CN101492708B - 混菌固态发酵制备生物活性专一的菜籽肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种混菌固态发酵制备生物活性专一的菜籽肽的方法，采用枯草芽孢杆菌、乳酸菌或产朊假丝酵母之一与雅致放射毛霉或宇佐美曲霉复配，制备发酵剂；将该发酵剂接种于粉碎的菜籽粕，进行固态发酵；提取固态发酵后的培养基，得到菜籽肽的粗提液；将所述粗提液分离纯化、灭菌、干燥即得生物活性专一的菜籽肽。该方法对环境友好，反应条件温和，能充分发挥微生物的蛋白酶水解作用和降解硫甙作用，是一种低成本、适合工业化大批量制备菜籽活性肽的方法。

Description

混菌固态发酵制备生物活性专一的菜籽肽的方法

技术领域

本发明涉及生物活性专一的菜籽肽的制备方法，具体涉及两种微生物混合培养，固态发酵菜籽粕制备生物活性专一的菜籽活性肽的方法。

背景技术

菜籽饼粕是生产菜籽油的副产物，其中含有丰富的蛋白质，是重要的植物蛋白质资源，因菜籽粕中含有硫甙、植酸等抗营养成分，使菜籽饼粕作为植物蛋白资源在食品工业中的应用受到限制。菜籽蛋白主要由12S球蛋白和2S或1.7S清蛋白组成，赖氨酸、胱氨酸和蛋氨酸的含量较高，氨基酸平衡优于大豆蛋白，是一种优质蛋白质，菜籽蛋白水解成多肽后，具有更好的生物活性和加工特性。

目前以菜籽粕或菜籽蛋白为原料制备生物活性专一(即具有某种特定生物活性如抗氧化、降血压、促进细胞生长和抗肿瘤)的菜籽肽的方法，主要有化学法和酶法。化学法酸或碱水解植物蛋白时会产生氯丙醇类致癌物质，且反应条件剧烈，破坏了氨基酸原有构型，同时水解废液的排放也会造成一定的环境污染。酶水解法是目前菜籽肽的制备主要方法，但是由于菜籽粕或菜籽分离蛋白中抗营养因子不能完全脱除，影响了蛋白酶的活性，水解程度不高，菜籽蛋白水解物的风味尤其是苦味问题还未根本解决，同时用于菜籽蛋白水解的酶类来源有限，且成本居高不下，酶法制备生物活性专一的菜籽肽受到了限制。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种混菌固态发酵制备生物活性专一的菜籽肽的方法，该方法对环境友好，反应条件温和，能充分发挥微生物的水解蛋白质作用和降解硫甙作用，是一种低成本、适合工业化大批量制备菜籽活性肽的方法。

本发明提供一种混菌固态发酵制备生物活性专一的菜籽肽的方法，包括以下步骤：

(1)将通过压榨或浸出制油工艺得到的菜籽粕粉碎，获得粉碎的菜籽粕。

(2)将枯草芽孢杆菌、乳酸菌或产朊假丝酵母之一与雅致放射毛霉或宇佐美曲霉复配，制备发酵剂。

(3)将步骤(2)所述发酵剂接入步骤(1)所述粉碎的菜籽粕，进行固态发酵

(4)提取步骤(3)所述固态发酵后的培养基，分离去除残渣，得到菜籽肽的粗提液。

(5)将步骤(4)中所述粗提液分离纯化、灭菌、干燥即得生物活性专一的菜籽肽。

步骤(1)所述菜籽粕的原料可以是普通油菜籽也可以是双低油菜籽，其粉碎粒径为100～600μm。粉碎后的菜籽粕可以直接用于发酵或灭菌后用于发酵。

步骤(2)中采用两种菌复配可以达到产生多种蛋白酶系的目的，如枯草芽孢杆菌、乳酸菌和产朊假丝酵母产丝氨酸蛋白酶，雅致放射毛霉和宇佐美曲霉产羧基酸性蛋白酶，酶切位点不同，能够满足生产不同活性肽的需要，同时两种菌复配也避免了多菌种之间的竞争抑制性。

