CN101519641B

CN101519641B - 一种混合微生物接菌剂的生产方法

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Publication number: CN101519641B
Application number: CN2009100292051A
Authority: CN
Inventors: 陈双林; 闫淑珍; 江玲娟
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2009-04-03
Filing date: 2009-04-03
Publication date: 2011-07-20
Anticipated expiration: 2029-04-03
Also published as: CN101519641A

Abstract

本发明涉及一种混合微生物固体接菌剂的生产方法。该方法是将先混合菌剂中的放线菌菌株采用固体发酵，得干燥的固体发酵物；再将细菌菌株分别采用液体发酵进行培养，得浓缩菌体；采用固定化的方法把发酵得到的不产芽孢的细菌的浓缩菌体固定，制成固体颗粒备用；将发酵得到的产芽孢的细菌的浓缩菌体悬液向之前得到的含有放线菌的干燥的固体料中均匀喷雾，再采用变温干燥技术促使芽孢细菌尽快产生芽孢；得干燥菌剂；最后将制得的包含菌体的干燥固体颗粒混合即制得混合微生物菌剂。通过本发明能生产多种功能性微生物混合的微生物接菌剂，能有效预防植物土传真菌病害，增加农作物产量和品质，改良土壤。生产和使用方法简单，成本较低廉，技术易推广。

Description

一种混合微生物接菌剂的生产方法

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种混合微生物固体接菌剂的生产方法。

技术背景

在土壤中微生物与植物的关系非常密切，正常的和有益的根际微生物能促进植物生长，并在植物生长周期中起到保驾护航的作用；而植物病原微生物能够侵染植物引起病害、抑制植物生长甚至杀死植物。植物根际中存在多种发挥不同作用的有益微生物。根据互生生物之间存在相克和相容关系的原理，从植物根际筛选各种功能(如具高酶活性、分泌生长素、产生抗生素和拮抗病原微生物及能从土壤中释放营养元素等)的微生物菌种，利用这些功能微生物在植物根际的生命活动及其代谢产物的作用，拮抗植物病原微生物、增强植物抗逆性、分解和释放土壤中固结的营养元素、分泌生长物质，实现提高产量和改善品质、减少化肥和农药的使用、改善土壤环境、降低病害发病率的目的。

目前，微生物接菌剂有单一菌种的接种剂和复合的微生物接种剂。在农业生产上微生物接菌剂可以直接施入土壤或作为拌种剂接种于植物根际，还可以复配于各种肥料中。一般地，由微生物和各种有机质发酵或者混合制成的肥料称为微生物肥料(又称菌肥)，同时还有由微生物接菌剂制成的生物有机肥或有机无机复混肥等产品。因为根据有益微生物与作物间有较强的选择性，对环境条件也有一定的要求，所以各类接菌剂都应有系列产品，才能满足不同地区不同作物的需求。

根据植物根际微生物生态研究及其应用的发展趋势，微生物接菌剂必然由单一菌种向复合菌种转变。在这个转变过程中，首先不再单纯地追求营养元素供应水平的提高，而要同时实现多功能，如抗病、避虫等。5406菌种是一种传统的发酵菌，可以增强作物的抗病能力，减少化学农药的使用，而与之相比，现在应用的复合菌种由于发挥了互惠、协同、共生、加强或者同位作用，因此使菌种的性能进一步提高。其次复合菌种的微生物接菌剂延长了功能微生物在土壤中的存活时间，微生物存活的时间越长，微生物肥料的持效期越长。微生物在土壤中存活时间的长短主要取决于土壤中可利用的碳源水平，可以通过在生物肥中加入能够分解土壤中含碳化合物的特定微生物菌株，以不断供应其它微生物碳源营养，达到延长微生物在土壤中存活时间的效果。

微生物肥料对植物的功效已为充分认可和接受，但目前已应用的多数产品在生产中的效果并不稳定，因而限制了其推广和普及。这是由于微生物的作用受许多条件的制约，如：微生物功能菌株的性质和植物之间的关系、功能微生物在植物根际的生态位、施用的单一菌剂或混合菌剂与土著微生物的关系、接菌剂中功能微生物在载体以及植物体上的存活时间、产品中保存的功能微生物的有效数量及其应用方法等方面。如果对这些制约因素不清楚，功能微生物的效果就不能充分发挥，因此需要进行深入和系统的研究，为开发微生物肥料奠定坚实的理论基础，使微生物肥料得到广泛的应用。

