CN101506378A - 在油包水乳液中的微粒上的单分子pcr - Google Patents
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Abstract
用于在珠子上扩增DNA的微乳液的油相粘度的调节增加了产物珠的同质性以及每个珠子扩增DNA的数量。此外,可以平行形成的分离的微乳液群的数量使用多孔板和被设计用于溶解生物样品的搅拌磨粉碎机得以增加。
Description
【01】本申请要求于2006年6月19日提交的美国临时申请系列第60/814,585号的权益,在此明确并入其全部公开内容。
【02】由于来自包括CA43460、CA57345和CA62924在内的NIH的基金,美国政府保留本发明的一些权利。
技术领域
【03】本发明涉及DNA分析领域。具体地,它涉及单种类DNA分子的扩增和分离。
背景技术
【04】在20世纪做出的最重要生物技术进步包括将单DNA分子转化成相同DNA分子群的方法。为了这个目的,第一次技术浪潮应用细胞(克隆),第二次浪潮应用PCR。在发源于单个分子的群通过克隆过程被内在地分离方面,克隆是有益的。相反,如果产物要保持分离的话,基于PCR的方法对于每个模板而言需要单独的区室(试管)。乳液PCR通过使区室微型化克服了这种缺点,因此,百万计的模板可以在单个试管中被单独地扩增。
【05】一旦乳液被破坏,通过将在每个区室内形成的产物保持在一起,BEAMing(珠子、乳液、扩增和磁学)在乳液PCR上建立。这通过下列过程完成:(i)将珠子引入区室内,以及(ii)确保一个PCR产物链与珠子结合。在扩增之后,每个珠子被涂敷存在于区室内的数千拷贝的单DNA分子,该区室包含珠子且这些珠子可以容易地用磁铁或通过离心作用被回收。
【06】通过BEAMing得到的珠子精确地反映了存在于模板群内的DNA多样性,并且可以被用于决定哪部分的DNA种群包含特定的突变。因为每个珠子包含数以千计的同一序列的分子,因此用杂交或酶试验得到的信噪比极高。使用传统的流式细胞术或光学扫描仪器可以在几分钟内分析数以百万计的珠子。与珠子结合的DNA也提供优良的模板,用于高通量测序。
【07】本领域内对提高DNA扩增的通量以改进DNA分析和遗传诊断存在持续的需求。
发明内容
【08】根据本发明的一个实施方式,提供了分析核苷酸序列变异的方法。形成包括油相和水相的微乳液。该水相包括一种或多种分析物DNA分子。10-30%(v/v)的微乳液是水相以及70-90%(v/v)的微乳液是油相。油相包括:数量为油相的60-85%(v/v)的一种或多种低粘度烃,其具有在25℃下为20mPas以下的粘度;数量为10-30%(v/v)的一种或多种高粘度烃,其具有在25℃下为20mPas以上的粘度;以及数量为5-10%(v/v)的乳化剂。在试剂珠存在下微乳液中的分析物DNA分子被扩增。该试剂珠与用于扩增分析物DNA分子的引物的多个分子结合。形成与一种分析物DNA分子的多个拷贝结合的产物珠。将该产物珠与未被结合到产物珠的分析物DNA分子分离。测定与产物珠结合的所述一种分析物DNA分子的序列特征。
【09】本发明提供了液体组合物。其包括形成含水区室的多种微乳液,其中至少一部分所述含水区室包括珠子、多核苷酸模板和用于扩增所述模板的寡核苷酸引物。至少一部分寡核苷酸引物与珠子结合。微乳液包括油相和水相。10-30%(v/v)的微乳液是水相以及70-90%(v/v)的微乳液是油相。油相包括:数量为油相的60-85%(v/v)的一种或多种低粘度烃,其具有在25℃下为20mPas以下的粘度;数量为10-30%(v/v)的一种或多种高粘度烃,其具有在25℃下为20mPas以上的粘度;以及数量为5-10%(v/v)的乳化剂。
【10】本发明的另一个实施方式是分离核苷酸序列变体的方法。形成了包括油相和水相的微乳液。水相包括一种或多种分析物DNA分子。10-30%(v/v)的微乳液是水相以及70-90%(v/v)的微乳液是油相。油相包括:数量为油相的60-85%(v/v)的一种或多种低粘度烃,其具有在25℃下为20mPas以下的粘度;数量为10-30%(v/v)的一种或多种高粘度烃,其具有在25℃下为20mPas以上的粘度;以及数量为5-10%(v/v)的乳化剂。在试剂珠存在下微乳液中的分析物DNA分子被扩增。该试剂珠与用于扩增分析物DNA分子的引物的多个分子结合。形成结合于一种分析物DNA分子的多个拷贝的产物珠。将该产物珠与未与产物珠结合的分析物DNA分子分离。使结合于第一种分析物DNA分子的多个拷贝的产物珠与结合于第二种分析物DNA分子的多个拷贝的产物珠分离。
【11】本发明的另一方面是用于分析核苷酸序列变异的方法的改进,其中,形成了包含一种或多种分析物DNA分子的微乳液,在试剂珠存在下微乳液中的分析物DNA分子被扩增,其中试剂珠与用于扩增分析物DNA分子的引物的多个分子结合,形成结合于一种分析物DNA分子的多个拷贝的产物珠,该产物珠与未被结合到产物珠的分析物DNA分子分离,并测定与产物珠结合的所述一种分析物DNA分子的序列特征。该改进是使用组织搅拌磨粉碎机和每孔中的金属球,在多孔板内同时形成多个分离的微乳液群。
【12】这些和其它实施方式——在阅读完本说明书之后其对于本领域的技术人员来说是显而易见的——为本领域提供了更有效地分析DNA变异的工具。
附图说明
【13】图1图解了BEAMing过程。方案中步骤的提及与每个关键步骤一起被表示。
【14】图2显示了沉淀在48-孔组织培养板孔中的400×乳液的相差显微图。作为参考,珠子(箭头)直径为1.05微米。
【15】图3显示了利用流式细胞术进行的珠群分析。在图3A中被圈起来的群(单珠子)在图3B中显示,代表用序列特异性FITC信号标记的珠子。
