表

<110>肿瘤疗法科学股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENCE INC.)

<120>过表达REG4或KIAA0101的癌症的治疗或预防

<130>ONC-A0611P

<150>US 60/838,649

<151>2006-08-18

<150>US 60/838,749

<151>2006-08-18

<160>64

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>1518

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>1

ataagacttt tatggatgga ttgtttttct caaataatat tatcgcttag tgactaaagt     60

aaagattatt aattcctgag gcaagaagat ataaaagctc cagaaacgtt gactgggacc    120

actggagaca ctgaagaagg caggggccct tagagtcttg gttgccaaac agaatgccca    180

tatccgtctt acctgtgagg aagcttgcct tgggcgccct ctgctggccc tcctgaagct    240

aacaggggcg agtgctcggt ggtttacaaa ttgcctccat gcagactatg aaactgttca    300

gcctgctata gttagatctc tggcactggc ccaggaggtc ttgcagattt gcagatcaag    360

gagaacccag gagtttcaaa gaagcgctag taaggtctct gagatccttg cactagctac    420

atcctcaggg taggaggaag atggcttcca gaagcatgcg gctgctccta ttgctgagct    480

gcctggccaa aacaggagtc ctgggtgata tcatcatgag acccagctgt gctcctggat    540

ggttttacca caagtccaat tgctatggtt acttcaggaa gctgaggaac tggtctgatg    600

ccgagctcga gtgtcagtct tacggaaacg gagcccacct ggcatctatc ctgagtttaa    660

aggaagccag caccatagca gagtacataa gtggctatca gagaagccag ccgatatgga    720

ttggcctgca cgacccacag aagaggcagc agtggcagtg gattgatggg gccatgtatc    780

tgtacagatc ctggtctggc aagtccatgg gtgggaacaa gcactgtgct gagatgagct    840

ccaataacaa ctttttaact tggagcagca acgaatgcaa caagcgccaa cacttcctgt    900

gcaagtaccg accatagagc aagaatcaag attctgctaa ctcctgcaca gccccgtcct    960

cttcctttct gctagcctgg ctaaatctgc tcattatttc agaggggaaa cctagcaaac   1020

taagagtgat aagggcccta ctacactggc ttttttaggc ttagagacag aaactttagc   1080

attggcccag tagtggcttc tagctctaaa tgtttgcccc gccatccctt tccacagtat   1140

ccttcttccc tcctcccctg tctctggctg tctcgagcag tctagaagag tgcatctcca   1200

gcctatgaaa cagctgggtc tttggccata agaagtaaag atttgaagac agaaggaaga   1260

aactcaggag taagcttcta gcccccttca gcttctacac ccttctgccc tctctccatt   1320

gcctgcaccc caccccagcc actcaactcc tgcttgtttt tcctttggcc atgggaaggt   1380

ttaccagtag aatccttgct aggttgatgt gggccataca ttcctttaat aaaccattgt   1440

gtacataaga ggttgctgtg ttccagttca gtaatggtga atgtggaaaa gtgaaataag   1500

accaagaaat acacccag                                                 1518

<210>2

<211>158

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>2

Met Ala Ser Arg Ser Met Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ser Cys Leu Ala

