CN101525379B - 植物耐旱相关蛋白及其编码基因与它们的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与植物耐旱相关蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №.3的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID №.3氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有耐旱相关功能的由SEQ ID №：3衍生的蛋白质。该基因具有下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列；2)序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列；3)在高严谨条件下可与1)或2)所述的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明的耐旱相关基因对于植物耐干旱分子机制的研究，植物抗逆性品种的选育具有重要的理论及实际意义。该基因过表达植株也可以作为指示植物，预警旱情。

Description

植物耐旱相关蛋白及其编码基因与它们的应用

技术领域

本发明涉及植物耐旱相关蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种来源于拟南芥的植物耐旱相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

粮食问题是当今世界所面临的几大难题之一。随着人类的经济发展和人口膨胀，水资源短缺现象日益严重，直接导致了干旱地区的扩大与干旱化程度的加重，干旱问题已经成为全球关注的问题。因此，了解和认识植物对干旱胁迫的反应机制，进而提高植物特别是农作物的抗旱能力，已成为如何进一步提高作物产量的重要研究工作，倍受世界各国政府和科学家的关注，也是当前生命科学研究的热点。

拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一种典型的模式植物(其作用与实验鼠、果蝇等模式生物相当)，已被广泛应用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究。拟南芥约有1.3亿个碱基对，约2.7万个基因。目前大部分基因的功能还不清楚，利用突变技术研究基因功能已经成为一种有效的方法。对拟南芥而言，T-DNA插入突变是主要途径，并且已经得到大量T-DNA插入突变体。拟南芥的大多数基因在其他植物中都能找到与之同源的序列，有关拟南芥的绝大多数发现也都能应用于其他植物研究。以往的研究已经证明，对拟南芥的研究将帮助科学家找到提高农作物产量的方法。面对农作物生产中日益严重的土壤干旱问题，克隆植物耐旱相关基因并对其功能进行研究，对尽快培育作物耐干旱品种有重要的实践意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物耐旱相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的植物耐旱相关的蛋白，名称为AtDT(Arabidopsis thalianaDrought Tolerant)，来源于拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列3的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐旱相关功能的由(a)衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列3所示的蛋白序列由849个氨基酸残基组成。

为了使(a)中的AtDT分泌到细胞周质或培养基中或使其功能稳定，可在由序列表中序列3的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端连接上信号肽序列，为了(a)中的AtDT便于纯化，可在由序列表中序列3的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagII	8	WSHPQFEK
			c-myc	11	EQKLISEEDL

上述(b)中的AtDT可人工合成，也可先合成其编码基因，再按照下述方法进行生物表达得到。上述(b)中的AtDT的编码基因可通过将序列表中序列1或序列2的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端连上信号肽的编码序列，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述植物耐旱相关蛋白的编码基因(AtDT)也属于本发明的保护范围。

上述植物耐旱相关蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列；

2)在高严谨条件下可与1)所述的DNA序列杂交的核苷酸序列。

其中，序列表中序列1是由2550个脱氧核苷酸组成，自序列表中序列1的5′端第1-2547位核苷酸序列为编码序列(ORF)，编码具有序列表中序列3的氨基酸残基序列的蛋白质。

上述植物耐旱相关蛋白的基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列；

2)在高严谨条件下可与1)所述的DNA序列杂交的核苷酸序列。

序列表中序列2由3123个脱氧核苷酸组成，含有6个外显子和5个内含子。自序列表中序列2的5′端第1-1613位核苷酸为第一个外显子，序列1的5′端第1698-1821位核苷酸为第二个外显子，序列1的5′端第1903-2196位核苷酸为第三个外显子，序列1的5′端第2282-2484位核苷酸为第四个外显子，序列1的5′端第2572-2862位核苷酸为第五个外显子，序列1的5′端第3189-3213位核苷酸为第六个外显子，

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有上述植物耐旱相关蛋白的编码基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增AtDT中任一片段的引物对在本发明的保护范围之内，该引物对中的每一个引物的长度为15到36个碱基，如SEQ ID№：4(5’atggaattccgcaaaccctttaagtctcat3’)和SEQ ID №：5(5’ttaacattcaagaagaataattcgccttaaatcaggg3’)。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的AtDT基因敲除掉，植物就表现耐旱相关性状；或者将AtDT基因在植株中过量表达，植物就表现干旱敏感性状。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本发明的耐旱相关基因对于植物耐干旱分子机制的研究，植物抗逆性品种的选育具有重要的理论及实际意义。如利用本发明的基因可设计小干扰RNA对该基因的表达进行干扰，插入突变该基因或者缺失突变该基因，从而提高植物对干旱的耐受能力。该基因过表达植株也可以作为指示植物，预警旱情。

附图说明

图1为AtDT在野生型和突变体atdt中的表达结果-RT-PCR；

图2为AtDT在野生型和AtDT过量表达植株中的表达分析结果-Northern杂交；

图3为干旱条件下AtDT基因的表达变化结果-Realtime PCR；

图4为野生型、AtDT过量表达植株(SUPER::AtDT-1和SUPER::AtDT-5)、AtDT敲除突变体(atdt)和AtDT恢复突变材料(P_AtDT::AtDT株系)在干旱条件下的表型观察结果。

