CN101508976B - 一种制备单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆用培养基及制备方法 - Google Patents
一种制备单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆用培养基及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种制备单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆用培养基及其制备方法，按常规方法配制RPMI 1640完全培养基，然后分别与一定比例的BHK-21、CRFK、Hela等细胞的无细胞培养上清混合，完全培养基与每种细胞上清的体积比为(7～1)∶1。本发明的优点在于：使用本发明所提供的杂交瘤细胞克隆用培养基，可完全省略在常规杂交瘤细胞克隆过程中以BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞的环节，大大简化了克隆操作，并使被克隆细胞的生长速度明显提高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是提供了一种制备单克隆抗体的交瘤细胞克隆用培养基及制备方法。
背景技术
单克隆抗体以其高度的特异性和灵敏度，在免疫学检测、目的蛋白的亲和纯化和肿瘤治疗领域得到广泛应用。目前在单克隆抗体制备过程中，对阳性杂交瘤细胞孔应用1640完全培养基并采用有限稀释法进行克隆，此条件下克隆细胞生长缓慢。为促进单个细胞的快速增殖，通常在克隆前首先制备正常BALB/c的腹腔巨噬细胞悬液，然后以2×104～2×105细胞/孔加到待克隆板中。该过程需要在细胞克隆前制备，不同操作者制备的腹腔巨噬细胞数量差异较大，并且受动物个体差异影响，不利于克隆过程的标准化，同时还增加了污染的几率。
发明内容
本发明提供了一种制备单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆用培养基，克服了常规杂交瘤细胞克隆过程中制备腹腔巨噬细胞的繁琐过程。
本发明还提供了一种制备单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆用培养基的制备方法，适用于单克隆抗体的生产。
本发明制备的单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆用培养基，主要由以下原料按体积份数比组成：
1640完全培养基7～1份，传代细胞上清1份；
所述的传代细胞上清为细胞对数生长前期的培养液，通过离心获得无细胞上清液。传代细胞选自：BHK-21、CRFK、Hela传代细胞系中的一种。
本发明培养基的制备工艺包括以下步骤：
1)1640无血清培养基的配制
将RPMI 1640、Hepes、NaHCO3用去离子水溶解，调pH值至7.0后定容到1000毫升，0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装；
2)双抗的配制
配制含青霉素100万单位、链霉素100万单位的双抗溶液；
3)1640完全培养基的配制
取79毫升步骤1的1640无血清培养基，加入胎牛血清20毫升、双抗溶液1毫升；
4)传代细胞培养基的配制
取89毫升步骤1的1640无血清培养基，加入胎牛血清10毫升、双抗溶液1毫升；
5)传代细胞的培养及上清的收集
传代细胞上清为细胞对数生长前期的培养液，通过离心获得无细胞上清液，传代细胞选自：BHK-21、CRFK、Hela传代细胞系中的一种；
6)制备单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆用培养基
将步骤3制备的1640完全培养基与步骤5的传代细胞上清按体积比(7～1)∶1混合，并将混合培养基的pH值调到7.2，即获得本发明的制备单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆用培养基，分别命名为BHK-1640、CRFK-1640、Hela-1640。
试验例
应用本发明所制备的培养基分别对SP2/0细胞和抗狂犬病病毒单克隆抗体分泌细胞进行克隆，并与常规克隆方法进行比较。
操作步骤如下：
1.BALB/c腹腔巨噬细胞悬液的制备：摘除健康BALB/c小鼠一侧眼球，待血液将流尽的濒死期拉颈处死，浸泡于75％的无水乙醇溶液中15min，然后在超净工作台中按常规方法制备用完全1640培养基稀释的腹腔巨噬细胞悬液，并以2×105/ml的密度加入到96孔培养板中，每孔100μl。
