CN101516395B

CN101516395B - 抗屈曲病毒感染的疫苗

Info

Publication number: CN101516395B
Application number: CN200780035576.XA
Authority: CN
Inventors: K·M·埃拉; K·苏马堤; J·S·佩迪坤码拉; N·R·海基
Original assignee: Bharat Biotech International Ltd
Current assignee: Bharat Biotech International Ltd
Priority date: 2006-09-01
Filing date: 2007-08-31
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2027-08-31
Also published as: US20130022631A1; WO2008026225A3; CN101516395A; EP2073839B1; WO2008026225A2; BRPI0716145A2; BRPI0716145B1; US8865184B2; EP2073839A2

Abstract

本发明涉及能够在人类和其它哺乳动物宿主中诱发对抗屈曲病毒感染的保护性免疫反应的疫苗制剂。免疫原性制剂含有处于稳定剂型的灭活屈曲病毒。探讨了病毒的增殖和纯化方法。灭活病毒制剂是非传染性的，具有免疫原性，能够在哺乳动物宿主中诱导保护性免疫反应。配制免疫原性组合物以用于人体内给药。本发明还探讨了利用以重组病毒蛋白作为抗原的亚单位疫苗来免疫的方案。具有潜在免疫原性的重组病毒抗原能可用于诊断病毒的存在。

Description

抗屈曲病毒感染的疫苗

技术领域

本发明涉及能够在人和其他哺乳动物宿主中诱发对抗屈曲病毒(Chikungunya virus，CHIKV)感染的保护性免疫反应的疫苗制剂。免疫原性制剂包括处于稳定剂型的纯化的灭活(inactivated)屈曲病毒。提供了在诸如Vero和MRC-5细胞等FDA/国家监管局认可的疫苗品质细胞系的连续细胞培养中进行体外病毒适应和增殖的方法。探讨了病毒的纯化和灭活方法。探讨了包含附加的稳定剂的病毒液体和冻干剂型的制备和服用方法。灭活病毒制剂是非感染性的，具有免疫原性，且能够在哺乳动物宿主中诱导保护性免疫反应。配制免疫原性组合物以用于人体内服。利用能够在哺乳动物宿主中诱发对抗屈曲病毒的保护性免疫反应的重组病毒蛋白作为抗原来开发亚单位(subunit)疫苗的方案也在本发明的范围内。重组抗原还有可能用于诊断病毒的存在。

背景技术

疾病和流行病学：基孔肯雅症(Chikungunya)是主要流行于非洲和亚洲的一种使人身体衰弱的疾病。症状包括突发高热、皮疹或者出血，关节痛，和偶尔累及神经系统、心脏和肝脏。能持续数年的关节痛会导致失能(Sarkar等，1965；Rao等，1965；Nimmannitya等，1969；Schuffenecker等，2006)。这种疾病是屈曲病毒(CHIKV)引起的，并且通过伊蚊(Aedes spp.)经由居住森林中的其他脊椎动物宿主传播(在非洲)或者经由人-蚊-人循环传播(在亚洲)(Powers等，2000)。这种疾病曾经有过几次大规模爆发，包括最近一次在印度洋、马来西亚和印度的爆发的几次就使得数以千计的人们受到疾病的折磨。在印度，主要的爆发发生在20世纪60年代和2005到2006年(Shah等，1964；Rao等，1965；Chaturvedi等，1970；Ravi，2006)。在最近一次爆发中，卡纳塔克邦、安德拉邦、泰米尔纳德邦、马哈拉施特拉邦可能还有奥里萨邦的几个地区都受到影响。多种血清学试验能够诊断这种疾病，但是由于多种紧密关联的虫媒病毒都会引起类似的疾病，因此最终的鉴定需要核实遗传物质，。治疗只能起到缓和作用，目前还没有商业化的疫苗。

屈曲病毒包含一个单链的有义链RNA基因组，与辛德毕斯(Sindbis)和塞姆利基森林(Semliki)疾病病毒(Forest diseaseviruses)同属披盖病毒科(Togaviridae)α病毒属A组虫媒病毒(Fauquet等，2005)。病毒体大小为50-60nm，并且能够被70％乙醇、1％次氯酸钠、2％戊二醛、液体脂溶剂、高于58oC的湿热或干热以及干燥灭活。

基因分型揭示存在三种进化枝：西部非洲型、东部中部南部非洲型和亚洲型。亚洲和非洲株形成序列、抗原性和病毒特性上彼此有区别的紧密联系的进化枝。亚洲隔离群显得比任何一种非洲进化枝更保守(Powers等，2000；Schuffenecker等，2006)。最近的印度洋爆发隔离群均显示出在疾病的早期到晚期发展过程中包膜糖蛋白E1的第226位从丙氨酸到缬氨酸的特有突变(Schuffenecker等，2006)。尽管还不清楚这种现象的重要性，但是可以推测其对于病毒有进化上的优势。

对病毒蛋白及其功能或病原性的了解还不多。病毒基因组大约12kb，具有5’7mG帽结构和3’poly(A)区，碱基组成为30％的A，25％的C和G，以及20％的U。基因组序列为5’-nsP1-nsP2-nsP3-nsP4-(连接区)-C-E3-E2-6K-E1-polyA-3’。非结构蛋白由基因组的5’端2/3部分直接翻译，而结构蛋白则由与基因组3’端1/3部分共线的26S亚基因组RNA产生。在基因组的3’非翻译区包含保守重复序列和一个内部poly(A)束(Khan等，2002；Schuffenecker等，2006)。

在序列信息的基础上推知出nsP1、nsP2、nsP3、nsP4、C、E3、E2、6K和E1蛋白分别包含535、798、530、611、261、64、423和61个氨基酸残基(Khan等，2002；Schuffenecker等，2006)。在SDS凝胶上能观察到包膜蛋白为62kD E2/E3，在90分钟内分裂为E2和E3，以及45-50kD的紧密共同迁移的E1和E2。E1和E2迅速地彼此紧紧结合在一起。11kD的E3蛋白不与病毒体结合，而是释放到培养基中(Simizu等，1984；Ranadive和Banerjee，1990)。

为了诊断的目的，在鹅红细胞上常规进行病毒E1糖蛋白使红细胞粘著，血凝反应试验(HA)和血凝抑制反应试验(HI)。病毒的HA活性对胰蛋白酶不敏感，而被tween-醚处理增强(Hannoun，1968)。HI效价大于40的血清通常显示出中和能力(Bedekar和Pavri，1969b)。

可以从新生家属或老鼠，或者动物或昆虫细胞培养物中分离病毒。Vero、非洲绿猴肾细胞、BHK21、BSC-1、鸡胚成纤维细胞和C6/36细胞被用来在体外分离和扩增病毒。病毒在细胞培养物中复制相当快。根据剂量和细胞系，细胞病变效应在12-48小时内能够被观察到。感染复数为1-5时，在一个5-6小时的隐蔽期之后，细胞内病毒效价急剧地升高并在12小时达到峰值。细胞外病毒在感染后8小时能够观察到，在12-24小时达到峰值，这取决于细胞体系和接种物剂量(Chain等，1966；Higashi等，1967；Hahon和Hankins，1970；Eckels等，1970)。在单细胞层中感染的扩散方式根据细胞种类的不同而不同，在BHK21细胞中包括细胞外以及细胞至细胞的传播，而在L929细胞和豚鼠肺细胞中仅仅只有前者(Hahon和Zimmerman，1970)。上清液的效价可以达到小鼠脑标本观察到的那么高(Shah等，1964；Paul和Singh，1968；Umrigar和Kadam，1974)。

病毒能通过超速离心从细胞培养上清液中浓缩，或者利用硫酸铵、明矾或者聚乙二醇沉淀(Eckels等，1970；Klein等，1970；Banerjee和Ranadive，1988；Killington等，1996)。病毒还能通过速度区带离心、平衡密度梯度或凝胶过滤进一步纯化(Eckels等，1970；Simizu等，1984；Banerjee和Ranadive，1988)。病毒的滴定可以利用免疫荧光、ELISA、补体结合、琼脂凝胶免疫扩散、血凝反应和血凝抑制反应、噬菌斑测定或中和作用进行。

现在还不清楚CHIKV或其它α病毒如何引起关节炎。提出的可能机制包括病毒复制导致细胞死亡和组织损伤，关节处产生免疫介导的攻击，或者免疫复合物介导的炎症。塞姆利基森林病毒(Semliki forestvirus)和罗斯河病毒(Ross River virus)被发现在新生儿的骨关联结缔组织和成体小鼠的皮肤和肌肉中复制(Heise等，2000)，但是对于CHIKV还没有类似的研究。

与需要适应才能感染动物的登革热病毒(Dengue virus)相反，CHIKV在临床样本的初次接种中显示出快而高的死亡率(Myers等，1965)。但是，新生家鼠和老鼠是仅有的显示出疾病的物种(Chakravarthy and Sarkar，1969)。在大脑内、腹膜内或皮下接种3-10天的病人血清后，新生家鼠/老鼠以一种剂量依赖性的方式显示出疾病和高死亡率，小鼠的半数致死剂量为105.5-107.0病毒/mL血清(Shah等，1964)。动物迅速出现呆滞，严重食欲不振，发绀，皮肤温度降低，和死亡。从病理学上看，它们显示出心脏肥大，胃肠道、肺泡、膀胱、关节和皮肤出血，骨骼肌和脂肪垫坏死，以及弥散的肠内机能障碍(Nimmannitya等，1969；Weiss等，1965)。存活者(注入较少剂量的)显示出发育障碍，但产生了HI抗体，并且在大脑内或腹膜内攻击之后得到保护使免受攻击(Shah等，1964；Giovarelli等，1977)。

新生兔和豚鼠对某些病毒复苏有适度的敏感性，而一天的小猫敏感性较低。成体家鼠、老鼠、豚鼠、仓鼠、野兔和家兔显示出病毒血症，但没有发生疾病，而且产生了HI抗体和中和抗体，反之成体猫和家禽则不会产生抗体。在奶牛、绵羊、山羊和马中能观察到低效价的HI抗体，而没有病毒血症或中和抗体(McIntosh等，1963；Bedekar和Pavri，1969a；Chakravarthy和Sarkar，1969)。鸟类的敏感性还有争论。在一项研究中，白来杭鸡死于病毒接种，而康复的鸟类产生了中和抗体(Bedekar和Pavri，1969a)。这项研究以及其它包括对鸡、麻雀、鸽子和蝙蝠的研究中观察到不伴随病毒血症的血清转化或者什么都没观察到(Shah等，1964；Bedekar和Pavri，1969a)。

属于各种种类的成体猴表现出病毒血症，能将病毒传播给蚊子，并且长时间持续产生中和抗体(Paul和Singh，1968)。非洲的野生猴和狒狒在病毒感染后传播高效价的病毒却不显现出任何明显的疾病，并能将病毒传播给蚊子(McIntosh等，1963)。但是，印度并没有猴子自然感染的血清学证据(Bedekar和Pavri，1969b)。

CHIKV感染(临床的或者隐在的)被认为给予终身免疫。因为接近的抗原关系，可以假定存在不同毒株之间的交叉保护(Casals，1957；Porterfield，1961；Shah等，1964)以及与其它α病毒之间的相互交叉保护(Parks和Price，1958；Hearn和Rainey，1963)，这在动物模型中得到了证实。尽管如此，有证据表明活的减弱α病毒疫苗可以干扰以后的相关疫苗(McClain等，1998)。