具体实施方式

实施例1、植物耐旱相关的基因及其编码蛋白的获得

一、Columbia背景的对干旱耐受性增强的拟南芥突变体的获得

对T-DNA插入突变体库进行筛选，得到一株对干旱胁迫具有耐受能力的突变体。从ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)购得到编号为Salk_133223的T-DNA插入突变体T4代种子(简称突变体atdt)。

1、T-DNA插入突变体Salk_133223的纯合体的获得和鉴定

拟南芥野生型(Columbia型)和T-DNA插入突变体Salk_133223材料在MS培养基上生长10天得到幼苗。各取100-200mg为材料，用TRizol(Invitrogen)提取其总RNA，经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性。按照SUPERSCRIPTII的使用说明，合成单链ss cDNA。

设计引物进行半定量PCR扩增检测插入基因的表达情况，引物序列为：

Primer1：5’AAATCAGCTCCTCCTTTCTGC 3’，Primer2：5’GAATTCCGCAAACCCTTTAAG 3’。

基因的扩增条件如下：将合成的单链cDNA稀释10倍，作为以下PCR反应的模板：20μL体系，内含10×PCR Buffer 2μL，2.5mM dNTP mix 0.4μL，10μM Primer1和Primer2各0.4μL，Taq enzyme(15U/μL)0.1μL。在PE9700上扩增：95℃预变性5min，95℃30s，59℃30s，72℃1min10s，共计35个循环；72℃延伸10min，将获得的PCR产物(1285bp)，用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

EF基因为看家基因，作为对照。其扩增引物为引物Primer3：5’ATGCCCCAGGACATCGTGATTTCAT 3’，Primer4：5’TTGGCGGCACCCTTAGCTGGATCA 3’。其扩增方法为：将上述合成的单链cDNA稀释10倍，作为以下PCR反应的模板：20μL体系，内含10×PCR Buffer 2μL，10mM dNTP mix 0.4μL，10μM Primer3和Primer4各0.4μL，Taq enzyme(15U/μL)0.1μL。在PE9700上扩增：95℃预变性5min，95℃30s，56℃30s，72℃1min，共计18个循环；72℃延伸10min，将获得的PCR产物(685bp)，用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

结果如图1所示，野生型植株中扩增到目的条带，大小为1285bp，而在T-DNA插入突变体Salk_133223中，没有扩增到目的条带，说明T-DNA插入突变体Salk_133223中AtDT基因被完全敲除，将T-DNA插入突变体Salk_133223命名为突变体atdt。

二、本发明耐旱相关基因(AtDT)及其编码蛋白的获得

1、本发明耐旱相关基因(AtDT)的cDNA的获得

按照步骤一的步骤1的方法提取拟南芥(Columbia型)幼苗总RNA、反转录为cDNA。以此cDNA为模板、利用分别设有XbaI和KpnI酶切位点的一对引物进行PCR扩增，得到耐旱相关基因的cDNA全长。引物序列如下：

Primer5：5’-gc tctaga ATGGAATTCCGCAAAC-3’(XbaI)；

Primer6：5’-gg ggtaccTTAACATTCAAGAAGA-3’(KpnI)。

采用Takara公司的高保真的Pyrobest DNA聚合酶对AtDT cDNA全长进行扩增，扩增体系为50μL，含10×Pyrobest PCR缓冲液5μL，10mM dNTP mix 1μL，10μM Primer5和Primer6各1μL，Pyrobest DNA聚合酶0.25μL，模板3-5μL(0.1ug)，补充灭菌超纯水至50μL，反应体系在冰上进行操作。在PE 9700仪器上进行扩增，预变性5min，95℃变性30s，56℃30s，72℃3min，循环数30个，72℃延伸10min。

将扩增片段用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收扩增片段，连接到pMD18-T载体，酶切、扩增、测序鉴定，测序结果表明，上述PCR扩增得到的片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，为本发明的抗旱相关基因cDNA基因命名为AtDT，序列表中序列1的核苷酸序列由2550个碱基组成，其编码序列为自序列表中序列1的第1-2547位核苷酸，编码具有序列表中序列3的氨基酸残基序列。将上述获得的正确的含有AtDT-1的重组载体命名为pMD18-AtDT。

2、本发明抗旱相关基因(AtDT)的基因组DNA的获得

从ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)购得到编号为F6P23的细菌人工染色体(BAC)。该编号为F6P23的BAC包含AtDT全长基因组序列。以此为模板，利用分别设有XbaI和KpnI酶切位点的一对引物(Primer5和Primer6)扩增目的基因的全长(3123bp)。

采用Takara公司的LA Taq DNA聚合酶对AtDT基因全长进行扩增，扩增体系为50μL，含10×LA PCR缓冲液5μL，10mM dNTP mix 8μL，10μM Primer1和Primer2各2μL，LA Taq DNA聚合酶0.5μL，模板3-5μL(0.1μg)，补充灭菌超纯水至50μL。在PE 9700仪器上进行扩增，预变性5min，95℃变性1min，56℃1min，72℃5min，循环数30个，72℃延伸10min。