具体实施方式
【16】本发明者开发了改进用于实践BEAMing的先前方法的方法。下面描述的方法提供了更均匀的珠群,其在周期结束时,在每个珠子上具有更高数量的DNA。而且,使用组织研磨仪和金属珠平行地制造大量微乳液将通量从单或双平行样品大量增加到数以百计的平行样品。
【17】在微乳液中的水相典型占微乳液的至少10、15、20或25%(v/v)以及可达30%(v/v)。油相典型地占微乳液的至少70、75、80或85以及可达90%(v/v)。乳化剂尽管是两性的,但被认为是油相的一部分。其被认为在乳液形成时排列在两相的界面处。形成油相的烃通常是油或蜡。这些以其如下显示的粘度为特征:
非常低 在25℃,<5mPas
低 在25℃,5-10mPas
中等 在25℃,10-20mPas
高 在25℃,20-50mPas
非常高 在25℃,>50mPas
【18】较低粘度的油(被定义为非常低、低和/或中等)比高粘度的油更容易起作用。低粘度的油可以具有在25℃为10mPas以下或5mpa以下的粘度。但是,少量更高粘度的油混合到油相中,在产物珠中提供增加的均匀性和更高的扩增水平。在25℃时,高粘度油可以在10-30、20-25或22-26mPas的范围内。大多数油相可以是非常低、低、中等,或这类油或蜡的混合物。较低粘度油与高粘度油的比例可以从85:10变化到60:30。至少60、65、70、75或80以及可达85%(v/v)的油相可以是较低粘度的油。至少10、15、17、20或25以及可达23、25、27或30%(v/v)的油相可以是高粘度的油。乳化剂可以占油相的至少5、6、7、8或9%以及可达10%(v/v)。
【19】在扩增之后,可以分析产物珠,以测定与它们结合的DNA的序列特征。可以使用测定序列特征的任何方法,包括杂交、引物延伸以及核苷酸测序。可选地,产物珠可以通过FACs分析来分析,即,一种用于分离或区分两种不同种类核苷酸分子的技术。可以使用其它分析方法,只要方便。
【20】根据本发明的珠子也被称为微球体或微粒。颗粒尺寸可以在直径为大约0.1到10微米之间变化。珠子典型地由聚合物材料例如聚苯乙烯制备,尽管也可以使用非聚合物材料例如二氧化硅。可以被使用的其它材料包括苯乙烯共聚物、甲基丙烯酸甲酯、官能化聚苯乙烯、玻璃、硅和羧酸酯。任选地,颗粒是超顺磁性的,其在用于反应之后,有利于它们的提纯。
【21】通过与其它材料的共价或非共价相互作用,珠子可以被修饰,或者改变总表面特性,例如疏水性或亲水性,或者连接赋予结合特异性的分子。这样的分子非限定性包括:抗体、配体、特异结合蛋白对成员、受体、核酸。特异结合蛋白对包括抗生物素蛋白-生物素、链酶抗生物素-生物素、和因子VII-组织因子。
【22】在根据本发明制备为产物珠之后的珠子具有与它们结合的超过一个拷贝的相同核酸分子。优选地,每个珠子与相同核酸序列的至少10、50、100、500或1000个分子结合。在一些情况下,一些产物珠与一种以上类型的核酸分子结合。这些产物珠通常在分析遗传序列群中的遗传序列的比率方面不太有用。这样的产物珠可以容易地识别,因此将不会歪曲分析。
【23】产物珠的群通常将包括两种或多种类型的核酸。关于核酸,这样的群是异质的。期望的是,大部分产物珠每个珠子仅仅包括一种类型的核酸。大部分可以是,例如,至少1%、至少5%、至少10%或至少50%。每个珠子仅具有一种类型核酸的产物珠被称为同质的。每个珠子仅具有一种类型核酸的同质珠子包括那些具有含差错核酸的珠子,该差错是由于在聚合酶链反应中的错误引起。每珠子具有两种类型核酸的产物珠被称为异质的。尽管不希望被任何特定的理论所束缚,但是异质产物珠被认为是由具有两个以上非同一序列模板的分子的含水区室造成。产物珠的群作为群可以是异质的,但是其含有为同质的单个产物珠。
【24】单个产物珠优选地包括超过一个拷贝的模板分析物分子。每个珠子可以包括至少10、至少50、至少100、至少500、或至少1000个拷贝的模板分析物。如果该珠子是同质的,则这些拷贝的每一个将是相同的。
【25】产物珠的群可以保持在液体悬浮液中。可选地,它们可以被沉淀和干燥或冷冻。对于储存稳定性来说,后面的可替代法是有益的。
【26】产物珠群的分析可以用于区分许多种类的遗传性变型。多核苷酸可以被区分,其由于如单核苷酸多态性(SNP)一样少、由于存在或不存在突变、由于存在或不存在插入或缺失、由于存在或不存在非单核苷酸多态性而不同。因此,针对这些遗传性变型,产物珠群可以是异质的。
【27】区分遗传型变型即测定分析物序列特征的一种非常方便的方法,是通过用荧光染料差示标记变型。通过将荧光标记的寡核苷酸探针与一种多核苷酸杂交,可以完成这样的标记。可替代地,荧光标记的抗体可以被用于特定地附着到一个与具体遗传性变型杂交的寡核苷酸探针上。这样的抗体结合例如可以通过附着至寡核苷酸杂交探针的蛋白质或多肽来介导。当然,可以无限定地使用在本领域已知的其它标记多核苷酸的方法。标记不同多核苷酸种类的另一个方法是通过引物延伸。引物可以使用标记的脱氧核苷酸例如荧光标记的脱氧核苷酸来延伸。
【28】产物珠的群可以被用做模板。通过杂交、引物延伸方法、质谱法和本领域内通常使用的其它方法,可以分析产物珠上的模板分析物分子,以评估DNA序列变异。在产物珠上的模板分析物分子可以被用于固相测序。在一种固相测序技术中,通过将产物珠放置在用互补寡核苷酸点印的玻片上来排列产物珠。在另一种固相测序技术中,产物珠被放进单个孔中。在又一固相测序技术中,产物珠被并入到丙烯酰胺基质中(具有或没有后续的聚合酶克隆(polony)形成)。测序反应可以用任意固相测序方法来进行,例如,使用未标记的核苷酸前体(例如,焦磷酸测序,如由Ronaghi等在Anal.Biochem.267:65-71,1999中所述)或标记的核苷酸(例如,由Mitra等在年Anal.Biochem.320:55-65,2003中所述的光分裂试剂)的那些方法。因此,产物珠可以被用于且便于多重平行测序。产物珠还可以被用于利用IIS型限制性内切核酸酶的测序中。产物珠也可以被用于为常规的双脱氧核苷酸测序提供模板。为了在序列分析后得到有用的数据,同质的模板群是期望的。为了提供同质的模板群,产物珠可以被稀释、分离、或另外隔离,以便每个测序反应包含单个产物珠。可替代地,产物珠可以被分类,以提供具有单一种类模板的珠群。
