CN101498704A - 无阀式微流控梯度实时反应芯片及反应控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微流控技术领域的无阀式微流控梯度实时反应芯片及反应控制方法。本发明在需要与药物反应的靶分子上标记磁性粒子，而在传统的金字塔型微流控梯度芯片出口末端前的浓度梯度场形成区内设置软磁性微柱阵列，通过此结构在外磁场下产生的高梯度磁场，在梯度场反应之前预先吸附标记有磁性粒子的药物分子，从而完成药物分子在金字塔型梯度芯片出口前端管道内的固定。进行梯度实时反应的时候，而药物经过不断分流及混合，最后在芯片的末端形成梯度场并流过这些软磁性微柱阵列，就可同时与固定在此处的药物分子进行反应。此芯片设计将可用于对生物大分子反应作用机理的研究、药物筛选等多方面。

Description

无阀式微流控梯度实时反应芯片及反应控制方法

技术领域

本发明涉及一种微流控技术领域的芯片及控制方法，具体地说，涉及的是一种无阀式微流控梯度实时反应芯片及反应控制方法。

背景技术

随着生物医学及化学的不断发展，目前很多研究都集中在分子水平上。近年来，微流控技术的出现使得生化分析出现了新的方向。微流控技术是指在微米级尺度(主要指宽度及高度)管道内操控及分析流体的技术。和常规的方法相比较，微流控技术可以有效的减少试剂消耗，缩短反应时间，使自动化程度更高，实现高通量，大规模的检测，从而降低成本，检测结果也更加可靠。因此在疾病检测、环境监控、化学合成、基因测序等方面都得到了广泛的应用。而在梯度微流体芯片的研究中，虽然目前国内外仍处于起步研究阶段，但是其高通量检测的可能性、对珍贵试剂消耗量的减少等优点尤其引人注目，受到国内外研究机构的高度重视。

经过对现有技术的文献检索发现，2001年Dertinger等在2001年第6期《分析化学》(Analytical Chemistry)上第1240页到1246页发表的文章“在微流体网络内形成不同复杂梯度的方法”(Generation of gradients havingcomplex shapes using microfluidic networks)提出利用微流体的层流及混合技术形成样品的不同的线性离散浓度梯度，这种芯片设计采用一种金字塔型的结构，制作采用聚合物塑料PDMS(聚二甲基硅氧烷)，成本低廉，加工周期短，通过对芯片的精确设计可以使得一次进样后，在芯片出口的梯度场形成区内形成药物的线性浓度梯度分布，这种微流控芯片引起了人们的极大关注。近年来通过改变设计，这种金字塔型微流控梯度芯片也可被用来在芯片上产生对数、线性或抛物线形状的浓度分布。

目前微流体梯度芯片研究较热，但大部分的研究是在药物浓度梯度场的形成上，如对数浓度场的形成、理论研究等。如果事先能将与药物反应的靶分子固定在芯片的梯度场形成区内，药物分子进入到芯片内，不仅能在芯片末端的梯度场形成区内形成梯度，而且同时就和固定在此区内的靶分子进行反应，这样将多种功能都集中在单片微流控芯片内，就可以直接在片观察不同的药物浓度梯度与靶分子的相互作用，一个片上的一次实验就相当于传统的多个试验，将会更节约时间，更方便操作，也更有意义，真正发挥微流体梯度芯片在生物化学分析上的应用优势。但这样必须将靶分子精确固定在梯度芯片的末端梯度场形成区内，而不能固定在芯片内别的区域，这就涉及到在微流控芯片内生物大分子的定位固定，就目前而言，这也是整个微流体技术的难点。