1               5                   10                  15

Lys Thr Gly Val Leu Gly Asp Ile Ile Met Arg Pro Ser Cys Ala Pro

            20                  25                  30

Gly Trp Phe Tyr His Lys Ser Asn Cys Tyr Gly Tyr Phe Arg Lys Leu

        35                  40                  45

Arg Asn Trp Ser Asp Ala Glu Leu Glu Cys Gln Ser Tyr Gly Asn Gly

    50                  55                  60

Ala His Leu Ala Ser Ile Leu Ser Leu Lys Glu Ala Ser Thr Ile Ala

65                  70                  75                  80

Glu Tyr Ile Ser Gly Tyr Gln Arg Ser Gln Pro Ile Trp Ile Gly Leu

                85                  90                  95

His Asp Pro Gln Lys Arg Gln Gln Trp Gln Trp Ile Asp Gly Ala Met

            100                 105                 110

Tyr Leu Tyr Arg Ser Trp Ser Gly Lys Ser Met Gly Gly Asn Lys His

        115                 120                 125

Cys Ala Glu Met Ser Ser Asn Asn Asn Phe Leu Thr Trp Ser Ser Asn

    130                 135                 140

Glu Cys Asn Lys Arg Gln His Phe Leu Cys Lys Tyr Arg Pro

145                 150                 155

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>3

ccaattgcta tggttacttc agg                                            23

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>4

gaaaaacaag caggagttga gtg                                              23

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的靶序列

<400>5

gacagaagga agaaactca                                                   19

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成靶序列

<400>6

gaagcagcac gacttcttc                                                   19

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>7

cggaattcat ggcttccaga agcatgc                                          27

<210>8

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>8

ataagaatgc ggccgctggt cggtacttgc acagg                                 35

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>9

aaggattatg aggaggttgg tgt                                              23

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>10

cttgggtctg taacaaagca ttc                                              23

<210>11

<211>51

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成序列

<400>11

caccgacaga aggaagaaac tcattcaaga gatgagtttc ttccttctgt c               51

<210>12

<211>51

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成序列

<400>12

aaaactgtct tccttctttg agtaagttct ctactcaaag aaggaagaca g               51

<210>13

<211>47

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成序列

<400>13

gacagaagga agaaactcat tcaagagatg agtttcttcc ttctgtc                    47

<210>14

<211>1475

<212>DNA

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>14

aaacataagg tcactgttct cactacagtt actgagcaca cagacctcac catgggatgg     60

agctctatca tcctcttctt ggtagcaaca gcctcaggtg tccactccca ggtccaactg    120

cagcaacctg ggtctgagct ggtgaggcct ggagcttcag tgaagctgtc ctgcaaggct    180

tctggctaca cattcaccag ctactggatg cactgggtga agcagaggcc tggacaaggc    240

cttgagtgga ttggaaatat ttatcctggt agtggtagta ctaactacga tgagaagttc    300

aagagcaagg ccacactgac tgtagacaca tcctccagca cagcctacat gcagctcagc    360

agcctgacat ctgaggactc tgcggtctat tactgtacaa gagggggtct atggttacgg    420

gttgactact ggggccaagg caccactctc acagtctcct cagccaaaac gacaccccca    480

tctgtctatc cactggcccc tggatctgct gcccaaacta actccatggt gaccctggga    540

tgcctggtca agggctattt ccctgagcca gtgacagtga cctggaactc tggatccctg    600

tccagcggtg tgcacacctt cccagctgtc ctgcagtctg acctctacac tctgagcagc    660

tcagtgactg tcccctccag cacctggccc agcgagaccg tcacctgcaa cgttgcccac    720

ccggccagca gcaccaaggt ggacaagaaa attgtgccca gggattgtgg ttgtaagcct    780

tgcatatgta cagtcccaga agtatcatct gtcttcatct tccccccaaa gcccaaggat    840

gtgctcacca ttactctgac tcctaaggtc acgtgtgttg tggtagacat cagcaaggat    900

gatcccgagg tccagttcag ctggtttgta gatgatgtgg aggtgcacac agctcagacg    960

caaccccggg aggagcagtt caacagcact ttccgctcag tcagtgaact tcccatcatg   1020

caccaggact ggctcaatgg caaggagttc aaatgcaggg tcaacagtgc agctttccct   1080

gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc aaaggcagac cgaaggctcc acaggtgtac   1140

accattccac ctcccaagga gcagatggcc aaggataaag tcagtctgac ctgcatgata   1200

acagacttct tccctgaaga cattactgtg gagtggcagt ggaatgggca gccagcggag   1260

aactacaaga acactcagcc catcatggac acagatggct cttacttcgt ctacagcaag   1320

ctcaatgtgc agaagagcaa ctgggaggca ggaaatactt tcacctgctc tgtgttacat   1380

gagggcctgc acaaccacca tactgagaag agcctctccc actctcctgg taaatgagga   1440

tccccgggta ccgagccgaa ttcactgcag cgtaa                              1475

<210>15

<211>461

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>15

Met Gly Trp Ser Ser Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Ser Gly

1               5                   10                  15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg

            20                  25                  30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

        35                  40                  45

Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

    50                  55                  60

Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asp

65                  70                  75                  80

Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser

                85                  90                  95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

            100                 105                 110

Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Leu Trp Leu Arg Val Asp Tyr Trp Gly