【29】寡核苷酸引物可以通过在本领域内已知的任何方法被结合到珠子。它们可以共价或非共价结合。它们可以通过中间反应来结合,例如,通过蛋白质-蛋白质相互作用,例如,抗体-抗原相互作用或生物素-抗生物素蛋白相互作用。在本领域内已知的其它特异结合对也可以被使用。为了取得最适的扩增,与珠子结合的引物可以比在均质液相反应中所需的更长。寡核苷酸引物在长度上可以是至少12、至少15、至少18、至少25、至少35、或至少45个核苷酸。结合于珠子的寡核苷酸引物的长度不需要与在液相中的引物的长度相同。引物可以被用于本领域已知的任意类型的扩增反应中,该扩增反应非限定性地包括聚合酶链反应、等温扩增、滚环扩增、自动维持序列扩增(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)和连接酶链反应(LCR)。
【30】通过油相、水相和清洁剂的搅拌或搅动,制备微乳液。该微乳液形成了小的含水区室,其具有0.5到50微米的平均直径。该区室可以是从1到10微米,包括1和10微米,从11到100微米,包括11和100微米,或平均为大约5微米。所有这样的区室不需要都包括珠子。期望的是,在10,000所述含水区室中至少一个包含珠子。典型地,所述含水区室的1/100到1/1或1/50到1/1包含珠子。为了使珠子——其对于寡核苷酸来说是同质的——的比例最大化,期望平均地每个含水区室包含1个以下的模板分子。含水区室还将期望包含进行扩增所需的任何类型的试剂和酶。例如,对于聚合酶链反应(PCR)来说,该区室将期望含有DNA聚合酶和脱氧核苷酸。对于滚环扩增来说,DNA聚合酶和遗传DNA环可以存在。
【31】乳液可以通过本领域已知的任何方法来“打破”或破坏。破坏乳液的一种特别简单的方法是加入更多的清洁剂。可以使用的清洁剂包括,但不限于:Triton X100、Lautreth 4、Nonidet。
【32】根据本发明用于扩增和分析的样品DNA可以是例如基因组DNA、cDNA、基因组DNA的PCR产物或cDNA的PCR产物。样品可以得自单一个体,例如得自身体样品,例如尿、血、痰、大便、组织或口水。样品还可以得自一群个体。该个体可以是人,但可以是任何生物体、植物或动物,真核的或原核的,病毒的或非病毒的。
【33】任何类型的探针可以被用于与结合于珠子的扩增多核苷酸的具体杂交。荧光标记探针是有用的,因为它们的分析可以是自动化的,且可以实现高通量。荧光激活细胞分选术(FACs)允许对不同族群的珠子进行分析和分离。可以使用的一种类型荧光标记探针是改良的分子信标探针。这些探针具有干环结构和在探针上的附着荧光部分,其通常在探针的一端上,有时穿过连接体被附着。和标准的分子信标探针不同,改良的分子信标探针不具有猝灭部分。改良的分子信标探针可以具有附着在该探针任何一端5’或3’上的荧光部分。一种这样的探针与野生型序列的杂交比与突变型更好。另一种这样的探针与突变型序列的杂交比与野生型更好。其它的探针将与一种多态变体相比于另一种优选杂交。
【34】可以使用的高保真度DNA聚合酶是那些比Taq聚合酶提供更高保真率(更低误差率)的聚合酶。优选地,这些高保真度DNA聚合酶提供小于10-5的误差率,更优选地提供小于5×10-6的误差率,以及甚至更优选提供小于10-6的误差率。适合的聚合酶包括:PhusionTM DNA聚合酶(NEB)、Taq High FidelityTM和PfuUltraTM。这些聚合酶被用于热循环聚合酶链反应中,这在本领域是常规的。
【35】微乳液与珠子和引物一起形成,如前面所教导的。因为BEAMing需要热循环,因此可以使用热稳定的乳化剂。一种这样的乳化剂是EM90(Degussa-Goldschmidt Chemical,Hopewell,VA)。如在本领域已知的,可以使用其它这样的乳化剂。乳化剂分子量的增加与热稳定性的增加相关。
【36】扩增子可以是使用聚合酶链反应进行有效扩增的任意尺寸。在模板得自癌症患者的血清的情况下,扩增子优选地短于或等于300个碱基对(bp),或短于或等于200个碱基对,或短于或等于100个碱基对。来自结肠癌症患者血清的模板明显地降到小尺寸。因此,更小扩增子的扩增导致更有效和更灵敏的检测。如图1所示,检测对尺寸的依赖性相当强。
【37】具有不同标记的双脱氧核苷酸的单碱基延伸反应提供用于检测序列特征的灵敏方法。如果在产物检测后,发现个体珠子具有多个不同的标记,例如,代表突变型和野生型核苷酸,则它们将放弃进一步的分析。在该上下文中多个不同标记表示,在微乳液中存在的珠子具有两个不同的分析物DNA模板,而不是期望的单一模板,或表示在微乳液中在扩增反应早期发生错误,因此,错误的模板和正确的模板都被扩增。