步骤(2)所述发酵剂的制备过程为：

(2-1)配制无菌营养液，其成分为葡萄糖0.1％～5％(w/v)，KH₂PO₄0.1％～2.0％，pH为4.0～10.0。

(2-2)将活化、扩大培养后的各微生物菌种，分别用(2-1)所述无菌营养液配制成菌含量或孢子含量为1×10⁴～1×10⁸个/mL的悬浊液，混合后即为发酵剂。

步骤(3)所述发酵条件为：发酵剂的加入量，为粉碎的菜籽粕质量的0.7～4倍，发酵温度20℃～40℃，发酵时间2～5天，环境湿度40％～100％，发酵容器为发酵罐、发酵缸或发酵池。

按照固液比为1∶5～1∶30(质量比)加入去离子水、蒸馏水或自来水，对固态发酵后的培养基进行提取。提取温度为15～80℃，提取时间为10～180min，提取1～3次。该提取液采用真空过滤器或压力过滤器去除残渣，也可以采用离心法，离心力为1000～15000g，以获得菜籽活性肽的粗提液。该粗提液采用超滤膜分离纯化，超滤膜的截留分子量为30KDa、10kDa，3kDa和1kDa，收集不同分子量的滤液，得到五种生物活性专一的菜籽肽。该粗提液也可以采用凝胶层析、亲和层析或离子交换方法进行分离纯化，得到生物活性专一的菜籽肽。

本发明与现有的技术相比，直接以菜籽粕为原料混菌固态发酵生产生物活性专一的菜籽肽，原料来源广泛，价格低廉，不需要对其进行酸、碱的处理，更不需要分离出菜籽蛋白，生产工艺简单、成本低，而且变废为宝，有利于环境保护，以微生物发酵取代纯酶制剂水解菜籽蛋白制备多肽，可以节省大量昂贵的生物酶制剂。同时不同微生物混合发酵时产生多种代谢产物和酶类，能有效降解菜籽粕种的有毒物质，水解蛋白质，达到人和动物的食用标准，还含有多种对人体有益的功能因子。

具体实施方式

实施例1固态发酵菜籽粕生产生物活性专一菜籽肽的菌种的筛选

筛选对象：黑曲霉、白地霉、米曲霉、宇佐美曲霉、雅致放射毛霉、乳酸菌、产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。

发酵剂的制备：活化后的菌种扩大培养后(按常规方法培养)，用无菌水稀释发酵种子使菌体或者孢子浓度达到3×10⁷个/mL，即为发酵剂。

将双低菜籽粕粉碎至粒径为500μm左右，121℃下湿热灭菌30min。于发酵罐内，按固液比1∶1～1∶2(质量比)的比例加入发酵剂，发酵温度为28℃～35℃，环境湿度为80％～90％，搅拌通风。发酵3天后，按固液比1∶15(质量比)加蒸馏水溶解发酵培养基，低速离心(2500g)分离去除粕渣，再用12000g离心力高速离心去杂，得菜籽活性肽粗提液。

通过比较不同菌种发酵后菜籽粕的氮溶解指数、氨基酸态氮、肽得率和微生物产生的蛋白酶的活力和粗体液中菜籽蛋白肽的分子量分布和粗提液的抗氧化性和降血压生物活性得出黑曲霉，白地霉、黑根霉和地衣芽孢杆菌发酵产物的氮溶解指数、氨基酸态氮、肽得率都比较低，而米曲霉固态发酵后产生了较多的可溶性氮，蛋白酶酶活力也很高，但多肽得率却较低，色谱分析结果表明产生了较多的游离氨基酸，可以推断其发酵后产生蛋白酶可能是外切酶，作用于菜籽粕后将蛋白质水解成了氨基酸，不能作为固态发酵生产生物活性专一菜籽肽的出发菌株。乳酸菌、产朊假丝酵母、宇佐美曲霉、雅致放射毛霉和枯草芽孢杆菌发酵效果较好。

实施例2枯草芽孢杆菌与雅致放射毛霉混菌固态发酵生产生物活性专一的菜籽肽枯草芽孢杆菌菌悬液的制备：

斜面培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5，琼脂20g，自来水1000mL，pH 7.2-7.4。

种子培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10，NaCl 5g，自来水1000mL，pH 7.2-7.4。