为了解决上述问题，Hsin-Chih Yeh等在2006年第21期第e411页的《核酸研究》(Nucleic Acids Res)发表的文章”微流控平台上研究SP1-DNA相互反应”(A microfluidic-FCS platform for investigation on the dissociationof Sp1-DNA complex by doxorubicin)提出了对金字塔型微流控梯度芯片的一种改进型设计，其主体结构层仍然是金字塔型的梯度芯片，但是在这个设计中，芯片整体的设计为三层，分为底层的基片、金字塔型梯度芯片的管道结构层以及基于PDMS(聚二甲基硅氧烷)材料的控制层，由于PDMS材料具有很小的杨氏模量，因此可以通过外加气源控制这一层特定位置的形变，该层的形变可以导致金字塔型结构的管道结构层也发生形变，从而控制管道的开放和闭合。通过这种三层结构设计的阀门，就可以控制靶分子在梯度场特定位置的固定以及药物梯度场与靶分子的相互反应。虽然Hsin-Chih Yeh的设计可以有效的结合梯度场形成及其与靶分子反应，但是这类芯片采用了外加阀门对芯片内的反应的生物分子进行操控或固定，需要多层结构，增加了加工的难度。而阀门的开启和关闭都需要一个额外的气源对其进行操作，增加了控制的难度。因此迫切需要研究一种新型的方法，既能在微流控梯度芯片形成的梯度场内进行实时的生化反应，同时芯片又易于加工和操作。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种无阀式微流控梯度实时反应芯片及反应控制方法，使其能在单个芯片内集成药物浓度梯度场的形成及其与靶分子反应等多功能。该芯片无需阀门对其进行控制，因此不需要上述文献介绍的对外接气源进行操控，而且由于结构不涉及到多层工艺，相比上述有阀门的芯片设计，加工难度也较低。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明所涉及的无阀式微流控梯度实时反应芯片，包括金字塔型微流控梯度芯片，所述金字塔型微流控梯度芯片上出口末端前的浓度梯度场形成区内设有软磁性微柱阵列，用于产生高梯度磁场来固定标记有磁性粒子的靶分子。

所述金字塔型微流控梯度芯片为双层结构，即基片及其上层的管道结构。其中基片在其与管道结构中浓度梯度场形成区内相对应的位置上设有软磁性微柱阵列。这样形成的微流控梯度芯片在其末端的浓度梯度场形成区内就分布有软磁性的微柱阵列。药物及药物缓冲液经进样口导入芯片内，经过各个分流结构及混合结构，不断地分流混合，最后在芯片的末端形成梯度场并流过软磁性微柱阵列。

所述软磁性微柱阵列，是由具有一定高度的带有软磁性的微柱按一定的距离组合排列而成，这些磁性微柱阵列可以在外磁场的作用下产生精确的磁场分布，这样就可以达到精确操控磁性粒子在微流控芯片内分布的目的，进而操控标记有磁性粒子的靶分子在芯片内的定位及反应。

本发明所涉及的无阀式微流控梯度实时反应控制方法，包括如下步骤：

第一步，在金字塔型微流控梯度芯片出口的末端浓度梯度场形成区的管道内制作软磁性微柱阵列；

第二步，由靶分子进样口通入带有磁性粒子的靶分子，当其流经浓度梯度场形成区的时候，施加永磁鉄(或外加电磁场)磁化在此区内的软磁性微柱阵列，该结构将产生高梯度磁场，吸附住标记有磁性粒子的靶分子，完成靶分子在金字塔型梯度芯片的浓度梯度场内的精确定位固定。

第三步，进行梯度实时反应的时候，药物及药物缓冲液仍由传统的金字塔型梯度芯片的进样口分别进入芯片内，经过不断分流及混合，最后在芯片的末端形成梯度场并流过软磁性微柱阵列，就可与固定在此处的靶分子进行反应。这样就可以在形成浓度梯度的同时就实施在线实时反应，同时完成药物梯度场的形成及其与靶分子的反应等多功能。

第四步，反应完毕，撤掉外磁场，由于软磁性阵列的软磁性以及磁性粒子的顺磁性，两者都不会有磁滞，因此不再相互作用，通入磁性粒子缓冲液(如磷酸缓冲液)就可以将标记有磁性粒子的靶分子-反应物的复合物冲走，芯片可以再次利用。