【38】用于检测与珠结合的扩增子上的序列特征的一种方法应用单碱基延伸(SBE)反应。该反应通常应用标记的双脱氧核苷酸三磷酸(dideoxynucleotide triphosphates),以确保仅发生单个单体加入。双脱氧核苷酸三磷酸可以用任何类型的可检测标记进行方便的标记,所述可检测标记包括放射性部分、荧光部分和发光部分。不同的标记可以被附着至不同的双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTPs),因此,在同一样品中可以检测到不同的产物。在加入引发SBE反应必需的所有试剂之前,未标记的ddNTPs可以被加入以阻断非特异性延伸。典型地,至少一种未标记的ddNTP在比标记ddNTPs浓度高5到40倍的浓度下被加入。优选地,该浓度至少高出10到20倍。例如,如果A是突变碱基而C是野生型碱基,在SBE期间,我们可以使用Rox-ddATP用于变异型,使用FITC-ddCTP用于野生型,使用ddGTP和ddTTP以1:2-10:20:20的比率用于阻断非特异性延伸。未标记的ddNTPs降低了非特异性并入。
【39】用于提高SBE反应的特异性和/或灵敏性的另一个任选步骤是在SBE反应之前,使附着至珠子的双链核酸双链体变性。例如,双链可以被加热或用氢氧化钠处理。在双链分离之后,没有结合于珠子的单链可以与珠子以及珠子结合的链分离,并且单链可以被弃掉。
【40】如果期望,在微乳液被破坏之后,可以使用又一个扩增步骤。这个步骤典型地应用等温扩增,也被称为滚环扩增。为了产生滚环,可以使用分子倒置探针或持锁探针。在模板-驱动的连接反应之前,探针可以需要或不需要填充,以产生环。如果填充是必需的,则将被填充的区域将典型地是从1到30个核苷酸。等温扩增可以非常显著地扩增最后检测的信号。在等温扩增之后,使用SBE(单碱基延伸)反应,可以检测到序列特征,如上面描述。可选地,在珠子上扩增核苷酸序列可以通过在本领域已知的任何测序方法测定,包括合成测序。
【41】可以被用作分析物DNA来源的样品包括血液、血浆、尿、大便、唾液、眼泪、口水和骨髓。固体组织也可以提供分析物DNA。样品可以从癌症患者、从相关的家族成员、从怀孕妇女和从新生婴儿得到。分析物DNA的来源可以用例如测试试剂处理,并且可以测定测试试剂对分析物DNA的作用。
【42】尽管该方案是现行扩增方法的进步,但是该技术存在一些局限。一种局限是可以在珠子上聚合的PCR产物的尺寸。尽管通过BEAMing,我们成功地扩增了长达2,700碱基的序列,但是该大尺寸产物的收率比用<110碱基对的扩增子取得的收率少5%。在珠子表面处的空间位阻可能对长扩增子的较低效率负责。将来这可以通过使用具有更多酶-相容表面或不同聚合酶的不同珠子而令人信服地克服(尽管迄今还没有商业可得的聚合酶比上面所描述的更有效)。
【43】该方法的另一个局限是需要为每个被质疑的扩增子制备不同的乳液。这种局限已经通过本文描述的新乳液-制备过程部分地克服,该制备过程原则上是自动化的且允许192个乳液同时产生。使用例如最近描述的那些过程5,多平行微流体可以被用于产生更多数量的乳液,这是可能的。微流体还具有比基于剪切力的方法例如本文所述的方法产生更均质乳液的能力。
【44】存在其它技术,其使用单一分子作为模板,可以实现区室化的PCR。这些包括在picotiter板6的孔中或在聚合酶克隆3内进行的扩增。这些方法没有产生如BEAMing一样多的区室,但是对于几种应用是足够的。BEAMing还提供这样的优点:除了在大多数情况下常规可得之外,对于乳液的制备或它们的分析,需要小的特殊设备。
【45】Mastrobattista等最近描述了一种在水/油/水(w/o/w)乳液中生产单模板扩增的方法,其可以直接被用于流式细胞术7。尽管设计这个方法的目的与驱动开发BEAMing的诊断应用是不同的,但是,如果荧光探针例如分子信标被引入水相中,则基于w/o/w的过程中形成的小滴可以被用于变体检测。这将允许查询扩增子内的一种或几种变异,而BEAMing允许查询扩增子内的任何变体。
【46】存在描述BEAMing应用的几种最新出版物。除了其用作高通量测序的模板3.8之外,它已经被用于在癌症患者血浆样品中的突变的量化4、聚合酶误差率的直接测定2和转录因子靶标的鉴定9。
【47】上面的公开概括描述了本发明。本文所公开的所有参考文献明确地并入以做参考。更全面的理解可以通过参考下面的具体实施例得到,所述实施例在本文提供,仅仅为了示例的目的,并不是意图限定本发明的范围。
实施例1——材料
【48】试剂
结合缓冲液:5mM Tris-HCl(pH7.5)、0.5mM EDTA、1M NaCl
分解缓冲液:10mM Tris-HCl(pH7.5)、1%Triton-X100、1%SDS、100mMNaCl、1mM EDTA
48孔细胞培养板(Corning,3548)
脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)混合物(每个10mM;USB,77212)
FACS鞘溶液(BD Biosciences,342003)
5×杂交缓冲液:75mM Tris-HCl(pH9.5)、33.5mM MgCl2、25%甲酰胺
注意
Microamp透明粘合膜(Applied Biosystems,4306311)
1.5ml微离心管(螺旋盖,Corning,430909)
矿物油(Sigma,M3516)
MyOne链霉亲和素涂敷的磁珠,亲水的,1-μm直径(10毫克/毫升;
7-12×109个珠子/毫升;Invitrogen,650-01)
0.1M NaOH注意
10×PCR缓冲液:670mM Tris-HCl(pH8.8)、166mM(NH4)2SO4、100mM
β-巯基乙醇、11.7mM MgCl2注意
油/乳化剂混合物:在Tegosoft DEC中的7%(w/v)ABIL WE09(DegussaGoldschmidt Chemical;因为它仅仅以比试验室试验所需多得多的数量进行销售,故从作者处获得)。在室温下储存混合物不超过两天。
96孔PCR板(Denville Scientific,Cl 8096X)