营养液成分：葡萄糖2.6g，KH₂PO₄2.6g，无菌水1000mL，pH为7.0。

从活化后的菌种保藏斜面中，挑取两环枯草芽孢杆菌接种于种子培养基中，8层纱布封口，35℃，120r/min，摇床培养24h，菌体浓度达到10⁸个/mL。

用无菌营养液稀释发酵液，配制成菌体浓度为3×10⁷个/mL的枯草芽孢杆菌菌悬液。

雅致放射毛霉菌悬液的制备：

斜面培养基：马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂2g0，自来水1000mL。

平板扩大培养基：马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL。

无菌营养液：葡萄糖5g，KH₂PO₄3g，1000mL无菌水，pH为7.0。

雅致放射毛霉接种到斜面培养基上于28℃恒温培养4天，然后接种于平板进行扩大培养，4天后用无菌营养液洗下孢子，并将其浓度调整为3×10⁷个/mL。

将枯草芽孢杆菌和雅致放射毛霉的菌悬液按2∶1的比例混合即得发酵剂。

将菜籽粕粉碎至粒径为500μm左右，灭菌，于发酵罐内，按固液比1∶1.5(质量比)的比例加入发酵剂，调发酵温度为32℃，环境湿度为90％，搅拌通风，发酵4天后，按固液比1∶15(质量比)的比例加蒸馏水溶解发酵培养基，低速离心(2500g)分离去除粕渣，再高速离心(10000g)除菌，即得菜籽活性肽粗提液。

将上述粗提液分别通过截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤，将分子量小于10kDa的组分经过离子交换柱(HiTrap^TM离子交换柱Q XL；流速：1mL/min；Tris HCl缓冲液pH 7.5温度：25℃)，疏水层析(HiTrap^TM疏水层析柱Phenyl FF；流速：1mL/min；温度：25℃)和凝胶过滤(Superdex Peptide HR 10/30；流速：0.2mL/min；温度：25℃)，收集具有冷冻干燥抗氧化生物活性的组分，得到抗氧化性专一的菜籽肽。

菜籽肽的抗氧化生物活性指标如下：

菜籽肽还原能力(还原Fe³⁺的能力)：产品浓度10mg/mL时，A₇₀₀nm为0.168

自由基清除率：产品浓度10mg/mL时，DPPH·自由基清除率为18％

金属螯合力(Fe²⁺的螯合能力)：产品浓度10mg/mL时，金属螯合力为65％

脂质氧化抑制率(硫氰酸盐-亚油酸法)：产品浓度50mg/mL时，脂质氧化抑制率为50％

实施例3雅致放射毛霉和产朊假丝酵母同步混菌固态发酵生产生物活性专一的菜籽肽雅致放射毛霉菌悬液的制备：

斜面培养基：马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL。

平板扩大培养基：马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL。

无菌营养液：葡萄糖5g，KH₂PO₄2g，1000mL无菌水，pH为6.5。

雅致放射毛霉接种到斜面培养基上于28℃恒温培养4天，然后接种于平板进行扩大培养，4天后用无菌营养液洗下孢子，并将其浓度调整为3×10⁷个/mL。

产朊假丝酵母菌悬液的制备：

斜面培养基：麦芽浸膏3g，葡萄糖10g，酵母浸膏3g，蛋白胨5g，琼脂20g，自来水1000mL。

种子培养基：麦芽浸膏3g，葡萄糖10g，酵母浸膏3g，蛋白胨5g；自来水1000mL。

营养液：葡萄糖5g，KH₂PO₄2g，无菌水1000mL，pH为6.5。

从活化后的菌种保藏斜面中，挑取两环产朊假丝酵母接种于种子培养基中，8层纱布封口，35℃，120r/min，摇床培养24h，菌体浓度达到10⁸个/mL。用无菌营养液将其浓度调整为10⁷个/mL。

将雅致放射毛霉和产朊假丝酵母的菌悬液按2∶1的比例混合即得发酵剂。

将菜籽粕粉碎至粒径为500μm左右，灭菌，于发酵罐内，按固液比1∶1(质量比)的比例加入发酵剂，调发酵温度为30℃，环境湿度为90％，搅拌通风，发酵3天后，按固液比1∶15(质量比)的比例加蒸馏水溶解发酵培养基，低速离心(2500g)分离去除粕渣，再高速离心(10000g)除菌，即得菜籽活性肽粗提液。

