CN101500420A

CN101500420A - 新聚合物材料和方法

Info

Publication number: CN101500420A
Application number: CNA2006800136950A
Authority: CN
Inventors: Z·关
Original assignee: CALIFORNIA SENATE
Current assignee: CALIFORNIA SENATE
Priority date: 2005-02-25
Filing date: 2006-02-24
Publication date: 2009-08-05
Also published as: WO2006091894A4; US9238697B2; WO2006091894A2; US20080317861A1; WO2006091894A3

Abstract

提供了嵌合体聚合物组合物和方法，其中多种碳水化合物片断和氨基酸形成一种聚合物的主链。最好，该聚合物包括构成该嵌合体聚合物的交替糖和肽部分。

Description

新聚合物材料和方法

本专利申请要求我们的实审中美国临时专利申请的优先权，其序号为60/656,743，是2005年2月25日提交的。

发明领域

本发明的领域是杂聚合物，尤其肽和糖构成其主链的杂聚合物。

发明背景

许多天然和合成的杂聚合物类化合物是业内已知的。例如，糖肽常见于大多数真核细胞中和细胞膜上。在大多数情况下，糖肽是在细胞中酶促地和后转译地合成的。因此，从结构观点来看，这样的分子的主链是一种有共价地附着到多肽主链的侧链R基团上的糖基侧链的多肽。同样，已知许多天然多糖携带一种或多种氨基酸。例如，胞壁质(即一种包含N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸的聚合物)典型地是用一种五肽衍生的，该五肽共价地偶合到该胞壁质中的N-乙酰胞壁酸上，充当2条或多条多糖链之间的交联剂。再一次从结构观点来看，这样的分子的主链也是一种有寡肽作为侧链基团共价地与其键合的多糖。

值得注意的是，尽管可以得到许多碳水化合物和氨基酸结构单元，但一般地说，除相对少数和有选择的分子外，尚无关于其中碳水化合物和肽构成杂聚合物主链的杂聚合物的报告。例如，在Biochem Pharmacol.2005 Nov 1；70(9)：1277-87中报告了由DNA和PNA部分组成的混合主链杂聚合物。在这篇论文中，2个DNA部分的糖磷酸酯主链连接到一个PNA部分的肽主链上。类似地，Zhang等在Bioorg.Med.Chem.Letter2001 May 21；11(10)：1269-72中描述了PNA(肽核酸)和乳糖构成其主链的某些嵌合体分子。虽然这样的聚合物有关于核酸杂化方面的理想性能，但各种缺点可能依旧。除其它方面外，在其主链包括DNA部分的情况下，由于主链中的磷酸根，在生理pH时典型地存在负电荷。

美国专利No.6,740,310中描述了其它官能化聚酯接枝共聚物，其组成为一种有至少一种氨基酸根掺入其中的线型α-羟基酸聚酯主链和至少一条从该聚酯中的氨基酸根延伸出来的聚(氨基酸)侧链。在又进一步实例中，在又进一步实例中，一种透明质酸聚合物和一种要么非离子型聚合物、要么聚合物胶、要么其组合的第二聚合物组合生成某些杂聚合物，如以前在美国专利申请No.2005/0084537中所述的。虽然这样的聚合物可以提供某些优点，但受控和高产率合成往往是困难的。进而，这样的合成聚合物中很多当植入时可能在动物中引起免疫反应。

因此，虽然杂聚合物的许多组合物和方法是业内已知的，但它们全部或几乎全部困扰于一种或多种缺点。最显著的是，在除含PNA化合物外的化合物中氨基酸和糖构成其主链的混合主链杂聚合物并不是已知的。因此，目前仍有提供改进的杂聚合物之需要，尤其有氨基酸-碳水化合物混合主链的杂聚合物。

发明概要

本发明涉及杂聚合物组合物和方法，其中至少一种碳水化合物片断和至少一种氨基酸片断构成该聚合物的主链。

在本发明主题的一个方面，一种嵌合体聚合物有按照下式的结构：[(M)_x1(N)_y1]_z1[(M)_x2(N)_y2]_z2，式中M独立地是一种碳水化合物片断，且N独立地是一种氨基酸，式中x1、x2、y1、y2、z1、和z2独立地是1～10000(含1和10000)的整数，式中x1当y2大于或等于1时任选地为零，且式中y2当x1大于或等于1时任选地为零，且式中该碳水化合物片断和该氨基酸彼此偶合，使得该碳水化合物片断和该氨基酸单元构成该聚合物的主链。

最好，x1和x2中至少一个是2～20的整数，和/或y1和y2中至少一个是2～20的整数。典型地，该氨基酸是经由该α氨基与该α羧基之间的共价键而成为该主链的一部分的，和/或该碳水化合物是经由酰胺键偶合到该氨基酸上的。在又进一步的期待方面，该碳水化合物片断中至少一个包含一种环状糖，和/或包含至少一种非天然存在的糖。当希望时，在所期待聚合物中M和N中至少一个包含一种交联性官能度，其中该交联性官能度较好共价地键合到另一种嵌合体聚合物的另一种交联性官能度上，从而生成一种交联聚合物。在又进一步的较好方面，该交联聚合物是一种任选地包括医药剂和细胞中至少一种的水凝胶，且该聚合物是配制成一种适合于植入、注射、和经口给药中至少一种的配方的。

因此，在本发明主题的另一个方面，期待包含权利要求1的嵌合体聚合物和医药活性剂的医药组合物。当希望时，该医药活性剂是封装于可生物降解聚合物中或共价地附着到该聚合物上的。替而代之，或此外，该医药活性剂是一种多肽，且(N)_y1和(N)_y2中至少一个包含该医药活性剂。在至少一些情况下，较好的是，该聚合物有适合于降解的组成，从而能释放出该医药活性剂。在替代的方面，所期待的聚合物也可以一种能发生生物侵蚀和/或受控释放的结构。

在本发明主题的又另一方面，含细胞结构可以包括所期待的嵌合体聚合物，或可以从所期待的嵌合体聚合物构建。较好，这样的结构中的嵌合体聚合物是与至少一种其它嵌合体聚合物交联的，且最好与其它嵌合体聚合物形成一种水凝胶。除其它构型外，这样的结构尤其适合于离体细胞生长、甚至适合于活体细胞生长(例如，呈一种含细胞植入物的形式)。例如，这样的聚合物可以用来生长和/或扩大干细胞，后者可以诱发到也可以不诱发到在该聚合物中或上的分化。此外，或替而代之，所期的聚合物可以用来作为所植入器件(可以包括也可以不包括细胞)的涂料。

从本发明的较好实施方案的以下详细描述，本发明的各种目的、特色、形态和优点将变得更加显而易见。

附图简述

图1是使用有对照化合物和所期待化合物的DNA多丛的各种琼脂糖凝胶电泳照片。

图2A是一幅图，说明与对照的和本文中提供的各种嵌合体聚合物DNA制剂接触的细胞的转染效率。

图2B是一幅图，说明用对照的和本文中提供的各种嵌合体聚合物培育的细胞的生存性。

图3是一幅图，说明对某些嵌合体聚合体的免疫反应的各时间点的ELISA结果。

图4A是一幅图，说明使用枯草杆菌蛋白酶A和二赖氨酸聚合物(Poly1)的降解研究的结果。

图4B是一幅图，说明使用枯草杆菌蛋白酶A和三赖氨酸聚合物(Poly2)的降解研究的结果。

图4C是一幅图，说明使用胰蛋白酶和二赖氨酸聚合物(Poly 1)的降解研究的结果。

详细描述

本发明者总体上期待杂聚合物的组合物和方法，其中至少一种碳水化合物片断和至少一种氨基酸片断构成该杂聚合物的主链。最好，所期待的杂聚合物将包括与一个或多个寡肽或多肽部分共价偶合的一个或多个单糖、寡糖、或多糖或有取代多醇(wide supra)部分。最典型地，较好是所期待的杂聚合物将包括多个且交替的寡糖和/或多糖和寡肽和/或多肽部分，如以下结构I中示意地说明的。然而，其它排列地视为适合于本文中使用。

结构I

使用这样的总体思路，应当知道的是，该氨基酸/肽部分和该糖部分中至少一种可以是支化的，或提供可以用于支化的反应性基团(例如，使用进一步的肽和/或糖部分，或其它基团)或其它共价的或非共价的相互作用。因此，应当认识到的是，按照本发明主题的杂聚合物可以制备成线型的、支化的、超支化的、或树枝状的分子，如以下结构II中例示性说明的。

结构II

除其它所期待的方案外，一般较好的是，糖部分与氨基酸和/或肽部分的共价偶合将是使用业内众所周知的合成程序经由酰胺键形成进行的，然而，许多其它共价键也可能是合适的，包括酯键、醚键、仲胺键、或酰亚胺键。例如，酰胺键可以通过使该糖部分的活化糖酸基与氨基酸或肽部分的氨基反应(例如使用酰氯与氨基，或使用DCCD或其它试剂使羧基活化)、经由开环聚合反应(例如使用糖内酯与氨基)、经由Click型反应(例如使用糖氮化物与乙炔改性肽)、经由N-烷基羟胺与α-酮酸的缩合(例如使用糖酸与羟胺肽)等生成。在以下实验部分提供了这样的合成路线的代表性实例。

替而代之，也期待的是，按照本发明主题的化合物可以通过各自端基使用第三类化合物的交联制备。然后，这样的交联剂可以例如使用反应性基团以如上所述方式反应，生成相应酰胺键。无论所采取的实际合成路线如何，都应当认识到，合成一般地将遵循成熟的路线和程序，而且可以容易地调制，从而达到实际上数目无限的组合。进而，这些嵌合体聚合物可以通过二硫化物键、氨基阳离子(-NH₃ ⁺)与羧酸根阴离子(-COO^-)之间的离子型相互作用、极性基团(羟基、氨基、硫代、酰胺基、羧基等)之间的氢键键合和疏水的范德化相互作用交联。

期待的碳水化合物

一般来说，所期待的是，本文中陈述的嵌合体聚合物中适用的碳水化合物包括单糖(即单一糖)、寡糖(即以线型或支化方式彼此共价偶合的2～20个糖)、和多糖(即以线型或支化方式彼此共价偶合的21～100000(甚至更多)个糖)。在该碳水化合物是一种寡糖或多糖的情况下，应当认识到的是，这些糖可以是相同的也可以是化学上各异的。也要理解的是，碳水化合物，糖(sugar)和糖(saccharide)这些术语在此是可互换地使用的，而且有相同的含义。进而，碳水化合物这一术语也包括下式的开链多醇

R_B-[CHOH]n-R_T

有可多达12个碳原子，其端基R_B和R_T选自CHO、N₃、CH₂OH、COOH、COCl、CO-O-烷基(烯基)，或末端羧基可以与γ羟基化合生成一种双内酯。诸如多醇二羧酸的羟基可以衍生成为丙酮化合物或有各种其它基团，包括烷基。也包括的是这样的分子，其中一个或多个羟基由氨基或乙酰胺基置换。进而，应当认识到该开链碳水化合物可以呈醛糖或酮糖形式。

进而，关于该碳水化合物的来源，期待的是，该碳水化合物可以是天然存在的或合成的碳水化合物，所述碳水化合物可以进一步加工要不然化学改性成一种预定结构和/或分子量。例如，天然存在的碳水化合物包括淀粉、糖原、直链淀粉、β-葡聚糖等，这些可以酶促地、化学地、和/或机械地加工成一种特定尺寸。此外或替而代之，该碳水化合物可以化学地或酶促地改性得能包括一个或多个所希望的侧基和/或取代基。可用于本发明主题的聚合物的合成碳水化合物可以使用酶促程序或合成程序制备，特别好的是，这样的合成碳水化合物已经包括随后与氨基酸和/或肽偶合所需要的反应性基团和保护基团。然而，无论该碳水化合物的来源如何，应当认识到的是，反应性基团和/或保护基团可以使用业内众所周知的方法和方案导入该碳水化合物中。

进一步期待的例示性碳水化合物包括这样的碳水化合物，其中该糖的环状部分中的杂原子是一种除氧外的原子(例如硫、碳、或氮)类似物，而其它替代糖可以不是环状的，但可以呈线型(开链)形式。所期的糖可以是氧化的或还原的碳水化合物。适用的糖也可以包括一个或多个双键。又进一步具体期待的替代糖包括那些有一个或多个非羟基的取代基者，且特别期待的取代基包括一、二、和三磷酸酯(较好C₅酯)、烷基、烷氧基、卤素、氨基、酰胺基和烷胺基、含硫取代基等。还进一步期待的是，有环状结构的碳水化合物中所有期待的取代基(羟基取代基和非羟基取代基)均可在α-或β-构型中涉及。

所期待的糖和糖类似物中许多是商业上可得的。然而，在所期待的糖不是商业上可得的情况下，应当认识到的是，业内有各种不同的已知方法来合成这样的糖。例如，适用的实验方案可以参阅＂Modern Methodsin Carbohydrate Synthesis＂by Shaheer H.Khan(Gordon & Breach Science Pub；ISBN：3718659212)，in U.S.Pat Nos.4,880,782和3,817,982，in WO88/00050，或in EP199,451。以下说明进一步期待的糖和糖类似物的一个例示性集合，其中例示性糖均可呈D-或L-构型，且其中端基差向异构体碳上的取代基中至少一个可以进一步呈要么α要么β取向。单糖、寡糖、和多糖大多数表示为五员环(呋喃糖)或六员环(吡喃糖)。以下说明一种例示性吡喃糖，其中R独立地如以上定义。最好，R中至少一个是OH、NH₂、NH-酰基或H，且杂原子选自O、S、Se、和N-R组成的一组。关于适用六员环糖的立体化学，适用与以上对五员环糖相同的考虑。

特别期待的一类糖包含以上糖的寡糖形式，其中构成主链的一部分的糖分子数目在1～100之间、更典型地在2～50之间。在该糖呈环状形式的情况下，应当认识到的是，该偶合可以采用该糖上任何可供利用基团，包括端基差向异构体碳原子(例如，生成1，6或1，4连接分子)。端基差向异构体碳上的偶合可以是α或β。然而，其它共价偶合也认为是适用的。

类似地，所期待的线型糖最好经由各自的末端官能团偶合到相邻分子(例如糖和/或氨基酸)上。例如，在该糖呈醛糖形式的情况下，与相邻分子的偶合典型地采用末端/伯羟基。该羟基中一个或多个氧化成相应的醛、酮或羟酸基也是所期待的，因而偶合也可以包括缩醛、缩酮、酯、硫代酯、亚胺、胺、和酰胺等。