Phusion/iProof高保真度DNA聚合酶(2U/μl;NEB/Biorad,F-530L/172-5302)
PlatinumTaq DNA聚合酶(5U/μl;Invitrogen,10966-034)
Quant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒(Invitrogen,P-7589)
不锈钢珠子(5mm;Qiagen,69982)
96孔储存板(1.2ml;圆孔;圆底;Abgene,AB-0564)
TE缓冲液:10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA
TK缓冲液:20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl
【49】寡核苷酸
对于单一BEAMing试验,需要六种寡核苷酸引物,如在图1中所示例。引物1到3是基因特异性的,而引物4到6是通用的。我们通常从IDT得到寡核苷酸。
引物3(域名:frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer 3,文件:primer3_www.cgi)被用于设计引物的基因特异性部分。这些序列应该具有约60℃的Tm,且长度为18到27个核苷酸。
引物1和2被用于DNA模板的预扩增。引物1在其5′端含有通用序列(Tag1,5′-TCCCGCGAAATTAATACGAC-3′;SEQ ID NO:1)以及在其3′端含有与感兴趣基因同源的序列。引物2在其5′端含有第二个通用序列(Tag2,5′-GCTGGAGCTCTGCAGCTA-3′;SEQ ID NO:2)以及在其3′端含有与感兴趣基因同源的序列。
引物3被用于检测在珠子上的扩增产物,并且在其5′端用荧光基团(例如FAM)标记。
引物4与珠子结合。在它的5′端其被双倍生物素化,并且在生物素和Tag1序列之间具有PEG 18间隔区和胸苷碱基,例如,5′-双生物素-间隔区18-T-TCCCGCGAAATTAATACGAC-3′;SEQ ID NO:3。
引物5和6是分别具有Tag1和Tag2序列的未修饰寡核苷酸。
在热循环期间,对于保持寡核苷酸附着至链霉抗生物素涂敷的珠子,双生物素是必须的1。
【50】设备
具有用于微量滴定板的吊桶的离心机(4K15;Qiagen/Sigma)
用于热循环仪的压缩垫(Thermo Hybaid)
流式细胞仪(LSRII,BD Biosciences)
MPC-S和MPC-9600磁分离器(Invitrogen,120-20D和120-06D)
ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies)
TissueLyser搅拌磨,具有来自2×24接头装置的连接板(Qiagen,85210和69982)
单珠分配器(Qiagen,69965)
实施例2——步骤
注意所有步骤在室温下进行,除另外表明之处。
【51】DNA样品的预扩增
1.建立50μl PCR反应,用于目标区域的初始扩增,如下:
按列出的顺序加入成分。用15μl的矿物油覆盖PCR反应,以防止在温度循环期间的蒸发。其它DNA聚合酶也可以被用于该预扩增,这取决于具体应用所需的保真性2。
如果模板DNA是复合物,例如哺乳动物细胞DNA,则我们通常使用3到30ng/PCR(1000-10,000单倍体基因组等价物)。
2.将反应放置在热循环仪中且根据下面递降程序扩增DNA片段:
降低PCR循环的数目是可能的,以最小化聚合酶诱导的序列错误。递降PCR条件最小化非特异性扩增产物的形成,但不是必须的。
3.通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物,并使用PicoGreen dsDNA试剂盒量化DNA收率。
120bp扩增子的典型产量在~15ng/μl(~200nM)的量级。来自预扩增的多余引物与珠子上的引物竞争并且在乳液PCR过程期间降低与珠子结合的PCR产物的数量。如果扩增子的浓度小于4nM,则用QIA快速PCR纯化试剂盒纯化PCR产物,以移除PCR引物。
故障排除
暂停点DNA可以储存在-20℃下。
关键步骤
【52】将引物与珠子结合
4.在1.5毫升的微量离心管中,用100μl的TK缓冲液冲洗100μl(7-12×108)的链霉抗生物素涂敷的磁珠两次。在每次冲洗之后,将微量离心管放在磁铁上一分钟,以便集中该珠子并用吸液管移除上清液。这将产生足够的珠子以进行18次乳液PCR。
5.在100μl的结合缓冲液中再悬浮珠子且加入10μl引物4(100μM,在TE缓冲液中)。立即涡流。
6.在15-25℃中温育珠子悬浮液30分钟。大约每10分钟,通过短暂地涡流该管而混合珠子。
7.分离珠子,现在用引物、用磁铁涂敷。去除上清液并如上所述用TK缓冲液冲洗珠子三次。
8.在100μl TK缓冲液中再悬浮珠子。
暂停点珠子可以在4℃下被储存至少3个月。
关键步骤
【53】乳液PCR
9.在应用的一天或两天内制备乳液/油混合物。
在Tegosoft DEC油中的沉淀偶尔可以在瓶底部观察到;当制备混合物时,不包括这种沉淀。
10.在使用前一刻用TE稀释模板DNA至~20pM。
在储存期间,低浓度的DNA可以粘着试管。
11.通过混合下列物质,建立150μl扩增反应。
关键步骤
12.按顺序,将一个钢珠、600μl油/乳化剂混合物和150μl PCR反应混合物加入到96孔储存板的一个孔中。用粘合膜密封板。
如果在孔的边上存在油,则粘合膜将密封不当。
将板倒转,以确保钢珠在孔中自由移动。
关键步骤