虽然在植物生长各个时期发挥主导作用的是植物根际微生物群落中的优势微生物种群，但调控土壤环境是多种微生物发挥作用的结果。国内和国外的研究者已从土壤中筛选了大量对植物生长有利的微生物菌株，这些菌株包括许多微生物种类，不同种类的微生物不仅活性不同，而且培养方法、保存方法和制成菌剂的方法也不尽相同，因此，微生物接菌剂制成的菌剂只能根据功能菌株的特点来生产，如固体发酵菌剂、固体吸附菌剂和液体发酵菌剂等。这些菌剂的生产主要是针对一种微生物或两种微生物。两种以上微生物的混合微生物菌剂没有一定的技术措施保障是很难生产的，特别是几种微生物的特性完全不一样的混合菌剂的生产必须具备特定的技术。

本实验室根据对植物促生和防病两方面的作用，从植物根际土壤中筛选了大量的微生物菌株，这些菌株在功能上有产ACC(1-氨基环丙烷1-羧酸，乙烯的前体)脱氨酶活性、促进植物生长和抗逆的菌株、有分泌生长激素的菌株、有分泌拮抗植物病原真菌物质的菌株、有分泌抗真菌蛋白的菌株等。这些菌株主要集中在两类微生物中，即放线菌和细菌。功能放线菌菌株主要属于链霉菌和小单孢菌两属，功能细菌主要涉及芽孢杆菌和假单胞菌两属。它们在菌剂的制备或生产上各有特点，关键技术也不相同。链霉菌和小单孢菌一般制成发酵菌剂，可以固体发酵后形成一定的菌量(即孢子)，干燥后长期保存；芽孢杆菌在菌体生长过程中需要液体发酵产生大量的菌体，诱导产芽孢后需干燥才能长期保存；而假单胞菌是一种不产芽孢的细菌，菌体的大量生产需液体发酵，大量的菌体长期保存是一项关键的技术，在研究中一般采用冷冻干燥的保存方法，但要求设备复杂，技术严格，在生产上很难应用，因此本实验室在这方面作了大量的研究工作，探索了固定化并干燥的方法，使大量的假单胞菌体在固定化干燥的颗粒中在干燥的条件下保存一年以上的存活率达100％。在研究单一菌种菌剂的生产技术下，为了将不同特性的功能菌株制成混合的菌剂，本实验室设计了多套技术方案。历经三年不断地研究和试验，最终形成了一套比较成熟的生产混合微生物接菌剂的方法，即：固体/液体发酵技术和喷雾/变温干燥技术相结合生产混合微生物接菌剂的方法

发明内容

本发明的目的是提供一种生产混合微生物接菌剂的方法，该微生物接菌剂是通过固体/液体发酵技术和喷雾变温干燥技术的方法制备。

本发明中所生产混合微生物接菌剂的方法，其特征包括以下步骤：

(1)将混合菌剂中的放线菌菌株采用固体发酵，得干燥的固体发酵物；

(2)将细菌菌株分别采用液体发酵进行发酵培养，得浓缩菌体；

(3)采用固定化的方法把(2)中发酵得到的不产芽孢的细菌的浓缩菌体固定，制成固体颗粒，干燥备用；

(4)将(2)中发酵得到的产芽孢的细菌的浓缩菌体悬液向(1)中得到的含有放线菌的干燥的固体料中均匀喷雾，再采用变温干燥技术促使芽孢细菌尽快产生芽孢；得干燥菌剂；

(5)将(3)制得的包含菌体的干燥固体颗粒混入(4)中制得的干燥菌剂中，混合均匀，包装，包装袋中放置干燥剂，即制得混合微生物菌剂。

上述方法的具体操作是：

(1)放线菌菌株的固体发酵：取经提纯复壮的放线菌功能菌株的斜面菌种，接种到米饭培养基中31℃培养7-10d，使放线菌的孢子布满每个米粒的表面，该菌种在无菌条件下用混合方法接种到灭菌的固体配料中，31℃发酵培养7-10d，在发酵过程中定期搅拌，注意确保不污染杂菌，不同的放线菌株分别发酵，发酵后按1∶1混合后倒入无菌方盘中，置干燥箱干燥，干燥条件为60℃，发酵物前期湿润时可以鼓风，后期干燥时定期搅拌但不要鼓风，发酵物干燥到恒重为止；