作为疫苗的前奏，原始CHIKV制剂经过福尔马林灭活(Harrison等，1967)或从体外培养的病毒中用tween-醚萃取(Eckels等，1970)。尽管两者都彻底丧失感染性，然而福尔马林破坏HA活性，而后者则完全保留HA活性。但是它们都引起相似的HA、补体结合和中和抗体，还在致死性攻击研究中显示出相似的保护水平(Eckels等，1970)。

马里兰州弗雷德里克的美军传染性疾病医学研究所制成了CHIKV的一种候选疫苗。使用来自于泰国(1962年爆发)的CHIKV毒株15561来生产经过多次绿猴中传代以及福尔马林灭活的制剂，服用至16个志愿者，他们显示出高的免疫反应并且没有不良反应(Harrison等，1971)。GMK传代的病毒进一步通过噬斑试验在MRC-5细胞中进行18次连续传代(Levitt等，1986)，在15名首次遭遇α病毒的个体进行的I期试验中是安全的，并有免疫原性，接种后2-4天出现病毒血症(McClain等，1988)。在一项随机的、双盲的、安慰剂对照的II期试验中，73名首次遭遇α病毒的18-40岁志愿者被皮下接种了0.5mL剂量，其中含有-105PFU的病毒(59人)或安慰剂(14人)。血清学评价包括噬斑减少中和效价(plaque reduction neutralization titer，PRNT)和50％减少效价＞20被视为阳性。局部和全身反应仅限于疫苗组，8％的CHIKV疫苗组成员(安慰剂组中没有)出现关节痛。到第28天为止98.3％的接种疫苗者发生血清转化，28-42天达到PRNT50效价的峰值1∶10240。尽管抗体水平随时间稍微下降，一年以后85％的接种疫苗者仍然是血清阳性的，在180-360天维持效价1∶1280(Edelman等，2000)。

发明内容

本发明的范围包括从受感染的病人的血清样本中分离屈曲(CHIK)病毒的程序，在诸如Vero和MRC-5等FDA/国家监管局认可的细胞系的连续培养中适应和增殖病毒到一个高的效价以及从培养的被感染细胞中收获病毒的方法。本发明描述的方法适用于所有屈曲病毒的基因型/毒株/遗传性变型，并且是本领域技术人员所熟知的。本发明的范围包括基本不含有细胞和血清组分的受感染细胞中纯化病毒的方法。本发明中使用的一种方法包括使用所有人HimaxTM的技术来纯化病毒。纯化的病毒通过热灭活或使用包括但不限于福尔马林、β-丙内酯、戊二醛、非离子洗涤剂、抗坏血酸等的灭活试剂中的一种化学灭活。疫苗制剂包括药学上可接受的缓冲剂，例如pH范围6.4-7.5的磷酸盐或磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，其中添加了稳定剂，包括但不限于：人血清清蛋白、明胶、还原和非还原糖、氨基酸、例如山梨醇和甘露醇的多元醇、甘油有机和无机盐、聚乙烯吡咯烷酮等中的一种或几种。液体形式的稳定制剂适合于人类宿主的肌肉内/皮内/皮下/静脉内服用。冻干形式的稳定制剂在服用前可以通过合适的溶剂再生。制剂适合人类口服和鼻内服用。疫苗制剂的功效通过多种方法例如病毒中和试验和血凝抑制测定确定出。抗原蛋白的评价通过使用标准蛋白评价方法和ELISA进行。疫苗的效能在动物模型中进行测试。疫苗制剂的效能在抗原剂量从1μg到200μg的范围内进行测试，制剂中的活性成分为灭活的病毒。在使用制剂服用的家兔中观察到了高比率的血清转化和对抗病毒的保护性抗体。

在诸如Vero/MRC-5等FDA/国家监管局认可的细胞系的连续细胞培养中病毒的适应和生长提供了一种能负担的，可再生的和容易被验证的方法来在适合于工业规模生产能够用作为疫苗的稳定病毒制剂的连续细胞培养中增殖屈曲病毒。添加了稳定剂的灭活屈曲病毒稳定制剂具有免疫原性，能够诱发对抗屈曲病毒株的保护性免疫反应。

本发明还描述了利用重组病毒蛋白作为抗原的亚单位疫苗的方案。病毒蛋白能够在原核或真核宿主细胞中表达为重组蛋白。如本领域技术人员所知，这里描述的克隆和表达的方法适用于病毒蛋白的所有遗传性变型/突变体。

附图说明

图1：A-未感染的对照Vero细胞

B-CHIK感染的Vero细胞

C-对照MRC-5细胞

D-CHIKV感染的MRC-5细胞

E-对照BHK21细胞

F-CHIKV感染的BHK21细胞

图2：纯化的CHIKV制剂的SDS-PAGE，示出了比病毒抗原更突出的E1和E2蛋白。病毒样本在12％的变性SDS-PAGE凝胶中电泳，通过银染使结果可视化。两种蛋白的大小约为46-50kD。

图3：纯化的屈曲病毒隔离群CHK/03/06在老鼠大脑内注射后的体内毒力。2天龄的老鼠大脑内注纯化的射屈曲病毒隔离群CHK/03/06，对照动物注射等体积的PBS。

图A-注射PBS 7天后的对照小鼠

图B-注射纯化病毒的老鼠在大脑内注射纯化病毒制剂后第6天死亡

图C-给2天龄的老鼠大脑内注射后第9天，注射PBS的对照动物显示正常生长(左)，而注射1∶64稀释的纯化病毒制剂的小鼠严重生长迟缓。

图4：CHK/03/06隔离群200K放大倍率的透射电子显微照片(TEM)。

图5CHK/01/06和CHK/03/06病毒隔离群使用CHIK病毒基因特异性引物扩增的RT-PCR产物的溴化乙锭染色照片。

泳道1-使用CHK SP FP1和CHK SP RP5扩增的CHK/01/06；～550bp

泳道2-使用CHK SP FP1和CHK SP RP5扩增的CHK/03/06；～550bp

M-分子大小标记；1kb ladder；(N3232S；New England Biolabs)

泳道4-使用CHK SP FP3和CHK SP RP4扩增的CHK/01/06；～686bp

泳道5-使用CHK SP FP3和CHK SP RP4扩增的CHK/03/06；～686bp

泳道6-使用CHK SP FP1和CHK SP RP5扩增的CHK/01/06；～637bp

泳道7-使用CHK SP FP1和CHK SP RP5扩增的CHK/03/06；～637bp

图6使用新鲜鹅红细胞的CHK/03/06病毒血凝反应(HA)。前两列是连续稀释的从Vero细胞中收获的病毒的HA效价。后两列是连续稀释的纯化CHIK病毒制剂的HA效价，表现出HA效价的增加。

图7.病毒结构蛋白的RT-PCR。

格A-泳道1-衣壳的PCR产物；泳道2-100bp ladder；泳道3-E2的PCR产物

格B-泳道1-E1的PCR产物；泳道2-1Kb ladder

格C-泳道1-100bp ladder；泳道2-E3的PCR产物

图8在大肠杆菌(E.coli)表达细胞中诱导的克隆E1蛋白的SDS-PAGE。泳道1-未诱导细胞；泳道2-蛋白质分子大小标记；泳道3-IPTG诱导4小时后的大肠杆菌细胞，显示出约47kD的E1蛋白的诱导。

图9在巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)中诱导的约30kD的衣壳蛋白的SDS-PAGE；泳道1-甲醇诱导后0小时的蛋白表达；泳道2-甲醇诱导后72小时；泳道3-蛋白质分子大小标记。

具体实施方式

说明了屈曲病毒颗粒的免疫原特性，病毒在宿主细胞系中适应和增殖以达到更高的效价(a high titer)，用RT-PCR、电子显微镜识别病毒的检测方法；还说明了一种纯化和灭活病毒的方法，在适合人类服用的药学可接受的载体上制备稳定液体和冻干疫苗制剂，在动物模型中研究疫苗功效的病毒方法和试验。

本发明中描述的疫苗的活性成分或免疫原是灭活的屈曲病毒颗粒。本发明描述的方法适合于屈曲病毒的任何基因型/毒株。从患者血清中的临床隔离群得到的病毒颗粒在体外单细胞层中适应和增殖了许多代。在可选择的操作规程中，在2天大小的乳鼠中进行病毒颗粒的传代，重新分离病毒并在体外单细胞层中传代。

根据本发明的屈曲(CHIK)病毒疫苗指灭活屈曲病毒的活性成分(免疫原)，其通过在cGMP条件下在细胞被用作培养屈曲病毒的宿主细胞的连续培养物中感染Vero细胞或MRC-5细胞的单细胞层来生产。细胞系在各种质量控制测试中表现合格，并被FDA/国家监管局认可作为疫苗品质细胞系。病毒通过在细胞培养物中生长到高效价(～109)和从感染的细胞中纯化来大量繁殖。病毒通过热灭活或灭活试剂灭活。

使用稳定剂型中的上述颗粒免疫得到的抗血清的中和抗体效价通过体外中和试验测定，它提供了动物中的保护性免疫。

屈曲病毒疫苗的免疫原是对抗各种毒株或基因型变体的屈曲病毒引起的传染性疾病的疫苗的免疫原的代表性实例。本发明的疫苗以液体或冻干形式在密封的小瓶或安瓿中提供。在液体剂型的情况下，以大约每人0.05ml到5ml的量通过皮下/肌肉内/皮内/静脉内注射或口/鼻内服用至要接种疫苗的个体。在冻干剂型的情况下，在使用合适的溶剂重新溶解后再注射。

根据本发明，本发明中使用的适合屈曲病毒株的方法适用于具有广泛抗原谱的任何屈曲病毒株。广谱抗原反应对除制造疫苗使用的毒株之外的多种CHIK病毒株提供了满意的免疫保护。如本领域技术人员所知，二价或多价疫苗可以通过将两种或多种在遗传上确证为CHIK病毒的CHIK病毒株制造的疫苗混合，并根据抗原蛋白含量以合适的比率混合来配制。这样的混合提供具有更广的对抗感染的保护抗原谱的疫苗制剂。

根据本发明，用病毒接种合适的宿主细胞系，例如Vero细胞/MRC-5细胞，在连续培养中维持感染的细胞。培养方法包括用病毒感染宿主单细胞层和从感染的宿主细胞中收获足够数量的病毒。在细胞层中生长的病毒包括能够通过离心收获的从感染的细胞培养物上清液中收获得到的细胞外病毒群落，并且通过超声降解和离心收获细胞关联的病毒。

能够在体外培养中增殖的细胞系可以用来作为病毒培养的宿主。例如，二倍体细胞系(如MRC-5和WI-38)以及连续传代细胞系(如Vero、BHK-21、CHO等)都能被使用。为了繁殖屈曲病毒株，优选地选择让病毒良好地生长的许可细胞(permissive cell)。例如Vero(ATCCNo.CCL-81)、BHK-21(ATCC No.CCL-10)、C6/C3(ATCC No.CRL-1660)等是优选使用的。本发明中使用的一种这样的细胞系是Vero细胞，它已经被确认为疫苗生产使用的宿主细胞。确认的Vero细胞系符合第50号生物制品要求，其关于世界卫生组织(WHO)推荐的生产生物制品的细胞的使用要求，因而证实这些细胞系具有生产疫苗的资格(WHO Technical report Series，No.878，pp 19-52，1998)。此外，按照惯例用于生产病毒疫苗的CV-1、BSC-1、MA104、MDCK、CaCO-2etch和DBS-FLC-1、DBS-FLC-2、DBS-FRhl-2、ESK-4、HEL、IMR-90、WRL68等同样能够使用(“ATCC Microbes and Cell at Work”，第二版.，pp 144，American Type Culture Collection(ATCC)1991，USA)。