将扩增片段用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收扩增片段，连接到pMD18-T载体，酶切、扩增、测序鉴定，测序结果表明，上述PCR扩增得到的片段具有序列表中序列2的核苷酸序列，为本发明的耐旱相关基因的基因组基因，将其命名为AtDT基因组基因，序列表中序列2的核苷酸序列由3123个核苷酸碱基组成，自序列表中序列2的5′端第1-1613位核苷酸为第一个外显子，序列1的5′端第1698-1821位核苷酸为第二个外显子，序列1的5′端第1903-2196位核苷酸为第三个外显子，序列1的5′端第2282-2484位核苷酸为第四个外显子，序列1的5′端第2572-2862位核苷酸为第五个外显子，序列1的5′端第3189-3213位核苷酸为第六个外显子，这六个外显子序列编码具有序列表中序列3的氨基酸残基序列。将上述获得的正确的含有AtDT基因组DNA的重组载体命名为pMD18-gAtDT。

实施例2、本发明的植物耐旱相关的基因及其编码蛋白的功能验证

1、AtDT过量表达植株和AtDT恢复突变体植株的获得

1)AtDT过量表达植株(转Super::gAtDT拟南芥植株)的获得

采用实施例1的步骤二的步骤2所获得的含有AtDT基因组DNA的重组载体pMD18-gAtDT和pBIB-Super质粒(pBIB-Super载体的构建方法：利用引物aagcttGTGGGCCTGTGGTCTCAAGAT和tctagaCTAGAGTCGATTTGGT从质粒pMSP-1(Ni M，Cui D，Einstein J，Narasimhulu S，Vergara C，Gelvin SB.Strenght and tissue specificityof chimaeric promoters derived from the octopine and mannopine systhase genes.19957：661-676.)中扩增出长1.1kb的super启动子序列；将扩增得到的super启动子用HindIII和XbaI双酶切，回收super启动子片段，插入到质粒pBIB(Becher D.Binaryvectors which allow the exchange of plant selectable markers and reporter genes.Nucleic Acids Res.199018：203.)的HindIII和XbaI酶切位点之间中，得到pBIB-Super质粒))同时用内切酶XbaI和KpnI进行大体系酶切。将所切得的AtDT基因片段和线性化的pBIB-Super质粒片段进行回收，连接，并测序验证，即获得验证正确的含有AtDT基因组基因的重组载体并将其命名为Super::gAtDT。将Super::gAtDT转入农杆菌株，进而利用农杆菌转化侵染Columbia野生型拟南芥植株，从而获得AtDT过量表达T1代转Super::gAtDT拟南芥植株。经过在含50mg/L潮霉素的MS培养基上筛选转Super::gAtDT拟南芥T 2代阳性植株并进行分离比统计，在T 3代即得到转Super::gAtDT拟南芥单拷贝纯合株系。

2)atdt恢复突变体植株(P_AtDT::AtDT)的获得

从ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)购得到编号为F6P23的细菌人工染色体(BAC)。该编号为F6P23的BAC包含AtDT全长基因组序列和AtDT启动子序列。以此为模板，利用分别设有BamHI和PstI酶切位点的一对引物扩增目的基因启动子和目的基因的全长(5840bp)，引物序列如下(下划线为保护碱基和酶切位点)：

Primer7：5’-_cgggatccTTATGCGTTCTAAGTGCTACTG_-3(BamHI)；

Primer8：5’-aactgcagTACGAAGATGAATCCACCCG-3’(PstI)。

采用Takara公司的LA Taq DNA聚合酶对AtDT基因全长及启动子区域进行扩增，扩增体系为50μL，含10×LA PCR缓冲液5μL，10mM dNTP mix 1μL，10μM Primer1和Primer2各2μL，LA Taq DNA聚合酶0.5μL，模板3-5μL(0.1μg)，补充灭菌超纯水至50μL。在PE 9700仪器上进行扩增，预变性5min，95℃变性1min，56℃1min，72℃7min，循环数30个，72℃延伸10min。将扩增片段用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收扩增片段，连接到pMD18-T载体，酶切、扩增、测序鉴定。测序结果表明，上述PCR扩增得到的片段包含AtDT全长基因组序列及其起始密码子上游promoter区2717bp的核苷酸序列。将所得AtDT基因promoter区和全长基因组片段与载体pCAMBIA1381连接，构建成重组质粒，并测序验证，即获得验证正确的含有AtDT基因组基因及其启动子序列的重组载体并将其命名为P_AtDT::AtDT。

并将P_AtDT::AtDT质粒通过农杆菌转入atdt突变体植株，从而获得T1代转P_AtDT::AtDT拟南芥atdt突变体植株。经过在含50mg/L潮霉素的MS培养基上筛选转P_AtDT::AtDT拟南芥T2代阳性植株并进行分离比统计，在T3代即得到atdt恢复突变体植株(P_AtDT::AtDT)单拷贝纯合株系。