将上述粗提液经过离子交换柱(HiTrap^TM离子交换柱SP XL；流速：1mL/min，磷酸盐缓冲液pH 6.5，温度：25℃)，疏水层析(HiTrap^TM疏水层析柱Phenyl FF；流速：1mL/min；温度：25℃)和凝胶过滤(Superdex Peptide HR 10/30；流速：0.2mL/min；温度：25℃)，收集具有抗氧化生物活性的组分，经冷冻干燥后得到抗氧化性专一的菜籽肽。

菜籽肽的抗氧化生物活性指标如下：

菜籽肽还原能力(还原Fe³⁺的能力)：产品浓度10mg/mL时，A₇₀₀nm为0.170；

自由基清除率：产品浓度10mg/mL时，DPPH·自由基清除率为17％；

金属螯合力(Fe²⁺的螯合能力)：产品浓度10mg/mL时，金属螯合力58％；

脂质氧化抑制率(硫氰酸盐-亚油酸法)：产品浓度50mg/mL时，脂质氧化抑制率为52％。

实施例4枯草芽孢杆菌与宇佐美曲霉同步混菌固态发酵生产生物活性专一的菜籽肽枯草芽孢杆菌菌悬液的制备：

斜面培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5，琼脂20g，自来水1000mL，pH 7.2-7.4。

种子培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10，NaCl 5g，自来水1000mL，pH 7.2-7.4。

营养液成分：葡萄糖3g，KH₂PO₄2g，无菌水1000mL，pH为6.5。

从活化后的菌种保藏斜面中，挑取两环枯草芽孢杆菌接种于种子培养基中，8层纱布封口，35℃，120r/min，摇床培养24h，菌体浓度达到10⁸个/mL。用无菌营养液稀释发酵液，配制成菌体浓度为3×10⁷个/mL的菌悬液。

宇佐美曲霉菌悬液的制备：

斜面培养基：马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL。

平板扩大培养基：马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL。

无菌营养液：葡萄糖3g，KH₂PO₄2g，1000mL无菌水，pH为6.5。

宇佐美曲霉接种到斜面培养基上于28℃恒温培养4天，然后接种于平板进行扩大培养，4d后用无菌营养液菌水洗下孢子，并将其浓度调整为3×10⁷个/mL。

将枯草芽孢杆菌和宇佐美曲霉的菌悬液按1∶2的比例混合即得发酵剂。

将菜籽粕粉碎至粒径为500μm左右，灭菌，于发酵罐内，按固液比1∶1.5(质量比)的比例加入发酵剂，调发酵温度为32℃，环境湿度为90％，搅拌通风，发酵4天后，按固液比1∶15(质量比)的比例加蒸馏水溶解发酵培养基，低速离心(2500g)分离去除粕渣，再高速离心(10000g)除菌，即得菜籽活性肽粗提液。

将上述粗提液分别通过截留分子量为30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行超滤，收集不同截留分子量的滤液，经脱盐柱(HiPrep^TM26/10，流速30mL/min，温度25℃)脱盐、脱色，灭菌(121℃，30min)，喷雾干燥得到生物活性不同的五个组分菜籽肽粉。其中分子量1KDa～3KDa的菜籽肽具有较好抗氧化性。

实施例5乳酸菌和宇佐美曲霉同步混菌固态发酵生产生物活性专一的菜籽肽

乳酸菌菌悬液的制备：

斜面培养基：酵母膏5g，碳酸钙6g，琼脂15～20g，5°Bé麦芽汁1000mL，pH 6.0。

种子培养基：酵母膏5g，碳酸钙6g，5°Bé麦芽汁1000mL，pH 6.0。

营养液成分：葡萄糖5g，KH₂PO₄1g、无菌水1000mL，pH为5.5。

从活化后的菌种培养斜面中，挑取两环乳酸接种于种子培养基中，8层纱布封口，37℃，120r/min，摇床培养24h，发酵液中的菌体浓度达到10⁸个/mL。用无菌营养液调节发酵液菌体浓度至3×10⁷个/mL。