所期待的肽和氨基酸

总体上期待的是，本文中陈述的嵌合体聚合物中使用的氨基酸和肽可以独立地以许多形式和结构排列存在。例如，所期待的聚合物包括单一氨基酸(例如，天然存在的、蛋白原的、或其它的)、寡肽(即2～20个以线型或支化方式彼此共价偶合的氨基酸)、和多肽(即20～100000(甚至更多)个以线型或支化方式彼此共价偶合的氨基酸)。当然，在该肽是一种寡肽或一种多肽的情况下，应当认识到的是，该氨基酸可以是相同或化学上各异的，和/或该肽可以是线型的或支化的。关于该肽和/或氨基酸的来源，期待的是，这些化合物可以是天然存在的或合成的，而且它们可以进一步加工要不然化学改性成预定结构和/或分子量。例如，天然存在的氨基酸和肽包括所有蛋白原氨基酸、呈D-和L-构型的各种天然和合成的α-氨基酸(及其混合物)、结构性多肽(例如角蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白、胶原蛋白等)、催化活性肽(例如氧化还原酶、脱氢酶等)、结合肽(例如清蛋白、各种球蛋白等)等，且这些当中每一种都可以酶促地、化学地、和/或机械地加工成某一特定尺寸。

可用于本发明主题的聚合物的合成肽可以使用合成程序、重组体程序和/或合成程序(例如固相或溶液相)制备，而且特别好的是，这样的合成肽已经包括随后与碳水化合物偶合所需要的反应性基团和/或保护基团。然而，不管该氨基酸和/或肽的来源如何，都应当认识到，反应性基团和/或保护基团也可以使用业内众所周知的方法和方案导入该化合物中。此外或替而代之，应当认识到，适用的肽可以化学改性和/或酶促改性得包括一个或多个所希望的官能团或取代基，然后可以执行特定的所希望功能和/或提供经调整的物理化学性能。例如，天然的和/或合成的肽可以进行酶促消化，以提供所希望的分子量(分布)或特定的化学组成。在其它实例中，该肽也可以进行糖基化或其它改性，较好使用该肽主链以外的一个或多个侧链基团。

在本发明主题的一个方面，适用的氨基酸较好有式CR₁R₂(CO₂ ^-)(NH₃ ⁺)，式中R₁和R₂独立地是H、芳基、杂芳基、芳烷基、烷基、烯基、炔基、和环烷基，任选地有OH、SH、SCH₃、COOH、NH₂、CONH₂、咪唑基、呋喃基、噻吩基、或吲哚基取代(以上烃基中每一个都可以进一步包括一个或多个杂原子[例如O、S、Se、N、P])，且其中R₁和R₂也可以形成一个环(任选地有NH₂，从而生成一种脯氨酸或脯氨酸样氨基酸)。在R₁和R₂不相同的情况下，应当认识到，该氨基酸会有一个或多个手性中心，而且所有对映体、非对映体、外消旋物及其混合物均认为是适当的。因此，在所期待的氨基酸当中，所有合成(非天然)的和天然存在的氨基酸、尤其蛋原氨基酸均可期待在本文中使用。相对于羧基而言，该氨基可以在α位、β位、γ位、δ位、和ε位。在不太好的方面，将该氨基酸改性得包括一种杂环碱。因此，至少在一些情况下，将这样的化合物从本发明主题的范围排除出去，其中该氨基酸改性得包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、和/或尿嘧啶(或能发生Watson-Crick杂化的其它核碱)。

在较好的方面，所期待的氨基酸彼此偶合生成一种寡肽或多肽，最好在一种氨基酸的氨基与第二种氨基酸的羧基之间生成至少一个酰胺键。然而，应当知道的是，也可以生成许多替代键来供价地偶合2种氨基酸，且2种氨基酸之间的特定键会至少部分地取决于第一种氨基酸和第二种氨基酸的化学组成。最典型地，包含氨基酸的主链部分将由2种或多种α-氨基酸之间的酰胺键构成。替而代之，主链也可以包括在α-氨基酸与β-或γ-氨基酸之间生成的键、一种诸如与赖氨酸的ε-氨基偶合的α-氨基酸的羧基或非酰胺键(例如酯键、酰亚胺键、硫代酯键、醚键、二硫化物键等)。

本文中使用的“烷基”这一术语系指饱和烃基，呈直链、支化、手性或非手性、或环状构型(也简称为环烷基，见下文)，特别期待的烷基包括低级烷基(即有6个或更少碳原子的烷基)。例示性烷基是甲基、乙基、丙基、2-丙基、丁基、2-丁基、2-甲基丙基、2，2-二甲基乙基、戊基、2-甲基丁基、己基等。

本文中使用的“烯基”系指直链或支化、手性或非手性、有至少一个双键的不饱和烃基。因此，特别期待的烯基包括直链或支化、有2～6个碳原子的基团(例如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-戊烯基等)。

类似地，本文中使用的“炔基”这一术语系指有至少一个三键的不饱和烃基。特别期待的炔基包括直链或支化、有合计2～6个碳原子的炔(例如乙炔基、1-丙炔基(炔丙基)、2-丁炔基、2-戊炔基等)。

本文中使用的“环烷基”这一术语系指环状烃基(即其中烃的碳原子链构成一个环)，较好包括3～8个碳原子。因此，例示性环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。应当进一步知道的是，环烷基也可以包括双键(称为环烯基)，例如环己烯基。

本文中使用的“芳基”这一术语系指芳香族烃环，该环可以进一步包括一个或多个杂原子(因而也简称为杂芳基)。因此，例示性芳基包括苯基、萘基等，而且所期待的杂芳基包括2-和3-吡啶基、2-和3-噻吩基、3-吲哚基、4-咪唑基等。

所期待的芳烷基包括苄基和苯乙基。

本文中使用的“烷氧基”这一术语系指直链或支化链烷氧化物，其中烃部分可以有任何数目的碳原子(而且可以进一步包括双键或三键)。例如，适用的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、2-丙氧基等。

类似地，“烷硫基”这一术语系指与硫原子连接的直链或支化烷基，其中烃部分可以有任何数目的碳原子(而且可以进一步包括双键或三键)。例如，所期待的烷硫基包括甲硫基(MeS)、乙硫基、丙硫基等。

“烷胺基”这一术语系指与NH基连接的直链或支化烷基，其中烃部分可以有任何数目的碳原子(而且可以进一步包括双键或三键，或可以是环状的)。进而，该烷胺基的NH的氢可以有另一个烷基取代，导致一种二烷胺基，其中2个烷基可以相同也可以不同。这些烷基中的一个或两个可以任选地有OH基取代。因此，例示性烷胺基和二烷胺基包括甲胺基、二甲胺基、乙胺基、二乙胺基、2-丙胺基、2-羟基乙胺基等。

本文中使用的“卤素”这一术语系指氟、氯、溴、和碘。

也应当认识到，以上定义的基团全部或几乎全部可以有一个或多个取代基取代，该取代基也还可以有取代。例如，在烷基中的氢原子有氨基取代的情况下，该氨基上的一个或两个氢原子可以有另外的基团(例如烷基或烯基)取代。

本文中使用的“取代”这一术语系指一种原子或一种官能团(例如H、NH₂、或OH)用另一种原子或官能团置换，特别期待的官能团包括-NH₂，-OH，-SH，COOH，COOR，芳基，芳烷基，烷基，烯基，炔基，-NH₃ ⁺，卤素，NHCOR，NHCONH₂，NHCSNH₂，O(CH₂)_1- ₄COOH，OCH₂CONH₂，OCH₂CONHR，OC(Me)₂COOH，OC(Me)₂CONH₂，NHCH₂COOH，NHCH₂CONH₂，NHSO₂R，NHSO₂CF₃，OCH₂-杂环，PO₃H，SO₃H，(CH₂)_1-3COOH，CH＝CHCOOH，NHCOCH₂CH(OH)COOH，CH(PO₃H)₂，，NHCHO，且R是烷基。

期待的主链和连接键

总体上较好的是，本文中所期待的化合物的主链将包括至少一个碳水化合物片断和至少一个氨基酸片断，甚至更好的是，这两种片断是独立地重复的。因此，该主链的一般结构或子结构可以用式I表示

[(M)_x1(N)_y1]_z1[(M)_x2(N)_y2]_z2 式I

式中M独立地是一种碳水化合物片断(例如单糖或类似物)，N独立地是一种氨基酸，且x1、x2、y1、y2、和z1、z2独立地是1与若千万之间的整数，其中x1当y2大于或等于1时任选地为零，且其中y2当x1大于或等于1时任选地为零。应当说明的是，在x1和/或x2大于1的情况下，该碳水化合物片断典型地(例如经由缩合或糖苷键)共价地偶合在一起。类似地，在y1和/或y2大于1的情况下，该氨基酸典型地(例如经由酰胺键)共价地偶合在一起。本文中使用“主链”这一术语系指共价结合原子(例如碳、氧、或氮原子)或片断(例如氨基酸或单糖)的连续链，其中该原子或片断中任何一个的脱除都会导致链的断裂。

因此，除各种其它主链外，特别好的主链包括那些包括多个、任选地各异的肽部分者，而这些肽部分有多个、任选地各异的碳水化合物部分分开。最好，该肽部分将包含合成的或天然存在的寡肽或多肽，该寡肽或多肽是如此制备或改性的，以致该氨基酸线型序列的两端都有至少一个氨基可用于与各该碳水化合物部分的各自反应性基团反应。例如，虽然该肽的一端可以是有一个α-氨基的N-末端，但该肽的另一端(即C-末端)可以由一种碱性氨基酸(例如赖氨酸或精氨酸)生成，反之亦然，这在一个除α-位置外的位置上(例如赖氨酸的ε位)提供了该氨基。肽主链的一个例示性链段用式II说明(例如，式中R₁、R₂、R₃、和R₄独立地是H、任选地有取代的烷基或芳烷基)。

式II

类似地，所期待的主链的碳水化合物部分可以有颇大差异，而且总体上期待的是，该碳水化合物部分将包括至少一种或多种单糖或如以上定义的多醇，这些可以独立地呈开链构型或呈环状形式。最好，该碳水化合物部分包括一种天然存在碳水化合物，但许多碳水化合物类似物、合成碳水化合物、及其所有合理的组合也是所期待的。进而，天然存在碳水化合物部分典型地以这样一种方式改性，以致能与肽部分的反应性基团反应。因此，应当认识到，该碳水化合物部分的端基可以是天然存在的基团、尤其包括OH基、CHO基、和COOH基。然而，在需要的情况下，应当知道，可以将适用的反应性基团导入该碳水化合物部分。例如，这样的反应性基团包括特定的离去基团、羰基卤等。碳水化合物部分的一个例示性链段说明于式III中(例如，式中R独立地是H、OH、COOH、CH₂OH、烷氧基、NH₂、NHCO-烷基、任选地有取代的烷基或芳基)。

式III

典型地，所期待化合物的平均分子量将是约百至数十万、甚至更高。进而，因所期待碳水化合物部分和/或氨基酸部分的具体结构而异，所期待化合物的主链可以是线型的、线型而有环状部分、支化的、或环状的。在又进一步期待的方面，按照本发明主题的嵌合体聚合物也可以包括化学上不同于本文中所期待的氨基酸和/或碳水化合物的另外片断/部分。例如，适用的聚合物可以包括经由亚烷基、聚乙二醇、聚醚、或其它基团或连接剂片断彼此偶合的碳水化合物和/或肽片断。最典型地，这样的另外片断/部分共价地偶合到本文中所期待的氨基酸和/或碳水化合物部分。

进而，所期待化合物中的主链也可以是支化的。在这样的化合物中，该碳水化合物和该氨基酸中至少一种将包括一个或多个能偶合到另一种碳水化合物和/或氨基酸上的官能团。最典型地，所期待化合物中分支的数目将取决于该碳水化合物和/或氨基酸的具体结构、和所希望的用途。因具体的结构而异，分支可以用于交联2条或更多条主链，因而，所期待化合物也可以视为三维网络。替而代之，或此外，支化聚合物也可以通过多官能共聚单体的添加来合成，该共聚单体可以在该碳水化合物和/或氨基酸片断之间偶合。

当然，应当知道的是，该碳水化合物片断和/或氨基酸片断可以分别制备、然后彼此偶合生成一条主链。这样的偶合可以直接地(例如，经由糖的羟基与氨基酸的羧基之间的酯键，或经由糖的羧基与肽的氨基之间的酰胺键)或经由衔接物间接地进行，该衔接物可以不同于该碳水化合物和/或氨基酸片断(例如二醇衔接物)。替而代之或此外，可以采用包含糖部分和氨基酸部分的2条或更多条主链之间的交联剂来增加结构复杂性。这样的交联剂可以包含一个或多个碳水化合物片断和/或氨基酸片断，也可以是完全不同的。

在本发明主题的另外方面，也期待的是，该主链的至少一端共价地偶合到该主链上的一个位置而形成一种环状结构。例如，在该主链的两端彼此共价地偶合的情况下，生成一条全环状主链。这样的环状主链可以特别有利地提供改进的、对外作用肽酶、酯酶和糖苷酶的抗性。在另一个实施例中，该主链的一端也可以偶合到该主链的一种侧链官能团上而形成一种拴马索型结构(在这样的偶合发生的情况下，双拴马索型结构也是所期待的)。在这样的聚合物的氨基酸部分内2个半胱氨酸残基的情况下，有二硫化物(-S-S-)键的环状结构也是所期待的。

关于该碳水化合物部分和/或该氨基酸部分的序列，应当认识到，该序列可以是为某一特定目的设计的，也可以是一种无规序列。例如，有未表征化学组成和结构的现行碳水化合物制剂(例如，来自植物细胞的细胞壁制剂)可以偶合到已表征的寡肽上，形成一种杂基材。类似地，可以分离出或合成地制备一种包括一个有已知功能的链段的肽片断(例如亮氨酸拉链、或螺旋转螺旋结构、或细胞表面结合表位例如RGD等)，然后可以将该片断偶合到一种已表征来源或未表征来源的碳水化合物上。在又进一步期待的方面，应当认识到，该碳水化合物片断和该肽片断中至少一种可以包括一种有已知功能的分子的至少一部分。例如，碳水化合物片断可以包括与细胞识别、细胞粘合、小分子结合(例如外源凝集素型或离子结合)相联系的部分。类似地，肽片断可以包括与催化功能(氧化还原酶、水解酶、裂合酶、连接酶等)。化学功能(例如某些酶的水解、蛋白水解等)、细胞识别功能(例如integrin结合的RGD等)、结构功能(例如胶原蛋白、肌球蛋白、微管蛋白等)、或其它功能(例如生长因子、转录因子、细胞动力因子、趋化因子等)相联系的部分。进而，该碳水化合物和肽部分中至少一种当它们从其母体聚合物降解出来时可以充当药理学活性剂。例如，一种或多种肽片断一旦从相邻碳水化合物片断释放出来就会有医药活性(例如GnRH)。