2、AtDT过量表达植株的定量表达Northen杂交检测

将野生型拟南芥(Columbia型)和步骤1得到的AtDT过量表达株系转Super::gAtDT拟南芥单拷贝纯合株系(名称分别为SUPER::AtDT-1、SUPER::AtDT-4和SUPER::AtDT-5)以及突变体atdt的种子萌发后在MS培养基上生长10天得到幼苗，取100-200mg，用TRizol(Invitrogen)提取其总RNA，经甲醛变性RNA琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性，用紫外分光光度计和电泳方法结合做精确定量。然后分别取相同量的RNA进行定量Northen杂交，其探针序列如序列6所示(自序列表中序列1的5′端第268-829位核苷酸，是AtDT基因的特异性较强的序列片断区域，探针长度为562bp。

以步骤二的步骤1中得到的载体pMD18-gAtDT为摸板，进行PCR扩增。引物序列如下：

Primer9：5’-GAGGAAACAGAGGATGTCAGC_-3；

Primer10：5’-_TGAGAACCAGCAAGACCACT_-3。

采用Takara公司的Pyrobest聚合酶对AtDS基因探针进行扩增，扩增体系为50μL，含10×Pyrobest PCR缓冲液5μL，10mM dNTP mix 1μL，10μM Primer1和Primer2各2μL，Pyrobest DNA聚合酶0.5μL，模板3μL(0.2μg)，补充灭菌超纯水至50μL。在PE 9700仪器上进行扩增，预变性5min，95℃变性1min，58℃1min，72℃1min，循环数30个，72℃延伸10min。将扩增片段用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收扩增片段，得到相应序列的探针。

Northen杂交结果如图2所示，结果表明在AtDT基因过量表达株系SUPER::AtDT-1和SUPER::AtDT-5中AtDT基因的表达量明显高于野生型。图2中，1-3为3个AtDT基因过量表达株系SUPER::AtDT-1、SUPER::AtDT-4和SUPER::AtDT-5；4为突变体atdt，5为野生型拟南芥(Columbia型)。

3、干旱条件下AtDT基因的表达变化结果-Real-Time PCR

实施例中所用的材料为Columbia野生型拟南芥在土中生长3周，取莲座叶进行干旱处理：在温室中，取莲座叶的等位叶，于培养皿中放置3小时后，取100-200mg作为材料，用TRizol(Invitrogen)提取总RNA，经甲醛变性RNA电泳检查RNA的完整性。使用Superscript II进行反转录，得到的cDNA样品稀释5倍作为Real-TimePCR反应的模板。对照样品为直接取正常生长3周的野生型拟南芥材料。

基因特异引物分别为：

Primer9：5’GAGCACGGTCTTATGGCTAATC 3’；

Primer10：5’ACGTGGAACGAAGAGGCTAGAA 3’。

PCR反应及其检测分别使用SYBR Green Master mix和ABI 7500sequencedetection system(Applied Biosystems)。数据的处理采用Comparative C_T方法(Nature Protocal，Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T)method，2008，3：1101-1108)。以18S rRNA作为内对照对数据进行归一化。

结果如图3所示，干旱处理条件下，AtDT基因的表达增加5倍，说明AtDT基因受干旱诱导表达。

4、野生型、AtDT过量表达植株(SUPER::AtDT-1和SUPER::AtDT-5)、AtDT敲除突变体(atdt)和AtDT恢复材料(转P_AtDT::AtDT拟南芥)在干旱条件下的表型观察结果

将野生型、AtDT过量表达植株(SUPER::AtDT-1和SUPER::AtDT-5)、AtSDS敲除突变体(atdt)和AtDT恢复材料(步骤1的步骤2)获得的转P_AtDT::AtDT拟南芥单拷贝纯合株系)的种子播种于MS培养基上生长7天，种于土壤中，正常浇水条件(每3天浇水一次)下生长3周后，停止浇水，进行干旱处理。干旱处理21天后进行拍照，同时将进行干旱处理的苗恢复浇水，三天后拍照。同时设置不进行干旱处理，继续正常浇水培养的株系作为对照组。

结果如图4所示：在土壤正常浇水条件下生长3周后，AtDT的突变体(atdt)、AtDT过量表达材料(SUPER::AtDT-1和SUPER::AtDT-5)、AtDT恢复突变材料(P_AtDT::AtDT)和野生型植株的表型一致；土壤干旱处理3周后，野生型植株和AtDT恢复突变材料(P_AtDT::AtDT)冠部萎蔫变黄，突变体(atdt)冠部叶片仍为绿色，略有萎蔫，过量表达材料(SUPER::AtDT-1和SUPER::AtDT-5)较野生型对干旱更为敏感，冠部变黄植株基本死亡；干旱3周后恢复浇水，可以观察到：野生型和AtDT恢复突变材料(P_AtDT::AtDT)的部分植株能继续生长，突变体atdt都能继续正常生长，过量表达材料(SUPER::AtDT-1和SUPER::AtDT-5)不能继续生长，全部死亡。图4中，1为AtDT的突变体(atdt)，2为野生型拟南芥(Columbia型)，3为AtDT过量表达材料(SUPER::AtDT-1)，4为AtDT过量表达材料(SUPER::AtDT-5)，5为AtDT恢复突变材料(P_AtDT::AtDT)。