为了在细胞培养中维持上述细胞系，能应用单细胞层固定培养，灌流系统培养，摇瓶，滚管/瓶培养，悬浮培养，微载体培养，细胞工厂和细胞堆集室以及类似的方法。例如商业上可以获得的多种Cytodex(Pharmacia Biotech，瑞典)被用作为微载体，也能使用其它商业上可以获得的动物细胞培养装置。

将灭活试剂诸如福尔马林、β-丙内酯，和戊二醛加入病毒悬浮液来灭活病毒。例如，使用福尔马林和β-丙内酯时，加入的量大约是0.001％到0.4％(v/v)，灭活温度为约2-8℃到约40℃，灭活持续时间主要取决于灭活温度。例如，37℃时在2-72小时范围之间，2-8℃时大约12-250小时。在22℃左右的中间温度灭活2-120小时也是有效的。病毒灭活也可以通过非离子型洗涤剂和抗坏血酸进行。56-58℃左右温度下热灭活屈曲病毒1小时也是有效的。

纯化病毒是利用物理方法或者化学方法或者更好地两者的组合来进行。物理方法利用病毒的物理性质诸如密度、大小、质量、沉降系数等和包括但不限于下列任何技术：区带超速离心、密度梯度离心、大小截断范围50-1000kDa的膜超滤来去除血清和细胞组分。通过化学方法的纯化应用诸如通过化学或生理化学反应吸附/解吸附的方法，并且包括例如超离心、密度梯度离心、离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、凝胶过滤层析、以硫酸氨为例的无机盐成盐和使用所有者HimaxTM的技术、有机盐、有机溶剂、硫酸铝、氢氧化铝以及诸如聚乙二醇的有机化合物。病毒的纯化通过上述一种方法或者两种及两种以上方法的联合而实现。

病毒的浓缩通过超滤膜低速离心、盐沉淀或使用HimaxTM技术纯化而实现。病毒颗粒的灭活可以在病毒纯化之前或之后实现。

通过使用2％(w/v)的乙酸双氧铀负染色方法在约20,000到约200,000放大倍率的电子显微镜中能观察到病毒。

CHIK病毒的遗传一致性通过对互补于毒株基因组RNA的cDNA测序来确认。更具体地说，通过超离心粒化或从密度梯度中分离后，从病毒感染的细胞或纯化的CHIKV中抽提基因组RNA。此后，使用一对引物和通过双脱氧链终止法确定的产物cDNA的碱基序列使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)进一步扩增编码包膜蛋白或非结构蛋白的区域。碱基序列编码的氨基酸序列使用通用密码译解并通过病毒的遗传一致性确认为屈曲病毒。

本发明的灭活病毒颗粒通过合适的药学上可接受的的稀释剂稀释以得到需要的效价。制剂中使用的缓冲液可以是磷酸盐或磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液。疫苗可以任选地含有防腐剂、稳定剂等。将还原和非还原糖、糖醇(如山梨醇和甘露醇)、甘油、氨基酸、人血清清蛋白以0.01％到10％的范围添加到液体剂型中或以不多于总固体量的60％添加到冻干剂型中。这样的液体或冻干形式的和在药学上可接受的缓冲液或水中重建之后的免疫原的稳定制剂适合于对人类宿主皮内/皮下/肌肉内/静脉内服用，也同样适合于口和鼻内服用。

可选地，屈曲病毒疫苗可以是亚单位疫苗，其用结构蛋白(如屈曲病毒株的衣壳蛋白、E1和E2和E3糖蛋白)配制，所述毒株可以是分别克隆和表示，并纯化来组成疫苗制剂，或通过表达由衣壳蛋白、E3、E2、6K多肽和E1蛋白构成的整个结构多聚蛋白，其作为一个单一的多肽克隆，并具有在例如酵母、经由杆状病毒介导表达的昆虫细胞，和宿主信号肽酶加工后的哺乳动物细胞的真核宿主细胞中组装为病毒样颗粒(VLP)的潜能。因为它们被宿主信号肽酶正确加工组装后在结构上模拟了天然病毒颗粒，因此VLPs具有高度免疫原性。它们的组装结构中包含了多拷贝的抗原蛋白。原核或真核宿主细胞中表达的病毒蛋白都经纯化去除了宿主细胞蛋白。纯化的结构蛋白可以以制剂且通过上述方法服用。克隆时在重组蛋白的任一端添加的组氨酸残基有利于重组蛋白的纯化。

在本发明的另一方面中，根据本发明获得的病毒颗粒和重组病毒蛋白在诊断试验中能被用作试剂(作为抗原)，例如在免疫沉淀方法、血凝抑制反应(HI)试验、补体结合(CF)反应、ELISA、放射免疫测定、免疫荧光检验、Western Blot和其它类似的试验中作为抗原。更具体地说，提供了使用本发明的灭活病毒颗粒整体或其部分的检测屈曲病毒各种毒株感染的高灵敏度和特异性的诊断试验。这里使用的术语灭活病毒颗粒的“部分”指保持需要的免疫原性并衍生自病毒颗粒的病毒部分，包括例如在提供的实施例中描述的在纯化步骤中溶解的或在重组表达系统中表达的结构蛋白。具体用于病毒的多克隆抗体或单克隆抗体能够用于屈曲病毒感染的诊断测定。

在Balb/c老鼠和家兔中测验疫苗制剂以测定疫苗的效能。对每组动物腹膜内注射大约0.2-0.5ml/老鼠的连续稀释疫苗制剂，不同测验组的剂量范围从1μg到大约500μg。首次服用抗原7-14天之后再给予一个加强剂量。在氢氧化铝和寡核苷酸中配制的灭活病毒制剂带来了更高的免疫反应。产物血清通过体外中和试验测定，抗体效价利用ELISA测定。使用疫苗制剂免疫的动物观察到血清转化。

下面包含的实施例仅仅是为了更全面地理解这里描述和要求保护的发明。这些实施例不以任何方式限制要求保护的发明的范围，它不能解释权利要求的保护范围。但是，应该理解的是，在不违背如前的权利要求给出的本发明的范围的前提下，本领域技术人员能够作出修饰和改变。益处、优点、问题的解决方法和任何能够带来益处、优点或出现或变得更显著的解决方法的要素都不应理解为任何或所有权利要求的关键的、必需的或本质的特征或要素。本发明仅仅通过附加的权利要求书来定义，包括在本申请审查期间的任何修改和那些权利要求的所有等效物。

实施例1：

在病毒培养细胞系中增殖：Vero细胞系(ATCC No.CCL-81)、BHK-21细胞和MRC-5细胞被用作为屈曲病毒(CHIKV)培养的候选细胞系，在每一种细胞系中都观察到良好的病毒增殖。Vero细胞和BHK-21细胞分别在由含有5％胎牛血清(FBS)的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium；Sigma-Aldrich Catalog#D5523；按照厂商的使用说明使用)组成的生长培养基中制备。它们在37℃静止培养直到80-100％的单细胞层融合为止。此后对细胞进行计数。MRC-5细胞在由用Hepes缓冲液缓冲到中性pH的含有5％FBS的MEM(MinimalEagle’s Medium)组成的生长培养基中制备，在37℃静止培养6天，此后对细胞进行计数。在另一种候选方法中，Vero细胞和MRC-5细胞在无血清培养基中培养。为了标定用于病毒感染的细胞的生产，使用来自于工作细胞库的包含5×106活Vero细胞的一支冷冻管来接种一个T175细胞培养瓶。含有5％FBS和50μg/ml新霉素硫酸盐的DMEM被用来复苏和培养细胞。在T175瓶中的单细胞层融合度超过90％后，细胞用胰蛋白酶消化并在细胞工厂/细胞堆集室(CF10)中进一步增殖。使用同样的DMEM培养基进行增殖(～2.0L/CF10)。

实施例2.

病毒的分离：

屈曲病毒(CHIKV)从具有典型屈曲病毒感染临床症状的感染患者的血清中分离。病毒的印度隔离群被用来制造疫苗制剂。在获得的众多隔离群中，名为CHK/03/06和CHK/01/06的两个隔离群被鉴定。从患者抽取的血液样本在4℃运送，并从中分离血清。血清使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)1∶1稀释，用0.5ml稀释的血清在252cm瓶中感染Vero细胞(ATCC No.CCL-81)，并在无血清培养基中34℃到37℃培养。Vero细胞对照瓶用同体积的1x PBS处理。感染后增殖Vero细胞的培养基是含有1％胎牛血清(FBS)的DMEM。在一种可选的方法中，细胞和病毒的培养都在无血清培养基中进行。在感染30-48小时之后收获病毒。感染的Vero细胞中屈曲病毒隔离群CHK/03/06的细胞病理效应(cpe)如图1B所示，图1A是未感染对照。病毒在类似条件下也在MRC-5细胞中培养，在MRC-5细胞中观察到的CHK/03/06的细胞病理效应如图1D所示，1C是未感染对照MRC-5细胞。在BHK21细胞中病毒的cpe如图1F所示，未感染对照BHK-21细胞如图1E所示。在试验的另一种候选方法中，Vero和MRC-5细胞在感染前用从0.01％到1％的低浓度化学试剂诸如胰蛋白酶处理，且使用或不使用二价离子(如钙和镁)。

实施例3：

病毒隔离群CHK/01/06和CHK/03/06的增殖：病毒隔离群CHK/01/06和CHK/03/06在Vero细胞(ATCC No.CCL-81)、BHK-21细胞和MRC-5细胞的连续细胞培养中扩增。感染用的培养基是含有0％-1％FBS的DMEM。感染48小时后，细胞病理效应接近Vero和BHK21细胞中的全部，并且病毒在细胞外培养基中大量出现。获得了达到109/ml的病毒TCID50。病毒隔离群在Vero细胞中连续传代23次并在连续细胞培养中稳定了。在通过家鼠大脑传代之后病毒效价大大增加。病毒感染和增殖同样可选地在无血清培养基中测试。

实施例4：

病毒的纯化：从感染的Vero单细胞层中纯化两种病毒隔离群的方法包括但不限于：低速离心去除大量细胞碎屑和血清组分，超速离心，蔗糖密度梯度离心和100-1000kDa的膜超滤。利用离子交换柱层析和在琼脂糖CL 4B或类似性质的基质中凝胶过滤来进一步纯化病毒。汇集含有病毒的部分并使用包括在下面列出的一种盐沉淀：在0.020M-0.20M NaCl存在下的PEG，用HimaxTM技术沉淀，硫酸氨，明矾等。病毒粒的感染性通过Vero、BHK21和MRC-5细胞的再感染和具有传染性来核实。浓缩的病毒在pH 7.2的磷酸盐缓冲液中悬浮以在7.5％-12％的SDS-PAGE中核实，病毒蛋白通过银染显现。病毒的高度纯化也可以通过离子交换层析、疏水作用柱层析和使用盐洗脱MonolithTM柱来实现。病毒制剂的纯度通过SDS-PAGE凝胶银染和使用家兔生产的抗CHIKV抗血清的Western blot来核实。在Monolith阴离子交换柱上纯化带来了更高的感染性恢复。病毒的感染性在消除血清和宿主细胞对病毒的污染并能常规地获得105到107/ml的TCID50的中试规模纯化的不同步骤中也都受到监控，并不断进一步最优化。