磁性粒子上标记药物分子如抗体、DNA等是目前生物学上常用的方法，有很多商售及研究单位的产品。且纳米磁性粒子还具有比表面积大、顺磁性等优点。根据静磁学理论，磁场中磁性粒子受到的磁场力Fmag的表达式为：

$F_{\mathrm{mag}}=\frac{V{\mathrm{\χ}}_m}{{\mathrm{\μ}}_0}(B\·\▿)B$

其中V为磁性粒子的体积，χ_m为磁性粒子的磁化系数，μ₀是真空磁导率，

为哈密顿算子，即磁场力的大小与外磁场强度和梯度有关，悬浮在微通道中的磁性粒子有向磁场梯度最大的区域移动的趋势。

如直接施加外加磁场控制磁性粒子在微通道内分布，磁性粒子容易形成聚集，堵塞管道，且不容易精确控制位置。而通过在微流控通道中制备不同形状的软磁性微元件，可以在外加磁场(永磁鉄或电磁场)的诱导下产生非均均的高梯度磁场，将这些磁性粒子固定在微柱周围，从而增加磁性粒子的捕获效率。由于磁性粒子主要是往磁场梯度最大的地方运动，因此这种吸附主要是在微柱的周围，其磁场力也随磁性粒子与微柱的距离的增加而急剧减小，因此通过微柱的排列可以达到较大的吸附面积，又不堵塞管道的效果。

和背景技术文献中介绍所不同的是，在本发明中，是将标记有磁性粒子的靶分子预先固定在芯片末端的浓度梯度场形成区内。而磁性粒子在该区域的精确定位及固定，则是通过微加工技术制作在此区域内的软磁性微柱阵列来实现。由于可以通过简单的控制外磁场来操控磁珠在芯片内的吸附及释放，因此本发明完全避免了阀门的使用，使得芯片的操控及加工都变得简单。

本发明设计的无阀式微流控梯度实时反应芯片，整个反应无需阀门控制，仅需施加外磁场，因此易于操作，且由于芯片可以重复利用，大大降低了成本，可以应用在制药、生物大分子反应机理等多方面。

附图说明

图1为本发明实施例的结构示意图：

图2为本发明实施例的平面图；

图3为本发明实施例中涉及的软磁性微柱阵列操作示意图；

其中：A为未加磁性粒子的示意图，而B为吸附磁珠后的示意图。

图中1为基片，2为软磁性微柱阵列，3为管道结构，4、5为进样口，6为液体混合区，7为分叉口，8为磁性粒子样品进入梯度芯片的进入点，9-16为把个出口储液池，17为磁性粒子的进样口，18-25为出口前形成浓度梯度场的管道，26为外加永磁鉄，27为软磁性微柱阵列中的单个微柱，28为吸附住的磁性粒子。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

如图1-2所示，本实施例涉及的无阀微流控梯度反应芯片，其基本特征是在传统的金字塔型微流控梯度芯片上进行改进设计，在出口的末端浓度梯度场形成区的管道内，增加软磁性微柱阵列2。本实施例能通过进样口4、5的进样在末端形成8个线性的药物浓度梯度，并能同时进行药物和靶分子反应。其结构包括样品进样口4、5，混合器6，分流点7，磁性粒子进样口17，软磁性微柱阵列2，8个出口9-16，及其前端的样品管道18-25等。

如图1所示，金字塔型微流控梯度芯片的结构为双层结构，由基片1及其上层的管道结构3构成。其中基片1在其与管道结构3中位置18相对应的位置上电镀有软磁性的微柱阵列；而上层的管道结构3含有管道的主体结构，两部分结合形成如附图2所示结构。这样形成的微流控梯度芯片在其末端出口处的管道18-25内就分布有软磁性的微柱阵列2。

如图3所示，标记有磁性粒子28的靶分子的首先进入芯片内，并流经位于管道内的软磁性微柱阵列2，由于此结构在外加磁场的时候能在其周围产生高梯度磁场，因此可以吸附标记有磁性粒子的靶分子。进行梯度反应的时侯，药物及药物缓冲液分别由进样口4和进样口5处进入到芯片内，在梯度场形成区内形成药物的浓度梯度，并和固定在此区域内的标记有磁性粒子的靶分子进行在线实时反应。同时由于软磁性微柱阵列2软磁性，在撤掉外磁场后，不会吸附磁性粒子，这样反应的磁性粒子可以被冲走，芯片可以重复利用。