上述实验结果表明AtDT可以增加植物对干旱的敏感性，说明其是植物耐旱相关基因。

序列表

<160>6

<210>1

<211>2550

<212>DNA

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

atggaattcc gcaaaccctt taagtctcat agctcgtata aacagattat aagcaccgga 60

gatcaaaacg agaagacaaa gaagaagaag aaactggcga atcttgacga tggccacatt 120

gctaaaactc agagctctgg gtctagtttc gatggaaaca gctataagtt ctggcaagac 180

attgcaacag atgattatac aaagagcggg agtttcgatt tcccgcaata ccgtgaggag 240

atcacactcg atgtaaacga agaaacagag gaaacagagg atgtcagcaa caacaacaat 300

ttgtccggtt ctaaagaaac gagagtcttt ttcaaaataa acagttcagg aactaataat 360

atgtctggtt ctgtacgttc ttgtacatct tcgacttcgt tttcatcggc cacaatgcgg 420

ttaaatttag agcagcagtt ggaggatgaa ggagaggtgg ttgtaagatg ttcatcggtg 480

aggaaaacag agctagtttc gagggcgaag gcgagatcga ggttgataga tccgccacaa 540

gaagaggaac aacaatactc gagctggatc gggacatcgg atcagttaag atcaggttta 600

cttgggagac actccgatga tattgaggaa gaagatgatt cttcggctga agaagatgtt 660

ccagtggaat atcgaaagtt gaaaatggat gcgataacgt tgcttcaatg gatgagctta 720

atcgcactcg tagttgcgtt agtgttgagt ctagggcttc atacttggag aaatgcaact 780

ctatggagcc ttcatctgtg gaaatgggaa gtggtcttgc tggttctcat ctgtgggagg 840

ctggtttcgg gatgcggaat ccgaatcatc gtcttcttta tcgaaagaaa cttccttttg 900

aggaaacggg ttctttactt cgtatacggt gtgaagactg ctgttcagaa ctgtctctgg 960

ctcggcctcg tgcttctcgc ttggcatttc ttgtttgaca agaaagtaga aaaggaaaca 1020

caaagcgatg ttcttcttct tatgtctaaa atattagtgt gttttttgtt gagcacggtc 1080

ttatggctga tcaagacact ggtggtgaaa gttctagcct cttcgttcca cgttagtacc 1140

tactttgatc ggattcaaga agctctgttt catcattact tgatcgagac gttatctgga 1200

cctccaatgc ttgagttaag caggattgag gaagaggaag atcggacgca agatgagatc 1260

tacaagatgc agaaaggagg agctgattta tcacctgaac tttgttccgc tgcgtttcct 1320

caggaaaaaa gtggaagtac aatgaacatg aagttctctc caatcattcc aaagacggga 1380

agtgataacg gaatcacaat ggatgattta cacaagatga atcagaaaaa cgtttcagct 1440

tggaacatga agagactgat gaagattgtg agaaatgttt ccctgagtac gttggacgaa 1500

caagcgcttc aaaacacgtg tgaagatgaa tccactcgac agatacggag cgaaaaagaa 1560

gctaaagcag ctgcaaggaa gattttcaag aacgtagctc aacctggcac aaaacacata 1620

tatctggagg acttgatgag atttttgcga gtagacgagg cgatgaagac aatgtgtctc 1680

ttcgaaggcg ccttagtgac caaaaagatt actaaatcag ccttgaagaa ctggctggta 1740

aatgctttca gagagagaag agcacttgcc ttaacactca atgacaccaa aacagcagtg 1800

aacaaactcc atcacatgat tagttttctc actgccattg tcatcatagt catatggctg 1860

atccttcttg aaatcgctac ttccaagtat cttttatttc taacttcaca agttgtactc 1920

ttagccttca tgtttgggaa ctctctcaag accgtcttcg agtcaatcat cttcctcttc 1980

atcattcacc cttacgatgt tggtgatcgg ttactcatcg acactgtaga gatggtggtg 2040

gaggaaatga acattctcac aacagttttc ttgagagctg acaatctgaa gattgtgtat 2100

ccaaatattc ttctatggca gaaagcgatc cacaattaca accgtagtcc ggatatggga 2160

gatgaagtta catgctgtgt ccacattact actcctcctg aaaagattgc tgcaatcaaa 2220

caaagaatat caagctacat tgatagcaag ccagagtatt ggtatccaaa agctgatgtc 2280

attgtaaagg atgtggaaga tttgaacatt gtgaggatag caatatggct atgtcataaa 2340

attaaccatc aaaacatggg agagagattt acaagaagag cgttgttgat cgaggaagta 2400

atcaaaatcc tcctcgaact cgacattcaa taccggtttc atccacttga catcaatgtt 2460

aaaaccatgc caacagttgt ctcgagcaga gttccacctg cctggtcaca aaaccctgat 2520

ttaaggcgaa ttattcttct tgaatgttaa                                  2550

<210>2

<211>3123

<212>DNA

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>2

atggaattcc gcaaaccctt taagtctcat agctcgtata aacagattat aagcaccgga 60

gatcaaaacg agaagacaaa gaagaagaag aaactggcga atcttgacga tggcgacatt 120

gctaaaactc agagctctgg gtctagtttc gatggaaaca gctataagtt ctggcaagac 180

attgcaacag atgattatac aaagagcggg agtttcgatt tcccgcaata ccgtgaggag 240

atcacactcg atgtaaacga agaaacagag gaaacagagg atgtcagcaa caacaacaat 300

ttgtccggtt ctaaagaaac gagagtcttt ttcaaaataa acagttcagg aactaataat 360

atgtctggtt ctgtacgttc ttgtacatct tcgacttcgt tttcatcggc cacaatgcgg 420

