CN101497656B

CN101497656B - 与整合素αvβ3具有高结合活性的多肽及其应用

Info

Publication number: CN101497656B
Application number: CN2009100257310A
Authority: CN
Inventors: 吴国球
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2009-03-09
Filing date: 2009-03-09
Publication date: 2012-08-15
Anticipated expiration: 2029-03-09
Also published as: CN101497656A

Abstract

本发明提供了一组具有SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽，该种多肽与整合素αvβ3具有高结合活性；该种多肽可用于新生血管结合剂、肿瘤治疗或显像的药物的制备以及用作药物辅料或连接物。

Description

与整合素αvβ3具有高结合活性的多肽及其应用

一、技术领域

本发明属于生物工程制药技术领域或蛋白质多肽类药物领域，特别涉及一组与整合素αvβ3具有高结合活性的多肽及其制备方法和应用。

二、背景技术

整合素(Integrin)是广泛存在于细胞表面的一类细胞黏附分子，由α和β两个亚单位形成跨膜异二聚体，迄今已发现约18种α亚单位和8种β亚单位，它们按不同组合构成24种整合素。整合素通过胞外区识别结合细胞外基质成分、可溶性配体如纤维蛋白原以及一些细胞表面分子中整合素结合位点如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-asparticacid，RGD)结合，通过整合素连接蛋白激酶和磷脂酰肌醇3磷酸激酶信号转导通路，进行细胞和细胞之间、细胞与细胞外基质之间的双向信号转导，从而调节细胞的生物学行为。

结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor，CTGF)是近年来发现的具有多种生物学活性的细胞因子。研究表明，多种信号分子通过不同的传导机制能诱导大多数胶质分子的合成，抑制其降解，并能调节整合素基质受体的表达从而导致组织和器官的纤维化。在所有这些信号机制活化通路中，CTGF可能是起关键作用的细胞因子。

CTGF是高度保守的CCN多肽家族(CTGF，CYR61，Nov)成员之一，蛋白结构主要分为4个区为：胰岛素样生长因子结合蛋白区，von Willebrand因子C型重复区，血小板反应蛋白(thrombospondin)1型重复区以及生长因子半胱氨酸群，Mr38000，主要由成纤维细胞和内皮细胞等合成分泌，它与皮肤瘢痕的形成，动脉粥样硬化，组织和器官的纤维化，创伤修复以及肿瘤的形成和转移密切相关。CTGF基因属即刻早期基因，定位于染色体6q23.1，有5个外显子，4个内含子，编码的蛋白具有明显的丝裂原性和趋化性，可诱导成纤维细胞增殖和分泌细胞外基质(ECM)，参与调节细胞增生、分化、胚胎发育以及伤口愈合。CTGF可显著增加NRK(normal rat kidney)成纤维细胞中I型胶原，整合素α和纤连蛋白基因的转录。

CTGF能与成纤维细胞中低密度脂蛋白受体相关蛋白/α2-巨球蛋白受体(LRP)及细胞表面的α6β1整合素，内皮细胞的αvβ3，血小板的αIIbβ3结合；同时，CTGF的N端能与胰岛素样生长因子(IGF)结合形成复合物，刺激心肌成纤维细胞的分化，产生大量的胶原和其它的ECM；CTGF的C端能与BMP4和TGF-β1结合，发挥生物学效应。CTGF包含的von Willebrand因子与基质蛋白有相似序列，因此可剂量依赖地促进血管内皮细胞的黏附，增殖和迁移，同时诱导血管内皮细胞形成管状，其作用强于碱性成纤维细胞生长因子或血管内皮生长因子。