应当进一步认识到，在碳水化合物片断和/或氨基酸片断有已知配体的情况下，这样的配体可以包括在所期待的组合物中。例如，在该氨基酸片断有聚天冬氨酸链的情况下，可以让阳离子(尤其Ca²或Mg²⁺)偶合(结合)到这样的片断上。类似地，在该碳水化合物片断有已知的对其它碳水化合物(例如外源凝集素)的亲合性的情况下，适用的配体可以包括在该组合物中。尤其应当指出的是，该主链中氨基酸和/或单糖的进一步衍生或审慎使用可以给该嵌合体聚合物提供所希望的性能。例如，可以将杂聚合物设计得具有特定净电荷、电荷比、或设计得完全中性的，如以下结构III的例示性结构所说明的：

结构III

类似地，也可以将杂聚合物设计得具有与水溶液的特定相互作用(例如，是亲水的、两亲的、或疏水的)，如以下结构IV的例示性结构所说明的：

结构IV

替而代之或此外，还可以将官能团或其它分子实体添加到该碳水化合物部分和/或该肽部分上，以实现该嵌合体聚合物的特定功能。例如，在所期待的材料与细胞接触的情况下，期待的是，该肽部分可以包括粘合因子或能与细胞表面成分相互作用的其它肽。类似地，该碳水化合物部分可以包括外源凝素(例如作为侧链)或能与细胞的一种或多种表面成分相互作用的触角碳水化合物。进一步期待的改性包括附着于主链上的一种或多种催化片断、结合片断、信号发生片断、和/或交联片断(要么直接附着于该主链的一个原子上，要么经由该主链外的一个侧链基团，要么经由外加的衔接物)。

因此，应当知道的是，所期待化合物的二维或三维网络的形成可以与该主链的形成同时形成，但也可以在这样一种反应中单独形成，其中将交联性主链(或其它结构，见以下)添加到多条预制主链中。例如，在反应性侧链基团附着到该主链上(例如肽部分的酪氨酸的苯酚基)的情况下，可以采用这样的基团作为交联目标并使用一种或多种交联剂进行。

所期待的用途

本发明者意外地发现，所期待的化合物中至少一些(最可能很多)在离体系统中、甚至在活体系统中是低毒至无毒的，还发现这样的化合物显示出优异的生物兼容性。因此，本文中陈述的组合物和方法可认为在活体应用和/或离体应用中是特别有价值的，其中该嵌合体聚合物发挥结构性作用、生理学作用、和/或药理学作用。除其它例示性用途外，所期待的杂聚物可用来作为医疗器件(例如暂时植入物或永久植入物)的涂布材料、作为(诸如干扰素、胰岛素等，有或无定时释放性能的)药物输送载剂、作为细胞培养物的可再吸收或永久性平台(例如在组织培养物中或用于培养干细胞)、作为食品和nutraceutical成分与添加剂、作为化妆品应用的局部和内部无毒赋形剂、和/或作为整体植入物材料。应当认识到，因肽结构而异，所期待的聚合物可能随pH、温度、和/或可用于经口、经粘膜或经局部施用的离子浓度的变化而发生溶胶-凝胶过渡。

应当认识到，所期待组合物有许多用途，而且具体用途将至少部分地决定特定结构，反之亦然。除其它用途外，特别期待的用途包括这样的用途，其中按照本发明主题的化合物用来作为可生物兼容的结构元件或涂料、作为医药剂载体、作为其它(任选地以可释放方式附着的)分子的平台、作为(有或无定时释放性能的)医药输送载剂、作为细胞培养物(例如在组织培养物中)的可再吸收或永久性平台、作为食品和nutraceutical成分与添加剂、作为化妆品应用的局部和内部无毒赋形剂、和/或作为植入物材料。例如，较好的可生物兼容结构元件包括可以支撑一种组织的局部和可注射化妆品组合物，其中该组合物可以包括胶原蛋白或胶原蛋白碎片，且其中该胶原蛋白是经由一种1-4-α-糖苷寡糖偶合到另一种胶原蛋白上的。替而代之，该结构元件可以用来作为细胞培养物的支撑体以有助于特定组织和/或器官的形成。在这样的实例中，较好的是，所期待的化合物是相对亲水的，而且会有凝胶状稠度。进而，这样的化合物对于干细胞生长来说较好是可生物兼容的。

可生物兼容涂料可以包括这样的涂料，其中(金属)植入物被覆所期待的化合物，以减少植入物/组织排异。在利用所期待化合物作为医药载体的情况下，应当认识到，该医药的释放可以以许多方式控制。例如，该医药可以用可生物兼容生物聚合物封装，且生物降解和/或侵蚀可以以一种预定方式释放该医药。替而代之或此外，该医药可以共价地、离子型地、或以其它方式偶合到该碳水化合物和/或肽片断上，使得酶促(例如酯酶或肽酶)或非酶促反应(例如经由氧化还原)就会释放该医药。例如，带正电荷聚合物可以用来作为基因输送载剂，其中该聚合物中氨基酸的正电荷与核酸的带负电荷磷酸根相互作用。在又进一步期待的方面，按照本发明主题的化合物将充当一种平台，使一种或多种分子实体以一种预定方式或随机方式附着。这样的化合物可以例如用来作为组合体库载体，而该大分子平台将充当一种可衍生固相。

在又进一步期待的方面，按照本发明主题的材料可以用来作为所希望生物学结构(例如血管内膜层)或非生物学结构(例如支架)上的层状涂料。最好，层状涂料可以包含交替层，其中一层在某一pH时有正净电荷，而另一层在相同pH时有负净电荷。这样的多层涂料可以用文献上充分记载的逐层沉积方法制备。这样的层主要由于库仑相互作用而将强烈地相互粘附。进而，尤其在这些层形成于支架上的情况下，期待的是，其中至少一层可以包括一种细胞和/或一种能释放NO的化合物，最好内皮细胞和硝普盐。

实验

总体考虑

所期待的合成路线

根据相对简单的化学及其许多众所周知的程序，其中许多排列可以以一种概念上无苛求方式生产。最好，该嵌合体聚合物的合成是使用预制肽部分和预制碳水化合物部分执行的。例如，肽部分和碳水化合物部分可以通过来自肽单体和碳水化合物单体的羧基与氨基之间的酰胺键形成而彼此共价地偶合。在另一条路线中，肽部分和碳水化合物部分可以使用一种双内酯和一种有2个末端氨基的肽的开环聚合而彼此共价地偶合，如以下流程I中所示。

流程I

替而代之，该碳水化合物部分可以改性得具有末端叠氮基，然后利用Click化学使其与一种有末端乙炔基的肽反应生成该嵌合体聚合物，如以流程II中例示性说明的。

流程II

在又另一种期待的思路中，该肽部分改性得包括末端羟胺基，而糖部分改性得包括末端α-酮酸基。然后通过N-烷基羟基胺与α-酮酸的缩合进行该嵌合体分子的聚合，如以下流程III的实例中所说明的。

流程III

所期待的聚合物的交联

如此制备的嵌合体聚合物的交联可以以许多相对简单的方式执行。最典型地，交联可以利用能与该主链的侧链基团形成(共价)键的外源添加交联剂的添加执行，和/或利用该主链和/或侧链中已经存在的化学执行。例如，如以下流程IV中所说明的，嵌合体聚合物是从一种有末端氨基的含酪氨酸三肽和一种有活化末端酸基如酰氯的糖部分制备的。然后，这样生成的嵌合体聚合物要么以一种过氧化物酶引发的反应要么以一种光催化氧化反应交联，形成各主链之间的苯-苯键。另外的和/或替代的交联方式，例如主链中半胱氨酸残基所形成的二硫化物(-S-S-)键，也是所期待的，而且尤其包括那些其中各聚合物之间的相互作用是一种非共价相互作用者。例如，适用的交联相互作用包括(NH₃ ⁺与COO^-)之间的离子型相互作用、(OH、NH₂、COOH、SH、CONH₂)之间的氢键合相互作用、和范德华力引起的疏水相互作用。

反应条件：

i)界面聚合，H₂O/CCl₄：ii)50％TFA/H₂O

iii)辣根过氧化物酶(HRP)，HOOH；iv)Ru(ii)和过硫酸铵(APS)

流程IV

官能化嵌合体聚合物的制备

类似于交联，官能化可以以许多方式进行，而且可以通过添加外源官能团(例如标记物、结合部分、催化部分、医药活性部分等)和/或在该主链的侧链基团和/或该主链本身中包括官能团来采用。该官能化可以要么通过官能性共聚单体的共聚要么通过聚合后官能化进行。一种例示性官能化方式见以下流程V，其中一种RGD肽改性的肽部分用开环聚合化学与其它非改性肽部分组合，如以上所说明的。

流程V

合成例

以下方案和程序是作为业内普通技术人员的例示性指导提供的。然而，不应当认为它们是对本发明主题的限制，因为氨基酸/肽成分和/或碳水化合物成分可以容易地用等效成分置换而不背离本文中陈述的发明概念。除其它地方外，还除述了以上所期待的碳水化合物和所期待的肽和氨基酸链段的例示性变异。在如以下所述的离体环境和活体环境中测试了其中一些例示性嵌合体聚合物(见结构V：二赖氨酸、三赖氨酸、和四赖氨酸衍生的半乳糖共聚物。

结构V

如以下进一步描述的，测试了Poly 1-3的基因输送应用。由于所期待的结构是可高度适配的，因而可相对容易地进行结构变异以优化基因转染水平同时维持相对低水平的细胞毒性。所执行的初期操作涉及用附加的L-赖氨酸残基使该肽单体序列延长，从而提高该聚合物总体的电荷密度，且从而提供更强的DNA结合。应当认识到的是，在提高的电荷密度改善了该聚合物系统的基因转染性的情况下，可以添加更多的残基直至发现最佳长度。实测五赖氨酸单体不溶于水、或水/溶剂混合物中。由于这个原因，尝试了溶液相聚合以得到小聚合物链和环状结构。以下结构VI中给出了环状结构的一个实例。

结构VI(左：受保护形式；右：脱保护后)

还尝试了进一步的合成路线，以在溶液相中生成六赖氨酸聚合物。然而，利用这样的思路，该聚合物链并没有生成，而有某种环形成。以上聚合的Mn是约70,000，而Mw是2,000,000以上。以上聚合物的多峰分子量分布(如HPLC洗脱所证实的)指出，可能有若干种不同的聚合机理在起作用。流程VI说明了使用七赖氨酸单体使用偶合试剂的聚合(反应条件：10:1＝DMF/水，EDC 4.4eq，DMAP催化，TEA 2.2eq)。

流程VI

在一条不同的思路中，本发明者指出，通过添加一种组氨酸残基，可以在该聚合物处于细胞内部的同时达到质子海绵效应，使得核内体逸出。作为一种潜在后果，在此前已知的转染中添加氯奎，再也不会需要成为DNA向细胞核的健康转染的一种添加剂。结构VII说明了有组氨酰衔接物的例示性聚合物，而结构VIII说明了为用于聚合而合成的例示性组氨酸单体。

结构VII

结构VIII

以下流程VII说明含组氨酸单体的例示性聚合流程(反应条件：水，MeOH，Na₂CO₃，CCl₄)。如Mn所示，该聚合条件可以进一步优化

流程VII

改进的碳水化合物-肽共聚物合成结果

该组氨酸单体的合成是大规模进行的，以进一步试验聚合条件。含组氨酸肽部分的一种例示性合成路线说明于流程VIII中。

流程VIII

反应条件是：a)与EDC/HOBt偶合，b)用二甲胺(DMA)/THF脱保护，c)与EDC/HOBt/FmocHis(Boc)OH偶合，d)与EDC/HOBt/FmocLys(Boc)OH偶合，e)用H₂Pd/C脱保护。让这种合成达到最终单体前的化合物，并在最终单体加氢和分离时，用¹H NMR和ESMS指出该化合物已经失去一些Boc保护基(峰“k”在脱保护期间消失)，如以下谱图中所示。

这样的事件可能在γ氮上发生，如NMR所证实的。这个位置上的保护基比典型的Boc基团更不稳定，因为它位于一种咪唑环上。为了克服随后步骤中的潜在问题，探讨了改变聚合物的替代路线。结构IX显示例示性的五聚、六聚、和七聚单体。

结构IX

碳水化合物单体简化

根据初步实验，显然糖单体合成可以缩短到一步酯化，得到一种会与二胺发生缩合反应而生成酰胺键的化合物，如流程IX中所示。这条路线是生成聚酰胺的酰氯路线，而不是生成聚酰胺的缩合反应。

流程IX

应当说明的是，如果这条路线在生成高Mn聚合物方面是可行的，则它会省略三个合成步骤。以下流程X(与二赖氨酸单体和二酯的缩合反应)显示以这种方式生成二赖氨酸糖共聚物的2种尝试的结果。显而易见地，这些尝试给出相对低的聚合物产率。然而，反应条件的优化可望提供改善的产率。

流程X

肽单体简化

根据初期转染结果，本发明者发现，三赖氨酸聚合物给出最高的转染水平，而且发现四赖氨酸给出可比结果。在一种进一步的思路中，添加了组氨酸残基。可以认为这些残基具有可提高该聚合物的转染水平的质子海绵效应。所期待的是，高结合效率(来自赖氨酸残基)和低pKa片断(来自组氨酸残基)是所需要的。因此，用赖氨酸单体、组氨酸单体和碳水化合物单体制备了一种ABC共聚物，如以下流程XI中所示：

流程XI

应当说明的是，这种聚合物不仅更容易取得(只要有更加收敛的合成)，而且该聚合物也是高度万能的。进而，可以添加不同数量的组氨酸和赖氨酸单体以给出不同掺入比例的官能团，从而导致有不同性能的不同聚合物。结构X说明了例示性Z保护单体。

结构X

材料：试剂是从Alrich公司(威斯康星州密尔沃基)收到就使用的，例外的是氨基酸和偶合试剂，这些购自NovaBiochem(加利福尼亚州圣迭戈)。所有反应都在氮气氛围下执行，并使用火焰干燥玻璃器皿。用于水敏反应的所有溶剂都是干燥的、用蒸馏法或用氧化铝过滤系统精制的。萃取溶剂是商业级的。闪急色谱法是用所指出的溶剂系统在Fisher硅胶60(230～400目)上强制流动进行的。

总体考虑：凝胶渗透色谱法(GPC)是使用一个Agilent 1100系列GPC-SEC分析系统连同Polymer Labs公司的混合床Plgel Mixed-C柱一起进行的。洗脱剂是THF，使用0.5mL/min的流量率。校准是使用Aldrich聚苯乙烯作为标准物进行的。¹H NMR谱是使用500MHz Bruker仪器获得的，而¹³C NMR是使用125MHz Bruker仪器获得的。NMR化学位移是作为δ值报告的，用相对于TMS或氘气代溶剂而言的ppm表示。数据表述如下：化学位移，峰裂数(s＝单峰，d＝双峰，t＝三峰，q＝四峰，m＝多峰)，用Hz表示的偶合常数和积分。多峰是在它们出现的范围(用ppm表示)内报告的。碳NMR数据是相对于溶剂信号记录的。质谱数据是用一台Micromass Autospec谱仪得到的。燃烧分析由AtlanticMicrolab(佐治亚州诺克罗斯)进行。

Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Z)-OMe的合成。向二异丙基乙基胺(2.8mL，16.1mmol)在DCM(100mL)中的0℃溶液中添加Lys(Z)OMe(5.0g，15.1mmol)。向此溶液中添加FmocLys(Boc)OH(7.08g，15.1mmol)、然后添加HOBt(2.04g，15.1mmol)、最后添加EDC·HCl(2.90g，15.1mmol)。让这种溶液搅拌8h，此时该有机溶液用1N HCl(3×20mL)洗涤、然后用饱和NaHCO₃(3×20mL)洗涤、最后用H₂O(3×20mL)洗涤。有机层真空浓缩，得到一种白色固体(1)(9.81g，87％产率)：

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ 7.79(d，J＝7.51，2H)，7.63(d，J＝7.23，2H)，7.42-7.32(m，9H)，7.20(s，1H)，5.95(s，1H)，5.70(s，1H)，5.25(s，1H)，5.15(m，1H)，5.05(s，1H)，4.92(s，1H)，4.60-4.21(m，6H)，3.75(s，3H)，3.18-3.09(m，5H)，2.00-1.65(m，6H)，1.47(brs，27H)，1.40-1.25(m，6H)；¹³CNMR(125MHz，CDCl₃)δ 173.1，172.0，157.1，156.7，156.6，144.2，141.7，137.17，128.9，128.6，128.5，128.3，128.2，127.6，125.6，125.5，120.4，79.5，67.5，67.2，66.9，55.2，54.0，53.7，52.8，52.5，47.5，40.8，40.4，40.3(2)，32.6(2)，31.8(2)，29.9(3)，29.6，28.9，28.8，23.0，22.8；

C₄₁H₅₂N₄O₉(M+Na)⁺的HRMS(FAB)m/z计算值767.3632、实测值767.3645。

Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Z)-OMe(2)的合成。在0℃，向1(4.16g，5.58mmol)在THF(55mL)中的溶液中添加二甲胺(28mL，2M，56.0mmol)。让此反应达到室温、搅拌2h。此时，将反应混合物真空浓缩。向该黄色固体中添加DCM(75mL)和DMF(25mL)。向此溶液中添加Fmoc-Lys(Boc)-OH(2.18g，4.64mmol)、然后添加HOBt(0.627g，4.64mmol)、然后添加EDC·HCl(0.890g，4.64mmol)。让此溶液搅拌8h，此时该有机溶液用1N HCl(3×15mL)、然后用饱和NaHCO₃(3×15mL)、最后用H₂O(3×15mL)洗涤。有机层用MgSO₄干燥、真空浓缩，得到一种白色固体。柱色谱法(2％MeOH，CHCl₃)精制给出产品2(3.42g，63％产率)：

¹HNMR(500MHz，CDCl₃)δ 7.74(d，J＝7.55，2H)，7.58(d，J＝7.35，2H)，7.38-7.25(m，15H)，7.00(br d，2H)，5.50(br，s，1H)，5.16-5.09(m，5H)，4.55(br s，1H)，4.36(m，3H)，4.25-4.10(m，2H)，3.61(s，3H)，3.16-3.10(m，6H)，1.81-1.39(m，23H)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ173.1，172.0，157.1，156.74，156.6，144.2，141.7，137.2，128.9，128.6，128.5，128.3，128.2，127.6，125.6，125.5，120.4，79.5，67.5，66.9，55.2，52.8，52.5，47.5，40.8，40.4，40.3，32.6，31.8，29.9，29.6，28.9，28.8，23.0，22.8；HRMS(FAB)m/z

C₅₂H₇₂N₆O₈(M+Na)⁺计算值995.5106，实测值995.5132。

FmocHis(Tr)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-BocLys(Z)的合成：向Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-BocLys(Z)(4.83g，4.97mmol)在THF(100mL)中的溶液中在0℃添加二甲胺(38mL，2M，64mmol)。让此反应达到室温、搅拌2h。此时将反应混合物真空浓缩。让该固体通过一个硅石塞，先用2％MeOH/CHCl₃、然后添加0.5％TEA并使极性提高到5％MeOH、洗脱。使该产品真空浓缩。向该固体(3.36g，4.47mmol)中添加DCM(45mL)和DMF(20mL)。向此溶液中添加Fmoc-His(Boc)-OH(2.24g，4.69mmol)、然后添加HOBt(0.634g，4.64mmol)、然后添加EDC·HCl(0.899g，4.69mmol)。将此溶液搅拌8h，此时有机溶液用水(1×20mL)、然后用1N HCl(3×20mL)、然后用饱和NaHCO₃(3×20mL)、最后用H₂O(3×20mL)洗涤。该有机层用MgSO₄干燥、真空浓缩，得到一种白色固体。柱色谱法(0～2％MeOH，CHCl₂)精制给出产品：

¹H NMR(500MHz，d₆DMSO)δ 8.30(s，2H)，8.18(m，1H)，8.09(s，1H)，8.04(br s，1H)，7.95(br s，1H)，7.87(m，2H)，7.64(m，2H)，7.55(br m，1H)，7.41-7.22(m，11H)，6.71(brm，2H)，5.00(s，2H)，4.35-4.16(m，7H)，3.60(s，3H)，2.98-2.82(m，9H)，1.70-1.45(m，16H)，1.44-1.28(m，35H)；¹³C NMR(125MHz，d₆DMSO)δ172.4，171.7，171.3，156.1，155.8，155.5，146.6，143.7，143.6，140.7，140.6，139.5，137.2，136.6，128.3，127.7，127.6，127.0，125.3，125.2，120.1，120.0，114.4，85.0，79.2，77.3，65.8，65.1，51.9，51.7，46.6，31.8，30.4，29.3，29.2，29.0，28.2，27.3，22.6，22.5；ESMS(FAB)m/zC₆₃H₈₇N₉O₁₅(M+H)⁺计算值1210.64、实测值1210.57。

Boc-Lys(Z)His(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-BocLys(Z)的合成：向FmocHis(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-BocLys(Z)(2.32g，1.92mmol)在THF(40mL)中的溶液中，在0℃添加二甲胺(19.2mL，2M，38.4mmol)。让此溶液达到室温并搅拌2h。此时将反应混合物真空浓缩。让该固体通过一个硅石塞，先用2％MeOH/CHCl₃、然后添加0.5％TEA、并将极性提高到5％MeOH、洗脱。产品真空浓缩。向该固体(0.880g，0.89mmol)中添加DCM(20mL)和DMF(6mL)。向此溶液中添加Boc-Lys(Z)-OH(0.4063g，1.06mmol)、然后添加HOBt(0.144g，1.06mmol)、然后添加EDC·HCl(0.205g，1.06mmol)。此溶液搅拌8h，此时该有机溶液用水(1×10mL)、然后用1N HCl(3×10mL)、然后用饱和NaHCO₃(3×10mL)、最后用H₂O(3×10mL)洗涤。该有机层用MgSO₄干燥、真空浓缩、得到一种白色固体。柱色谱法(0～2％MeOH，CHCl₃)精制给出产品：

¹H NMR(500MHz，d₆DMSO)δ 8.31(s，1H)，8.15(brs，1H)，8.05(s，1H)，7.97(br m，2H)，7.83(brs，1H)，7.40-7.15(m，13H)，6.90(br s，1H)，6.65(br s，2H)，5.00(s，4H)，4.52(br s，1H)，4.35-4.15(m，3H)，3.80(br s，1H)，3.60(s，3H)，3.05-2.75(m，10H)，1.72-1.40(m，18H)，1.39-1.12(m，46H)；¹³C NMR(125MHz，d₆ DMSO)δ 172.4，171.7，171.1，156.0，155.5，146.6，138.9，137.3，136.5，128.3，127.7，114.5，85.1，79.2，78.2，77.3，65.1，51.9，51.7，31.3，30.4，29.1，29.0，28.2，28.1，27.3，22.7，22.5；ESMS(FAB)m/z

C₆₇H₁₀₃N₁₁O₁₈(M+H)⁺的计算值1350.75、实测值1351.6。

(Boc)Lys(Z)-His(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys-OMe的合成。向(Boc)Lys(Z)-His(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys-OMe(0.88g)在MeOH(50mL)的氯仿(10mL)中的溶液中添加Pd/C(0.20g)。此溶液用H₂吹扫30min，然后与H₂气球连接。让反应进行8h，此时该混合物通过Celite过滤、真空浓缩，得到纯产品：

¹HNMR(500MHz，d₆DMSO)δ 8.32(br s，1H)，8.05(s，2H)，7.95(brs，2H)，7.28(s，1H)，6.95(brs，1H)，6.78(br s，2H)，4.55(br s，2H)，4.35-4.15(br m，4H)，3.83(br s，2H)，3.61(s，3H)，2.95-2.80(br s，6H)，2.65-2.75(brm，4H)，1.72-1.39(m，19H)，1.38-1.15(m，36H)；¹³C NMR(125MHz，d₆DMSO)δ 172.3，171.8，171.2，170.8，155.5，146.6，138.8，136.53，134.0，114.5，85.13，78.17，77.3，54.4，52.5，52.3，51.8，31.5，31.0，29.3，29.2，28.3，28.1，27.4，27.0，22.5，22.4，22.3；ESMS(FAB)m/z

C₅₁H₉₁N₁₁O₁₄(M+H)⁺的计算值1082.68、实测值1082.85。

组氨酸官能化聚合物的合成。化合物5(0.280g，0.259mmol)连同Na₂CO₃(0.603g)一起在3mL H₂O和0.5mL MeOH中搅拌。向这种剧烈搅拌的溶液中添加半乳糖二酰氯(0.085g，0.259mmol)在2.0mL CCl₄中的溶液。这种双相混合物在室温搅拌30min。沉淀物用过滤法收集、用水洗涤，得到一种白色固体。Mn＝2000g/mol。

2:3-4:5-四羟基半乳糖二酸二丁酯(6)的合成。将半乳糖二酸(30.0g，0.143mol)、1-丁醇(220mL)和浓H₂SO₄(6mL)的混合物在一台含有

分子筛的Soxhlet萃取器中回流加热24h。让反应混合物冷却到室温、过滤。滤饼用饱和NaHCO₃(100mL)洗涤、干燥，得到纯二酯(1，32.2g，70％)：

¹HNMR(500MHz，d₆DMSO)δ 4.87(d，J＝9.88，2H)，4.79(dd，J₁＝3.20，J₂＝7.44，2H)，4.29(d，J＝9.42，2H)，4.07(m，4H)，3.77(d，J＝7.34，2H)，1.58(m，4H)，1.32(m，4H)，0.88(m，＝6H)；¹³C NMR(125MHz，d₆DMSO)δ 174.6，72.2，71.1，64.6，31.2，19.5，14.5；HRMSm/zC₁₄H₂₆O₈(M+Na)⁺的计算值323.1706、实测值323.1707。C₁₄H₂₆O₈的分析计算值：C，52.16；H，8.13。实测值：C，52.15；H，8.15。

2:3-4:5-二-O-偏亚异丙基半乳糖二酸二丁酯(7)的合成。向6(10g，31mmol)在无水丙酮(100mL)中的充分搅拌溶液中添加浓H₂SO₄(3.0mL)和无水MgSO₄(5.0g)。此物料在室温搅拌24h，此时该反应混合物用NaHCO₃中和。然后将反应混合物过滤。添加水(100mL)使固体产品从滤液中沉淀出来。将沉淀滤出、干燥、用乙醇重结晶，得到白色结晶固体状7(8g，64％)。

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ 4.60-4.57(m，1H)，4.48-4.45(m，1H)，4.20(t，J＝6.7，2H)，1.68-1.62(m，2H)，1.50(s，3H)，1.40(s，3H)，1.41-1.37(m，2H)，0.93(t，J＝7.4，3H)；¹³CNMR(125MHz，CDCl₃)δ 171.0，12.3，79.2，76.0，65.5，30.5，27.0，26.0，19.0，13.6；HRMS m/z

C₂₀H₃₄O₈(M+Na)⁺的计算值403.2332，实测值403，2332。C₂₀H₃₄O₈的分析计算：C，59.68；H，8.5；实测值：C，60.02；H，8.35。

2:3-4:5-二-O-偏亚异丙基半乳糖二酸(8)的合成。2:3-4:5-二-O-偏亚异丙基半乳糖二酸二丁酯7(2.66g，5.38mmol)在5mL NaOH(0.84g，21.6mmol)水溶液中加热回流12h进行水解。让该反应溶液冷却到室温，然后添加12mL 2N HCl。此溶液用冰浴冷却。冷却时生成一种白色沉淀物。将固体滤出、用乙醇重结晶，得到8(1.07g，68％)：

¹H NMR(500MHz，d₆ DMSO)δ 13.17(s，2H)，4.45(m，2H)，4.38(m，2H)，1.38(s，6H)，1.33(s，6H)；¹³C NMR(125MHz，d₆ DMSO)δ 172.2，111.0，78.5，74.9，26.8，25.8；

C₁₂H₁₈O₈的分析计算值：C，49.65；H，6.25。实测值：C，49.49；H，5.98。

2:3-4:5-二-O-偏亚异丙基半乳糖二酰氯(9)的合成。向酸8(0.5g，1.72mmol)在20mL CH₂Cl₂(DCM)中的悬浮液中添加新蒸馏的亚硫酰二氯(0.5mL，6.38mmol)。2h后向此悬浮液中加一滴DMF。该反应混合物在室温搅拌12h，直至得到一种清澈溶液。该混合物通过一种0.2μm PTFE过滤器过滤、真空浓缩，得到一种无色固体状二酰氯9(0.53g，94％)：

¹HNMR(500MHz，d₆ DMSO)δ 4.82(m，2H)，4.58(m，2H)，1.53(s，6H)，1.44(s，6H)；¹³C NMR(125MHz，d₆DMSO)δ 173.9，114.7，83.6，27.5，26.3；

C₁₂H₁₆Cl₂O₆的分析计算值：C，44.05；H，4.93。实测值：C，43.75；H，5.07。

Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OMe(10)的合成。向Z-Lys-OMe·HCl(4.347g，13.14mmol)在无水DCM(75mL)中的冰冷溶液中添加二异丙基乙胺(2.29mL，13.14mmol)，随后添加Z-Lys(Boc)-OH(5.00g，13.4mmol)、HOBt(1.776g，13.14mmol)和EDC·HCl(2.519g，13.14mmol)。反应混合物在室温搅拌8h。然后，该有机溶液用1N HCl(3×30mL)、饱和NaHCO₃(3×30mL)和水(3×30mL)洗涤。有机层用MgSO4干燥、真空浓缩，得到一种白色固体。粗产品通过用30％EtOAc/己烷结晶精制。分离出无色固体状化合物10(7.123g，82.6％)：