ttaaatttag agcagcagtt ggaggatgaa ggagaggtgg ttgtaagatg ttcatcggtg 480

aggaaaacag agctagtttc gagggcgaag gcgagatcga ggttgataga tccgccacaa 540

gaagaggaac aacaatactc gagctggatc gggacatcgg atcagttaag atcaggttta 600

cttgggagac actccgatga tattgaggaa gaagatgatt cttcggctga agaagatgtt 660

ccagtggaat atcgaaagtt gaaaatggat gcgataacgt tgcttcaatg gatgagctta 720

atcgcactcg tagttgcgtt agtgttgagt ctagggcttc atacttggag aaatgcaact 780

ctatggagcc ttcatctgtg gaaatgggaa gtggtcttgc tggttctcat ctgtgggagg 840

ctggtttcgg gatgcggaat ccgaatcatc gtcttcttta tcgaaagaaa cttccttttg 900

aggaaacggg ttctttactt cgtatacggt gtgaagactg ctgttcagaa ctgtctctgg 960

ctcggcctcg tgcttctcgc ttggcatttc ttgtttcaca agaaagtaga aaaggaaaca 1020

caaagcgatg ttcttcttct tatgtctaaa atattagtgt gttttttgtt gagcacggtc 1080

ttatggctga tcaagacact ggtggtgaaa gttctagcct cttcgttcca cgttagtacc 1140

tactttgatc ggattcaaga agctctgttt catcattact tgatcgagac gttatctgga 1200

cctccaatgc ttgagttaag caggattgag gaagaggaag atcggacgca agatgagatc 1260

tacaagatgc agaaaggagg agctgattta tcacctgaac tttgttccgc tgcgtttcct 1320

caggaaaaaa gtggaagtac aatgaacatg aagttctctc caatcattcc aaagacggga 1380

agtgataacg gaatcacaat ggatgattta cacaagatga atcagaaaaa cgtttcagct 1440

tggaacatga agagactgat gaagattgtg agaaatgttt ccctgagtac gttggacgaa 1500

caagcgcttc aaaacacgtg tgaagatgaa tccactcgac agatacggag cgaaaaagaa 1560

gctaaagcag ctgcaaggaa gattttcaag aacgtagctc aacctggcac aaagtgagta 1620

tacaatttct ctactttctt taaaaagatt tctttcctag gacctaataa atccataatc 1680

tgaatgtata taaatagaca catatatctg gaggacttga tgagattttt gcgagtagac 1740

gaggcgatga agacaatgtg tctcttcgaa ggcgccttag tgaccaaaaa gattactaaa 1800

tcagccttga agaactggct ggtactactt cttgttcata gaaaatgttg attcttatga 1860

ttatgtatat atgtcactaa agtattgatt ctgcttaatt aggtaaatgc tttcagagag 1920

agaagagcac ttgccttaac actcaatgac accaaaacag cagtgaacaa actccatcac 1980

atgattagtt ttctcactgc cattgtcatc atagtcatat ggctgatcct tcttgaaatc 2040

gctacttcca agtatctttt atttctaact tcacaagttg tactcttagc cttcatgttt 2100

gggaactctc tcaagaccgt cttcgagtca atcatcttcc tcttcatcat tcacccttac 2160

gatgttggtg atcggttact catcgacact gtagaggtaa ctaaaaaacc aaaatgtgtt 2220

tgtttttagt ctatttacta aaccttatac ataggctaat ttaacaagat caaaattgta 2280

gatggtggtg gaggaaatga acattctcac aacagttttc ttgagagctg acaatctgaa 2340

gattgtgtat ccaaatattc ttctatggca gaaagcgatc cacaattaca accgtagtcc 2400

ggatatggga gatgaagtta catgctgtgt ccacattact actcctcctg aaaagattgc 2460

tgcaatcaaa caaagaatat caaggtaaaa aatcatgccc ttgttctagt gtcttaagct 2520

tatatattat gacaggatga taatatgatc gttttttcgc gaaaaccgca gctacattga 2580

tagcaagcca gagtattggt atccaaaagc tgatgtcatt gtaaaggatg tggaagattt 2640

gaacattgtg aggatagcaa tatggctatg tcataaaatt aaccatcaaa acatgggaga 2700

gagatttaca agaagagcgt tgttgatcga ggaagtaatc aaaatcctcc tcgaactcga 2760

cattcaatac cggtttcatc cacttgacat caatgttaaa accatgccaa cagttgtctc 2820

gagcagagtt ccacctgcct ggtcacaaaa ccctgattta aggtaattat agagaagatg 2880

tgtgtgcctt ttcttttggt gttaagtgtg ttatcttaac tcttaagtgc atgagagaca 2940

gcaaactgtg ttttagtatg aggttggttg ttgtattttt tttttctttg ttagtaaacc 3000

gcttgttgta tatatatgaa ggtgaaagca aagagtggga tcataaactt gtgttataga 3060

aactttatga aatagaaaca aatgatattt ttagtaatga ggtatttttt tatttatttt 3120

ttgtgtggca gaagagaaaa acttcgaaaa caaattcact tttttttctt cttgaatgtt 3180

ttttttaggc gaattattct tcttgaatgt taa                              3123

<210>3

<211>849

<212>PRT

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>3

Met Glu Phe Arg Lys Pro Phe Lys Ser His Ser Ser Tyr Lys Gln Ile

1               5                    10                  15

Ile Ser Thr Gly Asp Gln Asn Glu Lys Thr Lys Lys Lys Lys Lys Leu

             20                  25                  30

Ala Asn Leu Asp Asp Gly Asp Ile Ala Lys Thr Gln Ser Ser Gly Ser