所述软磁性微柱阵列2，可通过微加工技术，如甩胶、光刻、电镀等工艺制备的的具有软磁性(如坡莫合金)的微结构阵列，微结构可为圆柱或立方体等，其长宽高均在微米级，并按一定的间隔排列。

所述的磁性粒子28，具有磁性，可在磁场下反应，尺寸为纳米或微米，表面可固定药物分子。可由市售购买，如Introgen公司(美国)所售的Dynal Myone磁珠。

所述的软磁性微柱阵列2，其磁化是通过外置永磁铁或电磁铁的方式施加。

上述实施例涉及的无阀微流控梯度反应芯片，其制备可通过如下步骤实现：

1、玻璃基底电铸镍铁微柱阵列的制作

利用电镀工艺进行坡莫合金微柱阵列。为便于后续的光学检测，本实施例中基片1采用玻璃。具体工艺过程：玻璃圆片清洗后分别溅射Ti/Cu电铸种子层。在基片上旋涂正性光刻胶，获得厚度为25μm的胶层。显影后的模板在镍铁电铸液中获得高度大于20μm的坡莫合金微柱阵列。本例中微柱2结构为圆柱，直径50um，间隔也为50um，电铸后的基片除去种子层，烘干备用。

2、制备PDMS微流控通道

(1)光刻胶模板的制备

首先采用SU-8-3050型负性光刻胶(美国Micro Chem公司)，在单面抛光的硅片或者有氧化钛衬底的玻璃片上甩胶，获得厚度为50μm的光刻胶。前烘后曝光，后烘后条显影，显影后用异丙醇清洗，氮气吹干，即获得所需的光刻胶模板。光刻胶模板在浇铸前用氟硅烷(SiHF3)处理表面，以避免固化的PDMS模具脱模时损伤光刻胶模板。

(2)PDMS微管道的制作

本实例采用聚二甲基硅氧烷(PDMS，美国道康宁公司，牌号：Sygard 184)做为芯片的主体材料。PDMS是一种高分子硅橡胶材料，具有较低的杨氏模量及较好的封装特性，价格便宜，生物相容性好，光透性高。是目前微流体研究中常用的材料。将PDMS(道康宁sylgard 184)预聚体与固化剂按照10：1的质量比混合，真空脱气后，浇注在光刻胶模板上。固化后将其从模板上揭下，在进样口及出样口打孔，即可得到所需的PDMS片。

3、封装键合

利用PDMS材料易于封装的特性，用等离子处理机处理制作的PDMS微管道3与带有微镍铁柱的玻璃基片1表面，然后进行贴合封装。

如图2-3，本实施例涉及一种无阀式微流控梯度实时反应控制方法，按照以下步骤进行操作：

1)制作软磁性微柱阵列。

在金字塔型微流控梯度芯片出口的末端浓度梯度场形成区的管道内通过电镀技术制作软磁性微柱阵列；

2)吸附磁性粒子。

在实际操作中，如图2所示，标记有药物分子的磁性粒子28首先从磁性粒子进样口17进入芯片内，均匀的分成8个管道，在分叉口8处，由于流体往出口处9-16处的流阻小于往进样口4和进样口5，而在流体中，液体的流动会类似与电路，往流阻小的地方流动，因此磁性粒子溶液会从出口9-16这8个管道流出，当流经芯片末端固定有软磁性微柱阵列2的时候，如图2、3所示，外加磁场26对每个管道内的软磁性微柱阵列进行磁化，微柱周围会产生高梯度磁场，这种磁场会吸附流过的磁性粒子28，未被吸附的磁珠及其他溶液则流出芯片。