实施例5：

病毒制剂的纯度利用SDS-PAGE来核实发现具有高纯度。E1和E2包膜糖蛋白能够容易地检测到。见图2。根据通过测定病毒的感染性计数和通过在2天大小的家鼠大脑内注射各种稀释度的纯化病毒部分所测定的，纯化的病毒具有感染性。纯的纯化病毒和一些连续稀释物在大脑内注射时导致死亡。与注射PBS的对照小鼠相比，小鼠显示出严重的生长迟缓，如图3所示。

实施例6：

病毒的电子显微镜检查：超离心后的CHIK病毒的透射电子显微镜检查(Hitachi H-7500)通过使用2％乙酸双氧铀的负染色方法进行，如图4所示。

实施例7：

在Vero细胞中生长的屈曲病毒隔离群CHK/01/06和CHK/03/06的遗传一致性利用CHIK病毒隔离群的病毒基因组RNA的逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)确认。病毒基因组RNA按照标准操作规程从Vero细胞中的病毒培养物中抽提。总RNA使用oligodT(18mer)和屈曲病毒序列特异性引物在不同的反应中逆转录。可选地，在逆转录产物上使用下面给出的基因特异性正向和反向引物进行PCR。使用Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)进行PCR。CHIK病毒隔离群cDNA的一些RT--PCR的例子见图5。一些PCR反应中使用的部分正向和反向引物序列如下：

CHK SP FP1：5’CTAAATAGGTACGCACTACAGC 3’；

CHK SP FP2：5’TGGACTCCGCGCCCTACTATC 3’；

CHK SP FP3：5’TACTCAGGAGGCCGGTTCAC 3’.

CHK SP RP4：5’GTGTCCCATTGTTCCAG 3’

CHK SP RP5：5’GTGAACCGGCCTCCTGAGTA 3’

RT-PCR扩增的cDNA片断利用双脱氧链中止法测序。演绎的蛋白质序列使用通用遗传密码确定。屈曲病毒基因组附加区域的序列用其它基因特异性引物扩增，扩增的DNA的序列利用双脱氧链中止法确定。RT-PCR产物的序列确认了屈曲病毒隔离群的一致性。

实施例8：

病毒的热灭活：

CHK/03/06隔离群的纯化病毒粒在温度范围50℃到60℃内热灭活30-60min。病毒粒的感染性通过Vero细胞的再感染来核实。没有再感染被观察到。

实施例9：

病毒的化学灭活：

CHK/03/06隔离群的纯化病毒粒使用包括但不限于下列任一种方法来灭活：37℃下在浓度范围从0.01％到0.5％的福尔马林(甲醛)中灭活2小时，然后在4℃下培养48-96小时。在各种浓度的福尔马林中灭活的病毒粒在至少三次连续传代后再感染Vero细胞时不具有感染性。在一种可选择的灭活方法中，纯化病毒粒在37℃下用BPL∶病毒范围从1∶500到1∶3000的不同浓度β-丙内酯(BPL)灭活2小时，然后在4℃下培养48-200小时的不同时间区间。BPL∶病毒比率为1∶500稀释度到1∶1000稀释度的病毒在三次连续传代后没有观察到病毒的再感染。在22℃下持续48-96小时的可变小时数也能成功进行病毒的灭活。在浓度范围且测试不同时间长度，福尔马林和β-丙内酯灭活的病毒粒都没有观察到感染性。

实施例10：

病毒感染效价的测定：CHK/03/06隔离群的病毒感染效价通过使用Vero细胞的空斑计数方法以PFUs(plaque-forming units/ml，空斑形成单位/ml)计数并采用标准操作规程确定TCID50(Tissue cultureinfectious dose，组织培养感染剂量)来计数。空斑要在36-48小时之前准备好，而效价要在30-48小时之前确定。在Vero细胞中，不同传代数的Vero适应的病毒产生的效价达到108.5TCID50/ml。将病毒在2天大小的小鼠脑中传代后观察到效价升高。病毒从Vero细胞中传代的2个样本中斑纯化。

实施例11：

病毒免疫原性的确定：

CHK/03/06隔离群的屈曲病毒抗原量通过使用BCA方法的蛋白质评价和使用家兔抗-屈曲病毒抗血清的ELISA来测定。多克隆抗体通过对家兔皮内/皮下/肌肉内注射100μg纯化的屈曲病毒CHK/03/06隔离群并在首次抗原服用7-14天后注射类似抗原量作为加强剂量来生产。从BHK21细胞纯化的病毒的单次剂量注射带来大约6400的ELISA效价，以及通过病毒中和测定的大于80的效价，与之相比正常家兔血清约4。4份康复期的人类抗血清样本提供了80-240的不同的效价，而对照人类血清提供的效价约为4。也获得了抗病毒的CHK/01/06和CHK/03/06隔离群的抗血清。根据采用ELISA和体外中和检测所测定的，观察到了良好的血清转化。在单次加强注射之后观察到的中和测定效价更高。

实施例12：

血凝反应和血凝抑制反应：

血凝反应效价采用标准方法在鹅红细胞悬浮液中测定。家兔免疫血清和康复期人类血清采用标准操作规程确定血凝抑制反应。家兔免疫血清和康复期人类血清都显示出血凝抑制反应。纯化病毒的HA效价高于收获的纯的病毒样本。感染病毒样本和连续稀释后的纯化病毒样本的HA效价如图6所示。

实施例13：

动物试验：

每一组中使用15只一个月大小的Balb/c家鼠。每组动物使用约0.2ml-0.5ml/家鼠的连续稀释的CHK/03/06隔离群疫苗制剂腹膜内注射，不同试验组的剂量范围从1μg到约200μg。动物在首次免疫14天后进行加强。加强注射7天和14天后收集血液。每组汇集等量血清，56℃灭活补体大约30分钟。产物血清在中和测试中用作免疫血清，以及用于抗体效价的ELISA测定。在一个候选实验中，通过肌肉内服用相似量的灭活病毒制剂。肌肉内注射的抗体反应更强。所有剂型都含有pH 6.8-7.2含150mM NaCl的40mM磷酸盐缓冲液中伴随氢氧化铝的病毒抗原，50μg/剂的寡核苷酸和不同量的赋形剂，如下面实施例提到的。

实施例14：

剂型：

在含有或不含有154mM NaCl的pH 6.9-7.2的40mM磷酸盐缓冲液中配制屈曲病毒抗原CHK/03/06制剂。病毒制剂与氢氧化铝/磷酸铝一起配制成液体剂型，其中含有任意一种或组合的糖例如蔗糖、麦芽糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇或山梨醇。0.5％-10％范围，优选0.5％to 5％范围的糖的存在使制剂具有如37℃下3周的加速稳定性确定的良好的稳定性。液体剂型中包括50μg/剂剂量的寡核苷酸时得到了显著提高的抗体反应效价。类似的剂型也在pH 6.8-7.2的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中测试，没有观察到任何区别。达到总固体量60％的高浓度的上述糖、缓冲剂和盐使疫苗的冻干剂型具有良好的稳定性。制剂的稳定性在小鼠中通过效能测试来测定。

实施例15：

病毒抗原在原核和真核表达系统中的重组克隆和表达：

以CHK/03/06病毒隔离群作为克隆和表达序列由SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.10表示的所有病毒抗原的来源。SEQ ID NO.1编码的屈曲病毒结构多聚蛋白的完整开放阅读框通过病毒基因组RNA的RT-PCR扩增，使用引物CHKCPFP作为正向引物，CHKE1RP作为反向引物，得到一条约3776bp的PCR片段。PCR片段用Nde1和BamH1消化，并克隆到原核表达载体pET11B的Nde1和BamH1位点，包含插入片段的重组质粒被转化入大肠杆菌DH5a。在一个可选择的方法中，编码屈曲病毒结构多聚蛋白的开放阅读框SEQ ID NO.2通过类似的方式克隆和表达，使用CHKCKOZAKFP作为正向引物，CHKE1RP2作为反向引物得到一条相似大小的片段。SEQ ID NO.2用一条在5’端引入了Kozak’s共有序列的引物序列扩增以增强在真核表达系统中的表达。引物序列CHKCKOZAKFP含有EcoR1位点，CHKE1RP2含有HindIII和Not1位点以利于分别克隆进入杆状病毒载体pFastBac(InvitrogenCorporation，Carlsbad，USA)和毕赤酵母载体pPIC3.5K(InvitrogenCorporation，Carlsbad，USA)。

SEQ ID NO.2进一步用一条C端引物扩增，在C-末端引入6组氨酸残基，得到SEQ ID NO.3。

SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2编码SEQ ID NO.4的蛋白质。SEQ IDNO.3编码在C-末端有6组氨酸残基的SEQ ID NO.5的蛋白质。

位于SEQ ID NO.5的C-末端的6-组氨酸残基有利于表达的蛋白在Ni+亲和柱上的纯化。SEQ ID No.4和SEQ ID NO.5都在酵母中以及Sf9细胞的杆状病毒介导表达中表达并装配病毒样颗粒。用EcoR1和Not1消化相应于SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的PCR基因片段，并按照标准操作规程凝胶纯化，并克隆进入酵母表达载体pPIC3.5K(InvitrogenCorporation，Carlsbad，USA)的EcoR1和Not1位点。在用相同的引物进行PCR验证之后挑选阳性克隆。编码SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的完整结构蛋白的重组质粒按照厂商(Invitrogen)的说明书以及它们操作规程的概述转化进入巴氏毕赤酵母(Pichia Pastoris)GS115。PCR扩增片段被克隆进入AOX1基因座并通过甲醇诱导在AOX1启动子下表达。重组毕赤酵母菌株的克隆、筛选、分离以及克隆基因的甲醇诱导按照用户手册(“在巴氏毕赤酵母中表达重组蛋白的方法手册”M版，2002年1月，源于毕赤酵母表达试剂盒，Catalog#K1710-01，InvitrogenCorporation，Carlsbad，USA)进行。

通过RT-PCR扩增的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3编码的屈曲病毒结构多聚蛋白的完整开放阅读框(ORF)用EcoR1和Hind III消化，凝胶纯化并克隆进入在多面体启动子(polyhedron promoter)控制下的pFastBac载体(Invitrogen Corporation，Carlsbad，USA)的EcoR1和HindIII位点。重组杆状病毒载体的克隆和选择方法在Bac to Bac杆状病毒表达系统用户手册(“生成用于重组蛋白高水平表达的杆状病毒的高效位点特异性转座系统”D版，2004年4月6日，Invitrogen Corporation，Carlsbad，USA)中有准确概述。简要地说，该方法利用了诸如包含上面描述的克隆插入序列的重组pFastBac载体的表达盒的位点特异性转座来进入大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体(杆粒，bacmid)。包含在多面体启动子控制下克隆的SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5其中之一的插入片段的重组pFastBac载体转化进入大肠杆菌Max EfficiencyDH10BacTM感受态细胞，后者包含杆状病毒穿梭载体(bMON14272)和有利于允许重组杆粒在含有SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的pFastBac重组构建体转座后高效再生的转座的辅助质粒(pMON7124)。重组杆粒在含有氨苄青霉素、庆大霉素和卡那霉素的平板上通过使用卤代吲哚基-β-D-半乳糖苷(bluo-gal)和IPTG的蓝白斑筛选来选择。重组杆粒采用与分离质粒DNA类似的标准操作规程分离，使用CellfectinTM试剂将1μg杆粒DNA转染进入在Grace’s昆虫细胞培养基(Invitrogen Corporation，USA)中生长的Sf9昆虫细胞。P1病毒原液的转染、分离和滴定方法在上面给出的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统用户手册中有准确描述。