        115                 120                 125

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser

    130                 135                 140

Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val

145                 150                 155                 160

Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

                165                 170                 175

Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

            180                 185                 190

Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro

        195                 200                 205

Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro

    210                 215                 220

Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly

225                 230                 235                 240

Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile

                245                 250                 255

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys

            260                 265                 270

Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln

        275                 280                 285

Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

    290                 295                 300

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu

305                 310                 315                 320

Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg

                325                 330                 335

Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

            340                 345                 350

Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro

        355                 360                 365

Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr

    370                 375                 380

Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln

385                 390                 395                 400

Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly

                405                 410                 415

Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu

            420                 425                 430

Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn

        435                 440                 445

His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

    450                 455                 460

<210>16

<211>820

<212>DNA

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>16

agaactaatg agaatagcag taattagcta gggaccaaaa tacaaagaca aaatggattt     60

tcaagtgcag attttcagct tcctgctaat cagtgcctca gtcataatat ccagaggaaa    120

ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag gtcaccatga    180

cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag tcaggcacct    240

cccccaaaag atggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccct gctcgcttca    300

gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag gctgaagatg    360

ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccatt cacgttcggc tcggggacaa    420

agttggaaat aaaacgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca ccatccagtg    480

agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc taccccaaag    540

acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc ctgaacagtt    600

ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc acgttgacca    660

aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag acatcaactt    720

cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgttagtt aaattaagcg gaatccatat    780

gactagtaga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag                          820

<210>17

<211>235

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>17

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser

1               5                   10                  15

Val Ile Ile Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile

            20                  25                  30

Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser

        35                  40                  45

Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser

    50                  55                  60

Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro

65                  70                  75                  80

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

                85                  90                  95

Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

            100                 105                 110

Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

        115                 120                 125

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

    130                 135                 140

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

145                 150                 155                 160

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

                165                 170                 175

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

            180                 185                 190

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

        195                 200                 205

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

    210                 215                 220

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225                 230                 235

<210>18

<211>118

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>抗-REG4的VH氨基酸序列

<400>18

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

            20                  25                  30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Thr Arg Gly Gly Leu Trp Leu Arg Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

            100                 105                 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

        115

<210>19

<211>103

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>抗-REG4的VL氨基酸序列

<400>19

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

        35                  40                  45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65                  70                  75                  80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu

            100

<210>20

<211>5

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>抗-REG4的VH CDR1氨基酸序列

<400>20

Ser Tyr Trp Met His

1               5

<210>21

<211>12

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>抗-REG4的VH CDR2氨基酸序列

<400>21

Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asp

1               5                   10

<210>22

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>抗-REG4的VH CDR3氨基酸序列

<400>22

Gly Gly Leu Trp Leu Arg Val Asp Tyr

1               5

<210>23

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>抗-REG4的VL CDR1氨基酸序列

<400>23

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1               5                   10