研究表明，整合素在肿瘤细胞转化、生长、侵袭、转移、凋亡和肿瘤血管生成过程中起重要作用，肿瘤细胞从原发部位脱落，迁移至远处的靶器官过程中，肿瘤血管的形成为肿瘤细胞生长增殖提供营养成分，并为转移构建通路。其中，αvβ3、α5β1和αvβ5整合素在肿瘤血管内皮细胞中的高表达，在肿瘤血管系统的形成中起主要作用。这些研究结果均为整合素靶向药物治疗肿瘤提供了理论依据。目前整合素靶向治疗药物主要有整合素单克隆抗体、整合素肽类抑制剂、整合素基因靶向调节以及整合素介导的其他治疗等。其中，整合素肽类抑制剂由于作用靶点明确，分子量较小而易于透过组织，制备简单等优点备受关注。整合素一般与配体分子中的RGD序列结合而发挥整合素对细胞活性的调节。RGD肽包括环形和线性两类，不仅竞争结合整合素受体，阻止肿瘤细胞和(或)内皮细胞与细胞外基质黏附，且激活细胞凋亡蛋白酶，直接诱导肿瘤细胞和(或)内皮细胞凋亡，阻断整合素-斑点黏附激酶途径，诱导内皮细胞和(或)肿瘤细胞黏附、增殖、侵袭、转移，调节肿瘤血管的形成。如西仑吉肽(cilengitide，EMD2121974)含有环状RGD肽，靶向作用于αvβ3和αvβ5整合素，通过阻止整合素与细胞外基质中纤维粘连素和粘蛋白的相互作用诱导内皮细胞和肿瘤细胞的移行、分化、增殖、凋亡，抑制血管生成和肿瘤的发展；去整合素(salmosin和contortrostatin)是从蝮科毒蛇蛇毒中提取的含RGD序列的可溶性线性肽，与细胞外基质竞争结合αvβ3整合素，特异性阻断整合素αv亚基与纤维粘连素纤维粘连素和变性胶原蛋白作用，解离黏附斑点与肌动蛋白的连接，使细胞转变为圆形，彼此间解散，并阻断依赖黏着斑激酶的信号转导途径，引起细胞凋亡。ATN2161是从纤维粘连素辅助结构域衍生的非环状五氨基酸肽，与αvβ3和α5β1整合素作用，抑制裸鼠乳腺癌细胞和溶骨性移植瘤生长，使肿瘤细胞逆转，瘤体减小。S247为αvβ3整合素抑制剂，促使血管内皮细胞凋亡，抑制血管形成。

在前期研究中，我们发现CTGF C区的肽序列能与高表达αvβ3的人肝癌细胞株BEL-7402高度结合，通过比对发现它是一种非RGD的小肽，该序列的发现为进一步研发抗肿瘤新药或肿瘤显像剂拓宽了道路，同时也为设计合理的肿瘤治疗方案提供理论基础。

三、发明内容

技术问题：

本发明的目的是提供一组与整合素αvβ3具有高结合活性的多肽及其氨基酸序列，同时提供该种多肽作为新生血管结合剂或作为肿瘤治疗和显像的药物或载体的应用。

技术方案：本发明的技术解决方案为：即：

一种与整合素αvβ3具有高结合活性的多肽，具有SEQ ID NO：1氨基酸序列：Cys-Ile-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Ser-Lys-Pro-Ile-Lys-Phe-Glu-Leu-Ser-Gly；

一种与整合素αvβ3具有高结合活性的多肽，具有SEQ ID NO：2氨基酸序列：Ile-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Ser-Lys-Pro-Ile-Lys-Phe-Glu-Leu-Ser-Gly-Cys；

一种与整合素αvβ3具有高结合活性的多肽，具有SEQ ID NO：3氨基酸序列：Cys-Ile-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Ser-Lys-Pro-Ile-Lys-Phe-Glu-Leu-Ser-Gly-Cys；

上述任一项所述与整合素αvβ3具有高结合活性的多肽在制备新生血管结合剂、肿瘤治疗或显像的药物中的应用。

上述任一项所述与整合素αvβ3具有高结合活性的多肽单独或组合作为药物辅料或连接物的应用。

有益效果：

本发明与现有技术相比具有如下：

1.提供了一组多肽，扩大了与αvβ3结合肽的种类，获得了一组具有较高αvβ3结合活性的多肽。

2.用基因工程技术制备具有较高αvβ3结合活性的多肽，适合于大规模工业化生产。

3.采用基因工程技术制备，对环境友好，无任何有害物质产生。

4.生产成本较低。化学合成每毫克肽(18个氨基酸)需560元人民币，而用本方法生产每毫克肽只需2元人民币，大规模制备时成本甚至更低。

5.在表达载体构建中，在目的基因的上游引入了肠激酶切割位点(DDDDK)，当用肠激酶切割后目的多肽不残留任何多余氨基酸，大大简化了下游的纯化工艺。

6.用邻苯二马来酰亚胺(N，N’-O-phenylendimaleimide，OPDM)作偶联剂将多肽与巯基修饰的Fe3O4纳米颗粒连接，连接产物能与高表达αvβ3整合素的肝癌细胞株BEL-7402特异性结合；未用肽修饰的纳米颗粒未见结合；用该多肽预先与肝癌细胞孵育，再加入多肽标记的纳米颗粒，发现纳米颗粒的结合被多肽竞争抑制。

