CN101485705A

CN101485705A - 熟三七和熟三七标准提取物和其应用

Info

Publication number: CN101485705A
Application number: CNA200710066195XA
Authority: CN
Inventors: 王东; 廖彭莹; 张颖君; 杨崇仁
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2007-09-14
Filing date: 2007-09-14
Publication date: 2009-07-22

Abstract

本发明提供一种具有特殊化学组成的中药饮片熟三七以及由其进一步提取得到的标准提取物PNS450，总皂甙含量高，以人参皂甙Rh₄和人参皂甙Rg₅为主要成分；其制备新方法，该方法生产过程简单易行，产品质量稳定，生产周期短，易于批量制备和工业化生产。由该方法制备的熟三七和熟三七标准提取物PNS450可作为药食两用的中药饮片用于中成药产品和食品、保健品、以及功能化妆品等健康产品，可作为天然药物的原料，也可作为保健食品和特殊用途化妆品的原料。

Description

熟三七和熟三七标准提取物和其应用

所属领域：本发明涉及中药学领域，具体地，涉及中药饮片熟三七以及由其进一步提取得到的标准提取物PNS450，它们的炮制方法，及其作为在制备天然药物中的应用，在制备功能保健食品中的应用和在制备治疗或预防皮肤过敏、皮炎、牛皮癣中的应用。

背景技术：

三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)又名田七、金不换等，为五加科(Araliaceae)人参属植物，是我国著名的珍贵中药材。三七为中医血症之要药，用于内外伤等出血症，并有补血养血的作用。三七历来有“生撵熟补”之说，生三七用于散瘀止血，消肿定痛。熟三七则有补血活血、强壮补虚的作用。三七的炮制始见于明代的文献记载，传统的炮制方法有炒制、烤制、蒸制、酒制、黄精汁制等。由于烤制便于操作，目前大多以三七药材的干品为原料，采用烤制工艺加工生产熟三七。油炸法则仅在个别小型作坊或个体家庭作坊中使用。但缺乏规范的加工工艺和质量标准。近20多年来从三七中分离到大量的达玛烷型四环三萜皂甙，并证明为三七的主要生理活性物质。熟三七为三七药材经加工炮制的特殊饮片，对其加工技术和物质基础研究的甚少。本申请经过研究发现，传统经验对熟三七的应用，是与其特殊的物质组成相关的。在加工过程中三七的化学成分发生转化，形成特殊的皂甙组成，是熟三七特有功效的物质基础。三七的主要成分人参皂甙Rg₁，Rb₁和三七皂甙R₁在熟三七的加工过程中显著的降低，甚至检测不出，不应作为熟三七质量的检测指标。当前，熟三七既无统一规范的加工生产技术，又无可行的质量标准，产品质量无法控制。因此，建立规范熟三七的制备工艺，保证饮片的质量稳定性，提供产品稳定，有效成分含量稳定的熟三七及其标准提取物PNS450，是其现有技术中未有的技术方案，未达得到的技术目标。

发明内容：

本发明的目的旨在提供一种规范的熟三七饮片以及由其进一步提取得到的标准提取物PNS450，它们的炮制方法，及其作为在制备天然药物中的应用，在制备功能保健食品中的应用和在制备治疗或预防皮肤过敏、皮炎、牛皮癣中的应用。按本发明的方法生产的产品熟三七，具有特殊的化学组成，产品质量稳定，制备过程简单易行，生产周期短，易于批量制备和工业化生产，在熟三七饮片的生产中具有重要的意义。可用为药食两用的中药饮片，也可作为中成药的原料。熟三七和熟三七标准提取物PNS450，可用为天然药物和功能保健食品，以及特殊用途化妆品的原料。

为实现本发明的上述目的，本发明提供如下的技术方案：

熟三七，取三七地下部分为原料，经破碎或不破碎、100℃蒸汽或高于100℃高压蒸汽蒸制、干燥、粉碎或不粉碎，总皂甙含量为10％以上，其中人参皂甙Rh₄和人参皂甙Rg₅的含量不低于3％。

熟三七标准提取物PNS450，取权1所得熟三七，粉碎后用乙醇或甲醇或丙醇或丁醇加热提取，减压回收有机溶剂，通过大孔吸附树脂柱层析，用水充分洗涤后，用乙醇或甲醇或丙醇或丁醇洗脱，减压回收洗脱液，浓缩后干燥，得率为10％以上，总皂甙含量为90％以上，其中人参皂甙Rh₄和人参皂甙Rg₅的和为总皂甙的50％以上。