<210>24

<211>7

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>抗-REG4的VL CDR2氨基酸序列

<400>24

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser

1               5

<210>25

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>抗-REG4的VL CDR3氨基酸序列

<400>25

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe

1               5

<210>26

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>26

agctttgttg aacaggcatt t                                              21

<210>27

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>27

ggcagcagta caacaatcta agc                                             23

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>28

cacccccact gaaaaagaga                                                 20

<210>29

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>29

tacctgtgga gcaaggtgc                                                  19

<210>30

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>30

aaggattatg aggaggttgg tgt                                             23

<210>31

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>31

cttgggtctg taacaaagca ttc                                             23

<210>32

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成靶序列

<400>32

gccatattgt cactccttct a                                               21

<210>33

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成靶序列

<400>33

gaagcagcac gacttcttc                                                  19

<210>34

<211>34

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的显性失活肽

<400>34

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Val Arg

1               5                   10                  15

Pro Thr Pro Lys Trp Gln Lys Gly Ile Gly Glu Phe Phe Arg Leu Ser

            20                  25                  30

Pro Lys

<210>35

<211>34

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的显性失活肽

<400>35

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Val Arg

1               5                   10                  15

Pro Thr Pro Lys Trp Ala Lys Gly Ala Gly Glu Ala Ala Arg Leu Ser

            20                  25                  30

Pro Lys

<210>36

<211>34

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的显性失活肽

<400>36

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Ile Phe

1               5                   10                  15

Lys Gln Trp Pro Arg Gly Glu Thr Lys Pro Arg Val Leu Ser Pro Lys

            20                  25                  30

Gly Phe

<210>37

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的显性失活肽

<400>37

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Thr Pro

1               5                   10                  15

Lys Trp Gln Lys Gly Ile Gly Glu Phe Phe Arg Leu Ser Pro

            20                  25                  30

<210>38

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的显性失活肽

<400>38

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Thr Pro

1               5                   10                  15

Lys Trp Ala Lys Gly Ala Gly Glu Ala Ala Arg Leu Ser Pro

            20                  25                  30

<210>39

<211>1508

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>39

gagagacctt ggagcgcgcg ggaaagagac caatataaac tgtggcggga tagttttcgg     60

gtccttgtcc agtgaaacac cctcggctgg gaagtcagtt cgttctctcc tctcctctct    120

tcttgtttga acatggtgcg gactaaagca gacagtgttc caggcactta cagaaaagtg    180

gtggctgctc gagcccccag aaaggtgctt ggttcttcca cctctgccac taattcgaca    240

tcagtttcat cgaggaaagc tgaaaataaa tatgcaggag ggaaccccgt ttgcgtgcgc    300

ccaactccca agtggcaaaa aggaattgga gaattcttta ggttgtcccc taaagattct    360

gaaaaagaga atcagattcc tgaagaggca ggaagcagtg gcttaggaaa agcaaagaga    420

aaagcatgtc ctttgcaacc tgatcacaca aatgatgaaa aagaatagaa ctttctcatt    480

catctttgaa taacgtctcc ttgtttaccc tggtattcta gaatgtaaat ttacataaat    540

gtgtttgttc caattagctt tgttgaacag gcatttaatt aaaaaattta ggtttaaatt    600

tagatgttca aaagtagttg tgaaatttga gaatttgtaa gactaattat ggtaacttag    660

cttagtattc aatataatgc attgtttggt ttcttttacc aaattaagtg tctagttctt    720

gctaaaatca agtcattgca ttgtgttcta attacaagta tgttgtattt gagatttgct    780

tagattgttg tactgctgcc atttttattg gtgtttgatt attggaatgg tgccatattg    840

tcactccttc tacttgcttt aaaaagcaga gttagatttt tgcacattaa aaaattcagt    900

attaattaaa cattacttat tctaccctct tttttggcaa ggaggacaaa tacgcaatgt    960

tggaaaacct tggatggata tcttctcttt aaaaaaatgt aaagataatt tggtcttgag   1020

ggtttaaacg gttgataatg cctctacaac aacaagaaaa aagataaaat actaggatag   1080

aatcatggtg ggcacagtgg cttctcagga ggctgaggag ggaggtttgc ttgagtccag   1140

gagttggaga ccagcccagg caacatagcg taaaccctat ctctaaaaca atttttagcc   1200

aggtgcggtg gctcacgcct gtaatcccag cactctggga ggccgaggcg ggtggatcat   1260

gaggtcagga gatcgagacc atcctgccta acaaggtgaa accccgtctc tactaaaaat   1320

acaaaaaatt agccgggcgc ggtggcgggc gcctgtagtc ccagctactc gggaggctga   1380

ggcaggagaa tggcgtgaac ccgggaagtg gagcttgcag tgagccgaga ttgcgccact   1440

gcagtcggca gtccggcttg ggcgacagag cgagactccg tctcaaaaaa aaaaaaaaaa   1500

aaaaaaaa                                                            1508

<210>40

<211>111

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>40

Met Val Arg Thr Lys Ala Asp Ser Val Pro Gly Thr Tyr Arg Lys Val

1               5                   10                  15

Val Ala Ala Arg Ala Pro Arg Lys Val Leu Gly Ser Ser Thr Ser Ala

            20                  25                  30

Thr Asn Ser Thr Ser Val Ser Ser Arg Lys Ala Glu Asn Lys Tyr Ala

        35                  40                  45

Gly Gly Asn Pro Val Cys Val Arg Pro Thr Pro Lys Trp Gln Lys Gly

    50                  55                  60

Ile Gly Glu Phe Phe Arg Leu Ser Pro Lys Asp Ser Glu Lys Glu Asn

65                  70                  75                  80

Gln Ile Pro Glu Glu Ala Gly Ser Ser Gly Leu Gly Lys Ala Lys Arg

                85                  90                  95

Lys Ala Cys Pro Leu Gln Pro Asp His Thr Asn Asp Glu Lys Glu

            100                 105                 110

<210>41

<211>55

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成序列

<400>41

caccgccata ttgtcactcc ttctattcaa gagatagaag gagtgacaat atggc          55

<210>42

<211>55

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成序列

<400>42

aaaagccata ttgtcactcc ttctattcaa gagatagaag gagtgacaat atggc          55

<210>43

<211>5l

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成序列

<400>43

gccatattgt cactccttct attcaagaga tagaaggagt gacaatatgg c             51

<210>44

<211>20

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的显性失活肽

<400>44

Val Arg Pro Thr Pro Lys Trp Gln Lys Gly Ile Gly Glu Phe Phe Arg

1               5                   10                  15

Leu Ser Pro Lys

            20

<210>45

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的显性失活肽

<400>45

Thr Pro Lys Trp Gln Lys Gly Ile Gly Glu Phe Phe Arg Leu Ser Pro

1               5                   10                  15

<210>46

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>PIP基序

<400>46

Gln Lys Gly Ile Gly Glu Phe Phe

1               5

<210>47

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的Tat序列

<400>47

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1               5

<210>48

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的Penetratin序列

<400>48

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1               5                   10                  15