13.通过将含有乳液PCR混合物的96孔储存板夹在顶部和底部连接板之间装配TissueLyser接头装置,顶部和底部连接板的每一个安装有面向96孔储存板的压缩垫。将该组件放到TissueLyser固定器中,并紧密关闭把手。在15Hz混合10秒且在17Hz混合7秒。
用相同重量的第二接头装置平衡TissueLyser。
关键步骤
14.拆开接头装置且在大约3克下离心该板10秒,得到见底的液体。
15.用倒置显微镜以400×放大率评估乳液的质量。
取吸液管端头,将它侵入到乳液中,且将它快速地滴入到48孔细胞培养板底部。不要使用盖玻片,因为这些能够改变乳液的质量。立刻检查样品,因为含水区室迅速蒸发。
图2显示了通过该过程制备的乳液的照片。
故障排除
16.等分80μl的乳液放入96孔PCR板的8个孔中。
慢慢地吸取乳液,以避免剪切力。在大约3克下离心该板10秒,得到见底的液体。
17.根据下面的程序,温度循环该乳液。
暂停点乳液可以被储存在4℃。
【54】分解乳液
18.向每个80μl的乳液,加入150μl的分解缓冲液且上下吸取3次以便混合。
19.密封PCR板,将它放入空的96孔储存板中,且如上面所描述(步骤13)装配在两个TissueLyser连接板之间。放入到TissueLyser中且在20Hz下混合30s。
20.从TissueLyser中移出PCR板且在3200克下离心2分钟。
21.用连接至真空歧管的20μl的吸液管端头移除顶部的油层。
22.加入150μl分解缓冲液,密封该板,且再次在3200克下离心2分钟。
23.将板放入到96孔的磁分离器中1分钟且用吸液管完全移除液体。
24.从磁体移走该板,将珠子再悬浮于100μl TK缓冲液中,将珠子从8个孔中集中到1.5毫升的试管中。
25.将试管放在磁体上集中珠子1分钟且仔细地用吸液管移除上清液。故障排除
26.在500毫升的0.1M的NaOH中再悬浮珠子且温育2分钟。将试管放在磁分离器中1分钟且仔细地移除上清液。
这从珠子中移除了未生物素化的DNA链。
27.将珠子再悬浮于100μl TK缓冲液中。
通过测量600nm处的吸收可以评估珠子的回收。Nanodrop分光光度计对于此目的是方便的,因为仅仅需要2μl的珠子悬浮液。用引物5涂敷的等分珠子可以被用作基准。利用上述方法的典型回收是50-70%。
故障排除
暂停点珠子可以被储存在4℃。
【55】检测珠子上的DNA
28.通过混合下列物质在96孔PCR板中建立寡杂交(oligohybridization):
使用的珠子的数目取决于试验的性质。1千万的珠子提供在磁收集期间所看见的足够大的量并促进回收。如上面描述,通过测量600nm处的吸收可以评估回收。
29.在热循环仪中在50℃温育15分钟。
30.将板放入在96孔磁分离器中1分钟,集中珠子并用吸液管移除80μl的上清液。
31.用80μl TK缓冲液冲洗珠子两次。
暂停点珠子可以被储存在4℃。
【56】珠子群的分析
32.使用流式细胞术测定与珠子上的DNA杂交的引物的相对荧光强度。
我们已经成功地使用BD Bioscience FACScan、LSR I & II、FACSCalibur和FACSAria。可选地,荧光显微镜可以提供所产生的珠子的快速定性分析。
关键步骤*
33.经验地,建立用于检测向前散射(FACS)、侧向散射(SSC)和荧光信号的放大器增益(电压)。
图3图解了所得到的典型结果。
故障排除**
关键步骤*
【57】关键步骤
关键步骤3
在乳液PCR中使用的DNA的数量可以在相对广的范围内变化。最佳地,20%+/-15%的珠子应该含有PCR产物。太少的模板产生太少的阳性珠子,有损分析的灵敏性。太多的模板产生太多包含多个模板的区室,使其很难精确地量化含有感兴趣序列的初始模板的部分。
关键步骤8
除了1.05微米MyOne珠子,许多珠子可以被用于该步骤。MyOne珠子是均匀的,其对于流式细胞术特别有利。当表面密度比均匀性更重要时,其它磁珠(例如来自Seradyn的Sera-Mag颗粒)具有比MyOne更多的表面链霉亲和素分子并且可以被使用。更大的均匀的珠子(例如DynabeadsM-280)具有甚至更多的表面链霉亲和素分子,但是贵得多(每个珠子),并且乳液制剂必须改变,以使它们成为有效的载体。最后,可以使用非磁珠,尽管这些珠子更难处理,因为必须使用离心而不是磁铁来操纵它们。
关键步骤11
在乳液中固体载体上的扩增效率随扩增子长度的增加而降低3。优选的扩增子长度(包括引物)是70到110bp。200bp的扩增子产生那些在珠子上含100bp的产物的~30%。我们通常使用通用引物(图1中引物5)作为反向引物。但是,还可以使用嵌套反向引物,其产生的扩增子比在预扩增步骤的产物更短,以减少在微球体上的非特异性扩增或降低珠子结合的PCR产物的尺寸,并因此增加产量。最后,聚合酶的浓度和类型在本文所述的方案中已经得到充分优化。通常,更高的聚合酶浓度导致与珠子结合的PCR产物的产量更高。增加与珠子结合的PCR产物数量的另一种方法是通过滚环聚合反应2。
关键步骤12
如果没有TissueLyser,使用搅拌棒或均化器也可以产生乳液1,4。尽管该乳液不如那些用TissueLyser制备的乳液一样均匀或容易控制,但是它们对于许多BEAMing应用是足够的,尤其是当仅需要少量样品的时候。制备此类乳液的一个简单方法是通过在2ml深低温小瓶中(Corning430661)混合240μl PCR反应与矿物油中(Sigma)的960μl 7% AbilEM90,利用涡旋机混合10秒,以及利用装备有一次性匀浆器端头(OmniIntl.,30750)的匀浆器(IKA,T25 basic,2953000)以最低速度混合50秒4。
关键步骤13