7.3种多肽与人肝癌细胞株BEL-7402共孵育，可促进肿瘤细胞的凋亡。

四、附图说明

图1是融合蛋白SDS-PAGE分析图；

其中：1-分子量Marker、2-含P1c菌体、3-含P118c破壁上请液、4-含P17c破壁上请液、5-含P1c破壁上请液；

图2是小肽Tricine-SDS-PAGE电泳图；

其中，6-胰岛素、7-纯化后小肽；

图3是P1c-SPIO与BEL-7402的结合图；

图4是P17c-SPIO与BEL-7402的结合图；

图5是P118c-SPIO与BEL-7402的结合图；

图6是未修饰的SPIO与BEL-7402的结合图；

图7是P1c-SPIO与BEL-7402的结合被P1c竞争抑制图；

图8是P17c-SPIO与BEL-7402的结合被P17c竞争抑制图；

图9是P118c-SPIO与BEL-7402的结合被P118c竞争抑制图；

图11是P17c促进BEL-7402的凋亡图；

图10是P1c促进BEL-7402的凋亡图；

图12是P118c促进BEL-7402的凋亡图；

图13是未加肽干预的BEL-7402细胞图。

五、具体实施方式

本发明所用内切酶、连接酶、其他分子生物学试剂购自Novagen公司。电泳、感受态细胞制备、转化等分子生物学方法采用《分子克隆实验指南》的方法进行(萨姆布鲁斯(Sambrool，J.)等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第3版)，北京，科学出版社，2002，8)。质粒提取，采用上海生工试剂盒K192，按照使用说明进行。

实施例1：

表达载体的构建和转化子的获得

根据大肠杆菌偏爱三联密码子设计合成多聚酶链式反应(Polymerase ChainReaction，PCR)引物：SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：9，根据引物不同配对，使用PCR方法合成带有肠激酶切割位点的P1c，P17c和P118c 3个基因：P1c：TGTATTCGGACTCCGAAGATTAGTAAGCCTATTAAGTTTGAGCTGTCGGGT；P17c：ATTCGGACTCCGAAGATTAGTAAGCCTATTAAGTTTGAGCTGTCGGGTTGT；P118c：TGTATTCGGACTCCGAAGATTAGTAAGCCTATTAAGTTTGAGCTGTCGGGTTGT。PCR反应条件为：94℃10分钟预变性，循环反应：94℃30秒，72℃30秒，共25个循环，随后自然冷却至室温；将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离，胶回收，得到目的片段。将目的片段依照内切酶产品说明书用Kpn I和Xho I分别进行酶切，低熔点琼脂糖法回收相应片段(《分子克隆》)，按连接酶产品说明书用T4 DNA连接酶与相同酶切并回收的pET32a(+)相应片段连接，获得含编码本发明多肽DNA序列的表达载体；将表达载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选并鉴定转化子，用碱裂解法提取质粒，送上海Invitrogen公司测序，测序结果与预期序列一致。所构建的质粒命名为pET32/P1c，pET32a/P17c，pET32a/P118c。

表1引物序列

诱导表达，检测鉴定

将编码3个小肽的阳性质粒分别转化BL21(DE3)感受态细胞，获得转化子，接种于含Amp(50μg/ml)的LB肉汤20ml中培养，当菌液OD值达到0.6时，加入乳糖至终浓度8mM，37℃诱导表达6小时。5000rpm离心10分钟，取沉淀，将沉淀溶于50mM Tris-HCl、10mM NaCl(pH8.0)组成的缓冲液中，超声破碎20min。将超声后的溶液12000rpm离心20min，分别保留上清液和沉淀用于电泳检测。在20KDa分子量附近有明显条带(见附图1)，即为融合蛋白，主要集中在溶液上清。融合蛋白的表达量分别占菌体总蛋白的42％(P1c)，31％(P17c)和27％(P118c)。