<210>49

<211>21

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的Buforin II序列

<400>49

Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His

1               5                   10                  15

Arg Leu Leu Arg Lys

            20

<210>50

<211>27

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的Transportan序列

<400>50

Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu

1               5                   10                  15

Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu

            20                  25

<210>51

<211>18

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的MAP(模型两亲性肽)序列

<400>51

Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys

1               5                   10                  15

Leu Ala

<210>52

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的K-FGF序列

<400>52

Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro

1               5                   10                  15

<210>53

<211>5

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的Ku70序列

<400>53

Val Pro Met Leu Lys

1               5

<210>54

<211>28

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的朊病毒序列

<400>54

Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp

1               5                   10                  15

Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro

            20                  25

<210>55

<211>18

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的pVEC序列

<400>55

Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His

1               5                   10                  15

Ser Lys

<210>56

<211>21

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的Pep-1序列

<400>56

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys

1               5                   10                  15

Lys Lys Arg Lys Val

            20

<210>57

<211>18

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的SynB1序列

<400>57

Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr

1               5                   10                  15

Gly Arg

<210>58

<211>15

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的Pep-7序列

<400>58

Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gln Tyr

1               5                   10                  15

<210>59

<211>12

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的HN-1序列

<400>59

Thr Ser Pro Leu Asn Ile His Asn Gly Gln Lys Leu

1               5                   10

<210>60

<211>11

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的多聚精氨酸序列

<400>60

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1               5                   10

<210>61

<211>5

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的Ku70序列

<400>61

Pro Met Leu Lys Glu

1               5

<210>62

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的显性失活肽

<400>62

Ala Lys Gly Ala Gly Glu Ala Ala

1               5

<210>63

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于合成的人工合成引物序列

<400>63

cggaattcat ggcttccaga agcatgc                                        27

<210>64

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于合成的人工合成引物序列

<400>64

ataagaatgc ggccgctggt cggtacttgc acagg                               35

Claims (76)

1.一种治疗或预防受试者中胰腺癌的方法，包括对所述受试者施用包含至少一种小干扰RNA(siRNA)的组合物，所述小干扰RNA抑制REG4或KIAA0101的表达。

2.权利要求1的方法，其中所述siRNA包含有义核酸序列和与来自REG4或KIAA0101的序列特异性杂交的反义核酸序列。

3.权利要求1的方法，其中治疗的癌症选自下组：胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌。

4.权利要求3的方法，其中所述胰腺癌是胰腺导管腺癌(PDAC)。

5.权利要求1的方法，其中所述siRNA抑制REG4的表达，并且治疗的癌症是PDAC。

6.权利要求1的方法，其中siRNA抑制KIAA0101的表达，并且治疗的癌症是胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌。

7.权利要求2的方法，其中所述siRNA包含对应于作为靶序列的SEQID NO：5或SEQ ID NO：32的序列的核糖核苷酸序列。

8.权利要求7的方法，其中所述siRNA具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，

其中[A]是对应于SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：32的核苷酸序列的核糖核苷酸序列，

[B]是由3-23个核苷酸组成的核糖核苷酸环序列，且

[A’]是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。

9.一种包含有义链和反义链的双链分子，其中所述有义链包含对应于SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：32的靶序列的核糖核苷酸序列，并且其中所述反义链包含与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义链和所述反义链相互杂交形成所述双链分子，并且其中所述双链分子当导入表达REG4或KIAA0101基因的细胞时，抑制所述基因的表达。

10.权利要求9的双链分子，其中所述靶序列包含来自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：39的核苷酸序列的至少约10个连续核苷酸。

11.权利要求10的双链分子，其中所述靶序列包含来自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：39的核苷酸序列的约19至约25个连续核苷酸。