当使用具有TissueLyser连接板的96孔储存板时,更靠近装置主体(G行和H行)的样品比A行和B行中的样品振动更慢。为了防止乳液质量上的变化,如果制备小于24个样品时,我们建议仅仅使用A行和B行。当使用全部96孔板时,在混合过程的一半时旋转96孔板。
关键步骤32
在FACSCalibur和LSR I & II设备的单试管操作方式中,在进样管(SIT)上的液滴存留单元(DCM)套管应该被移除,以预防1微米的磁珠被捕集在套管之间。该套管可以用更短的改良金属套管保护器来替代。我们还建议使用高质量的鞘液。
关键步骤33
使用传统光电二极管检测器的设备的向前散射分辨率对检测单1微米颗粒应当足够灵敏。但是,如果没有适当排列,珠子将很难与背景分离。向前散射光电倍增管(PMT)检测系统增加灵敏度,下至0.2μm的分辨率,并且当使用1微米直径的珠子时,被推荐使用。
【0058】故障排除表
问题步骤3期望带不是预扩增的主要产物。
解决方案
使用更高的退火温度(60到65℃)且改变MgCl2浓度(1.5mM至2.5mM)。GC富集的模板应该在Phusion GC缓冲液和3-6%DMSO中被扩增。检查该序列在模板基因组中没有被重复。使用寡核苷酸分析程序(例如,Oligonucleotide Properties Calculator;http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html),核查同源二聚体和异源二聚体的形成。如果扩增有问题,值得尝试几个引物对。
问题步骤15水滴太小或太大
解决方案
如果乳液的含水区室太小,将具有很少扩增或没有扩增。如果区室太大,仅具有单模板的区室部分将太低,而不能提供统计学重要的结果。分别通过增加1s或1Hz来改变混合时间或振动速度,液滴的尺寸可以被优化。问题步骤25珠子形成可见的聚集体。
解决方案
在分解乳液之后,我们偶尔在多个步骤观察到磁珠的聚集体。这伴随着更大的扩增子(>200bp)更经常发生。可能负责的因素是样品放入磁场中的时间、盐浓度和缓冲液的温度。为了使聚集体形成的可能性最小,仅仅使用在室温下平衡的缓冲液。样品留在磁铁上不应超过2分钟(特别是在液体已经被移除之后)。可以增加盐浓度。一旦聚集体已经形成,它们很难分散。在一些情况下,可以通过吸移、涡旋或超声处理(来自Diagenode的Bioruptor)将它们分散。在一些情况下加热也可以帮助反向聚集。
问题步骤27在乳液PCR之后,珠子的低回收率。
解决方案
低回收率可能源自不完全的破乳作用或效率低的磁分离。为了防止不完全的破乳作用,增加混合时间和速度。为了防止在磁铁分离期间释放珠子,不移除所有的上清液,不接触珠子颗粒,且使用如上面所建议的相同牌子的试管、模板和磁铁。
问题步骤33差的信噪比
解决方案
这通常是由于在珠子上扩增的低效率,但也可能由于标准杂交条件或由于差的探针(例如防止杂交的二级结构)。建议通过HPLC或凝胶电泳进行杂交探针的纯化。通过使引物与和Tag1互补的珠子杂交,检查杂交条件。由于在珠子上的每个PCR产物在它的5’端具有这个序列,得到的信号代表可能的最大信号。来自这些珠子的信号应该等价于通过结合5’-生物素化的寡核苷酸——其在3’端具有相似的荧光基团——得到的那些信号。来自引物3的信号应该在用Tag1得到信号的10倍之内,这意味着至少10%的珠子结合的引物在PCR期间被延伸。在珠子上的少量DNA可以由于小尺寸的含水区室(参考问题步骤15),或差的反应条件而引起。注意在本文所述方案的每个方面,已经进行广泛的优化,与这些条件的偏离应该谨慎进行。
参考资料
引用的每篇参考资料的公开内容在此被明确并入。
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<211>21
<212>DNA
<213>智人
<400>3
Claims (38)
1.一种用于分析核苷酸序列变异的方法,包括:
形成微乳液,其包括油相和水相,其中所述水相包括一种或多种分析物DNA分子,其中所述水相占所述微乳液的10-30%(v/v)以及所述油相占所述微乳液的70-90%(v/v);其中所述油相包括:数量为所述油相的60-85%(v/v)的一种或多种低粘度烃,其具有在25℃下为20mPas以下的粘度;数量为10-30%(v/v)的一种或多种高粘度烃,其具有在25℃下大于20mPas的粘度;以及数量为5-10%(v/v)的乳化剂;
在试剂珠存在下扩增所述微乳液中的分析物DNA分子,其中所述试剂珠与用于扩增所述分析物DNA分子的引物的多个分子结合,由此形成与一种分析物DNA分子的多个拷贝结合的产物珠;
分离所述产物珠与未结合于所述产物珠的分析物DNA分子;
测定与所述产物珠结合的所述一种分析物DNA分子的序列特征。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述微乳液用数量为所述油相的15-25%(v/v)的高粘度烃形成。
3.如权利要求1所述的方法,其中所述微乳液用数量为所述油相的17-23%(v/v)的高粘度烃形成。
4.如权利要求1所述的方法,其中多个分离的微乳液群利用组织搅拌磨粉碎机和每孔中的金属球在多孔板中同时形成。
5.如权利要求1所述的方法,其中所述低粘度烃包括选自下述的氧部分:羟基、酯、醚和羧酸。
6.如权利要求1所述的方法,其中所述高粘度烃在25℃具有20-30mPas的粘度。
7.如权利要求1所述的方法,其中所述高粘度烃在25℃具有20-25mPas的粘度。
8.如权利要求1所述的方法,其中所述高粘度烃在25℃具有22-26mPas的粘度。
9.如权利要求1所述的方法,其中所述低粘度烃选自:4-甘油异硬脂酸酯、乙二醇、丙二醇、十六烷基丙二醇、月桂酸己酯、碳酸二乙基己酯以及它们的混合物。