发酵罐中试放大

按照下列条件对工程菌进行中试放大实验：

发酵体系：10L LB培养基(Amp100μg/mL)

发酵方案：挑取LB平板上(Amp100μg/mL)保藏菌种单菌落转接至种子液，37℃，200r/min摇床培养7h，按5∶100(种子液∶培养基体积比)的比例转接至发酵罐；37℃，固定通气量4L/min，培养约6小时至对数生长期，补料1L LB，同时加入诱导剂(IPTG 0.1mmol/L)后继续培养，5小时后放罐。结果显示，融合蛋白表达量占菌体总蛋白的32％(P1c)，21％(P17c)和30％(P118c)。

融合蛋白的酶切，分离纯化

将融合蛋白加入肠激酶缓冲液中，按1mg/1U用肠激酶(Novagen)进行切割，酶切条件为25℃16小时。酶切完成后，用DEAE-sephadex A25阴离子交换柱(Pharmacia)分离，得到小肽粗品，冷冻干燥后，再经高效液相制备仪(HPLC，C18柱)精制，获得纯品，其纯度达到95％以上。以胰岛素为对照，将产品按照Tricine-SDS-PAGE电泳方法，检测其分子量约为1.9KDa(附图2)。

实施例2：

小肽与Fe₃O₄纳米颗粒(SPIO)的连接

用pH 5.0，0.1M的醋酸钠缓冲液将邻苯二马来酰亚胺(N，N’-O-phenylendimaleimide，OPDM，Sigma)配制成0.75mmol/L溶液。巯基修饰的Fe₃O₄纳米颗粒(SPIO，制备方法见文献：Zhang S，Bian Z，Gu C，et al.Preparation of anti-human cardiac troponin I immunomagnetic nanoparticles andbiological activity assays.Colloids and Surfaces B：Biointerfaces 55(2007)143-148.东南大学生物医学工程系张宇教授慧赠)5mg悬浮于2ml OPDM溶液中，37℃孵育2小时，pH 5.0，0.1M的醋酸钠缓冲液洗涤3次后，用0.5ml相同缓冲液悬浮，分别加入小肽P1c，P17c和P118c 1mg，37℃反应2小时，再用醋酸钠缓冲液洗涤3次后，获得P1c-SPIO，P17c-SPIO和P118c-SPIO，4℃保存备用。

实施例3：

小肽修饰的纳米颗粒与肝癌细胞结合试验

人肝癌细胞株BEL-7402(高表达αvβ3整合素，中科院上海细胞生物研究所)扩增培养后，调整细胞浓度为1.5×10⁵/ml，六孔细胞培养板每孔加2ml。分别加入500μl实施例2所述的P1c-SPIO，P17c-SPIO，P118c-SPIO或500μl未修饰的SPIO，37℃孵育3小时，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次后，用体积百分浓度为4％的多聚甲醛固定15分钟。用蒸馏水洗涤3次后，加入染液(所述染液为由体积百分浓度为20％的亚铁氰化钾溶液和浓盐酸按体积比为5∶1混合而成)，50-56℃温育45分钟。再用蒸馏水洗涤3次后，加入体积百分比为0.3％的中性红溶液，37℃孵育15分钟，蒸馏水洗涤3次后晾干，显微镜下观察并摄片。结果显示，3种小肽修饰的纳米颗粒(P1c-SPIO，P17c-SPIOP和118c-SPIO)均能与BEL-7402高度结合，与细胞结合的纳米颗粒被染成蓝色(见附图3、附图4、附图5中的深色区域)，而未经修饰的纳米颗粒未见结合(附图6)，说明P1c，P17c和P118c 3个小肽均能与高表达αvβ3整合素的人肝癌细胞株BEL-7402结合。