         35                  40                  45

Ser Phe Asp Gly Asn Ser Tyr Lys Phe Trp Gln Asp Ile Ala Thr Asp

     50                  55                  60

Asp Tyr Thr Lys Ser Gly Ser Phe Asp Phe Pro Gln Tyr Arg Glu Glu

 65                  70                  75                  80

Ile Thr Leu Asp Val Asn Glu Glu Thr Glu Glu Thr Glu Asp Val Ser

                 85                  90                  95

Asn Asn Asn Asn Leu Ser Gly Ser Lys Glu Thr Arg Val Phe Phe Lys

            100                 105                 110

Ile Asn Ser Ser Gly Thr Asn Asn Met Ser Gly Ser Val Arg Ser Cys

        115                 120                 125

Thr Ser Ser Thr Ser Phe Ser Ser Ala Thr Met Arg Leu Asn Leu Glu

    130                 135                 140

Gln Gln Leu Glu Asp Glu Gly Glu Val Val Val Arg Cys Ser Ser Val

145                 150                 155                 160

Arg Lys Thr Glu Leu Val Ser Arg Ala Lys Ala Arg Ser Arg Leu Ile

                165                 170                 175

Asp Pro Pro Gln Glu Glu Glu Gln Gln Tyr Ser Ser Trp Ile Gly Thr

            180                 185                 190

Ser Asp Gln Leu Arg Ser Gly Leu Leu Gly Arg His Ser Asp Asp Ile

        195                 200                 205

Glu Glu Glu Asp Asp Ser Ser Ala Glu Glu Asp Val Pro Val Glu Tyr

    210                 215                 220

Arg Lys Leu Lys Met Asp Ala Ile Thr Leu Leu Gln Trp Met Ser Leu

225                 230                 235                 240

Ile Ala Leu Val Val Ala Leu Val Leu Ser Leu Gly Leu His Thr Trp

                245                 250                 255

Arg Asn Ala Thr Leu Trp Ser Leu His Leu Trp Lys Trp Glu Val Val

            260                 265                 270

Leu Leu Val Leu Ile Cys Gly Arg Leu Val Ser Gly Cys Gly Ile Arg

        275                 280                 285

Ile Ile Val Phe Phe Ile Glu Arg Asn Phe Leu Leu Arg Lys Arg Val

    290                 295                 300

Leu Tyr Phe Val Tyr Gly Val Lys Thr Ala Val Gln Asn Cys Leu Trp

305                 310                 315                 320

Leu Gly Leu Val Leu Leu Ala Trp His Phe Leu Phe Asp Lys Lys Val

                325                 330                 335

Glu Lys Glu Thr Gln Ser Asp Val Leu Leu Leu Met Ser Lys Ile Leu

            340                 345                 350

Val Cys Phe Leu Leu Ser Thr Val Leu Trp Leu Ile Lys Thr Leu Val

        355                 360                 365

Val Lys Val Leu Ala Ser Ser Phe His Val Ser Thr Tyr Phe Asp Arg

    370                 375                 380

Ile Gln Glu Ala Leu Phe His His Tyr Leu Ile Glu Thr Leu Ser Gly

385                 390                 395                 400

Pro Pro Met Leu Glu Leu Ser Arg Ile Glu Glu Glu Glu Asp Arg Thr

                405                 410                 415

Gln Asp Glu Ile Tyr Lys Met Gln Lys Gly Gly Ala Asp Leu Ser Pro

            420                 425                 430

Glu Leu Cys Ser Ala Ala Phe Pro Gln Glu Lys Ser Gly Ser Thr Met

        435                 440                 445

Asn Met Lys Phe Ser Pro Ile Ile Pro Lys Thr Gly Ser Asp Asn Gly

    450                 455                 460

Ile Thr Met Asp Asp Leu His Lys Met Asn Gln Lys Asn Val Ser Ala

465                 470                 475                 480

Trp Asn Met Lys Arg Leu Met Lys Ile Val Arg Asn Val Ser Leu Ser

                485                 490                 495

Thr Leu Asp Glu Gln Ala Leu Gln Asn Thr Cys Glu Asp Glu Ser Thr

            500                 505                 510

Arg Gln Ile Arg Ser Glu Lys Glu Ala Lys Ala Ala Ala Arg Lys Ile

        515                 520                 525

Phe Lys Asn Val Ala Gln Pro Gly Thr Lys His Ile Tyr Leu Glu Asp

    530                 535                 540