10.如权利要求1所述的方法,其中所述低粘度烃在25℃时具有15mPas以下的粘度。
11.如权利要求1所述的方法,其中所述低粘度烃在25℃时具有10mPas以下的粘度。
12.如权利要求1所述的方法,其中所述低粘度烃在25℃时具有5mPas以下的粘度。
13.液体组合物,其包括多个形成含水区室的微乳液,其中所述含水区室的至少一部分包括:
珠子;
多核苷酸模板;和
用于扩增所述模板的寡核苷酸引物;
其中所述寡核苷酸引物的至少一部分与所述珠子结合,其中所述微乳液包括油相和水相,其中所述水相占所述微乳液的10-30%(v/v)以及所述油相占所述微乳液的70-90%(v/v);其中所述油相包括:数量为所述油相的60-85%(v/v)的一种或多种低粘度烃,其具有在25℃下为20mPas以下的粘度;数量为10-30%(v/v)的一种或多种高粘度烃,其具有在25℃下20mPas以上的粘度;以及数量为5-10%(v/v)的乳化剂。
14.如权利要求13所述的液体组合物,其中所述微乳液包括数量为所述油相的15-25%(v/v)的高粘度烃。
15.如权利要求13所述的液体组合物,其中所述微乳液包括数量为所述油相的17-23%(v/v)的高粘度烃。
16.如权利要求13所述的液体合成物,其中多个分离的微乳液群利用组织搅拌磨粉碎机和每孔中的金属球在多孔板中同时形成。
17.如权利要求13所述的液体组合物,其中所述低粘度烃包括选自下述的氧部分:羟基、酯、醚和羧酸。
18.如权利要求13所述的液体组合物,其中所述高粘度烃在25℃具有20-30mPas的粘度。
19.如权利要求13所述的液体组合物,其中所述高粘度烃在25℃具有20-25mPas的粘度。
20.如权利要求13所述的液体组合物,其中所述高粘度烃在25℃具有22-26mPas的粘度。
21.如权利要求13所述的液体组合物,其中所述低粘度烃选自:4-甘油异硬脂酸酯、乙二醇、丙二醇、十六烷基丙二醇、月桂酸己酯、碳酸二乙基己酯以及它们的混合物。
22.如权利要求13所述的液体组合物,其中所述低粘度烃在25℃具有15mPas以下的粘度。
23.如权利要求13所述的液体组合物,其中所述低粘度烃在25℃具有10mPas以下的粘度。
24.如权利要求13所述的液体组合物,其中所述低粘度烃在25℃具有5mPas以下的粘度。
25.一种用于分离核苷酸序列变体的方法,包括:
形成微乳液,其包括油相和水相,其中所述水相包括一种或多种分析物DNA分子,其中所述水相占所述微乳液的10-30%(v/v)以及所述油相占所述微乳液的70-90%(v/v);其中所述油相包括:数量为所述油相的60-85%(v/v)的一种或多种低粘度烃,其具有在25℃下为20mPas以下的粘度;数量为10-30%(v/v)的一种或多种高粘度烃,其具有在25℃下为20mPas以上的粘度;以及数量为5-10%(v/v)的乳化剂;
在试剂珠存在下扩增所述微乳液中的分析物DNA分子,其中所述试剂珠与用于扩增所述分析物DNA分子的引物的多个分子结合,由此形成与一种分析物DNA分子的多个拷贝结合的产物珠;
分离所述产物珠与未结合于产物珠的分析物DNA分子;
分离结合于第一种分析物DNA分子的多个拷贝的产物珠与结合于第二种分析物DNA分子的多个拷贝的产物珠。
26.如权利要求25所述的方法,其中所述微乳液用数量为所述油相的15-25%(v/v)的高粘度烃形成。
27.如权利要求25所述的方法,其中所述微乳液用数量为所述油相的17-23%(v/v)的高粘度烃形成。
28.如权利要求25所述的方法,其中多个分离的微乳液群利用组织搅拌磨粉碎机和每孔中的金属球在多孔板中同时形成。
29.如权利要求25所述的方法,其中所述低粘度烃包括选自下述的氧部分:羟基、酯、醚和羧酸。
30.如权利要求25所述的方法,其中所述高粘度烃在25℃具有20-30mPas的粘度。
31.如权利要求25所述的方法,其中所述高粘度烃在25℃具有20-25mPas的粘度。
32.如权利要求25所述的方法,其中所述高粘度烃在25℃具有22-26mPas的粘度。
33.如权利要求25所述的方法,其中所述低粘度烃选自:4-甘油异硬脂酸酯、乙二醇、丙二醇、十六烷基丙二醇、月桂酸己酯、碳酸二乙基己酯以及它们的混合物。
34.如权利要求25所述的方法,其中所述低粘度烃在25℃具有15mPas以下的粘度。
35.如权利要求25所述的方法,其中所述低粘度烃在25℃具有10mPas以下的粘度。
36.如权利要求25所述的方法,其中所述低粘度烃在25℃具有5mPas以下的粘度。
37.一种用于分析核苷酸序列变异的方法,其中,形成包含一种或多种分析物DNA分子的微乳液,在试剂珠存在下所述微乳液中的所述分析物DNA分子被扩增,其中所述试剂珠与用于扩增所述分析物DNA分子的引物的多个分子结合,由此形成与一种分析物DNA分子的多个拷贝结合的产物珠,分离所述产物珠与未结合于产物珠的分析物DNA分子,以及测定与所述产物珠结合的所述一种分析物DNA分子的序列特征,其改进包括:
利用组织搅拌磨粉碎机和每孔中的金属球在多孔板中同时形成多个分离的微乳液群。
38.如权利要求37所述的方法,其中所述微乳液包括油相和水相,其中所述水相包括一种或多种分析物DNA分子,其中所述水相占所述微乳液的10-30%(v/v)以及所述油相占所述微乳液的70-90%(v/v);其中所述油相包括:数量为所述油相的60-85%(v/v)的一种或多种低粘度烃,其具有在25℃下为20mPas以下的粘度;数量为10-30%(v/v)的一种或多种高粘度烃,其具有在25℃下为20mPas以上的粘度;以及数量为5-10%(v/v)的乳化剂。
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