2.本发明的培养基加到细胞培养板：将BHK21、CRFK、Hela等细胞的无细胞培养上清与完全1640培养基(按体积比)1∶3混合所制备的杂交瘤细胞克隆用培养基，以每孔100μl的量加到96孔培养板中，每种培养基设32个重复孔。
3.将处于对数生长期的SP2/0细胞和抗狂犬病病毒单克隆抗体分泌细胞分别用1640完全培养基和不同的杂交瘤细胞克隆培养物稀释到10个/ml，然后分别加入到含相同培养基的培养板中，每孔100μl，置37℃ 5％ CO2条件下培养。分别于第6天和第9天时每孔更换100μl相同培养基，到第12天时检测克隆大小和分泌抗狂犬病病毒单克隆抗体的克隆细胞孔上清的效价。以相同培养条件下有克隆细胞生长孔细胞集落直径(平均数±标准差)和抗体效价(OD450)作为判断依据。
表1.本发明与现有培养基的比较
如表1所见，当克隆细胞生长到第12天时，无论是SP2/0还是分泌单克隆抗体的细胞，用3种不同的杂交瘤细胞克隆用培养基所形成的细胞集落直径不仅大于常规培养基所形成的集落直径，而且上清中所分泌的抗体效价也高于常规培养基所分泌的效价。进一步比较还发现，3种杂交瘤细胞克隆用培养基中以含BHK21-1640培养基在细胞集落直径和抗体效价方面均优于CRFK-1640和Hela-1640培养基。
本发明的积极效果在于：提供了一种可简化杂交瘤细胞克隆过程的培养基及其配置方法，通过SP2/0细胞和分泌抗狂犬病病毒的杂交瘤细胞的克隆试验表明，本发明所提供的培养基可完全代替现有培养基。当用有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆，不仅省去了常规杂交瘤细胞克隆过程中制备腹腔巨噬细胞的繁琐过程，而且使克隆生长速度及所分泌的抗体效价也得到明显提高。
本发明的另一个优点在于极大地消除了因小鼠个体和人为因素对克隆过程所产生的影响，有利于克隆过程的标准化，而且操作简便，因此具有潜在的商业化前景。
具体实施方式
为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。
实施例1
杂交瘤细胞克隆用培养基的制备工艺，包括以下步骤：
1)1640无血清培养基的配制
将RPMI 1640(干粉)(GIBCO公司生产)10.4克、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，上海生工，分析纯)3.574克、NaHCO3(北京化工厂，分析纯)2克用去离子水900毫升，调pH值至7.0后定容到1000毫升，0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装待用；
2)100倍浓缩双抗的配制
将青霉素100万单位、链霉素100万单位依次溶于100ml去离子水中，用0.22μm滤膜过滤除菌，制成双抗溶液，分装小瓶后置-20℃保存待用；
3)1640完全培养基的配制
取79毫升步骤1制备的1640无血清培养基，加入胎牛血清(GIBCO公司生产)20毫升、双抗1毫升待用；
4)传代细胞培养基的配制
取89毫升步骤1制备的1640无血清培养基，依次加入胎牛血清10毫升、双抗1毫升待用；
5)单层细胞消化液(10×贮存液)配置
取牛胰蛋白酶2.5克、氯化钠40克、氯化钾2.0克、葡萄糖5.0克、NaHCO32.9克、EDTA 1.0克，依次溶于450毫升三馏水中，待胰酶完全溶解后，加入1％酚红，并加三馏水至500毫升，0.22μm滤膜过滤后除菌，-20℃保存待用；
6)传代细胞的培养及上清的收集
(1)BHK-21细胞的培养和上清的收集
从液氮罐中取出BHK-21细胞冷冻管，立即投入37℃水浴中快速解冻，轻摇冷存管使其在1分钟内全部融化。200g/min离心5分钟，在超净工作台内无菌吸弃上清，用适量传代细胞培养液悬浮后，接种于细胞培养瓶中，置37℃恒温培养箱中培养。
约48hr后，当细胞分裂增殖已布满培养瓶底部时，倒出培养瓶内陈旧培养液，每次用1倍的单层细胞消化液2ml浸洗细胞2次，最后加入0.5ml单层细胞消化液平铺培养瓶底部，静置2-5分钟后观察。当细胞间隙变大，此时轻轻拍动瓶身使细胞脱落，然后加入传代细胞培养液，调节细胞密度到5×105/ml，分瓶培养。24h后无菌收集细胞上清，800g离心10min，同时在原培养瓶中加入相同体积的新鲜传代细胞培养液，收集培养12h的上清，同上离心后，将二次收集的上清合并，将胎牛血清浓度调整为20％，-20℃冻存备用。
(2)CRFK细胞的培养及上清的收集
从液氮中取出CRFK细胞冷冻管，立即放入37℃水浴中快速解冻，然后200g/min离心5分钟，无菌吸弃上清，用传代细胞培养基稀释后接种于细胞培养瓶中，在37℃恒温培养箱中培养。