结构多聚蛋白序列编码的(如分别相应于下列序列编号：SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的衣壳蛋白、E3、E2、6K多肽和E1结构蛋白)每个结构抗原的开放阅读框通过PCR扩增，使用下面第一步扩增中的基因特异性引物。在第二步中，编码6组氨酸残基的反向引物被用于每个单独基因的PCR(引物序列未给出)，并克隆进入在大肠杆菌中原核表达的pET11B载体和在昆虫细胞中杆状病毒介导表达的pFastBac载体。

一些原本为大肠杆菌和杆状病毒的克隆设计的PCR引物没有克隆进入pPIC3.5K以在巴氏毕赤酵母中表达的合适限制性位点。由于在正向和反向引物中分别存在相应的限制性位点而在5’末端有EcoR1位点并在C-末端有BamH1位点的那些PCR片段最初克隆进入载体pBluescript SK+的EcoR1和BamH1位点。选择出的重组克隆用EcoR1和Not1消化，消化片段进一步按照上面的描述亚克隆进用于酵母转化的pPIC3.5K。用于各种扩增的引物序列如下指出。在大肠杆菌中E1抗原的表达和在酵母中衣壳蛋白的表达如图8和图9所示。

引物序列：

1)CHKCKOZAKFP：

5’ATTGAATTCACCATGGAGTTCATCCCAACCCAAAC 3’

2)CHKE1RP2：

5’AACAAGCTTGCGGCCGCTTAGTGCCTGCTGAACGACACG 3’

3)CHKSPE3FP：

5’ACCGAATTCATATGAGTCTTGCCATCCCAGTTATG 3’

4)CHKSPE3RP：

5’TGCAAGCTTGGATCCTTAGCGTCGCTGGCGGTGGGGAG 3’

5)CHKSP6KFP：

5’ACGGAATTCATATGGCCACATACCAAGAGGCTGCG 3’

6)CHKSP6KRP：

5’ATTAAGCTTGGATCCTTAGGTGCCCACACTGTGAGCGC 3’

7)CHKCPFP：

5’ACAGAATTCATATGGAGTTCATCCCAACCCAAAC 3’

8)CHKCPRP：

5’ATTAAGCTTGGATCCTTACCACTCTTCGGCCCCCTCGGGG3’

9)CHKE1FP：

5’TAGAATTCATATGTACGAACACGTAACAGTGATCC 3’

10)CHKE1RP：

5’TATAAGCTTGGATCCTTAGTGCCTGCTGAACGACACGC 3’

11)CHKE2FP：

5’TCGGAATTCATATGAGCACCAAGGACAACTTCAATGTC 3’

12)CHKE2RP：

5’TCCAAGCTTGGATCCTTACGCTTTAGCTGTTCTGATGCAGC3’

实施例16：

原核或真核表达系统中表达的重组抗原都能用于诸如ELISA的诊断目的。ELISA用灭活全病毒和用家兔抗血清来建立。相似的技术也能使用纯化的重组抗原代替全病毒抗原来建立。针对病毒抗原尤其是结构抗原的多克隆抗血清或单克隆抗体能够被用作免疫治疗试剂。

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41.Umrigar MD和Kadam SS.1974.Comparative sensitivity of sucklingmice and Vero cells for primary isolation of Chikungunya virus.Ind.J.Med.Res.62：1893-1895.

42.Weiss HJ，Halstead SB和Russ SB.1965.Hemorrhagic disease inrodents caused by Chikungunya virus.1.Studies of hemostasis.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.119：427-432.

序列表

<110>伯哈拉特生物技术国际有限公司

<120>抗屈曲病毒感染的疫苗

<130>09-1071-PW

<140>PCT/IN07/000383

<141>2007-08-31

<150>1583/CHE/2006

<151>2006-09-01

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>3747

<212>DNA

<213>屈曲病毒(Chikungunya virus)

<400>1

atggagttca tcccaaccca aactttttac aataggaggt accagcctcg accctggact 60

ccgcgctcta ctatccaaat catcaggccc agaccgcgcc ctcagaggca agctgggcaa 120

cttgcccagc tgatctcagc agttaataaa ctgacaatgc gcgcggtacc ccaacagaag 180

ccacgcagga atcggaagaa taagaagcaa aagcaaaaac aacaggcgcc acaaaacaac 240

acaaatcaaa agaagcagcc acctaaaaag aaaccggctc aaaagaaaaa gaagccgggc 300

cgcagagaga ggatgtgcat gaaaatcgaa aatgattgta ttttcgaagt caagcacgaa 360

ggtaaggtaa caggttacgc gtgcctggtg ggggacaaag taatgaaacc agcacacgta 420

aaggggacca tcgataacgc ggacctggcc aaactggcct ttaagcggtc atctaagtat 480

gaccttgaat gcgcgcagat acccgtgcac atgaagtccg acgcttcgaa gttcacccat 540

gagaaaccgg aggggtacta caactggcac cacggagcag tacagtactc aggaggccgg 600

ttcaccatcc ctacaggtgc tggcaaacca ggggacagcg gcagacctat cttcgacaac 660

aagggacgcg tggtggccat agtcttagga ggagctaatg aaggagcccg tacagccctc 720

tcggtggtga cctggaataa agacattgtc actaaaatca cccccgaggg ggccgaagag 780

tggagtcttg ccatcccagt tatgtgcctg ttggcaaaca ccacgttccc ctgctcccag 840

cccccttgca cgccctgctg ctacgaaaag gaaccggagg aaaccctacg catgcttgag 900

gacaacgtca tgagacctgg gtactatcag ctgctacaag catccttaac atgttctccc 960

caccgccagc gacgcagcac caaggacaac ttcaatgtct ataaagccac aagaccatac 1020

ttagctcact gtcccgactg tggagaaggg cactcgtgcc atagtcccgt agcactagaa 1080

cgcatcagaa atgaagcgac agacgggacg ctgaaaatcc aggtctcctt gcaaatcgga 1140

ataaagacgg atgacagcca cgattggacc aagctgcgtt atatggacaa ccacatgcca 1200

gcagacgcag agagggcggg gctatttgta agaacatcag caccgtgtac gattactgga 1260

acaatgggac acttcatcct ggcccgatgt ccaaaagggg aaactctgac ggtgggattc 1320

actgacagta ggaagattag tcactcatgt acgcacccat ttcaccacga ccctcctgtg 1380

ataggtcggg aaaaattcca ttcccgaccg cagcacggta aagagctacc ttgcagcacg 1440

tacgtgcaga gcaccgccgc aactaccgag gagatagagg tacacatgcc cccagacacc 1500

cctgatcgca cattaatgtc acaacagtcc ggcaacgtaa agatcacagt caatggccag 1560

acggtgcggt acaagtgtaa ttgcggtggc tcaaatgaag gactaacaac tacagacaaa 1620

gtgattaata actgcaaggt tgatcaatgt catgccgcgg tcaccaatca caaaaagtgg 1680

cagtataact cccctctggt cccgcgtaat gctgaacttg gggaccgaaa aggaaaaatt 1740

cacatcccgt ttccgctggc aaatgtaaca tgcagggtgc ctaaagcaag gaaccccacc 1800

gtgacgtacg ggaaaaacca agtcatcatg ctactgtatc ctgaccaccc aacactcctg 1860

tcctaccgga atatgggaga agaaccaaac tatcaagaag agtgggtgat gcataagaag 1920

gaagtcgtgc taaccgtgcc gactgaaggg ctcgaggtca cgtggggcaa caacgagccg 1980

tataagtatt ggccgcagtt atctacaaac ggtacagccc atggccaccc gcatgagata 2040

attctgtatt attatgagct gtaccccact atgactgtag tagttgtgtc agtggccacg 2100

ttcatactcc tgtcgatggt gggtatggca gcggggatgt gcatgtgtgc acgacgcaga 2160

tgcatcacac cgtatgaact gacaccagga gctaccgtcc ctttcctgct tagcctaata 2220

tgctgcatca gaacagctaa agcggccaca taccaagagg ctgcgatata cctgtggaac 2280

gagcagcaac ctttgttttg gctacaagcc cttattccgc tggcagccct gattgttcta 2340

tgcaactgtc tgagactctt accatgctgc tgtaaaacgt tggctttttt agccgtaatg 2400

agcgtcggtg cccacactgt gagcgcgtac gaacacgtaa cagtgatccc gaacacggtg 2460

ggagtaccgt ataagactct agtcaataga cctggctaca gccccatggt attggagatg 2520

gaactactgt cagtcacttt ggagccaaca ctatcgcttg attacatcac gtgcgagtac 2580

aaaaccgtca tcccgtctcc gtacgtgaag tgctgcggta cagcagagtg caaggacaaa 2640

aacctacctg actacagctg tagggtcttc accggcgtct acccatttat gtggggtggc 2700

gcctactgct tctgcgacgc tgaaaacacg cagttgagcg aagcacatgt ggagaagtcc 2760

gaatcatgca aaacagaatt tgcatcagca tacagggctc ataccgcatc tgcatcagct 2820

aagctccgcg tcctttacca aggaaataac atcactgtaa ctgcctatgc aaacggcgac 2880

catgccgtca cagttaagga cgccaaattc attgtggggc caatgtcttc agcctggaca 2940

cctttcgaca acaaaattgt ggtgtacaaa ggtgacgtct ataacatgga ctacccgccc 3000

tttggcgcag gaagaccagg acaatttggc gatatccaaa gtcgcacacc tgagagtaaa 3060

gacgtctatg ctaatacaca actggtactg cagagaccgg ctgcgggtac ggtacacgtg 3120

ccatactctc aggcaccatc tggctttaag tattggctaa aagaacgcgg ggcgtcactg 3180

cagcacacag caccatttgg ctgccaaata gcaacaaacc cggtaagagc ggtgaactgc 3240

gccgtaggga acatgcccat ctccatcgac ataccggaag cggccttcac tagggtcgtc 3300

gacgcgccct ctttaacgga catgtcgtgc gaggtaccag cctgcaccca ttcctcagac 3360

tttgggggcg tcgccattat taaatatgca gccagcaaga aaggcaagtg tgcggtgcat 3420

tcgatgacta acgccgtcac tattcgggaa gctgagatag aagttgaagg gaattctcag 3480

ctgcaaatct ctttctcgac ggccttagcc agcgccgaat tccgcgtaca agtctgttct 3540

acacaagtac actgtgcagc tgagtgccac cccccgaagg accacatagt caactacccg 3600

gcgtcacata ccaccctcgg ggtccaggac atctccgcta cggcgatgtc atgggtgcag 3660

aagatcacgg gaggtgtggg actggttgtt gctgttgccg cactgattct aatcgtggtg 3720

ctatgcgtgt cgttcagcag gcactaa 3747

<210>2

<211>3750

<212>DNA

<213>屈曲病毒

<400>2

accatggagt tcatcccaac ccaaactttt tacaatagga ggtaccagcc tcgaccctgg 60

actccgcgct ctactatcca aatcatcagg cccagaccgc gccctcagag gcaagctggg 120

caacttgccc agctgatctc agcagttaat aaactgacaa tgcgcgcggt accccaacag 180

aagccacgca ggaatcggaa gaataagaag caaaagcaaa aacaacaggc gccacaaaac 240

aacacaaatc aaaagaagca gccacctaaa aagaaaccgg ctcaaaagaa aaagaagccg 300

ggccgcagag agaggatgtg catgaaaatc gaaaatgatt gtattttcga agtcaagcac 360

gaaggtaagg taacaggtta cgcgtgcctg gtgggggaca aagtaatgaa accagcacac 420

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tatgaccttg aatgcgcgca gatacccgtg cacatgaagt ccgacgcttc gaagttcacc 540