所用原料三七地下部分优选人参属植物三七的新鲜或干燥的地下部位，包括各种商品规格的根茎、主根、支根和须根以及按各种比例混合的上述不同部位。

本发明的熟三七和熟三七标准提取物PNS450，还含有一定量的人参皂甙20(S)-Rg₃，20(R)-Rg₃，20(S)-Rh₁，20(R)-Rh₁，Rk₁和Rk₃以及其它微量的达玛烷型四环三萜配糖体。

熟三七可单品或配伍于中药复方中，也可于生产各种中成药产品，其剂型包括但并不限于散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂。

制备熟三七标准提取物PNS450所用的大孔吸附树脂为苯乙烯型的非极性，非离子型的交联聚合物。包括但不限于：Diaion HP，Amberlite XDA，DA201，DA201，CAD-40，HZ，MD，GD-105，KB-8；干燥包括但不限于热风干燥、真空干燥法、冷冻干燥法，喷雾干燥法。

此外，本发明还提供了熟三七和熟三七标准提取物PNS450在制备天然药物中的应用。具体在药物中的应用包括：熟三七和熟三七标准提取物PNS450在制备预防和治疗癌症、免疫调节、抗衰老、抗疲劳、抗应激反应、治疗心脑血管疾病、神经系统疾病中的应用。熟三七和熟三七标准提取物PNS450在制备功能保健食品中的应用。熟三七和熟三七标准提取物PNS450在制备治疗或预防皮肤过敏、皮炎、牛皮癣中的应用。

提供了检测熟三七和熟三七标准提取物PNS450中所含皂甙成分优选用薄层层析和高效液相色谱HPLC分析方法。

下面用本发明的具体制备熟三七饮片和熟三七标准提取物PNS450的方法和分析两种产品中有效成分的含量的方法来详细描述本发明的方法细节：

1.熟三七饮片的制备方法

取新鲜或干燥的三七地下部分，破碎(或不破碎)，经100℃或者高于100℃的蒸汽蒸制，干燥，即得到熟三七。

上述技术方案中用于制备熟三七的植物原料为五加科人参属植物三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)的新鲜或干燥的全根或各个不同的地下部位，包括根茎(俗称剪口、芦头)、主根(俗称头子)、支根(俗称筋条、大筋)和须根以及按各种比例混合的上述不同部位。

本发明制备熟三七的具体步骤如下：

(1)原料处理：干燥的三七地下部分通过机械破碎为一定的粒度。新鲜的三七地下部分可不破碎，或切割为一定的大小。

(2)蒸制：将上述原料置于高压锅内，通入高温蒸汽，保持温度在100-120℃之间进行蒸制。干燥的三七地下部分蒸制时间12小时；新鲜的三七地下部分蒸制时间8小时。

(3)干燥：蒸制后，取出，干燥。

(4)精制：根据需要，制成粉状、颗粒状、片状、块状等不同形状的饮片。

(5)薄层层析分析：按本发明制备的熟三七，薄层层析的主要斑点与人参皂甙Rh₄和人参皂甙Rg₅标准对照品的Rf值相同(图1)。

薄层层析检测方法如下：取Rh₄和人参皂甙Rg₅标准对照品适量，加甲醇制成每1ml约含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液及上述对照品溶液各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇—水(8:2:0.3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

高效液相色谱(HPLC)分析：按本发明制备的熟三七具有如图2所示的高压液相色谱指纹图谱。定量分析结果表明，人参皂甙Rh₄和人参皂甙Rg₅的含量均不低于3％。

高压液相色谱(HPLC)分析方法如下：

色谱条件：HPLC条件色谱柱以用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱规格：4.6×250mm，5μm或4.6×150mm，5μm)；以流动相A：乙腈，流动相B：水，按下表进行梯度洗脱；流速每分钟为1.0ml，；检测波长为203nm；柱温25℃。

时间(分钟)	A(％)	B(％)
时间(分钟)	A(％)	B(％)	0	20	80
20	22	78	0	20	80
20	22	78	45	45	55
55	55	45	45	45	55
55	55	45	90	90	10