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ 7.36-7.26(m，10H)，6.77(br s，1H)，5.29(brs，1H)，5.12-5.06(m，5H)，4.54(m，1H)，4.11(m，1H)，3.68(s，3H)，3.18-3.11(m，4H)，1.80-1.45(m，8H)，1.42(s，9H)，1.31-1.36(m，4H)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ 172.5，156.5，155.8，136.5，136.4，128.4，128.3，128.1(2)，128.0(2)，127.9(2)，127.7(2)，79.9，66.5，66.4，53.9，52.2，51.9，40.3(2)，31.9，31.4，29.2，29.0，28.2(3)，22.3，22.1，

C₁₄H₂₆的分析计算值：C，62.18；H，7.37；实测值：C，62.33；H，7.44。

Boc-Lys-Lys-OMe(11)的合成。将二赖氨酸10(7.43g，0.0113mol)溶解于MeOH(100mL)中。用氮气吹扫之后，添加10％Pd/C(0.30g)。然后该烧瓶用氢吹扫，反应混合物搅拌过夜。经由Celite层过滤除去Pd/C。向滤液中添加三氟乙酸(TFA，1.8mL，0.023mol)、然后真空脱除溶剂，给出粘性油状物。用20mL二乙醚研制，得到一种白灰色物质。所得到的物质真空干燥，给出玻璃状固体产品11(6.4g，92％)：¹H NMR(500MHz，d₆ DMSO)δ 8.19(d，J＝7.5，1H)，7.90(brs，6H)，6.82(d，J＝8.0，1H)，4.23(m，1H)，3.91(m，1H)，3.61(s，3H)，2.75(m，4H)，1.36-1.61(m，21H)；¹³C NMR(125MHz，d₆DMSO)δ 172.4(2)，158.4(q，2)，155.3，117.2(q，2)，78.0，53.9，51.6，38.7，38.6，31.2，30.3，28.1(3)，26.7，26.5，22.3，22.2；HRMS(FAB)m/z

C₂₂H₃₈F₆N₄O₉(M+H)⁺的计算值389.2764，实测值389.2767。

Boc-Lys(Z)-Lys(Boc)-Lys(Z)-OMe(12)的合成。在0℃，向1(2.405g，3.23mmol)在THF(50mL)中的溶液中添加二甲胺(16mL，2M，32.3mmol)。让此反应达到室温、搅拌2h。此时，将反应混合物真空浓缩。向该黄色的固体中添加DCM(50mL)和DMF(10mL)。向此溶液中添加Boc-Lys(Z)-OH(1.23g，3.23mmol)、然后添加HOBt(0.458g)、然后添加EDC·HCl(0.650g，15.1mmol)。让此溶液搅拌8h，此时该有机溶液用1N HCl(3×15mL)、然后用饱和NaHCO₃(3×15mL)、最后用H₂O(3×15mL)洗涤。该有机层用MgSO₄干燥、真空浓缩，得到一种白色固体。柱色谱法(2％MeOH，CHCl₃)精制给出产品12(1.86g，65％产率)：

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ7.74(d，J＝7.55，2H)，7.58(d，J＝7.35，2H)，7.38-7.25(m，15H)，7.00(br d，2H)，5.50(br，s，1H)，5.16-5.09(m，5H)，4.55(brs，1H)，4.36(m，3H)，4.25-4.10(m，2H)，3.61(s，3H)，3.16-3.10(m，6H)，1.81-1.39(m，23H)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ 172.7，172.2，156.8，156.5，156.2，143.9，143.8，141.4，141.3，136.7，128.5，128.3，128.1，127.8，125.2(2)，120.1，79.9，67.2，54.7，53.6，52.5，50.2，47.2，40.3，32.4，31.4，29.6，29.3，28.6(3)，22.4；HRMS(FAB)m/z C₄₅H₆₈N₆O₁₂(M+H)⁺的计算值885.4974，实测值885.4977。

Boc-Lys-Lys(Boc)-Lys-OMe(13)的合成。向12(0.88g，0.99mmol)在MeOH(25mL)和DCM(25mL)中的溶液中添加Pd/C(0.20g)。这种溶液用H₂吹扫30min，然后安装一个H₂气球。让反应进行8h，此时让该混合物经由Celite过滤、真空浓缩，得到纯的清澈产品13(0.622g，定量)：

¹HNMR(500MHz，d₆ DMSO)δ 8.42(brs，1H)，8.16(br s，4H)，7.92(br s，1H)，6.92(br s，1H)，6.74(brs，1H)，4.27(brs，1H)，4.20(br s，1H)，3.89(br s，1H)，3.62(s，3H)，3.46(br s，3H)，2.87-2.73(m，5H)，2.52(s，1H)，1.80-1.45(brs，10H)，1.45-1.15(m，22H)；¹³C NMR(125MHz，d₆ DMSO)δ 173.2，172.8，156.4，156.2，78.94，78.19，54.91，53.1，52.7，52.6，39.3，39.2，32.8，32.0，30.9，29.1，29.1，27.3，27.2，23.2，23.1.HRMS(FAB)m/z

C₂₉H₅₆N₆O₈(M+H)⁺的计算值617.4238，实测值617.4236。

Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Z)-OMe(14)的合成。向1(4.16g，5.58mmol)在THF(55mL)中的溶液中，在0℃添加二甲胺(28mL，2M，56.0mmol)。让此反应达到室温并搅拌2h。此时，让反应混合物真空浓缩。向该黄色固体中添加DCM(75mL)和DMF(25mL)。向此溶液中添加Fmoc-Lys(Boc)-OH(2.18g，4.64mmol)、然后添加HOBt(0.627g，4.64mmol)、然后添加EDC·HCl(0.890g，4.64mmol)。让此溶液搅拌8h，此时该有机溶液用1N HCl(3×15mL)、然后饱和NaHCO₃(3×15mL)、最后H₂O(3×15mL)洗涤。该有机层用MgSO₄干燥、真空浓缩，得到一种白色固体。柱色谱法(2％MeOH，CHCl₃)精制给出产品14(3.42g，63％产率)：

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ 7.74(d，J＝7.55，2H)，7.58(d，J＝7.35，2H)，7.38-7.25(m，15H)，7.00(br d，2H)，5.50(br，s，1H)，5.16-5.09(m，5H)，4.55(br s，1H)，4.36(m，3H)，4.25-4.10(m，2H)，3.61(s，3H)，3.16-3.10(m，6H)，1.81-1.39(m，23H)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ173.1，172.0，157.1，156.74，156.6，144.2，141.7，137.2，128.9，128.6，128.5，128.3，128.2，127.6，125.6，125.5，120.4，79.5，67.5，66.9，55.2，52.8，52.5，47.5，40.8，40.4，40.3，32.6，31.8，29.9，29.6，28.9，28.8，23.0，22.8；HRMS(FAB)m/z

C₅₂H₇₂N₆O₈(M+Na)⁺的计算值995.5106、实测值995.5132。

Boc-Lys(Z)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Z)-OMe(15)的合成。在0℃，向14(1.48g，1.52mmol)在THF(30mL)中的溶液中添加二甲醚(15.2mL，在THF中2M，30.4mmol)。让此反应达到室温并搅拌2h。此时将反应混合物真空浓缩。向该黄色固体中添加DCM(30mL)和DMF(5mL)。向此溶液中添加Boc-Lys(Z)-OH(0.608g，1.60mmol)、然后HOBt(0.216g，1.60mmol)、然后EDC·HCl(0.3063g，1.60mmol)。让此溶液搅拌8h，此时该有机相用1N HCl(3×15mL)、然后饱和NaHCO₃(3×15mL)、最终H2O(3×15mL)洗涤。该有机层用MgSO4干燥、真空浓缩，得到一种白色固体。柱色谱法(2％MeOH，CHCl₃)精制给出产品15(1.0g，59％产率)：

¹HNMR(500MHz，CDCl₃)δ 8.15(br s，1H)，8.03(br s，1H)；7.88(br s，1H)，7.45-7.28(m，10H)，7.12(br s，1H)，6.65(br s，1H)，5.08(s，1H)，4.45-4.35(m，3H)，4.05(br s，1H)，3.67(s，3H)，3.11(br s，1H)，3.01(br s，1H)，1.90-1.60(m，8H)，1.60-1.38(m，44)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ 173.3，173.2，172.7，172.3，157.2，156.6，138.4，129.0，128.4，79.0，78.1，66.0，55.7，53.8，53.4，53.0，52.2，41.1，40.9，40.8，32.7，32.5，31.6，29.8，29.6，28.6，23.7，23.5；ESMS(FAB)m/z

C₆₆H₈₈N₈O₁₅(M+H)⁺的计算值1113.65，实测值1113.52。

Boc-Lys-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys-OMe(16)的合成。向15(1.0g，0.89mmol)在MeOH(25mL)和DCM(25mL)中的溶液中添加Pd/C(0.20g)。此溶液用H₂吹扫30min、然后装上一只H₂气球。让反应进行8h，此时该混合物经由Celite层过滤、真空浓缩，得到纯产品(0.75g，0.89mmol)：

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ 8.04(br s，1H)，6.70(br s，3H)，4.32(brs，4H)，3.69(s，·3H)，3.05(m，8H)，1.85-1.65(m，8H)，1.65-1.40(m，28)；¹³CNMR(125MHz，CDCl₃)δ 173.2，172.9，156.7，78.9，78.04，52.2，40.8，40.1，34.9，34.8，32.0，31.1，30.6，28.6，28.5，23.6，23.2，23.1；HRMS(FAB)m/z

C₄₀H₇₆N₈O₁₁(M+H)⁺的计算值845.5172、实测值845.5699。

B.聚合物合成

二赖氨酸/碳水化合物共聚物(17)的合成。二赖氨酸11(1.7089g，2.77mmol)连同Na₂CO₃(0.785g，7.4mmol)一起在冷却于0℃的H₂O(60mL)中搅拌。向这种剧烈搅拌的溶液中添加半乳糖二酰氯9(0.9066g，2.77mmol)在25mL CCl₄中的溶液。这种双相混合物在0℃搅拌5min、在室温搅拌30min。将沉淀物过滤收集、用水洗涤，得到一种白色固体(1.1g)：

¹HNMR(500MHz，CD₃OD)δ 8.25(m，1H)，7.94(m，2H)，4.56(m，2H)，4.38(m，2H)，4.32(m，1H)，3.95(m，1H)，3.62(s，3H)，3.12(m，4H)，1.74-1.33(m，45H)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ 172.6，158.7，110.9，80.0，78.8，75.1，54.0，52.5，38.7，34.5，33.5，29.3，29.0，28.5，26.9，26.1，22.9；M_n＝15,000g/mol，M_w＝27,900g/mol.

二赖氨酸/碳水化合物聚合物(Poly 1)的脱保护。将30％TFA/THF溶液(5.1mL)添加到受保护聚合物17(0.123g)中。1h后加水(1.2mL)、让反应进行5h。此时让该溶液浓缩，提供脱保护的聚合物Poly1(定量)：

¹H NMR(500MHz，CD₃OD)δ 4.65(brd，1H)，4.45-4.43(m，1H)，4.34-4.38(m，1H)，4.17(brs，1H)，3.95(brs，1H)，3.80(s，3H)，3.32-3.34(m，5H)，2.00-1.80(m，4H)，1.70-1.54(m，4H)，1.34-1.44(m，4H)；¹³C NMR(125MHz，(CDCl₃)δ 183.5，177.6，177.5，172.5，73.2，56.9，55.6，41.2，33.1，32.4，30.6，30.4，30.3，25.7，24.8，24.7，23.8.

三赖氨酸/碳水化合物聚合物(18)的合成。将化合物13(0.296g，0.480mmol)连同Na₂CO₃(0.112g)一起在冷却于0℃的2.0mL H₂O中搅拌。向这种剧烈搅拌的溶液中添加半乳糖二酰氯9(0.157g，0.480mmol)在4mL CCl₄中的溶液。这种双相混合物在0℃搅拌5min、在室温搅拌30min。将沉淀物过滤收集、用水洗涤，得到一种白色固体(0.250g)：

¹H NMR(500MHz，CD₃OD)δ 8.25(m，1H)，7.94(m，2H)，4.56(m，2H)，4.38(m，2H)，4.32(m，1H)，3.95(m，1H)，3.62(s，3H)，3.12(m，4H)，1.74-1.33(m，45H)；¹³C NMR 125MHz，(CDCl₃)δ 173.0(m)，156.63(m)，111.39(m)，80.3，79.39，75.39，52.8(m)，40.6，39.0，31.7，29.8，28.79-26.4(m)，22.91(m)；M_n＝9085g/mol，M_w＝26686g/mol.

三赖氨酸/碳水化合物聚合物(Poly2)的脱保护。将一种30％TFA/THF溶液(5.0mL)添加到受保护聚合物18(0.105g)中。1h后加水(1.0mL)、让反应进行5h。此时将该溶液浓缩，提供脱保护的聚合物(Poly2，定量)：

¹H NMR(500MHz，CD₃OD)δ 4.625(br s，5H)，4.41(br s，4H)，4.05(s，1H)，3.95(s，1H)，3.74(s，3H)，2.98(m，3)，1.85-1.61(m，22H)；¹³C NMR 125MHz，(CDCl₃)δ 173.2，162.5-161.7(m)，120.73，118.4，116.1，113.7，71.5-71.2(m)，55.5-51.9(m)，39.5，38.5-35.4，31.328.9，27.1，23.1，22.6.

四赖氨酸/碳水化合物聚合物(19)的合成。化合物16(0.349g，0.413mmol)连同Na₂CO₃(0.0963g)一起在冷却于0℃的3mL H₂O中搅拌。向这种剧烈搅拌的溶液中添加半乳糖二酰氯9(0.135g，0.413mmol)在3.5mL CCl₄中的溶液。这种双相混合物在0℃搅拌5min、在室温搅拌30min。将沉淀物过滤收集、用水洗涤，得到一种白色固体(19，0.380g)：

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ 4.51(m，6H)，3.74(s，3H)，3.32-3.05(m，9H)，2.00-1.62(br s，10H)，1.30-1.62(br s，62H)；¹³C NMR(125MHz，(CDCl₃)δ174-170(m)，157-155(m)，110，79-74(m)，54-51(m)，40-38(m)，31-22(m)；M_n＝13213g/mol，M_w＝47918g/mol.

脱保护四赖氨酸聚合物(Poly3)的合成。将一种30％TFA/THF溶液(1.7mL)添加到受保护聚合物9(0.050g)中。1h后加水(0.4mL)、让反应进行5h。此时将该溶液浓缩，提供脱保护聚合物(Poly3，定量)：

¹H NMR(500MHz，CD₃OD)δ 4.40(m，4H)，4.05(m，2H)，3.73(s，3H)，3.36(s，3H，有溶剂峰)，2.97(brs，5H)，1.85-1.41(m，22H)；¹³C NMR(125MHz，(CDCl₃)δ 173-169(m)，164-160(m)，71-67(m)，54-51(m)，40-39(m)，31-21(m).