(2)细菌菌株的液体发酵：取经提纯复壮的细菌功能菌株的斜面菌种，接种到三角瓶中31℃发酵48h制成种子液，种子液接种到发酵罐中(培养基为优化的配方)发酵48h，发酵结束，离心，收集浓缩菌体。

(3)固定化菌体的获得：把(2)中发酵的不产芽孢的细菌(荧光假单胞菌等)的浓缩菌体与2％的的卡拉胶混合，制成固体颗粒，干燥。

(4)将上述(2)浓缩的产芽孢菌的菌液均匀喷洒到(1)中制成的干燥物中搅拌均匀，平铺到方盘中置40℃干燥箱中干燥4-6小时后，60℃干燥箱中烘干6-12小时。

(5)将(3)制得的包含菌体的干燥固体颗粒按一定比例混入(4)中制得的干燥菌剂中，混合均匀，包装，包装袋中放置干燥剂，即制得混合微生物菌剂。

本发明方法中，必须采用固定化的方法使不能产生芽孢的细菌如假单胞杆菌等存在于固定化颗粒中才能在干燥菌剂中保存活力。

本发明的另一个目标是提供一种混合微生物接菌剂。混合微生物接菌剂的特征在于，是由上述(1)-(5)步骤制得。

本发明中，所说的放线菌菌株是指能产分生孢子的所有放线菌菌株。可从植物根际土壤中筛选的、纯化的，也可使用现有菌株。

本发明中，所说的细菌菌株是指从植物体内和根际中筛选的、纯化的所有的细菌菌株。

将所制得的微生物接菌剂施入植物根际或拌种，可以预防植物土传真菌病害、促进植物生长和增强植物抗逆性。

通过本发明的方法，能生产多种功能性微生物混合的微生物接菌剂，这种接菌剂能有效预防植物土传真菌病害，增加农作物产量和品质，改良土壤。生产和使用方法简单，成本较低廉，技术易推广。

附图说明：

图1是固体/液体发酵技术和喷雾/变温干燥技术相结合生产混合微生物接菌剂的技术流程图

图2本发明实施例3效果照片：图A和图B是接种菌剂和空白对照促生效果图；图C和图D是先接种菌剂再接种辣椒疫霉病菌和毒素的防治效果图；图E和图F是接种菌剂和空白对照的单株结果数量图；图G是接种菌剂对油菜苗的促生效果图。

具体实施方式：

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

为了详细说明本发明的方法，在以下实施中使用的菌株均由发明人实验室保存，可向公众提供，但本发明的内容并不限于实施例中列举的菌株。

ME2：(闫淑珍，刘维红，方洁.小单孢菌E2菌株对辣椒疫霉的抑制及抗菌物质的初步测定，植物保护学报，2005，Vol.32(4)：383-386.)

F53(温小娟，闫淑珍，刘维红，沈萍，汪勇，拮抗性类芽孢杆菌F53菌株固体发酵条件研究，安徽农业科学，2007，35(2)：461-463)

XG32(沈萍，刘维红，闫淑珍*，陈双林，XG32菌株产ACC脱氨酶的培养条件和酶活影响因素，南京师大学报(自然科学版)，2008，Vol.31(1)：104-108.)(沈萍，闫淑珍*，陈双林，崔晓灿，李莉.具ACC脱氨酶活性的植物内生细菌对辣椒的促生作用和对疫霉病的防治作用.植物保护学报，2008，Vol.35(1)：28-35.)

实施例1：

西瓜防病促生微生物接菌剂的生产

1、功能性菌株的准备：

(1)放线菌菌株

放线菌ACCC40021从中国普通微生物菌种管理中心购买；对从植物根际分离放线菌进行筛选，获得一株功能放线菌，代号为ME2。这两株菌经抑菌谱鉴定对西瓜枯萎病菌和西瓜炭疽病菌有较高的拮抗作用，单菌种发酵物苗期人工接种病原菌的防病效果达80％以上，ACCC40021对西瓜苗期有明显的促生作用，ACCC40021和ME2均能定植于西瓜根际。