对照提取物溶液的制备：精密称取在60℃减压干燥至恒重的皂苷对品，以甲醇溶解即得。

供试品溶液的制备：取样品粉末(过3号筛)约0.5g，精密称定，于10ml容量瓶中加入70％甲醇定容，超声处理30分钟，放冷至室温，补足体积，取上清液，用微孔滤膜(0.45μm)滤过即得。

测定法：照提取物溶液以不同体积进样，制作标准曲线。供试液进样10μl，根据标准曲线计算样品的各皂苷成分的含量。

2.熟三七标准提取物PNS450的制备方法

取熟三七，用低级醇加热提取，减压回收有机溶剂，通过大孔吸附树脂柱层析，用水充分洗涤后，用低级醇洗脱，减压回收洗脱液，浓缩后干燥，即得到熟三七标准提取物PNS450。

上述技术方案中，用于制备熟三七标准提取物PNS450的原料为按本发明的上述本方法制备得到的熟三七。

发明制备熟三七标准提取物PNS450的具体步骤如下：

(1)提取：取熟三七粉或熟三七颗粒，用不同浓度的乙醇、甲醇、丙醇、丁醇等低级醇，加热回流提取2-3次，每次回流时间2小时。合并提取液，减压回收溶剂。

(2)层析：浓缩液通过大孔吸附树脂柱层析进行分离。用水洗尽糖、有机酸等大极性的杂质后，以乙醇洗脱。收集乙醇洗脱部分，减压回收溶剂。

(3)干燥：根据需要与条件，采用真空干燥法、冷冻干燥法，喷雾干燥法等方法进行干燥，得到粉末状的熟三七标准提取物PNS450。

(4)薄层层析检测：按本发明制备的熟三七标准提取物PNS450，薄层层析的主要斑点与人参皂甙Rh₄和人参皂甙Rg₅标准对照品的Rf值相同。薄层层析检测方法：除供试品溶液为熟三七标准提取物PNS450的甲醇溶液外，其余步骤同熟三七饮片的TLC检测方法。

(5)高压液相色谱(HPLC)分析：按本发明制备的熟三七标准提取物PNS450具有如图2所示的高压液相色谱指纹图谱。定量分析结果表明，人参皂甙Rh₄和人参皂甙Rg₅的含量不低于50％。高压液相色谱(HPLC)分析方法：除供试品溶液为熟三七标准提取物PNS450的甲醇溶液(约5mg/ml)外，其余步骤同熟三七饮片的分析方法。

与现有传统工艺相比，本发明的方法具有下述的优点：

本发明采用蒸制法制备熟三七，与目前通用的烤制法相比较，有利于达玛烷型四环三萜皂甙的结构转化，产品质量稳定，便于规模化、规范化生产。

本发明制备的熟三七具有特殊的化学组成，总皂甙含量为10％以上，主要成分人参皂甙Rh₄和人参皂甙Rg₅的生理活性与传统中药对熟三七饮片的应用经验相应。

按本发明的方法制备的熟三七可作为中药三七的规范化饮片，也可作为中成药的原料，也可作为食品的添加剂(如佐汤料等)、功能保健食品等健康产品的原料。

按本发明的方法制备的熟三七标准提取物PNS450具有独创性。熟三七标准提取物PNS450的总皂甙含量为90％以上，其中，主要成分人参皂甙Rh₄和人参皂甙Rg₅的和占总皂甙的50％以上。该标准提取物可作为天然药物和功能保健食品，以及特殊用途化妆品的原料，广泛用于医疗保健方面。

本发明以薄层层析(TLC)检测和高效液相色谱(HPLC)分析对熟三七和熟三七标准提取物PNS450的质量进行监控，保证了产品的质量稳定性。

附图说明：

图1为本发明的炮制三七的薄层层析图，图中1.Rb₁，2.Rg₁，3.Rg₅，4.Rh₄，5.熟三七粉，6.熟三七标准提取物PNS450；

图2为本发明的炮制三七的HPLC指纹图谱，图中1：20-(S)Rh₁，2：20-(R)Rh₁，3：Rk₃，4：Rh₄，5：20-(S)Rg₃，6：20-(R)Rg₃，7：Rk₁，8：Rg₅。