实施例4：

竞争抑制试验小肽修饰的纳米颗粒与肝癌细胞结合试验

人肝癌细胞株BEL-7402(高表达αvβ3整合素，中科院上海细胞生物研究所)扩增培养后，调整细胞浓度为1.5×10⁵/ml，六孔细胞培养板每孔加2ml。分别加入小肽P1c，P17c和P118c与细胞孵育30分钟后，再分别对应加入500μl的P1c-SPIO，P17c-SPIO和P118c-SPIO，37℃孵育3小时，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次后，用4％多聚甲醛固定15分钟。用蒸馏水洗涤3次后，加入染液(染液由体积百分浓度为20％的亚铁氰化钾溶液与浓盐酸按照体积比为5∶1混合而成)，50-56℃温育45分钟。再用蒸馏水洗涤3次后，加入体积百分浓度为0.3％的中性红溶液，37℃孵育15分钟，蒸馏水洗涤3次后晾干，显微镜下观察并摄片。结果显示，肝癌细胞预先加入3种小肽结合(即细胞膜表面的αvβ3整合素与小肽结合饱和)后，不再与小肽修饰的纳米颗粒结合，细胞不再被染成蓝色(黑白打印时与对照相比无明显变化)(见附图7，附图8，附图9)，说明P1c，P17c和P118c 3个小肽与高表达αvβ3整合素的人肝癌细胞株BEL-7402的结合具有高度选择性和特异性。

实施例5：

促进肿瘤细胞的凋亡

人肝癌细胞株BEL-7402(高表达αvβ3整合素，中科院上海细胞生物研究所)扩增培养后，调整细胞浓度为1.5×10⁵/ml，六孔细胞培养板每孔加2ml。分别加入小肽P1c，P17c和P118c(450μg/ml)与细胞37℃孵育3小时后，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，用体积百分浓度为4％的多聚甲醛固定15分钟。用蒸馏水洗涤3次，加入体积百分浓度为0.3％的中性红溶液，37℃孵育15分钟，蒸馏水洗涤3次后晾干，显微镜下观察并摄片。结果显示，肝癌细胞加入3种小肽后使肿瘤细胞破裂(图10，图11，图12)，而未加肽的对照组细胞不受影响(图13)，说明P1c，P17c和P118c 3个小肽具有促进肿瘤细胞凋亡的作用。

序列表

<110>东南大学

<120>与整合素αvβ3具有高结合活性的多肽及其应用

<130>与整合素αvβ3具有高结合活性的多肽及其应用

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>17

<212>PRT

<213>human

<400>1

Cys Ile Arg Thr Pro Lys Ile Ser Lys Pro Ile Lys Phe Glu Leu Ser

1 5 10 15

Gly

<210>2

<211>17

<212>PRT

<213>human

<400>2

Ile Arg Thr Pro Lys Ile Ser Lys Pro Ile Lys Phe Glu Leu Ser Gly

1 5 10 15

Cys

<210>3

<211>18

<212>PRT

<213>human

<400>3

Cys Ile Arg Thr Pro Lys Ile Ser Lys Pro Ile Lys Phe Glu Leu Ser

1 5 10 15

Gly Cys

<210>4

<211>56

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>4

gcggtaccga cgacgacgac aagtgtattc ggactccgaa gattagtaag cctatt 56

<210>5

<211>50

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>5

cgctcgagtt aaccagacag ctcaaactta ataggcttac taatcttcgg 50

<210>6

<211>53

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>6

gcggtaccga cgacgacgac aagattcgga ctccgaagat tagtaagcct att 53

<210>7

<211>53

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>7

cgctcgagtt atgtaccaga cagctcaaac ttaataggct tactaatctt cgg 53

<210>8

<211>56

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>8

gcggtaccga cgacgacgac aagtgtattc ggactccgaa gattagtaag cctatt 56

<210>9

<211>53

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>9

cgctcgagtt atgtaccaga cagctcaaac ttaataggct tactaatctt cgg 53

Claims

1.一种与整合素αvβ3具有高结合活性的多肽，其特征在于该多肽为SEQ IDNO：1氨基酸序列。

2.一种与整合素αvβ3具有高结合活性的多肽，其特征在于该多肽为SEQ IDNO：3氨基酸序列。

3.根据权利要求1-2任一项所述与整合素αvβ3具有高结合活性的多肽在制备肝癌治疗或显像的药物中的应用。

4.根据权利要求1-2任一项所述与整合素αvβ3具有高结合活性的多肽单独或组合作为药物辅料或连接物的应用。