3)反应。

当磁性粒子标记的药物分子吸附在末端以后，就可以通过梯度芯片进样，如图2所示，药物及药物缓冲液分别由进样口4和进样口5处进入到芯片内，在混合区6进行混合并不断分流，在末端的18-25处形成浓度梯度。由于在分叉口8处，溶液往进样口17(磁性粒子进样口)流出的流阻大于从出口处9-16处流出的流阻，因此溶液会从出口9-16处流出。当流经出口处前端管道18-25的时候，可以和固定在管道内的磁性粒子28上标记的药物分子进行反应，实行在线实时反应。

4)冲洗并更换磁性粒子。

反应完毕，撤掉外磁场26，从进样口17通入磁性粒子缓冲液，由于软磁性结构2丧失磁性，不能吸附磁性粒子28，因此随着缓冲液，磁性粒子28会从出口9-16处冲离出芯片。重复上述1步骤，重新吸附磁性粒子，便可进行下一次的反应。

所述的磁性粒子28，可由市售购买，如Introgen公司(美国)所售的DynalMyone磁珠。

所述的性粒子缓冲液是指用于稀释磁性粒子的缓冲液，按所用各类磁性粒子生产商的说明配置，如稀释Introgen公司的Dynal Myone磁珠使用磷酸缓冲液。

所述的药物，是包括化学类小分子或生物大分子如抗体、核酸等。所述药物缓冲液是指可用于稀释药物分子的溶液，如水、磷酸缓冲液等。

Claims (8)

1、一种无阀式微流控梯度实时反应芯片，其特征在于，包括金字塔型微流控梯度芯片，所述金字塔型微流控梯度芯片上出口末端前的浓度梯度场形成区内设有软磁性微柱阵列。

2、根据权利要求1所述的无阀式微流控梯度实时反应芯片，其特征是，所述金字塔型微流控梯度芯片为基片及其上层的管道结构的双层结构，其中基片在其与管道结构中浓度梯度场形成区内相对应的位置上设有软磁性微柱阵列。

3、根据权利要求1或2所述的无阀式微流控梯度实时反应芯片，其特征是，所述软磁性微柱阵列，由带有软磁性的微柱按设定的距离组合排列而成。

4、根据权利要求1或2所述的无阀式微流控梯度实时反应芯片，其特征是，所述软磁性微柱阵列，其长宽高均在微米级。

5、一种无阀式微流控梯度实时反应控制方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步，在金字塔型微流控梯度芯片出口的末端浓度梯度场形成区的管道内制作软磁性微柱阵列；

第二步，由靶分子进样口通入带有磁性粒子的靶分子，当其流经浓度梯度场形成区的时候，施加永磁鉄或外加电磁场磁化在此区内的软磁性微柱阵列，该结构将产生高梯度磁场，吸附住标记有磁性粒子的靶分子，完成靶分子在金字塔型梯度芯片的浓度梯度场内的定位固定；

第三步，进行梯度实时反应时，药物及药物缓冲液由金字塔型梯度芯片的进样口分别进入芯片内，经过分流及混合，最后在芯片的末端形成梯度场并流过软磁性微柱阵列，与固定在此处的靶分子进行反应，在形成浓度梯度的同时在线实时反应；

第四步，反应完毕，撤掉外磁场，通入磁性粒子缓冲液将标记有磁性粒子的靶分子-反应物的复合物冲走，芯片可再次利用。

6、根据权利要求5所述的无阀式微流控梯度实时反应控制方法，其特征是，所述软磁性微柱阵列通过微加工技术制备，具有软磁性的微结构阵列，微结构为圆柱或立方体，其长宽高均在微米级，并按间隔排列。

7、根据权利要求5所述的无阀式微流控梯度实时反应控制方法，其特征是，所述的磁性粒子，尺寸为纳米或微米，表面可固定药物分子。

8、根据权利要求5所述的无阀式微流控梯度实时反应控制方法，其特征是，所述药物及药物缓冲液，其中药物包括化学类小分子或生物大分子药物，药物缓冲液是指用于稀释药物分子的溶液，而磁性粒子缓冲液是指用于稀释磁性粒子的缓冲液，按所用各类磁性粒子生产商的说明配置。

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