12.权利要求11的双链分子，其中所述双链分子是单一核糖核苷酸转录物，其包含藉由单链核糖核苷酸序列连接的所述有义链和反义链。

13.权利要求10的双链分子，其中所述双链分子是长度小于约100个核苷酸的寡核苷酸。

14.权利要求13的双链分子，其中所述双链分子是长度小于约75个核苷酸的寡核苷酸。

15.权利要求14的双链分子，其中所述双链分子是长度小于约50个核苷酸的寡核苷酸。

16.权利要求15的双链分子，其中所述双链分子是长度小于约25个核苷酸的寡核苷酸。

17.权利要求16的双链多核苷酸，其中所述双链分子是长度约19至约25个核苷酸的寡核苷酸。

18.一种载体，其编码权利要求10的双链分子。

19.权利要求18的载体，其中所述载体编码具有二级结构的转录物并且包含所述有义链和反义链。

20.权利要求19的载体，其中所述转录物进一步包含连接所述有义链和反义链的单链核糖核苷酸序列。

21.一种载体，其包含含有有义链核酸和反义链核酸的组合的多核苷酸，其中所述有义链核酸包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：32的核苷酸序列，并且所述反义链核酸由该有义链的互补序列组成。

22.权利要求21的载体，其中所述多核苷酸具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，

其中[A]是SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：32的核苷酸序列；

[B]是由3-23个核苷酸组成的核苷酸序列；且

[A’]是[A]的互补核苷酸序列。

23.一种用于治疗或预防胰腺癌的药物组合物，包含作为活性成分的药学有效量的抑制REG4表达的小干扰RNA(siRNA)，和药学可接受的载体。

24.权利要求23的药物组合物，其中所述siRNA包含作为靶序列的SEQID NO：5的核苷酸序列。

25.权利要求24的组合物，其中所述siRNA具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，

其中[A]是对应于SEQ ID NO：5的核苷酸序列的核糖核苷酸序列；

[B]是由3-23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列；和

[A’]是[A]的互补核糖核苷酸序列。

26.一种用于治疗或预防胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌的药物组合物，包含作为活性成分的药学有效量的抑制KIAA0101表达的小干扰RNA(siRNA)，和药学可接受的载体。

27.权利要求26的药物组合物，其中所述siRNA包含作为靶序列的SEQID NO：32的核苷酸序列。

28.权利要求27的组合物，其中所述siRNA具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’

其中[A]是对应于SEQ ID NO：32的核苷酸序列的核糖核苷酸序列；

[B]是由3-23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列；且

[A’]是[A]的互补核糖核苷酸序列。

29.抑制REG4表达的小干扰RNA(siRNA)用于制备治疗或预防胰腺癌的药物组合物的用途。

30.权利要求29的用途，其中所述siRNA包含作为靶序列的SEQ ID NO：5的核苷酸序列。

31.抑制KIAA0101表达的小干扰RNA(siRNA)用于制备治疗或预防胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌的药物组合物的用途。

32.权利要求31的用途，其中所述siRNA包含作为靶序列的SEQ ID NO：32的核苷酸序列。

33.一种用于治疗或预防受试者中胰腺癌的方法，包括向所述受试者施用中和REG4活性的抗REG4抗体或其片段。

34.权利要求33的方法，其中所中和的REG4活性是以自分泌/旁分泌的方式促进胰腺癌的细胞增殖的活性。

35.权利要求33的方法，其中所述胰腺癌是胰腺导管腺癌(PDAC)。

36.权利要求33的方法，其中所述抗REG4抗体是单克隆抗体。

37.权利要求33的方法，其中所述抗体包含VH链和VL链，每条VH链和VL链包含由框架氨基酸序列隔开的称为CDR1、CDR2和CDR3的CDR氨基酸序列，每条VH链和VL链中各CDR的氨基酸序列是：

VH CDR1：SYWMH(SEQ ID NO：20)，

VH CDR2：NIYPGSGSTNYD(SEQ ID NO：21)，

VH CDR3：GGLWLRVDY(SEQ ID NO：22)，

VL CDR1：SASSSVSYMH(SEQ ID NO：23)，

VL CDR2：DTSKLAS(SEQ ID NO：24)，和

VL CDR3：QQWSSNPF(SEQ ID NO：25)。

38.权利要求36的方法，其中人VH包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列，并且人VL包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列。

39.一种用于治疗或预防胰腺癌的药物组合物，所述组合物包含药学有效量的中和REG4活性的抗REG4抗体或其片段作为活性成分，和药学可接受载体。

40.权利要求39的药物组合物，其中所述胰腺癌是胰腺导管腺癌(PDAC)。

41.权利要求39的药物组合物，其中所述抗REG4抗体是单克隆抗体。

42.权利要求39的药物组合物，其中所述抗体包含VH链和VL链，每条VH链和VL链包含由框架氨基酸序列隔开的称为CDR1、CDR2和CDR3的CDR氨基酸序列，每条VH链和VL链中各CDR的氨基酸序列是：