catgagaaac cggaggggta ctacaactgg caccacggag cagtacagta ctcaggaggc 600

cggttcacca tccctacagg tgctggcaaa ccaggggaca gcggcagacc tatcttcgac 660

aacaagggac gcgtggtggc catagtctta ggaggagcta atgaaggagc ccgtacagcc 720

ctctcggtgg tgacctggaa taaagacatt gtcactaaaa tcacccccga gggggccgaa 780

gagtggagtc ttgccatccc agttatgtgc ctgttggcaa acaccacgtt cccctgctcc 840

cagccccctt gcacgccctg ctgctacgaa aaggaaccgg aggaaaccct acgcatgctt 900

gaggacaacg tcatgagacc tgggtactat cagctgctac aagcatcctt aacatgttct 960

ccccaccgcc agcgacgcag caccaaggac aacttcaatg tctataaagc cacaagacca 1020

tacttagctc actgtcccga ctgtggagaa gggcactcgt gccatagtcc cgtagcacta 1080

gaacgcatca gaaatgaagc gacagacggg acgctgaaaa tccaggtctc cttgcaaatc 1140

ggaataaaga cggatgacag ccacgattgg accaagctgc gttatatgga caaccacatg 1200

ccagcagacg cagagagggc ggggctattt gtaagaacat cagcaccgtg tacgattact 1260

ggaacaatgg gacacttcat cctggcccga tgtccaaaag gggaaactct gacggtggga 1320

ttcactgaca gtaggaagat tagtcactca tgtacgcacc catttcacca cgaccctcct 1380

gtgataggtc gggaaaaatt ccattcccga ccgcagcacg gtaaagagct accttgcagc 1440

acgtacgtgc agagcaccgc cgcaactacc gaggagatag aggtacacat gcccccagac 1500

acccctgatc gcacattaat gtcacaacag tccggcaacg taaagatcac agtcaatggc 1560

cagacggtgc ggtacaagtg taattgcggt ggctcaaatg aaggactaac aactacagac 1620

aaagtgatta ataactgcaa ggttgatcaa tgtcatgccg cggtcaccaa tcacaaaaag 1680

tggcagtata actcccctct ggtcccgcgt aatgctgaac ttggggaccg aaaaggaaaa 1740

attcacatcc cgtttccgct ggcaaatgta acatgcaggg tgcctaaagc aaggaacccc 1800

accgtgacgt acgggaaaaa ccaagtcatc atgctactgt atcctgacca cccaacactc 1860

ctgtcctacc ggaatatggg agaagaacca aactatcaag aagagtgggt gatgcataag 1920

aaggaagtcg tgctaaccgt gccgactgaa gggctcgagg tcacgtgggg caacaacgag 1980

ccgtataagt attggccgca gttatctaca aacggtacag cccatggcca cccgcatgag 2040

ataattctgt attattatga gctgtacccc actatgactg tagtagttgt gtcagtggcc 2100

acgttcatac tcctgtcgat ggtgggtatg gcagcgggga tgtgcatgtg tgcacgacgc 2160

agatgcatca caccgtatga actgacacca ggagctaccg tccctttcct gcttagccta 2220

atatgctgca tcagaacagc taaagcggcc acataccaag aggctgcgat atacctgtgg 2280

aacgagcagc aacctttgtt ttggctacaa gcccttattc cgctggcagc cctgattgtt 2340

ctatgcaact gtctgagact cttaccatgc tgctgtaaaa cgttggcttt tttagccgta 2400

atgagcgtcg gtgcccacac tgtgagcgcg tacgaacacg taacagtgat cccgaacacg 2460

gtgggagtac cgtataagac tctagtcaat agacctggct acagccccat ggtattggag 2520

atggaactac tgtcagtcac tttggagcca acactatcgc ttgattacat cacgtgcgag 2580

tacaaaaccg tcatcccgtc tccgtacgtg aagtgctgcg gtacagcaga gtgcaaggac 2640

aaaaacctac ctgactacag ctgtagggtc ttcaccggcg tctacccatt tatgtggggt 2700

ggcgcctact gcttctgcga cgctgaaaac acgcagttga gcgaagcaca tgtggagaag 2760

tccgaatcat gcaaaacaga atttgcatca gcatacaggg ctcataccgc atctgcatca 2820

gctaagctcc gcgtccttta ccaaggaaat aacatcactg taactgccta tgcaaacggc 2880

gaccatgccg tcacagttaa ggacgccaaa ttcattgtgg ggccaatgtc ttcagcctgg 2940

acacctttcg acaacaaaat tgtggtgtac aaaggtgacg tctataacat ggactacccg 3000

ccctttggcg caggaagacc aggacaattt ggcgatatcc aaagtcgcac acctgagagt 3060

aaagacgtct atgctaatac acaactggta ctgcagagac cggctgcggg tacggtacac 3120

gtgccatact ctcaggcacc atctggcttt aagtattggc taaaagaacg cggggcgtca 3180

ctgcagcaca cagcaccatt tggctgccaa atagcaacaa acccggtaag agcggtgaac 3240

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gtcgacgcgc cctctttaac ggacatgtcg tgcgaggtac cagcctgcac ccattcctca 3360

gactttgggg gcgtcgccat tattaaatat gcagccagca agaaaggcaa gtgtgcggtg 3420

cattcgatga ctaacgccgt cactattcgg gaagctgaga tagaagttga agggaattct 3480

cagctgcaaa tctctttctc gacggcctta gccagcgccg aattccgcgt acaagtctgt 3540

tctacacaag tacactgtgc agctgagtgc caccccccga aggaccacat agtcaactac 3600

ccggcgtcac ataccaccct cggggtccag gacatctccg ctacggcgat gtcatgggtg 3660

cagaagatca cgggaggtgt gggactggtt gttgctgttg ccgcactgat tctaatcgtg 3720

gtgctatgcg tgtcgttcag caggcactaa 3750

<210>3

<211>3768

<212>DNA

<213>屈曲病毒

<400>3

accatggagt tcatcccaac ccaaactttt tacaatagga ggtaccagcc tcgaccctgg 60

actccgcgct ctactatcca aatcatcagg cccagaccgc gccctcagag gcaagctggg 120

caacttgccc agctgatctc agcagttaat aaactgacaa tgcgcgcggt accccaacag 180

aagccacgca ggaatcggaa gaataagaag caaaagcaaa aacaacaggc gccacaaaac 240

aacacaaatc aaaagaagca gccacctaaa aagaaaccgg ctcaaaagaa aaagaagccg 300

ggccgcagag agaggatgtg catgaaaatc gaaaatgatt gtattttcga agtcaagcac 360

gaaggtaagg taacaggtta cgcgtgcctg gtgggggaca aagtaatgaa accagcacac 420

gtaaagggga ccatcgataa cgcggacctg gccaaactgg cctttaagcg gtcatctaag 480

tatgaccttg aatgcgcgca gatacccgtg cacatgaagt ccgacgcttc gaagttcacc 540

catgagaaac cggaggggta ctacaactgg caccacggag cagtacagta ctcaggaggc 600

cggttcacca tccctacagg tgctggcaaa ccaggggaca gcggcagacc tatcttcgac 660

aacaagggac gcgtggtggc catagtctta ggaggagcta atgaaggagc ccgtacagcc 720

ctctcggtgg tgacctggaa taaagacatt gtcactaaaa tcacccccga gggggccgaa 780

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gaacgcatca gaaatgaagc gacagacggg acgctgaaaa tccaggtctc cttgcaaatc 1140

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gtgataggtc gggaaaaatt ccattcccga ccgcagcacg gtaaagagct accttgcagc 1440

acgtacgtgc agagcaccgc cgcaactacc gaggagatag aggtacacat gcccccagac 1500

acccctgatc gcacattaat gtcacaacag tccggcaacg taaagatcac agtcaatggc 1560

cagacggtgc ggtacaagtg taattgcggt ggctcaaatg aaggactaac aactacagac 1620

aaagtgatta ataactgcaa ggttgatcaa tgtcatgccg cggtcaccaa tcacaaaaag 1680

tggcagtata actcccctct ggtcccgcgt aatgctgaac ttggggaccg aaaaggaaaa 1740

attcacatcc cgtttccgct ggcaaatgta acatgcaggg tgcctaaagc aaggaacccc 1800

accgtgacgt acgggaaaaa ccaagtcatc atgctactgt atcctgacca cccaacactc 1860

ctgtcctacc ggaatatggg agaagaacca aactatcaag aagagtgggt gatgcataag 1920

aaggaagtcg tgctaaccgt gccgactgaa gggctcgagg tcacgtgggg caacaacgag 1980

ccgtataagt attggccgca gttatctaca aacggtacag cccatggcca cccgcatgag 2040

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acgttcatac tcctgtcgat ggtgggtatg gcagcgggga tgtgcatgtg tgcacgacgc 2160