Leu Met Arg Phe Leu Arg Val Asp Glu Ala Met Lys Thr Met Cys Leu

545                 550                 555                 560

Phe Glu Gly Ala Leu Val Thr Lys Lys Ile Thr Lys Ser Ala Leu Lys

                565                 570                 575

Asn Trp Leu Val Asn Ala Phe Arg Glu Arg Arg Ala Leu Ala Leu Thr

            580                 585                 590

Leu Asn Asp Thr Lys Thr Ala Val Asn Lys Leu His His Met Ile Ser

        595                 600                 605

Phe Leu Thr Ala Ile Val Ile Ile Val Ile Trp Leu Ile Leu Leu Glu

    610                 615                 620

Ile Ala Thr Ser Lys Tyr Leu Leu Phe Leu Thr Ser Gln Val Val Leu

625                 630                 635                 640

Leu Ala Phe Met Phe Gly Asn Ser Leu Lys Thr Val Phe Glu Ser Ile

                645                 650                 655

Ile Phe Leu Phe Ile Ile His Pro Tyr Asp Val Gly Asp Arg Leu Leu

            660                 665                 670

Ile Asp Thr Val Glu Met Val Val Glu Glu Met Asn Ile Leu Thr Thr

        675                 680                 685

Val Phe Leu Arg Ala Asp Asn Leu Lys Ile Val Tyr Pro Asn Ile Leu

    690                 695                 700

Leu Trp Gln Lys Ala Ile His Asn Tyr Asn Arg Ser Pro Asp Met Gly

705                 710                 715                 720

Asp Glu Val Thr Cys Cys Val His Ile Thr Thr Pro Pro Glu Lys Ile

                725                 730                 735

Ala Ala Ile Lys Gln Arg Ile Ser Ser Tyr Ile Asp Ser Lys Pro Glu

            740                 745                 750

Tyr Trp Tyr Pro Lys Ala Asp Val Ile Val Lys Asp Val Glu Asp Leu

        755                 760                 765

Asn Ile Val Arg Ile Ala Ile Trp Leu Cys His Lys Ile Asn His Gln

    770                 775                 780

Asn Met Gly Glu Arg Phe Thr Arg Arg Ala Leu Leu Ile Glu Glu Val

785                 790                 795                 800

Ile Lys Ile Leu Leu Glu Leu Asp Ile Gln Tyr Arg Phe His Pro Leu

                805                 810                 815

Asp Ile Asn Val Lys Thr Met Pro Thr Val Val Ser Ser Arg Val Pro

            820                 825                 830

Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Asp Leu Arg Arg Ile Ile Leu Leu Glu

        835                 840                 845

Cys

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>4

atggaattcc gcaaaccctt taagtctcat            30

<210>5

<211>37

<212>DNA

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>5

ttaacattca agaagaataa ttcgccttaa atcaggg    37

<210>6

<211>563

<212>DNA

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>6

gaggaaacag aggatgtcag caacaacaac aatttgtccg gttctaaaga aacgagagtc   60

tttttcaaaa taaacagttc aggaactaat aatatgtctg gttctgtacg ttcttgtaca   120

tcttcgactt cgttttcatc ggccacaatg cggttaaatt tagagcagca gttggaggat   180

gaaggagagg tggttgtaag atgttcatcg gtgaggaaaa cagagctagt ttcgagggcg   240

aaggcgagat cgaggttgat agatccgcca caagaagagg aacaacaata ctcgagctgg   300

atcgggacat cggatcagtt aagatcaggt ttacttggga gacactccga tgatattgag   360

gaagaagatg attcttcggc tgaagaagat gttccagtgg aatatcgaaa gttgaaaatg   420

gatgcgataa cgttgcttca atggatgagc ttaatcgcac tcgtagttgc gttagtgttg   480

agtctagggc ttcatacttg gagaaatgca actctatgga gccttcatct gtggaaatgg   540

gaagtggtct tgctggttct cat                                           563

Claims (3)

1.植物耐旱相关蛋白在培育对耐旱相关性提高的植物中的应用；

所述植物耐旱相关蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID №.3所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述植物耐旱相关蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID №：1或SEQ ID №：2所示。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述植物为拟南芥。

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