(2)细菌菌株：

对从植物根内和根际分离的细菌进行筛选，获得两株功能细菌，代号分别为F53和XG32。其中XG32为荧光假单胞菌，分离自辣椒根内；F53为类芽孢杆菌，分离自茄子根际。XG32细菌具有ACC脱氨酶活性，对西瓜有促生和抗逆作用，并能定植于西瓜根内。F53具有拮抗多种植物病原菌和促进植物生长的作用，能定植于西瓜根际。

2、菌种的培养和单菌剂的制备

(1)沙土管保存的放线菌ACCC40021和ME2的菌种活化后，分别接种到米饭培养基中31℃培养7-10d，使放线菌的孢子布满每个米粒的表面，该菌种在无菌条件下用混合方法接种到灭菌的固体配料中，31℃发酵培养7-10d，在发酵过程中定期搅拌，注意确保不污染杂菌。ACCC40021和ME2菌株分别发酵，发酵后按1∶1混合后倒入无菌方盘中，置干燥箱干燥，干燥条件为60℃，发酵物前期湿润时可以鼓风，后期干燥时定期搅拌但不要鼓风，发酵物干燥到恒重为止；检测各菌株数量。

(2)取经提纯复壮的细菌F53和XG32功能菌株的斜面菌种，分别接种到三角瓶中31℃发酵48h制成种子液，种子液接种到发酵罐中(培养基为优化的配方)发酵48h，发酵结束，离心，收集浓缩菌体。

(3)把(2)发酵的XG32菌株(荧光假单胞菌)的浓缩菌体与2％的的卡拉胶混合，制成固体颗粒，在滑石粉中干燥至衡重。检测干燥菌剂的含菌数量。

(4)将F53(类芽孢杆菌)浓缩的菌液均匀的喷洒到(1)中制成的干燥放线菌菌剂中搅拌均匀，平铺到方盘中置40℃干燥箱中干燥4-6小时后，使DP1在4-6小时内大量形成芽孢，经检测菌剂中的F53菌株80％的菌体已形成芽孢时，60℃干燥箱烘干6-12小时。

3、混合菌剂的生产和包装

将放线菌ACCC40021和ME2、细菌F53菌株制得的干燥菌剂和XG32菌株固定化的菌剂按一定比例混合均匀，每株菌的数量为10⁶-10⁸cfu/g。标明混合的干燥菌剂中每种微生物的菌体数量后包装，包装袋中放置干燥剂，即制得混合微生物菌剂。

4、应用效果：

菌剂的水浸提液抑制西瓜枯萎病效果明显，菌剂加5倍的水滴加牛津小杯中抑菌圈直径达1.2cm。西瓜苗期人工接种西瓜枯萎病防效在90％以上。促生效果明显。接种效果见表1。

表1混合微生物接种剂对西瓜苗期人工接种西瓜枯萎病的防治效果

实施例2：

草莓防病促生微生物接菌剂的生产，流程如图1所示。

1、功能性菌株的准备：

(1)放线菌菌株

放线菌ACCC40021和ME2。这两株菌经抑菌谱鉴定对草莓枯萎病菌和草莓炭疽病菌有较高的拮抗作用，单菌种发酵物苗期人工接种病原菌的防病效果达80％以上，ACCC40021对草莓在苗期有明显的促生作用，ACCC40021和ME2均能定植于草莓根际。

(2)细菌菌株：

从辣椒根际分离筛选到一株细菌XG32，经鉴定为荧光假单胞菌；从茄子根际筛选到的F53为类芽孢杆菌，XG32细菌有较高的ACC脱氨酶活性，对草莓有促生和抗逆作用，并能定植于草莓根内。F53具有拮抗多种植物病原菌和促进植物生长的作用，能定植于草莓根际。

2、菌种的培养和单菌剂的制备

(3)把(2)发酵的XG32菌株的浓缩菌体与2％的的卡拉胶混合，制成固体颗粒，在滑石粉中干燥至衡重。检测干燥菌剂的含菌数量。

3、混合菌剂的生产和包装

将放线菌ACCC40021和ME2、F53菌株制得的干燥菌剂和XG32菌株固定化的干燥菌剂按一定比例混合均匀，标明混合的干燥菌剂中每种微生物的菌体数量后包装，包装袋中放置干燥剂，即制得混合微生物菌剂。