agatgcatca caccgtatga actgacacca ggagctaccg tccctttcct gcttagccta 2220

atatgctgca tcagaacagc taaagcggcc acataccaag aggctgcgat atacctgtgg 2280

aacgagcagc aacctttgtt ttggctacaa gcccttattc cgctggcagc cctgattgtt 2340

ctatgcaact gtctgagact cttaccatgc tgctgtaaaa cgttggcttt tttagccgta 2400

atgagcgtcg gtgcccacac tgtgagcgcg tacgaacacg taacagtgat cccgaacacg 2460

gtgggagtac cgtataagac tctagtcaat agacctggct acagccccat ggtattggag 2520

atggaactac tgtcagtcac tttggagcca acactatcgc ttgattacat cacgtgcgag 2580

tacaaaaccg tcatcccgtc tccgtacgtg aagtgctgcg gtacagcaga gtgcaaggac 2640

aaaaacctac ctgactacag ctgtagggtc ttcaccggcg tctacccatt tatgtggggt 2700

ggcgcctact gcttctgcga cgctgaaaac acgcagttga gcgaagcaca tgtggagaag 2760

tccgaatcat gcaaaacaga atttgcatca gcatacaggg ctcataccgc atctgcatca 2820

gctaagctcc gcgtccttta ccaaggaaat aacatcactg taactgccta tgcaaacggc 2880

gaccatgccg tcacagttaa ggacgccaaa ttcattgtgg ggccaatgtc ttcagcctgg 2940

acacctttcg acaacaaaat tgtggtgtac aaaggtgacg tctataacat ggactacccg 3000

ccctttggcg caggaagacc aggacaattt ggcgatatcc aaagtcgcac acctgagagt 3060

aaagacgtct atgctaatac acaactggta ctgcagagac cggctgcggg tacggtacac 3120

gtgccatact ctcaggcacc atctggcttt aagtattggc taaaagaacg cggggcgtca 3180

ctgcagcaca cagcaccatt tggctgccaa atagcaacaa acccggtaag agcggtgaac 3240

tgcgccgtag ggaacatgcc catctccatc gacataccgg aagcggcctt cactagggtc 3300

gtcgacgcgc cctctttaac ggacatgtcg tgcgaggtac cagcctgcac ccattcctca 3360

gactttgggg gcgtcgccat tattaaatat gcagccagca agaaaggcaa gtgtgcggtg 3420

cattcgatga ctaacgccgt cactattcgg gaagctgaga tagaagttga agggaattct 3480

cagctgcaaa tctctttctc gacggcctta gccagcgccg aattccgcgt acaagtctgt 3540

tctacacaag tacactgtgc agctgagtgc caccccccga aggaccacat agtcaactac 3600

ccggcgtcac ataccaccct cggggtccag gacatctccg ctacggcgat gtcatgggtg 3660

cagaagatca cgggaggtgt gggactggtt gttgctgttg ccgcactgat tctaatcgtg 3720

gtgctatgcg tgtcgttcag caggcaccat caccatcacc atcactaa 3768

<210>4

<211>1248

<212>PRT

<213>屈曲病毒

<400>4

Met Glu Phe Ile Pro Thr Gln Thr Phe Tyr Asn Arg Arg Tyr Gln Pro

1 5 10 15

Arg Pro Trp Thr Pro Arg Ser Thr Ile Gln Ile Ile Arg Pro Arg Pro

20 25 30

Arg Pro Gln Arg Gln Ala Gly Gln Leu Ala Gln Leu Ile Ser Ala Val

35 40 45

Asn Lys Leu Thr Met Arg Ala Val Pro Gln Gln Lys Pro Arg Arg Asn

50 55 60

Arg Lys Asn Lys Lys Gln Lys Gln Lys Gln Gln Ala Pro Gln Asn Asn

65 70 75 80

Thr Asn Gln Lys Lys Gln Pro Pro Lys Lys Lys Pro Ala Gln Lys Lys

85 90 95

Lys Lys Pro Gly Arg Arg Glu Arg Met Cys Met Lys Ile Glu Asn Asp

100 105 110

Cys Ile Phe Glu Val Lys His Glu Gly Lys Val Thr Gly Tyr Ala Cys

115 120 125

Leu Val Gly Asp Lys Val Met Lys Pro Ala His Val Lys Gly Thr Ile

130 135 140

Asp Asn Ala Asp Leu Ala Lys Leu Ala Phe Lys Arg Ser Ser Lys Tyr

145 150 155 160

Asp Leu Glu Cys Ala Gln Ile Pro Val His Met Lys Ser Asp Ala Ser

165 170 175

Lys Phe Thr His Glu Lys Pro Glu Gly Tyr Tyr Asn Trp His His Gly

180 185 190

Ala Val Gln Tyr Ser Gly Gly Arg Phe Thr Ile Pro Thr Gly Ala Gly

195 200 205

Lys Pro Gly Asp Ser Gly Arg Pro Ile Phe Asp Asn Lys Gly Arg Val

210 215 220

Val Ala Ile Val Leu Gly Gly Ala Asn Glu Gly Ala Arg Thr Ala Leu

225 230 235 240

Ser Val Val Thr Trp Asn Lys Asp Ile Val Thr Lys Ile Thr Pro Glu

245 250 255

Gly Ala Glu Glu Trp Ser Leu Ala Ile Pro Val Met Cys Leu Leu Ala

260 265 270

Asn Thr Thr Phe Pro Cys Ser Gln Pro Pro Cys Thr Pro Cys Cys Tyr

275 280 285

Glu Lys Glu Pro Glu Glu Thr Leu Arg Met Leu Glu Asp Asn Val Met

290 295 300

Arg Pro Gly Tyr Tyr Gln Leu Leu Gln Ala Ser Leu Thr Cys Ser Pro

305 310 315 320

His Arg Gln Arg Arg Ser Thr Lys Asp Asn Phe Asn Val Tyr Lys Ala

325 330 335

Thr Arg Pro Tyr Leu Ala His Cys Pro Asp Cys Gly Glu Gly His Ser

340 345 350

Cys His Ser Pro Val Ala Leu Glu Arg Ile Arg Asn Glu Ala Thr Asp

355 360 365

Gly Thr Leu Lys Ile Gln Val Ser Leu Gln Ile Gly Ile Lys Thr Asp

370 375 380

Asp Ser His Asp Trp Thr Lys Leu Arg Tyr Met Asp Asn His Met Pro

385 390 395 400

Ala Asp Ala Glu Arg Ala Gly Leu Phe Val Arg Thr Ser Ala Pro Cys

405 410 415

Thr Ile Thr Gly Thr Met Gly His Phe Ile Leu Ala Arg Cys Pro Lys

420 425 430

Gly Glu Thr Leu Thr Val Gly Phe Thr Asp Ser Arg Lys Ile Ser His

435 440 445

Ser Cys Thr His Pro Phe His His Asp Pro Pro Val Ile Gly Arg Glu

450 455 460

Lys Phe His Ser Arg Pro Gln His Gly Lys Glu Leu Pro Cys Ser Thr

465 470 475 480

Tyr Val Gln Ser Thr Ala Ala Thr Thr Glu Glu Ile Glu Val His Met

485 490 495

Pro Pro Asp Thr Pro Asp Arg Thr Leu Met Ser Gln Gln Ser Gly Asn

500 505 510

Val Lys Ile Thr Val Asn Gly Gln Thr Val Arg Tyr Lys Cys Asn Cys

515 520 525

Gly Gly Ser Asn Glu Gly Leu Thr Thr Thr Asp Lys Val Ile Asn Asn

530 535 540

Cys Lys Val Asp Gln Cys His Ala Ala Val Thr Asn His Lys Lys Trp

545 550 555 560

Gln Tyr Asn Ser Pro Leu Val Pro Arg Asn Ala Glu Leu Gly Asp Arg

565 570 575

Lys Gly Lys Ile His Ile Pro Phe Pro Leu Ala Asn Val Thr Cys Arg

580 585 590

Val Pro Lys Ala Arg Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Lys Asn Gln Val

595 600 605

Ile Met Leu Leu Tyr Pro Asp His Pro Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Asn

610 615 620

Met Gly Glu Glu Pro Asn Tyr Gln Glu Glu Trp Val Met His Lys Lys

625 630 635 640

Glu Val Val Leu Thr Val Pro Thr Glu Gly Leu Glu Val Thr Trp Gly

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Asn Asn Glu Pro Tyr Lys Tyr Trp Pro Gln Leu Ser Thr Asn Gly Thr

660 665 670

Ala His Gly His Pro His Glu Ile Ile Leu Tyr Tyr Tyr Glu Leu Tyr

675 680 685

Pro Thr Met Thr Val Val Val Val Ser Val Ala Thr Phe Ile Leu Leu

690 695 700

Ser Met Val Gly Met Ala Ala Gly Met Cys Met Cys Ala Arg Arg Arg

705 710 715 720

Cys Ile Thr Pro Tyr Glu Leu Thr Pro Gly Ala Thr Val Pro Phe Leu

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Leu Ser Leu Ile Cys Cys Ile Arg Thr Ala Lys Ala Ala Thr Tyr Gln

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Tyr Ser Pro Met Val Leu Glu Met Glu Leu Leu Ser Val Thr Leu Glu

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Pro Ser Pro Tyr Val Lys Cys Cys Gly Thr Ala Glu Cys Lys Asp Lys

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Asn Leu Pro Asp Tyr Ser Cys Arg Val Phe Thr Gly Val Tyr Pro Phe

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Ser Glu Ala His Val Glu Lys Ser Glu Ser Cys Lys Thr Glu Phe Ala

915 920 925

Ser Ala Tyr Arg Ala His Thr Ala Ser Ala Ser Ala Lys Leu Arg Val

930 935 940

Leu Tyr Gln Gly Asn Asn Ile Thr Val Thr Ala Tyr Ala Asn Gly Asp

945 950 955 960

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Asn Met Pro Ile Ser Ile Asp Ile Pro Glu Ala Ala Phe Thr Arg

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Tyr Ala Ala Ser Lys Lys Gly Lys Cys Ala Val His Ser Met Thr

1130 1135 1140

Asn Ala Val Thr Ile Arg Glu Ala Glu Ile Glu Val Glu Gly Asn

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Ser Gln Leu Gln Ile Ser Phe Ser Thr Ala Leu Ala Ser Ala Glu

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Phe Arg Val Gln Val Cys Ser Thr Gln Val His Cys Ala Ala Glu

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Cys His Pro Pro Lys Asp His Ile Val Asn Tyr Pro Ala Ser His

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1205 1210 1215

Val Gln Lys Ile Thr Gly Gly Val Gly Leu Val Val Ala Val Ala

1220 1225 1230

Ala Leu Ile Leu Ile Val Val Leu Cys Val Ser Phe Ser Arg His

1235 1240 1245

<210>5

<211>1254

<212>PRT

<213>屈曲病毒

<400>5

Met Glu Phe Ile Pro Thr Gln Thr Phe Tyr Asn Arg Arg Tyr Gln Pro

1 5 10 15

Arg Pro Trp Thr Pro Arg Ser Thr Ile Gln Ile Ile Arg Pro Arg Pro

20 25 30

Arg Pro Gln Arg Gln Ala Gly Gln Leu Ala Gln Leu Ile Ser Ala Val

35 40 45

Asn Lys Leu Thr Met Arg Ala Val Pro Gln Gln Lys Pro Arg Arg Asn

50 55 60

Arg Lys Asn Lys Lys Gln Lys Gln Lys Gln Gln Ala Pro Gln Asn Asn

65 70 75 80

Thr Asn Gln Lys Lys Gln Pro Pro Lys Lys Lys Pro Ala Gln Lys Lys

85 90 95

Lys Lys Pro Gly Arg Arg Glu Arg Met Cys Met Lys Ile Glu Asn Asp

100 105 110

Cys Ile Phe Glu Val Lys His Glu Gly Lys Val Thr Gly Tyr Ala Cys

115 120 125

Leu Val Gly Asp Lys Val Met Lys Pro Ala His Val Lys Gly Thr Ile

130 135 140

Asp Asn Ala Asp Leu Ala Lys Leu Ala Phe Lys Arg Ser Ser Lys Tyr

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Asp Leu Glu Cys Ala Gln Ile Pro Val His Met Lys Ser Asp Ala Ser

165 170 175

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180 185 190

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Ser Val Val Thr Trp Asn Lys Asp Ile Val Thr Lys Ile Thr Pro Glu