VH CDR1：SYWMH(SEQ ID NO：20)，

VH CDR2：NIYPGSGSTNYD(SEQ ID NO：21)，

VH CDR3：GGLWLRVDY(SEQ ID NO：22)，

VL CDR1：SASSSVSYMH(SEQ ID NO：23)，

VL CDR2：DTSKLAS(SEQ ID NO：24)，和

VL CDR3：QQWSSNPF(SEQ ID NO：25)。

43.权利要求42的组合物，其中所述人VH包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列，并且人VL包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列。

44.一种抗体，其包含VH链和VL链，每条VH链和VL链包含由框架氨基酸序列隔开的称为CDR1、CDR2和CDR3的CDR氨基酸序列，每条VH链和VL链中各CDR的氨基酸序列是：

VH CDR1：SYWMH(SEQ ID NO：20)，

VH CDR2：NIYPGSGSTNYD(SEQ ID NO：21)，

VH CDR3：GGLWLRVDY(SEQ ID NO：22)，

VL CDR1：SASSSVSYMH(SEQ ID NO：23)，

VL CDR2：DTSKLAS(SEQ ID NO：24)，和

VL CDR3：QQWSSNPF(SEQ ID NO：25)。

45.权利要求44的抗体，其中所述人VH包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列，并且人VL包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列。

46.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求44的抗体。

47.一种载体，其包含编码权利要求44的抗体的多核苷酸。

48.一种分离的宿主细胞，其包含载体，该载体包含编码权利要求44的抗体的多核苷酸。

49.一种产生抗体的方法，包括培养权利要求48的宿主细胞从而表达所述多核苷酸，和从宿主细胞培养物回收所述抗体。

50.一种用于治疗或预防胰腺癌的药物组合物，所述组合物包含编码权利要求44的抗体的多核苷酸，或含有该多核苷酸的载体。

51.与REG4编码的蛋白质结合的抗体或其片段用于制备治疗或预防胰腺癌的药物组合物的用途。

52.权利要求51的用途，其中所述抗体包含VH链和VL链，每条VH链和VL链包含由框架氨基酸序列隔开的称为CDR1、CDR2和CDR3的CDR氨基酸序列，每条VH链和VL链中各CDR的氨基酸序列是：

VH CDR1：SYWMH(SEQ ID NO：20)，

VH CDR2：NIYPGSGSTNYD(SEQ ID NO：21)，

VH CDR3：GGLWLRVDY(SEQ ID NO：22)，

VL CDR1：SASSSVSYMH(SEQ ID NO：23)，

VL CDR2：DTSKLAS(SEQ ID NO：24)，和

VL CDR3：QQWSSNPF(SEQ ID NO：25)。

53.一种治疗和/或预防癌症的作用剂，其包含：作为活性成分的包含QKGIGEFF/SEQ ID NO：46的多肽；与该多肽在功能上等同的多肽；或编码这些多肽的多核苷酸，其中所述多肽缺乏由SEQ ID NO：40组成的肽的生物学功能。

54.权利要求53的作用剂，其中所述生物学功能是细胞增殖活性。

55.权利要求53的作用剂，其中所述多肽由8-30个残基组成。

56.权利要求53的作用剂，其中所述多肽包含氨基酸序列VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK/SEQ ID NO.44或TPKWQKGIGEFFRLSP/SEQ ID NO.45。

57.权利要求53的作用剂，其中所述多肽由氨基酸序列VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK/SEQ ID NO.44或TPKWQKGIGEFFRLSP/SEQ ID NO.45组成。

58.权利要求53的作用剂，其中活性成分是所述多肽，并且将所述多肽用细胞膜透过性物质修饰。

59.权利要求58的作用剂，其中所述多肽具有以下通式：

[R]-[D]；

其中[R]表示细胞膜透过性物质；且[D]代表包含QKGIGEFF/SEQ ID NO：46的片段序列的氨基酸序列，或与该多肽在功能上等同的多肽，其中所述多肽缺乏由SEQ ID NO：40组成的肽的生物学功能。