4、应用效果：

菌剂的水浸提液抑制草莓枯萎病效果明显，菌剂加5倍的水滴加入牛津小杯中抑菌圈直径达1.2cm。草莓苗期人工接种西瓜枯萎病防效在70％以上。促生效果明显见表2

表2混合微生物接种剂对草莓小苗生长的影响

实施例3：

蔬菜防病促生微生物接菌剂的生产

1、功能性菌株的准备：

(1)放线菌菌株

放线菌ACCC40021和ME2。这两株菌经抑菌谱鉴定对多种蔬菜的枯萎病菌和炭疽病菌有较高的拮抗作用，单菌种发酵物苗期人工接种病原菌的防病效果达80％以上，ACCC40021对辣椒在苗期有明显的促生作用，ACCC40021和ME2均能定植于辣椒和番茄等植物根际。

(2)细菌菌株：

从茄子根际分离筛选到一株细菌F53，经鉴定为类芽孢杆菌；该株细菌对多种蔬菜有促生和抗病作用，并能定植于多种蔬菜根际。

2、菌种的培养和单菌剂的制备

(2)取经提纯复壮的细菌F53功能菌株的斜面菌种，接种到三角瓶中31℃发酵48h制成种子液，种子液接种到发酵罐中(培养基为优化的配方)发酵48h，发酵结束，离心，收集浓缩菌体。

(3)将F53浓缩的菌液均匀的喷洒到(1)中制成的干燥放线菌菌剂中搅拌均匀，平铺到方盘中置40℃干燥箱中干燥4-6小时后，使F53在4-6小时内大量形成芽孢，经检测菌剂中的F53菌株80％的菌体已形成芽孢时，60℃干燥箱烘干6-12小时。

3、混合菌剂的生产和包装

将放线菌ACCC40021、ME2、F53菌株制得的干燥混合菌剂标明其中每种微生物的菌体数量，然后包装，包装袋中放置干燥剂，即制得混合微生物菌剂。

4、应用效果：

菌剂的水浸提液抑制黄瓜枯萎病菌和茄子黄萎病菌效果明显，菌剂加5倍的水滴加入牛津小杯中抑菌圈直径达1.2cm。茄子苗期人工接种黄萎病菌防效在70％以上，对辣椒疫病防效在80％以上。接种防效见图示。复合菌剂对辣椒促生效果明显，增产效果明显。见图2和表3。

表3混合微生物接种剂对辣椒产量的影响

Claims

1.一种混合微生物接菌剂的生产方法，其特征在于，

（1）将混合菌剂中的放线菌菌株采用固体发酵，得干燥的固体发酵物；具体是：取经提纯复壮的斜面菌种，接种到米饭培养基中培养7-10d，使放线菌的孢子布满每个米粒的表面，该菌种在无菌条件下用混合方法接种到灭菌的固体配料中，31℃发酵培养7-10d，在发酵过程中定期搅拌，注意确保不污染杂菌，不同的放线菌株分别发酵，发酵后按1：1混合后倒入无菌方盘中，置干燥箱干燥，干燥条件为60℃，发酵物前期湿润时可以鼓风，后期干燥时定期搅拌但不要鼓风，发酵物干燥到恒重为止；

（2）将细菌菌株分别采用液体发酵进行发酵培养，得浓缩菌体；

（3）采用固定化的方法把（2）中发酵得到的不产芽孢的细菌的浓缩菌体与2%的卡拉胶混合，制成固体颗粒，干燥备用；

（4）将（2）中发酵得到的产芽孢的细菌的浓缩菌体悬液向（1）中得到的含有放线菌的干燥的固体料中均匀喷雾，平铺到方盘中置40℃干燥箱中干燥4-6小时后，60℃干燥箱中烘干6-12小时，促使芽孢细菌尽快产生芽孢；得干燥菌剂；

（5）将（3）制得的包含菌体的干燥固体颗粒混入（4）中制得的干燥菌剂中，混合均匀，包装，包装袋中放置干燥剂，即制得混合微生物菌剂。

2.根据权利要求1所述的混合微生物接菌剂的生产方法，其特征在于，步骤（2）细菌菌株的液体发酵：取经提纯复壮的斜面菌种，分别接种到三角瓶中31℃发酵48h制成种子液，种子液接种到发酵罐中发酵48h，发酵结束，离心，收集浓缩菌体。