当细胞分裂增殖已布满培养瓶底部时，倒出培养瓶内陈旧培养液，用单层细胞消化液分散，然后用新鲜传代细胞培养基调整细胞密度为5×105/ml后分瓶培养。24h后无菌收集细胞上清，800g离心10min，同时在原培养瓶中加入相同体积的新鲜传代细胞培养基，再次收集培养12h的上清，同上离心后，将二次收集的上清合并，将血清浓度调整为20％，-20℃冻存备用。
(3)Hela的培养及上清的收集
从液氮罐中取出Hela细胞冷冻管，立即放入37℃水浴中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化。200g/min离心5分钟，在超净工作台内无菌吸弃上清，用适量传代细胞培养液悬浮后，接种于细胞培养瓶中，置37℃恒温培养箱中培养。
约48hr后，当细胞分裂增殖已布满培养瓶底部时，倒出培养瓶内陈旧培养液，每次用3ml 1倍的单层细胞消化液浸洗细胞3次，最后加入0.5ml单层细胞消化液平铺培养瓶底部，静置2-5分钟后观察。当细胞间隙变大，此时轻轻拍动瓶身使细胞脱落后，用传代细胞培养基调节细胞密度至5×105/ml后分瓶培养。24h后无菌收集细胞上清，800g离心10min，同时在原培养瓶中加入相同体积的新鲜传代细胞培养基，再次收集培养12h的上清，同上离心后，将二次收集的上清合并，将血清浓度调整为20％，-20℃冻存备用。
7)制备单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆用培养基
将1640完全培养基与步骤6制备的传代细胞上清按体积比(7～1)∶1的比例混合，并将混合培养基的pH值调到7.2，即获得本发明的制备单克隆抗体的不同杂交瘤细胞克隆用培养基。分别根据所加入上清的来源命名为BHK-1640、CRFK-1640、Hela-1640。
实施例2
含不同比例传代细胞上清的杂交瘤细胞克隆用培养基与常规培养基的比较
1.同试验例步骤1制备BALB/c腹腔巨噬细胞悬液并加到96孔板中。
2.不同比例的杂交瘤细胞克隆用培养基的配置并加到96孔板中将按实施例步骤7所配置的培养基，以每孔100μl的量加到96孔培养板中，每种培养基设32个重复孔。
3.应用实施例步骤7所配置的培养基，将处于对数生长期的SP2/0细胞稀释到10个/ml，然后分别加入到含相同培养基的培养板中，每孔100μl，置37℃5％CO2条件下培养。分别于第6天和第9天时每孔更换100μl相同培养基，到第12天时比较不同培养基条件下所形成的细胞集落直径。
如表2所见，不同培养基克隆的SP2/0细胞，生长到第12天时，传代细胞上清和1640完全培养基的混合比例为1∶(1～7)时，所形成的细胞集落直径均明显大于常规培养基所形成的集落直径。进一步比较还发现，当传代细胞上清和1640完全培养基按1∶(3～5)混合时，细胞所形成的集落直径大于其他比例时的集落直径。当混合比例相同时，含BHK21细胞上清的杂交瘤细胞克隆培养基所形成的集落直径最大。
表2.不同培养基条件下SP2/0细胞所形成的集落直径
Claims (1)
1.一种制备单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆用培养基，主要由以下原料按体积份数比组成的：
1640完全培养基7～1份，传代细胞上清1份；
所述的传代细胞上清为细胞对数生长前期的无细胞上清液，传代细胞选自：
BHK-21、CRFK、Hela传代细胞系中的一种；
所述制备单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆用培养基的制备过程包括以下步骤：
1)1640无血清培养基的配制
将RPMI 1640、Hepes、NaHCO3用去离子水溶解，调pH值至7.0，除菌后分装；
2)双抗的配制
将青霉素100万单位、链霉素100万单位依次溶于100ml去离子水中，用0.22μm滤膜过滤除菌，制成双抗溶液，分装小瓶后置-20℃保存待用；
3)1640完全培养基的配制
取79毫升步骤1)的1640无血清培养基，加入胎牛血清20毫升、双抗溶液1毫升；
4)传代细胞培养基的配制
取89毫升步骤1)的1640无血清培养基，加入胎牛血清10毫升、双抗溶液1毫升；
5)传代细胞上清的收集
传代细胞上清为细胞对数生长前期的培养液，通过离心获得无细胞上清液，传代细胞选自：BHK-21、CRFK、Hela传代细胞系中的一种；
6)制备单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆用培养基
将步骤3)制备1640完全培养基与步骤5的传代细胞上清按体积比(7～1)∶1的比例混合，并将混合培养液的pH值调到7.2，即获得培养基。
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