碳水化合物-肽共聚物的替代结构

生成糖肽共聚物的另一条替代路线是使用丙烯酸酯和伯胺系单体经由迈克尔加成反应生成聚合物，如以下流程XII所示：

流程XII

用较简单单体的示范反应测试了这条路线的可行性。试验丙烯酸酯单体和聚合物的合成如以下流程XIII中所示

反应条件：I)4eq.LAH，Et₂O，4h(产率72.1％)

ii)4eq.丙烯酰氯，4eq.DIPEA，DCM，0.5h(产率60％)

iii)1eq.22，1eq.23，1M in DCM

流程XIII

从该示范反应得到一种聚合物。遵照相同的战略，本发明者期待以下合成能产生一种新型生物材料，如以下流程XIV中所示：

流程XIV

二丙烯酸酯糖单体的合成：向有二乙酰亚胺保护的糖二醇(0.50g，1.91mmol)在DCM(19mL)和DIPEA(4mL)中的搅拌溶液中滴加丙烯酰氯(0.93mL，11.44mmol)。此溶液变成褐色，搅拌45min，此时加水(15mL)。产物用Et₂O(100mL)萃取、然后分离、用MgSO₄干燥。柱色谱法(20％Et₂O/己烷)精制给出产品(60％产率)。

二丙烯酸酯糖单体和11-氨基十一碳烯的聚合：向11-氨基十一碳烯(0.1211g，0.7153mmol)和DCM(0.25mL)的溶液中添加二丙烯酸酯糖单体(0.2648g，0.7153mmol)。此物料在N₂下密封、在45℃搅拌4天，生成该聚合物。

转染实验

作为实例，半乳糖二酸-二赖氨酸、三赖氨酸、和四赖氨酸杂共聚物(分别为Poly1～3)是通过L-赖氨酸衍生的单体和相应的半乳糖衍生的单体的界面聚合合成的。EMSA试验显示，这些聚合物以低达1.5的N/P比例有效地结合和阻滞DNA。AFM成像为DNA压实到适合于基因转染应用的尺寸提供了证据，其微粒的80.0～90.6％的直径低于200nm。虫荧光素酶试验显示，这类聚合物在无血清的氯奎辅助条件下能有效地转染DNA。转染水平超过对照实验的转染水平，这可能部分地由于所期待聚合物的细胞毒性降低的缘故。细胞生存性试验显示，本文中陈述的共聚物有显著低的细胞毒性。所期待的是，这种降低的毒性起因于亲水碳水化合物间隔物引起的聚合物主链上的连续电荷密度和电荷屏蔽效应的降低。这两个因素都降低了与细胞膜的电荷相互作用，从而减少膜破裂。这一类新的碳水化合物-肽共聚物可以进一步优化，以诸如通过使用氨基酸残基的替代长度、使不同的氨基酸残基取代到该链上、以及通过延长或缩短该碳水化合物间隔物而在保持生物兼容性的同时提高转染效率。

材料：试剂是从Aldrich公司(威斯康星州密尔沃基)收到时就使用，例外的是购自Nova Biochem(加利福尼亚州圣迭戈)的氨基酸和购自GL Biochem(中国上海)的偶合试剂和添加剂[N-羟基苯并三唑(HOBt)和1-乙基-3-3′-二甲胺基丙基碳化二亚胺·HCl(EDC·HCl)]。用于转染研究的猴肾成纤维细胞(COS-7细胞)购自ATCC并在37℃、5％CO₂和购自Sigma公司(Saint Louis，MS)的MEM培养基中培养。虫荧光素酶检测试剂盒(包括报告者基因)、MTT试剂盒、和pSV-β-gal质粒DNA(6821bp)购自Promega公司(Madison，WI)。所有反应都氮气氛围下进行，并使用火焰干燥的玻璃器皿。用于水敏反应的所有溶剂都是干燥的、并经由蒸馏或用氧化铝过滤系统精制。萃取溶剂是商业级的。闪急色谱法是使用所指出溶剂系统在Fisher硅胶60(230-400目)上的强制流动进行的。

总体考虑：涉及活细胞使用的任何操作都是在层流通风橱中使用标准无菌技术进行的。凝胶渗透色谱法(GPC)是使用一个Agilent 1100系列GPC-SEC分析系统连同购自Polymer Labs的混合床Plgel Mixed-C柱一起进行的。洗脱剂是THF，使用0.5mL/min的流量率。校准是使用Aldrich聚苯乙烯标准物进行的。¹H NMR谱是使用500MHz Bruker仪器获得的，而¹³C NMR是使用125MHz Bruker仪器获得的。NMR化学位移是作为δ值以相对于TMS或氘代溶剂而言的ppm报告的。数据表述如下：化学位移，峰裂数(s＝单峰，d＝双峰，t＝三峰，q＝四峰，m＝多峰)，以Hz表示的偶合常数和积分。多峰是在它们出现的范围内(用ppm表示)报告的。碳NMR数据是相对于溶剂信号记录的。高分辨率质谱(HRMS)数据是用一台Micromass Autospec谱仪获得的。燃烧分析由Atlantic Microlab(Norcross，GA)进行。

半乳糖二酸-赖氨酸聚合物/DNA复合物的电泳。碳水化合物-肽共聚物/pSV-β-gal质粒DNA复合物是以不同电荷比例在Hepes缓冲食盐水溶液(HBS，20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.4)中生成的。该复合物是通过混合DNA溶液(10μL，0.1μg/μL)与等体积含试验聚合物的溶液以不同的伯胺/磷酸根(N/P)比值形成的。让该聚合物/DNA溶液在室温静置0.5h，此时将8μL该复合物溶液取出并与2μL 6x负荷染料混合。将该复合物/负荷染料溶液转移到一种琼脂糖凝胶(0.6％w/v琼脂糖，含0.5μg/mL溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓)中，并使该凝胶展开(30min，90V)。该DNA在该凝胶中的位置是用一台UV发光器确定的。凝胶结果显示于图1中。

Polyplexes用原子力显微镜检查法(AFM)成像：Polyplexes是像在电泳实验中那样配制的。培养30min后从该Polyplexes溶液中取出20μL样品、添加到一个新鲜云母表面上。然后，使该云母表面以2000RPM旋转15秒。对于每种聚合物来说，这都是以20和40N/P进行的。使用一台购自Park Scientific Instruments公司、配备100μm描述器的CPResearch原子力显微镜进行Polyplexes观察。数据采集全都采用ProScan软件(1.6版)进行。数据汇总如下。

细胞转染试验。COS-7细胞以16,000细胞/孔的密度在转染研究开始前24h接种于一个24孔平皿中。在该Polyplexes添加前4h，通过向每孔中添加25μL 2mM氯奎/PBS溶液，用氯奎处理该细胞。DNA/聚合物复合物是通过将50μL聚合物溶液添加到50μL 0.7μg/μLDNA溶液中并进行涡旋而以适当电荷比制备的。让该复合物培养30min。然后将该复合物溶液添加到该细胞中，在无血清培养基条件下培养5h。此时，将50μL胎牛血清添加到每一孔中(使培养基总体积为550μL)、将细胞培养24h。然后，将培养基从细胞中取出，该细胞随后用PBS缓冲剂(2×500μL)洗涤。然后向该细胞中添加250μL溶素缓冲剂、然后该细胞培养10min。此时将50μL溶胞产物和50μL虫荧光素酶试验试剂混合、其发生立即用一台发光计读数。然后，用一种商业上可得的试验测定其余溶胞产物的总蛋白质含量(n≥3)。不用和用氯奎得到的转染效率汇总于图3中。

细胞增殖试验：细胞增殖试验是用一种非放射性MTT试验进行的。在增殖研究开始前24h，将COS-7细胞以16,000细胞/孔的密度接种于一种24孔平皿中。向这些细胞中添加对照和实验的聚合物以及空白溶液(作为负对照)，其浓度与无血清条件下每个电荷比例的转染研究中所使用的浓度相同。将这些细胞培养5h，向每孔中添加50μL胎牛血清(使培养基总体积为550μL)。将这些细胞培养24h，此时添加75μL四唑盐溶液。培养4h后，加一滴溶液，再将这些细胞培养1h。将每个孔的内容物混合、在570nm测定其吸收。然后，计算相对于没有用聚合物处理的对照细胞而言的吸收，给出％活细胞。

选择L-赖氨酸衍生的肽残基来从其α和ε伯氨基导入阳离子片断。尽管PLL不是基因输送的最有效合成运载体，但它是研究得最多的合成运载体之一而且文献上有比较用的丰富数据，这使其成为一种用于证实目前陈述的碳水化合物-肽设计概念的良好模型肽。除其它优点外，所期待的是，碳水化合物间隔物的导入可以降低PLL的细胞毒性。虽然PLL能有效地复合DNA并将DNA运送到细胞中，但它有相对高的细胞毒性。已经有人显示，PLL用某些亲水片断的改性能提高该polyplexes的溶解度和降低其细胞毒性。在目前期待的化合物中，L-赖氨酸衍生的肽与导入多个极性羟基的碳水化合物衍生单体的共聚可认为能给该聚合物以优异的水溶性。该碳水化合物间隔物也降低了该聚合物的阳离子电荷密度，预期这会降低细胞毒性。在碳水化合物与肽共聚单体之间采用缩合聚合来构建杂共聚物。为此，所需要的碳水化合物和肽共聚单体是像以下所讨论的那样制备的。

肽和碳水化合物单体及共聚物的合成。选择半乳糖二酸作为制造碳水化合物单体的起始原料的可容易得到碳水化合物衍生物。采用一种简单的四步合成来制造二酰氯单体4，如以下流程XV中所说明的：

流程XV

用1-丁醇酯化、随后进行羟基官能度的丙酮化物保护给出2。然后在碱性介质中进行酯皂化，给出二酸3。然后用SOCl₂定量地合成二酰氯单体。肽单体的合成是采用简单的溶液相肽合成进行的，如流程XVI中所示：

流程XVI

在每个偶合反应中，都在HOBt的存在下使用EDC·HCl作为偶合剂。每次肽偶合之后，都使用二甲胺/THF进行氨基甲酸9-芴基甲酯(Fmoc)脱保护，然后使其从反应混合物中真空脱除、和进行下一个偶合反应。每次单体合成的最终步骤都是通过标准氢解定量脱除苄氧羰基(Z)保护基。在测试各种聚合条件之后，界面聚合给出了最佳结果，而且用于合成每种共聚物。¹H和¹³CNMR谱都证实每种聚合物的正确化学结构。这三种预聚物(仍有Boc和丙酮化物保护)的数均分子量(Mn)实测值分别为15,000、9085、和13,200g/mol。丙酮化物和氨基甲酸叔丁酯(Boc)保护基使用TFA/H₂O/THF的全面脱保护给出最终共聚物Poly 1-3(流程XVII)。

流程XVII

在流程3中，Poly 1-3的游离胺是以其阳离子形式显示的。用这些杂共聚物的DNA复合和基因转染实验是在缓冲至pH7.4的水溶液中进行的，在这种情况下该氨基会是质子化的(α-NH₂ pKa～9，ε-NH₂pKa～10.8)。

在一条替代的路线中，先通过使一种糖酸脱水环化，制备一种双内酯，如以下例示性地说明的。当一种二赖氨酸单体与该双内酯在极性溶剂例如甲醇或水或混合溶剂中混合时，末端氨基将内脂环打开并生成杂共聚物。可以使用带有氨基或其它亲核基团的其它单体来使双内酯开环而生成有其它结构的杂共聚物，如结构XI中所示。以下进一步描述更详细的实验例。

结构XI

双内酯开环聚合

如同以上流程I中所说明的，本发明期待一条更高效率的路线来制造所公开的聚合物，其中肽部分和碳水化合物部分可以利用一种双内酯与一种有2个末端氨基的肽的开环聚合来彼此共价偶合。为了找出这条直接开环聚合路线的良好条件，使用乙二胺与葡糖二酸1，4:6，3-双内酯(A)之间的模型聚合来筛选质子溶剂中会生成高聚物的催化条件(表1)。筛选了一系列已知能催化对酯的亲核加成的催化剂。简单的亲核催化剂例如二甲胺基吡啶(DMAP)和2-羟基吡啶(HOP_y)并没有导致显著的改善。本发明者发现，一系列路易斯酸催化剂例如Sc(OTf)₃和Yb(OTf)₃能非常有效地催化开环聚合。如表1中所示，室温下纯水中的模型聚合能给出重复单元数为27的聚酰胺。这种链长水平对于很多应用来说会是足够的。

表1 使用乙二胺和作为单体的双内酯的模型开环聚合

注：a)n＝重复单元数目

葡糖二酰胺，N，N′-二氨基乙烷共聚物：向葡糖二酸1，4:6，3-双内酯(A)(0.1508g，0.8666mmol，1当量)在H₂O(0.45mL)中的搅拌溶液中滴加乙二胺(2M)在H₂O(0.434mL，0.8666mmol)中的溶液，然后立即添加TEA(0.015mL，0.2当量)。向此溶液中添加Sc(OTf)₃(0.084g，0.2当量)在H₂O(0.2mL)中的溶液。Sc(OTf)₃的添加立即在该溶液中生成一种白色沉淀，并在整个反应期间持久发生。这种混合物又搅拌24h，此时所得到的聚合物作为纯白色固体从丙酮中沉淀出来。该聚合物有Mn＝5.3K、Mw＝6.53K、重复单元平均数＝27。

双内酯与二赖氨酸单体的开环聚合

遵照从模式系统研究识别的路易斯酸催化开环聚合条件，进行二赖氨酸单体与双内酯的聚合并得到聚合物(流程XVIII)

流程XVIII

二赖氨酸-双内酯共聚物：向葡糖二酸1，4:6，3双内酯(A)(0.1280g，0.7358mmol，1eq)在MeOH(0.45mL)中的搅拌溶液中滴加二赖氨酸单体(0.2858g，0.7358mmol，1eq)在H₂O(0.45mL)中的溶液、然后立即添加TEA(0.015mL，0.2eq)。向此溶液中添加Se(OTf)₃(0.089g，0.2eq)在H₂O(0.2mL)中的溶液。一种沉淀物生成并在Sc(OTf)₃添加时迅速溶解。让这种混合物再搅拌24h，此时所得到的聚合物作为一种纯白色固体从丙酮中沉淀出来。聚合物表征：Mn＝4.58K，Mn＝8.93K，n＝8.70。