60.权利要求58的作用剂，其中所述细胞膜透过性物质是选自下组中的任一种：

多聚精氨酸；

Tat/RKKRRQRRR/SEQ ID NO：47；

Penetratin/RQIKIWFQNRRMKWKK/SEQ ID NO：48；

Buforin II/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK/SEQ ID NO：49；

Transportan/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/SEQ ID NO：50；

MAP(模式两性肽)/KLALKLALKALKAALKLA/SEQ ID NO：51；

K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP/SEQ ID NO：52；

Ku70/VPMLK/SEQ ID NO：53或PMLKE/SEQ ID NO：61；

朊病毒/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP/SEQ ID NO：54；

pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK/SEQ ID NO：55；

Pep-1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/SEQ ID NO：56；

SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR/SEQ ID NO：57；

Pep-7/SDLWEMMMVSLACQY/SEQ ID NO：58；和

HN-1/TSPLNIHNGQKL/SEQ ID NO：59。

61.权利要求60的作用剂，其中所述多聚精氨酸是Arg 11(SEQ ID NO：60)。

62.权利要求53的作用剂，其中所述癌症是选自下组中的任一种：胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌。

63.一种治疗和/或预防癌症的方法，包括施用包含QKGIGEFF/SEQ IDNO：46的多肽；与该多肽在功能上等同的多肽；或编码这些多肽的多核苷酸的步骤，其中所述多肽缺乏由SEQ ID NO：40组成的肽的生物学功能。

64.包含QKGIGEFF/SEQ ID NO：46的多肽；与该多肽在功能上等同的多肽；或编码这些多肽的多核苷酸在制备治疗和/或预防癌症的药物组合物中的用途，其中所述多肽缺乏由SEQ ID NO：40组成的肽的生物学功能。

65.一种药物组合物，其包含含有QKGIGEFF/SEQ ID NO：46的多肽或与该多肽在功能上等同的多肽，和药学可接受的载体，其中所述多肽缺乏由SEQ ID NO：40组成的肽的生物学功能。

66.一种多肽，其包含QKGIGEFF/SEQ ID NO：46；或与该多肽在功能上等同的多肽的氨基酸序列，其中所述多肽缺乏由SEQ ID NO：40组成的肽的生物学功能。

67.权利要求66的多肽，其中所述生物学功能是细胞增殖活性。

68.权利要求66的多肽，其中所述多肽由8-30个残基组成。

69.权利要求66的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK/SEQ ID NO.44或TPKWQKGIGEFFRLSP/SEQ ID NO.45。

70.权利要求66的多肽，其中所述多肽由氨基酸序列VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK/SEQ ID NO.44或TPKWQKGIGEFFRLSP/SEQ ID NO.45组成。

71.权利要求66的多肽，其中将所述多肽被细胞膜透过性物质所修饰。

72.权利要求71的多肽，其具有以下通式：

[R]-[D]；

其中[R]表示细胞膜透过性物质；且[D]代表包含QKGIGEFF/SEQ ID NO：46的片段序列的氨基酸序列，或与包含所述片段序列的多肽在功能上等同的多肽的氨基酸序列，其中所述多肽缺乏由SEQ ID NO：40组成的肽的生物学功能。

73.权利要求72的多肽，其中所述细胞膜透过性物质是选自下组中的任一种：

多聚精氨酸；

Tat/RKKRRQRRR/SEQ ID NO：47；

Penetratin/RQIKIWFQNRRMKWKK/SEQ ID NO：48；

Buforin II/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK/SEQ ID NO：49；

Transportan/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/SEQ ID NO：50；

MAP(模式两性肽)/KLALKLALKALKAALKLA/SEQ ID NO：51；

K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP/SEQ ID NO：52；

Ku70/VPMLK/SEQ ID NO：53

Ku70/PMLKE/SEQ ID NO：61；

朊病毒/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP/SEQ ID NO：54；

pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK/SEQ ID NO：55；

Pep-1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/SEQ ID NO：56；

SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR/SEQ ID NO：57；

Pep-7/SDLWEMMMVSLACQY/SEQ ID NO：58；和

HN-1/TSPLNIHNGQK上/SEQ ID NO：59。

74.权利要求73的多肽，其中所述多聚精氨酸是Arg 11(RRRRRRRRRRR/SEQ ID NO：60)。

75.一种用于诊断受试者中癌症的化放疗抗性的方法，包括步骤：

(a)检测源自患者的生物样品中REG4基因的表达水平；

(b)将检测到的表达水平与对照水平比较；和

(c)当检测到的水平相对正常对照水平有所增加时，判定所述受试者患有化放疗抗性癌症或处于化放疗抗性的危险中。

76.权利要求75的方法，其中所述癌症是胰腺癌。

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