宇佐美曲霉菌悬液的制备：

斜面培养基：马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL。

平板扩大培养基：马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂2g0，自来水1000mL。

无菌营养液：葡萄糖5g，KH₂PO₄1g，1000mL无菌水，pH为5.5。

宇佐美曲霉接种到斜面培养基上于28℃恒温培养4天，然后接种于平板进行扩大培养，4天后用无菌营养液菌水洗下孢子，并将其浓度调整为3×10⁷个/mL。

将乳酸菌和宇佐美曲霉的菌悬液按1∶1的比例混合即得发酵剂。

将菜籽粕粉碎至粒径为500μm左右，灭菌，于发酵罐内，按固液比1∶5(质量比)的比例加入发酵剂，调发酵温度为30℃，环境湿度为90％，搅拌通风，发酵3天后，按固液比1∶15(质量比)的比例加蒸馏水溶解发酵培养基，低速离心(2500g)分离去除粕渣，再高速离心(10000g)去杂，即得菜籽活性肽粗提液。

将上述粗提液分别通过截留分子量为3kDa的超滤膜进行超滤，分子量≤3kDa的组分经过凝胶过滤(柱：SOURCE^TM 5RPC，流速1mL/min，温度25℃；磷酸盐缓冲液pH6.5)，收集具有抑制ACE(血管收缩素转移酶)活性的组分，经冷冻干燥后得到生物活性专一的菜籽肽。

该生物活性专一的菜籽肽降血压生物活性指标：抑制50％的ACE(血管收缩素转移酶)活性所需抑制剂的浓度(IC₅₀)为0.2mg/mL。

Claims (6)

1.一种混菌固态发酵制备生物活性菜籽肽的方法，其特征在于：

(1)将通过压榨或浸出制油工艺得到的菜籽粕粉碎，获得粉碎的菜籽粕；

(2)将产朊假丝酵母与雅致放射毛霉复配，制备发酵剂；具体方法为：

(2-1)配制无菌营养液，其成分为葡萄糖5g，KH₂PO₄2g，无菌水1000mL，pH为6.5；

(2-2)将活化、扩大培养后的各微生物菌种，分别用(2-1)所述无菌营养液配制成雅致放射毛霉孢子浓度为3×10⁷个/mL、产朊假丝酵母菌体浓度为10⁷个/mL的悬浊液，按2∶1的比例混合即得发酵剂；

(3)将步骤(2)所述发酵剂接入步骤(1)所述粉碎的菜籽粕，进行固态发酵；具体方法为：按固液的质量比1∶1加入发酵剂，调发酵温度为30℃，环境湿度为90％，搅拌通风，发酵3天；

(4)提取步骤(3)所述固态发酵后的培养基，分离去除残渣，得到菜籽肽的粗提液；

(5)将步骤(4)中所述粗提液分离纯化、灭菌、干燥即得生物活性菜籽肽。

2.根据权利要求1所述混菌固态发酵制备生物活性菜籽肽的方法，其特征在于：步骤(1)中所述粉碎后的菜籽粕的粒径为200～800μm。

3.根据权利要求1所述混菌固态发酵制备生物活性菜籽肽的方法，其特征在于制备菜籽粕的菜籽原料是普通油菜籽或双低油菜籽。

4.根据权利要求1所述混菌固态发酵制备生物活性菜籽肽的方法，其特征在于：步骤(4)所述提取条件为：按照固液比为1∶5～1∶30加入离子水、蒸馏水或自来水进行提取，提取温度为15～80℃，提取时间10～180min，提取1～3次。

5.根据权利要求1所述混菌固态发酵制备生物活性菜籽肽的方法，其特征在于：步骤(4)所述分离去除残渣的方法为过滤法或离心法，过滤法采用真空过滤器或压力过滤器，离心法采用的离心力为1000～15000g。

6.按权利要求1或2所述混菌固态发酵制备生物活性菜籽肽的方法，其特征在于：步骤(5)中所述分离纯化过程为采用凝胶层析、疏水层析或离子交换方法，得到生物活性菜籽肽。