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405 410 415

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645 650 655

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675 680 685

Pro Thr Met Thr Val Val Val Val Ser Val Ala Thr Phe Ile Leu Leu

690 695 700

Ser Met Val Gly Met Ala Ala Gly Met Cys Met Cys Ala Arg Arg Arg

705 710 715 720

Cys Ile Thr Pro Tyr Glu Leu Thr Pro Gly Ala Thr Val Pro Phe Leu

725 730 735

Leu Ser Leu Ile Cys Cys Ile Arg Thr Ala Lys Ala Ala Thr Tyr Gln

740 745 750

Glu Ala Ala Ile Tyr Leu Trp Asn Glu Gln Gln Pro Leu Phe Trp Leu

755 760 765

Gln Ala Leu Ile Pro Leu Ala Ala Leu Ile Val Leu Cys Asn Cys Leu

770 775 780

Arg Leu Leu Pro Cys Cys Cys Lys Thr Leu Ala Phe Leu Ala Val Met

785 790 795 800

Ser Val Gly Ala His Thr Val Ser Ala Tyr Glu His Val Thr Val Ile

805 810 815

Pro Asn Thr Val Gly Val Pro Tyr Lys Thr Leu Val Asn Arg Pro Gly

820 825 830

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835 840 845

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Pro Ser Pro Tyr Val Lys Cys Cys Gly Thr Ala Glu Cys Lys Asp Lys

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885 890 895

Met Trp Gly Gly Ala Tyr Cys Phe Cys Asp Ala Glu Asn Thr Gln Leu

900 905 910

Ser Glu Ala His Val Glu Lys Ser Glu Ser Cys Lys Thr Glu Phe Ala

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Phe Arg Val Gln Val Cys Ser Thr Gln Val His Cys Ala Ala Glu

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Cys His Pro Pro Lys Asp His Ile Val Asn Tyr Pro Ala Ser His

1190 1195 1200

Thr Thr Leu Gly Val Gln Asp Ile Ser Ala Thr Ala Met Ser Trp

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Val Gln Lys Ile Thr Gly Gly Val Gly Leu Val Val Ala Val Ala

1220 1225 1230

Ala Leu Ile Leu Ile Val Val Leu Cys Val Ser Phe Ser Arg His

1235 1240 1245

His His His His His His

1250

<210>6

<211>267

<212>PRT

<213>屈曲病毒

<400>6

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260 265

<210>7

<211>71

<212>PRT

<213>屈曲病毒

<400>7

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<210>8

<211>430

<212>PRT

<213>屈曲病毒

<400>8

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1 5 10 15

Leu Ala His Cys Pro Asp Cys Gly Glu Gly His Ser Cys His Ser Pro

20 25 30

Val Ala Leu Glu Arg Ile Arg Asn Glu Ala Thr Asp Gly Thr Leu Lys

35 40 45

Ile Gln Val Ser Leu Gln Ile Gly Ile Lys Thr Asp Asp Ser His Asp

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Arg Ala Gly Leu Phe Val Arg Thr Ser Ala Pro Cys Thr Ile Thr Gly

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210 215 220

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225 230 235 240

Pro Leu Val Pro Arg Asn Ala Glu Leu Gly Asp Arg Lys Gly Lys Ile

245 250 255

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260 265 270

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325 330 335

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405 410 415

Cys Cys Ile Arg Thr Ala Lys Ala His His His His His His

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<210>9

<211>68

<212>PRT

<213>屈曲病毒

<400>9

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1 5 10 15

Pro Leu Phe Trp Leu Gln Ala Leu Ile Pro Leu Ala Ala Leu Ile Val

20 25 30

Leu Cys Asn Cys Leu Arg Leu Leu Pro Cys Cys Cys Lys Thr Leu Ala

35 40 45

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50 55 60

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65

<210>10

<211>446

<212>PRT

<213>屈曲病毒

<400>10

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1 5 10 15

Lys Thr Leu Val Asn Arg Pro Gly Tyr Ser Pro Met Val Leu Glu Met

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Glu Leu Leu Ser Val Thr Leu Glu Pro Thr Leu Ser Leu Asp Tyr Ile

35 40 45

Thr Cys Glu Tyr Lys Thr Val Ile Pro Ser Pro Tyr Val Lys Cys Cys

50 55 60

Gly Thr Ala Glu Cys Lys Asp Lys Asn Leu Pro Asp Tyr Ser Cys Arg

65 70 75 80

Val Phe Thr Gly Val Tyr Pro Phe Met Trp Gly Gly Ala Tyr Cys Phe

85 90 95

Cys Asp Ala Glu Asn Thr Gln Leu Ser Glu Ala His Val Glu Lys Ser

100 105 110

Glu Ser Cys Lys Thr Glu Phe Ala Ser Ala Tyr Arg Ala His Thr Ala

115 120 125

Ser Ala Ser Ala Lys Leu Arg Val Leu Tyr Gln Gly Asn Asn Ile Thr

130 135 140

Val Thr Ala Tyr Ala Asn Gly Asp His Ala Val Thr Val Lys Asp Ala

145 150 155 160

Lys Phe Ile Val Gly Pro Met Ser Ser Ala Trp Thr Pro Phe Asp Asn

165 170 175

Lys Ile Val Val Tyr Lys Gly Asp Val Tyr Asn Met Asp Tyr Pro Pro

180 185 190

Phe Gly Ala Gly Arg Pro Gly Gln Phe Gly Asp Ile Gln Ser Arg Thr

195 200 205

Pro Glu Ser Lys Asp Val Tyr Ala Asn Thr Gln Leu Val Leu Gln Arg

210 215 220

Pro Ala Ala Gly Thr Val His Val Pro Tyr Ser Gln Ala Pro Ser Gly

225 230 235 240

Phe Lys Tyr Trp Leu Lys Glu Arg Gly Ala Ser Leu Gln His Thr Ala

245 250 255

Pro Phe Gly Cys Gln Ile Ala Thr Asn Pro Val Arg Ala Val Asn Cys

260 265 270

Ala Val Gly Asn Met Pro Ile Ser Ile Asp Ile Pro Glu Ala Ala Phe

275 280 285

Thr Arg Val Val Asp Ala Pro Ser Leu Thr Asp Met Ser Cys Glu Val

290 295 300

Pro Ala Cys Thr His Ser Ser Asp Phe Gly Gly Val Ala Ile Ile Lys

305 310 315 320

Tyr Ala Ala Ser Lys Lys Gly Lys Cys Ala Val His Ser Met Thr Asn

325 330 335

Ala Val Thr Ile Arg Glu Ala Glu Ile Glu Val Glu Gly Asn Ser Gln

340 345 350

Leu Gln Ile Ser Phe Ser Thr Ala Leu Ala Ser Ala Glu Phe Arg Val

355 360 365

Gln Val Cys Ser Thr Gln Val His Cys Ala Ala Glu Cys His Pro Pro

370 375 380

Lys Asp His Ile Val Asn Tyr Pro Ala Ser His Thr Thr Leu Gly Val

385 390 395 400

Gln Asp Ile Ser Ala Thr Ala Met Ser Trp Val Gln Lys Ile Thr Gly

405 410 415

Gly Val Gly Leu Val Val Ala Val Ala Ala Leu Ile Leu Ile Val Val

420 425 430

Leu Cys Val Ser Phe Ser Arg His His His His His His His

435 440 445

Claims

1.一种能够在人和其它哺乳动物宿主中诱发抗屈曲病毒感染的保护性免疫反应的疫苗制剂，其中屈曲病毒免疫原是灭活的屈曲病毒隔离群CHK／03／06的病毒颗粒，所述屈曲病毒隔离群CHK／03／06的结构多聚蛋白序列由SED ID NO.4表示。

2.根据权利要求1的疫苗制剂，其中所述制剂中的所述病毒免疫原是纯化并灭活的屈曲病毒。

3.根据权利要求2的疫苗制剂，其中所述制剂中的所述病毒免疫原是纯化并热灭活的屈曲病毒。

4.根据权利要求2的疫苗制剂，其中所述病毒免疫原用化学方法灭活。

5.根据权利要求4的疫苗制剂，其中病毒灭活试剂是下列的一种：

i)β-丙内酯(BPL)，使用浓度范围为0.001％-0.4％v／v，或在BPL：病毒为1∶500-1∶3000稀释度下使用；

ii)福尔马林(甲醛)，使用浓度范围为0.01％-0.5％，在37℃下使用2小时，之后在4℃孵育48-96小时的时段；

iii)其它灭活试剂，所述其他灭活试剂为离子型洗涤剂、非离子型洗涤剂、抗坏血酸和戊二醛。

6.根据权利要求5的疫苗制剂，其中BPL灭活在下列温度和时段之一进行：

i)在37℃2小时，然后在4℃孵育48-200小时；

ii)在22℃48小时-96小时。

7.根据权利要求1的疫苗制剂，其中所述基因型CHK／03／06的屈曲病毒免疫原的结构多聚蛋白序列由SEQ ID No.4表示。

8.一种液体疫苗制剂，包括：

i)纯化并灭活的屈曲病毒隔离群CHK／03／06作为抗原，所述屈曲病毒隔离群CHK/03／06的结构多聚蛋白序列由SED ID NO.4表示，

ii)pH6.9-7.2的40mM磷酸盐缓冲液，或pH6.8-7.2的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，

iii)在0.1％-5％范围的糖的一种或组合，其中糖选自列表，该列表包括：乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖，

iv)154mM NaCl，

v)以0.1％-5％浓度使用的人血清清蛋白，

vi)氢氧化铝或磷酸铝。

9.根据权利要求8的疫苗制剂，其中所述病毒抗原每剂接种使用的范围为1μg-200μg。

10.一种冻干疫苗制剂，包括：

i)纯化并灭活的屈曲病毒隔离群CHK／03／06作为抗原，所述屈曲病毒隔离群CHK／03／06的结构多聚蛋白序列由SED ID NO.4表示，

ii)磷酸盐缓冲液或磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，

iii)浓度在0.1％-50％范围的糖，其中糖选自列表，该列表包括：乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖和／或其组合，

iv)154mM NaCl，

v)以0.1％-5％浓度使用的人血清清蛋白。

11.根据权利要求10的疫苗制剂，其中所述病毒抗原每剂接种使用的范围为1μg-200μg。

12.核苷酸序列SEDIDNo.1、核苷酸序列SED ID No.2和SED ID No.3，其中所述核苷酸序列SED ID No.2和SED ID No.3已被修改以包含Kozak’s共有序列来增强真核表达。

13.重组DNA构建体，包括(i)载体和(ii)编码诸如SED ID No.4和SED ID No.5的任一蛋白质的氨基酸序列的核酸序列中的一个。

14.根据权利要求13所述的重组DNA构建体，其中所述核酸序列是SED ID No.1。

15.根据权利要求13所述的重组DNA构建体，其中所述核酸序列是SED ID No.2或SED ID No.3。

16.根据权利要求13的重组DNA构建体，所述核酸序列是SED ID No.1，其中所述载体是原核质粒表达载体，其在原核表达系统中转化／增殖。

17.根据权利要求16的重组DNA构建体，其中所述原核表达系统是大肠杆菌DH5a。

18.根据权利要求13的重组DNA构建体，其用于将由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2编码的SED ID No.4和由SEQ ID NO.3编码的SED IDNo.5表达成病毒样颗粒(VLPs)，其中所述载体是真核质粒表达载体，其在真核宿主和杆状病毒中被克隆以在昆虫细胞中表达，所述真核宿主是酵母。

19.根据权利要求13的重组DNA构建体在制备用于诊断屈曲病毒感染的免疫治疗试剂中的用途。