在这些新阳离子型聚合物的成功合成和表征之后，用它们作为基因载体进行DNA复合和基因转染。然后，利用EMSA和AFM观察，表征在这些新阳离子型聚合物与质粒DNA之间生成的polyplexes。进行虫荧光素酶试验以考察转染效率。最后，进行细胞生存性实验，以检验关于碳水化合物间隔物对肽链的加成从而降低该聚合物系统的细胞毒性的有效性的假设。

Polyplex生成和EMSA：稳定的聚合物/DNA复合物的生成是高效率基因输送的先决条件。遵照标准实验方案，利用凝胶电泳来表征该polyplexes。polyplexes是在pH7.4和模拟活体离子强度条件的150mM盐浓度的HEPES缓冲食盐水中生成的。该质粒与该聚合物样品以各种不同的N/P比例混合，并培养和复合0.5h。然后，在一种含溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的凝胶中进行该聚合物/DNA复合物的电泳，来观察DNA。适当的阳离子型聚合物可以与DNA结合而引起电荷中和，这阻碍了DNA沿该凝胶的电流梯度向下运动。每种阳离子型聚合物(Poly 1-3)都显示出在N/P比<2.0时有效地阻滞pSV-β-gal质粒DNA的运动(见图1)。

Poly 1和Poly 3两者在N/P比为1.5时都有效地阻滞了质粒DNA，而Poly 2在2.0N/P比值时阻滞了质粒DNA。重要的是要注意，在各种不同N/P比生成的聚合物/DNA复合物在水溶液中都依然是均相的，这与显示出非均相的PLL/DNA复合物成鲜明对照。这种增大的溶解度归因于碳水化合物间隔物导入的增强的亲水性。

电荷中和在相对低N/P比时发生，表明这些聚合物能非常有效地掩蔽DNA电荷。数据显示，在有高离子强度(150mM)的水溶液中这种电荷屏蔽也发生了。由于高盐浓度减少了电荷吸引，因而这种观察进一步支持了这些聚合物对质粒DNA的结合效能。这种使DNA束上的负电荷中和的能力让该polyplex变得致密，从而能经由细胞膜运送而实现基因转染。

该Polyplexes的AFM观察：polyplexes进入细胞内通常经由透过细胞膜的活性内吞作用发生，这需要先与该细胞膜结合、总苞到核内体中、并在内化之后从该核内体释放出来。polyplexes被内吞的效率在很大程度上取决于该polyplexes的物理特征，包括粒度。透过细胞膜的有效运送的正常粒度范围是50～200nm。在这一范围以上时，经由内吞作用的细胞内化是不太可能的。该聚合物/DNA复合物的粒度和形状是用AFM研究的。

AFM样品是通过用20μL聚合物/DNA polyplex溶液旋涂云母载玻片制备的(像在EMSA试验中那样制备)。每种聚合物都将DNA缩合成球形纳米微粒，其直径典型地在50～200nm之间。对于有20和40N/P比的polyplexes观察到下列粒度分布：对于Poly 1，在20和40N/P比时，87.4％微粒的直径为50～200nm；对于Poly 2，在相同N/P比时，90.2％微粒的直径为50～200nm；最后，对于Poly 3来说，95.3％Polyplexes的直径为50～200nm。

EMSA和AFM研究证实碳水化合物-肽共聚物可以有效地压缩质粒DNA，形成粒度主要在200nm以下的纳米微粒。这些数据表明，该碳水化合物-肽阳离子型聚合物适合于在基因输送应用方面的进一步研究。

基因转染结果。测试了这些杂聚合物的转染效率，并与PLL比较。之所以选择PLL作为对照，是因为它是研究得最多的聚合物基因转染运载体，且包含L-赖氨酸作为其余聚合物。转染研究是用商业上可得的COS-7细胞和虫荧光素酶试验试剂盒进行的。

遵照已知的文献程序，基因转染是在无血清条件下添加氯奎—一种已知能使核内体的膜破裂并有助于该polyplexes逸出核内体的添加剂—进行的。经由内吞作用的内化之后，若该polyplexes不能高效率地逸出核内体，它们就会传递到高酸性的溶酶体中，从而引起该DNA降解。增强polyplexes的核内体释放的一种有效机理是使用质子海绵效应，其中该聚合物载体在处于酸性核内体中的同时变得更高度质子化。这触发了氯根跨越核内体膜的流入，且水随后流入，以抗衡该内体内的高离子浓度。渗透压终究导致核内体破裂和所截留DNA的释放。由于L-赖氨酸及其它伯胺基有相对高的pKa，而且不应当有任何质子海绵效应，因而通常来用氯奎的添加来增强核内体释放、从而提高基因转染效率。对于新型合成非病毒运载体的基因转染研究来说，在以前的报告中通过也使用无血清条件。

细胞与氯奎一起预培养4h，然后添加实验的和对照的polyplexes，然后在无血清条件下培养5h。然后添加血清，再经历另外24h培养时间。然后使细胞溶解，并测量其相对光单位(RLU)，将后者归一化到总细胞蛋白/孔。这一实验的结果见图2A的图。如同可以看到的，Poly 2和Poly 3在基因转染方面均超过PLL，转染水平接近于1.00E+08RLU/mg蛋白质标记。

这些结果显示，Poly 2和Poly 3可以高效率地输送基因穿越细胞膜。Poly 1有显著较低的转染效率，这被认为可归因于其结构：Poly 1只有一个α-氨基/重复单元。这种聚合物上的阳离子电荷密度是这些聚合物中最低的，这可能导致对DNA较弱的结果。与Poly 2或3相比，Poly 1中α-氨基与ε-氨基阳离子部位之间pKa值和结合几何形状方面的差异也可能对不同的基因转染效率有贡献。若干种系统已经显示，非常微妙的结构变化就会导致DNA结合和随后基因输送性能的显著差异。一项研究显示，侧链阳离子电荷与聚合物主链的距离对与DNA生成的复合物有显著影响。

转染水平在若干浓度和电荷比上是与PLL竞争的，但稍低于最高效合成聚合物系统的一些例如PEI，后者已被显示有比PLL高的转染效率。然而，由于用本发明主题的聚合物系统可以容易地进行结构置换，因而该杂系统的效率可以进一步改变。例如，核内体逸出是当前一些聚合物的一个问题，因而只在较低pH(例如核内体中的环境)才会质子化的、pKa值较低的氨基(例如组氨酸残基pKa～5.2)的添加可能潜在地改善转染效率。

细胞增殖研究。合成基因输送运载体的一个决定性问题是，高效率合成运载体例如PEI通常有高细胞毒性。这显著妨碍了它们向基因治疗临床试验的发展。在发展新载体方面，决定性的是找出它们的细胞毒性水平。本发明者用标准四唑系MTT试验测试了碳水化合物-肽聚合物的细胞毒性。该测试是以对应于转染实验中所使用的那些的聚合物浓度进行的。该杂共聚物与对照PLL(有类似Mn，8500g/mol)之间毒性的差异是出乎意外的。如同从图2B中可以看到的，即使在杂聚合物的高浓度，细胞毒性也接近于负对照组的水平，24h培养时间后细胞生存性为92～98％。成鲜明对照的是，在这些研究中所使用的每个浓度上，PLL都显示出高得多的毒性。

纯共聚物的这些试验结果可以代表最大细胞毒性，因为以前的研究表明，与DNA的复合通常会降低阳离子型聚合物的细胞毒性。在阳离子型聚合物中，细胞毒性往往起因于该阳离子型聚合物与细胞膜的相互作用，从而引起细胞膜溶解和细胞死亡。阳离子型聚合物引起的细胞膜破裂会受到三个主要因素影响：氨基官能度类型(伯胺是最毒的，而叔胺是毒性最小的)、聚合物浓度、和阳离子电荷密度(聚合物链电荷密度的增大引起导致胞质泄漏的与细胞膜相互作用的改善)。如果该阳离子型聚合物有高电荷密度而且能容易地与细胞膜相互作用、有很多近附着点，则它更可能是细胞毒性的。

细胞生存性结果进一步显示，半乳糖二酸-肽共聚物显示出即使在高聚合物浓度也基本上没有细胞毒性。虽然细胞毒性的这种大幅降低的确切机理并不清楚，但工作假设如下。首先，将阳离子型肽分离成短链段降低了连续电荷密度，导致较低的细胞毒性。在寡-L-赖氨酸研究中，已经显示，细胞毒性随该低聚物的长度增大，这表明高连续电荷密度对细胞膜有破裂性影响。其次，亲水的碳水化合物链段会屏蔽该DNA聚合物复合物的表面电荷，降低了其ζ电位，从而缓解了细胞膜破裂。进而，当该阳离子型肽链段与该碳水化合物-肽杂共聚物中的质粒DNA结合时，据认为，可挠曲碳水化合物间隔物可能凸出来并屏蔽该polyplex表面电荷。作为后果，可以使细胞毒性降低。

碳水化合物-肽聚合物的免疫学研究

除低细胞毒性外，低免疫原性是安全基因输送运载体的另一个重要基准。早期研究发现，氨基酸的无规线型均聚物是几乎无抗原的。然而，由于所期待的碳水化合物-肽共聚物是新化合物，因而重要的是找出它们在动物中是否会发生任何免疫反应。选择一种Mn为9000g/mol的四赖氨酸共聚物(Poly A)、用Fisher344大鼠作为动物模型进行各种免疫学评估。由于该共聚物是一种含有不同分子量化学种分布的多分散性样品，因而对于高分子量化学种和低分子量化学种来说，试验结果都应当是代表性的。

个体Fisher 344大鼠进行隐静脉静脉切开术、将血清贮存于-20℃直至用来作为免疫前血清。若干股大鼠接受50μg Poly A(无佐药)作为50μL脚垫皮下(SC)注射液或100μL静脉内(IV)尾静脉注射液。Poly A是分别在第一周、第三周和第六周给药的，动物是该聚合物每次追加给药之后21天进行静脉切开术的。血清是在第六周和第九周得到的，并贮存于4℃直至使用。

96孔Immulon MaxiSorb微升平皿的各个孔涂布100μL要么浓度为3μg/mL的Poly A要么正常大鼠血清(阳性对照)，并在4℃培养过夜。将来自正常、IV给药、和SC注射的Poly A大鼠的大鼠血清样品添加到各孔(50μL/孔)中而不稀释，并在室温下培养1h。各孔用200μL 0.1％Tween-20 1XPBS洗涤4次。Anti-rat IgG(H+L)HRP用1％ BSA 1×PBS稀释1:3000、添加到各孔中、在室温下培养1h。各孔用200μL 0.1％Tween-20 1XPBS洗涤4次。添加TMB(75μL/孔)并培养15min。在添加25μL 2N HCl使反应停止后，该平皿用一台微平皿读出器读数。

图3中的图说明来自这些ELISA的各股大鼠的OD的平均值和SD。这里说明了抗聚合物ELISA数据，包括背景、免疫前血清、皮下注射(SC)、静脉内注射(IV)、和正常大鼠血清(阳性对照)的结果。第1、第2、和第3血清是分别在第3周、第6周和第9周采集的。这些ELISA数据证实，在聚合物A经由要么SC要么IV途径的3次给药之后，相对于背景而言，没有任何可检测抗体反应。没有任何抗体反应的证据，所有大鼠都是健康的(无失重、正常活性、良好卫生/优质皮毛)，表明没有其它有害免疫反应或毒性。这些数据证实，本发明的碳水化合物-肽聚合物要么不是免疫原的要么不是毒性的。

糖-肽杂共聚物的酶促降解

进行了关于Poly 1-3的酶促降解研究，其结构显示于结构V中。如MALDI-TOF质谱法所监测的，这些聚合物的分子量随培养时间增加而降低，表明这些聚合物被酶降解。

用枯草杆菌蛋白酶A作为催化剂的Poly 1生物降解研究：向磷酸盐缓冲食盐水(1.38mL，PBS，120mM NaCl，2.7mM KCl，10mM磷酸盐缓冲剂)和枯草杆菌蛋白酶A(0.138mg，11U/mg，来自bacilliusglobigii)的溶液中添加Poly 1(13.8g)。此溶液在该实验期间在38℃搅拌。以适当时间间隔采集等分样品(100μL)、用MeOH(200μL)稀释。将α-氰基-4-羟基肉桂酸在H₂O/MeOH(1:2)中的饱和溶液的等分样品(1μL)点到作为基体的MALDI样品板上。让这些样品风干，此时将不同稀释倍数的MeOH稀释降解溶液添加到该基体上。将MALDI数据输出给Excel^TM，利用一条以100点的实验平均值平滑的棱线作图。图4A显示使用枯草杆菌蛋白酶A和二赖氨酸聚合物(Poly 1)的降解研究的结果。

用枯草杆菌蛋白酶A作为催化剂的Poly 2生物降解研究：向磷酸盐缓冲食盐水(2.6mL，PBS，120mM NaCl，2.7mM KCl，10mM磷酸盐缓冲剂)和枯草杆菌蛋白酶A(0.26mg，11U/mg，来自baciliusglobigii)的溶液中添加Poly 2(12.9mg)。此溶液在该实验期间在38℃搅拌。以适当时间间隔采集等分样品(100μL)并以MeOH(200μL)稀释。将α-氰基-4-羟基肉桂酸在H₂O/MeOH(1:2)中的饱和溶液的等分样品(1μL)点到作为基体的MALDI样品板上。让这些样品风干，此时将不同稀释倍数的MeOH稀释降解溶液添加到该基体上。将MALDI数据输出给Excel^TM，利用一条以100点的实验平均值平滑的棱线作图。图4B显示使用枯草杆菌蛋白酶A和三赖氨酸聚合物(Poly 2)的降解研究的结果。

用胰蛋白酶作为催化剂的Poly 1降解研究：向磷酸盐缓冲食盐水(1.07mL，PBS，120mM NaCl，2.7mM KCl，10mM磷酸盐缓冲剂)和胰蛋白酶(0.0011mg，10.2U/mL，来自牛胰腺)的溶液中添加Poly 1(10.7mg)。此溶液在该实验期间在38℃搅拌。以适当时间间隔采集等分样品(50μL)、用MeOH(100μL)稀释。将α-氰基-4-羟基肉桂酸在H₂O/MeOH(1:2)中的饱和溶液的等分样品(1μL)点到作为基体的MALDI样品板上。让这些样品风干，此时将不同稀释倍数的MeOH稀释降解溶液添加到该基体上。将MALDI数据输出给Excel^TM，利用一条以实验平均值光滑的棱线作图。图4C显示使用胰蛋白酶和二赖氨酸聚合物(Poly 1)的降解研究的结果。

含酪氨酸糖-肽共聚物的合成

本发明者期待使用酪氨酸氧化偶合作为一种手段来使水凝胶形成用的本发明聚合物交联。这种交联方法应当容易地以可见光作为光引发剂或以过氧化物酶作为催化剂(在生物合成路线中)进行。为此，一种含酪氨酸共聚单体像以下流程XIX中所述那样合成：

反应条件：i)EDC，HOBt，DIPEA，12h，90％产率

ii)DMA(2M)，THF.

iii)BocLys(Z)OH，EDC，HOBt，DIPEA，12h，60％产率

iv)Pd/C，2当量TFA，12h，95％产率

流程XIX

Fmoc-Tyr(tBu)-Lys(Z)-OMe的合成：向二异丙基乙基胺(1.19mL，3.43mmol)/DCM(50mL)的溶液中添加Lys(Z)OMe(1.13g，3.43mmol)。向此溶液中添加FomcTyr(tBu)OH(1.50g，3.26mmol)、然后HOBt(0.463g，3.43mmol)、最后EDC·HCl(0.6571g，3.43mmol)。此溶液搅拌8h，此时该有机溶液用1N HCl(2×20mL)、然后饱和NaHCO₃(2×20mL)、最后H₂O(2×20mL)洗涤。有机层真空浓缩，得到一种白色固体(2.34g，97.5％产率)：

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ 7.77(d，J＝7.53，2H)，7.55(m，2H)，7.40(t，J＝7.45，2H)，7.38-7.29(m，7H)，7.08(m，2H)，6.88(d，J＝8.25，2H)，6.43(brs，1H)，5.52(br s，1H)，5.15-5.07(brm，3H)，4.50(m，1H)，4.42(m，1H)，4.30(m，1H)，4.18(t，J＝6.92，1H)，3.70(s，3H)，3.18-2.95(m，4H)，1.85-1.35(m，4H)，1.30(s，10H)，1.20(br s，2H)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ 163.0，154.6，143.9-143.8(3)，141.46，136.6，130.0，128.7，128.2，127.9，127.3，125.2，124.5，120.2(2)，67.13，66.8，53.6，52.6，47.3，41.0，37.8，32.6，29.4，29.0(3)，22.17；HRMS(FAB)m/z

C₄₃H₄₉N₃O₈(M+H)⁺的计算值736.3598，实测值736.3623。

Boc-Lys(Z)-Tyr(tBu)-Lys(Z)-OMe的合成：向Fmoc-Tyr(tBu)-Lys(Z)-OMe(7.72g，10.49mmol)/THF(105mL)的溶液中添加二甲胺(52.5mL，2M，104.9mmol)。让这一反应达到室温并搅拌1.5h。此时，将反应混合物真空浓缩。向该黄色固体中添加DCM(225mL)和DMF(45mL)。向此溶液中添加Boc-Lys(Z)-OH(4.19g，11.01mmol)、然后HOBt(1.488g，11.01mmol)、然后EDC·HCl(2.112g，11.01mmol)。此溶液搅拌8h，此时该有机溶液用1N HCl(3×100mL)、然后饱和NaHCO₃(3×100mL)、最终H₂O(3×100mL)洗涤。该有机层变成凝胶状，添加MeOH以破坏该凝胶。该有机层用MgSO₄干燥、真空浓缩，得到一种白色固体。柱色谱法(0～1％MeOH，CHCl₃)精制给出产品(5.51g，65％产率)。

Boc-Lys-Tyr(tBu)-Lys-OMe(KYK)的合成：向BocLys(Z)Tyr(tBu)Lys(Z)OMe(1.79g，2.04mmol)在MeOH(113mL)和TFA(0.304mL，2eq.)中的溶液中添加Pd/C(催化剂)。此溶液用H₂吹扫30min、然后安装一个H₂气球。让反应进行8h，此时该混合物通过Celite层过滤、真空浓缩，得到纯粹、清澈的产品(1.63g，95％产率)。然后，使含酪氨酸的单体与半乳糖二酰氯共聚，生成一种含酪氨酸共聚物：

受保护半乳糖二酰-KYK共聚物的合成：将Boc-Lys-Tyr(tBu)-Lys-OMe(0.881g，1.05mmol)连同Na₂CO₃(0.369g)一起在30.0mL H₂O中搅拌。向这种猛烈旋涡的溶液中添加一种半乳糖二酰氯(0.345g，1.05mmol)在10mL CCl₄中的溶液。这种双相混合物在室温搅拌30min。沉淀物通过过滤收集、用水洗涤，得到一种白色固体。该聚合物的特征在于：Mn＝4.9kg/mol，Mw＝8.9kg/mol。

全保护半乳糖二酰三赖氨酸共聚物的脱保护：向50％TFA/H₂O(15.0mL)的溶液中添加受保护聚合物(0.600g)。4h后，将该溶液浓缩，提供脱保护聚合物(定量)。为了提高该共聚物的水溶性，也通过一种二赖氨酸单体(KK)、一种含酪氨酸共聚单体(KYK)和一种碳水化合物二酰氯单体的共聚，合成了以下三元共聚物。作为流程XX中所示的一个实例，一种这样的聚合物的合成是使用0.3当量KYK单体和0.7当量KK单体进行的。

流程XX

反应条件：i)0.3eq.KYK，0.7eq.KK，1.0eq糖二酰氯，H₂O/CCl₄，Mn＝13K，Mw＝21K，ii)TFA/H₂O

NMR显示该聚合物链中KK和KYK单体单元的摩尔比为约50:50。这意味着KYK单体的反应性略高于KK单体。KK-KYK-糖共聚物的Mn高于KYK共聚单体与糖二酰氯的共聚物。合成细节说明如下：

受保护KK-KYK糖共聚物的合成：Boc-Lys-Tyr(tBu)-Lys-OMe(0.332g，0.386mmol)、Boc-Lys-Lys-OMe(0.528g，0.856mmol)连同Na₂CO₃(0.434g)一起在含有28.0mL H₂O的烧杯中搅拌。向这种涡旋溶液中添加半乳糖二酰氯4(0.406g，1.24mmol)在12mL CCl₄中的溶液。这种两相混合物在室温搅拌30min。沉淀物过滤收集、用水洗涤，得到一种白色固体(0.380g产率)：Mn＝12.9kg/mol，Mw＝20.4kg/mol。

全保护KK-KYK-糖共聚物的脱保护：向50％TFA/H₂O(10.0mL)的溶液中添加受保护聚合物(0.380g)。4h后，将该溶液浓缩，提供脱保护聚合物(定量)。

含酪氨酸共聚物交联生成水凝胶

如以上流程IV中所说明的，本发明者期待2种使水溶液中含酪氨酸共聚物交联的方法。第一种使用Ru(III)(bpy)₃作为氧化剂(从Ru(II)(bpy)₃、过硫酸铵和光发生)。第二种在超氧化物歧化酶的存在下使用一种过氧化物酶和过氧化氢。在此证实的是，化学路线和酶促路线都能高效率地使含酪氨酸共聚物交联成水凝胶(流程XXI)

反应条件：i)Ru(II)(bpy)₃Cl₂，过硫酸铵，可见光，180-120s。

ii)HOOH，超氧化物歧化酶，辣根过氧化物酶(HRP)。

流程XXI

水凝胶生成的详细条件描述如下：

使用Ru(II)催化剂的水凝胶生成：向KK-KYK-糖共聚物(70.0mg)在PBS(0.250mL)中的溶液中添加足量NaOH(2.5M，3滴)以使该聚合物沉淀。添加最低限量HCl(0.1M，8滴)使该聚合物再变成溶液。然后，向此溶液中添加Ru(II)(bpy)₃Cl₂·2H₂O(1.5mg，0.002mmol)和过硫酸铵(1.55mg，0.00679mmol)在PBS(0.100mL)中的溶液。此溶液充分混合、光照180s。生成一种半透明橙色凝胶。

使用HOOH和HRP的水凝胶生成：向KK-KYK-糖共聚物(70.0mg)在硼酸/硼酸盐缓冲剂(0.25M，0.250mL)中的溶液中添加足量NaOH(2.5M，2滴)在使该聚合物沉淀。以最低限量HCl(0.10M，8滴)使该聚合物又几乎完全回到溶液中。然后，向此溶液中添加HRP(1.75mg)和SOD(1.75mg)。此溶液充分混合、然后向其中添加HOOH溶液(28μL，0.03％溶液)。5分钟内生成一种微鞣色凝胶。

KK-KYK-糖共聚物水凝胶上的细胞培养

制备了若干种使用所述条件的水凝胶，用于细胞生长研究。这样生成的水凝胶用PBS缓冲剂洗涤少数几次，直至它们不是酸性的。作为细胞培养实验的一个实例，将平滑肌细胞(SMC’s)接种到该凝胶上，并监测其生长。5天后该细胞健康地生长。

新的含酪氨酸共聚物合成

为了改善该共聚物在较高pH的溶解性，在以下的亲水聚合物设计中包括了酸性片断。为此，以下流程XXII显示一种有可裂解酸基的KK单体的合成：

反应条件：i)EDC，HOBt，DIPEA，12h，90％产率

ii)Pd/C，2当量TFA，12h，95％产率

流程XXII

然后，将这种单体用于界面聚合，作为如以下流程XXIII中所述与KYK单体共聚的试验条件。该聚合进行顺利，Mn＝9118且Mw＝14,390g/mol。叔丁酯的TFA脱保护需要24h，相比之下，丙酮化物和Boc保护基的脱保护只需3h左右。

反应条件：i).0当量KK，1.0当量二酰氯，H₂O/CCl₄，M_n＝9.1K，M_w＝14.5K； ii)1:1 TFA/水 24小时

流程XXIII

这种新单体和KYK单体也与一种糖二酰氯共聚，生成以下三元共聚物(流程XXIV)。这种聚合物的分子量与前面的KK-KYK-糖共聚物系统的分子量大致相同，Mn＝8.6K且Mw＝13.5K。

反应条件：i)0.70当量 KKOtBu，0.30当量KYK，1.0当量二酰氯，H₂O/CCl₄，M_n＝8.6K，M_w＝13.5K；ii)1:1 TFA/水 24小时

流程XXIV

Angew.Chem.Int.Ed.2005，44，6529-6533中描述了又进一步的数据、实验、和考虑，以及支持信息(例如，在www.angewnadte.org上可用电子手段获得)，这些都明确地列为本文参考文献。

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因此，已经公开了聚合物材料的具体实施方案和应用。然而，对于业内技术人员来说，应当显而易见的是，除已经描述的那些外，只要不背离本文中的发明概念，还可以进行很多修饰。因而，本发明主题是不受限制的，除所附权利要求书的精神外。进而，在解读本说明书和权利要求书两者时，所有术语都应当以与上下文一致的最广泛可能方式解读。具体地说，“包含”(comprises和comprising)这一术语应当解读为系指呈非排他性方式的要素、成分、或步骤，表明所提及的要素、成分、或步骤可以与未明确提及的其它要素、成分、或步骤一起存在、利用或组合。进而，在列为本文参考文献的参考文献中术语的定义或用途与本文中所提供的该术语的定义不一致或矛盾的情部下，适用本文中所提供的该术语的定义，而不适用该参考文献中该术语的定义。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种嵌合体聚合物，有按照式I的结构：

[(M)_x1(N)_y1]_z1[(M)_x2(N)_y2]_z2 式I

式中M独立地是一种碳水化合物片断，且N独立地是一种氨基酸；

式中(M)_x1和(M)_x2有多个与主链偶合的反应性基团，且式中(N)_y1和(N)_y2有多个与主链偶合的反应性基团；

式中x1、x2、y1、y2、z1、和z2独立地是1～10000之间的整数，含1和10000；

式中x1当y2大于或等于1时任选地为0，且式中y2当x1大于或等于1时任选地为0；和

式中该碳水化合物片断和该氨基酸彼此偶合，使得该碳水化合物片断和该氨基酸构成该聚合物的主链。

2.权利要求1的嵌合体聚合物，其中x1和x2中至少一个是2～20的整数。

3.权利要求1的嵌合体聚合物，其中y1和y2中至少一个是2～20的整数。

4.权利要求1的嵌合体聚合物，其中多个N形成一种氨基酸主链，且其中该氨基酸主链是经由一种氨基酸的α、β、γ、或ε氨基之一与第二种氨基酸的α、β、和γ羧酸根之一之间的共价键形成的。

5.权利要求1的嵌合体聚合物，其中该碳水化合物是经由酰胺键共价地偶合到氨基酸上的。

6.权利要求1的嵌合体聚合物，其中该碳水化合物片断中至少一个是一种环状碳水化合物。

7.权利要求1的嵌合体聚合物，其中该碳水化合物片断中至少一个是一种非环状碳水化合物。

8.权利要求1的嵌合体聚合物，其中该氨基酸中至少一种是一种非天然存在的氨基酸。

9.权利要求1的嵌合体聚合物，其中M和N中至少一种包含交联性官能度，且其中该交联性官能度共价地键合到另一种嵌合体聚合物的另一种交联性官能度上，从而生成一种交联聚合物。

10.权利要求1的嵌合体聚合物，其中M和N中至少一种包含交联性官能度，且其中该交联性官能度是通过离子键、氢键、二硫化物键、和疏水性相互作用中至少一种键合到另一种嵌合体聚合物的另一种交联性官能度上的，从而生成一种交联聚合物。

11.权利要求9或权利要求10中任何一项的嵌合体聚合物，其中该交联聚合物是一种任选地包括医药剂和细胞中至少一种的水凝胶。

12.权利要求1的嵌合体聚合物，其中该聚合物配制成一种适合于植入、注射、经局部、经粘膜、和经口给药中至少一种的制剂。

13.一种包含权利要求1的嵌合体聚合物和医药活性剂的医药组合物，其中该医药活性剂任选地共价附着到该聚合物上。

14.权利要求13的医药组合物，其中该医药活性剂封装于该聚合物形成的一种基体中。

15.权利要求13的医药组合物，其中该医药活性剂是一种肽，且其中(N)_y1和(N)_y2中至少一种包含该医药活性剂。

16.权利要求13的医药组合物，其中该聚合物有适合于生物降解的组成，从而能释放出该药理活性剂。

17.一种包含权利要求1的嵌合体聚合物的含细胞结构。

18.权利要求17的含细胞结构，其中该嵌合体聚合物与至少一种其它嵌合体聚合物交联。

19.权利要求18的含细胞结构，其中该嵌合体聚合物是一种由多种其它嵌合体聚合物形成的水凝胶的组成部分。

20.权利要求17的含细胞结构，其中该嵌合体聚合物包含一种共价键合到该嵌合体聚合物上的细胞粘合增强剂。

21.权利要求17的含细胞结构，其中该结构构型成为一种植入物。

Claims

1.一种嵌合体聚合物，有按照式I的结构：

[(M)_x1(N)_y1]_z1[(M)_x2(N)_y2]_z2 式I

式中x1、x2、y1、y2、z1、和z2独立地是1～10000之间的整数，含1和10000，

式中碳水化合物片断和氨基酸彼此耦合，以致成为聚合物主链的碳水化合物片断和氨基酸。

17.一种包含权利要求1的嵌合体聚合物的含细胞结构。