具体实施方式：

下面以本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1：干三七制备熟三七

(1)干燥的三七主根(无数头)，破碎为小粒。

(2)将上述粒状的干燥三七根1kg置于高压灭菌锅内，120℃蒸制12小时。

(3)蒸制后的三七于55℃进行干燥。

(4)粉碎，通过120目筛孔，得到熟三七粉830g。

实施例2：新鲜三七制备熟三七

(1)新鲜的三七全根，切成片状。

(2)将上述片状的新鲜三七全根1kg置于高压灭菌锅内，120℃蒸制8小时。

(3)蒸制后的三七于55℃进行热风干燥。

(4)粉碎，通过120目筛孔，得到熟三七粉275g。

实施例3：熟三七制备标准提取物PNS450

(1)按上述方法得到的熟三七1kg，用工业用乙醇3000ml加热回流提取2小时，趁热过滤，滤渣中加工业用乙醇1500ml，同法反复提取2次。合并提取液，减压回收溶剂。

(2)通过D101大孔吸附树脂柱层析分离。用水洗脱直至洗脱液无色无味。继以乙醇洗脱，至乙醇洗脱液用硫酸-乙醇试剂检查为负反应。合并乙醇洗脱部分，减压回收溶剂。

(3)将浓缩液置于冷冻干燥器中，冷冻干燥，得到熟三七标准提取物PNS450冻干粉。

(4)将浓缩液喷雾干燥，得到熟三七标准提取物PNS450粉116g。

实施例4：熟三七及熟三七标准提取物PNS450的薄层层析分析

取实施例1所制得的熟三七粉样品及实施例1所制得的熟三七标准提取物PNS450适量，加甲醇分别制成10mg/ml和1mg/ml的溶液，吸取供试品溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇—水(8:2:0.3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液显色。结果见图1。

实施例5：熟三七及熟三七标准提取物PNS450的高压液相色谱分析：

仪器：美国Waters公司Waters2695型高效液相色谱仪，Waters2996二极管阵列检测器；EMPOWER色谱工作站；MILLI-PROA纯水处理器。色谱柱：Symmetry C₁₈(4.6×150mm，5μm)

供试品溶液的制备：精密称取实施例1所制得的熟三七粉样品约0.5g及实施例1所制得的熟三七标准提取物PNS450约50mg，分别以70％甲醇溶解并定容至10ml，超声处理30min，放冷至室温，校正体积，静置，取上清液，用0.45μm微孔滤膜滤过。

对照品溶液制备：分别精密称取三七皂苷R₁ 2.48mg，人参皂苷Rg₁ 2.60mg，20(S)-Rg₃ 3.32mg，20(R)-Rg₃ 1.79mg，Rd 2.96mg，Re 2.89mg，Rb₁ 2.93mg，20(S)-Rh₁ 4.94mg，20(R)-Rh₁ 5.07mg，Rk₃5.11mg，Rh₄ 5.09mg，Rg₅ 5.19mg，Rk₁ 3.20mg，于5ml容量瓶中用甲醇溶解并定容，作为对照品溶液。

标准曲线及线性关系考察：精密吸取人参皂苷Rg₁，Rb₁各1、2、5、10、20、40、80、100μl进样，人参皂苷20(S)-Rg₃、20(R)-Rg₃、Rd、Re、20(S)-Rh₁、20(R)-Rh₁、Rk₁、三七皂苷R₁各2、4、8、10、16、20μl进样，人参皂苷Rh₄、Rg₅各5、10、20、40、80μl，Rk₃2、4、8、16、20μl进样，以各对照品的量为横坐标，各对照品峰的峰面积为纵坐标，分别绘制标准曲线，计算回归方程。结果如下：

皂苷	线性范围(μg)	线性方程	r²
皂苷	线性范围(μg)	线性方程	r²	Rg₁	1.04-52.00	y＝269257x+744.58	0.9999
Rb₁	1.17-58.60	y＝216076x+113569	0.9996	Rg₁	1.04-52.00	y＝269257x+744.58	0.9999
Rb₁	1.17-58.60	y＝216076x+113569	0.9996	R₁	0.99-9.92	y＝244129x-79969	0.9991
Rd	1.18-11.84	y＝252248x+844.92	0.9990	R₁	0.99-9.92	y＝244129x-79969	0.9991
Rd	1.18-11.84	y＝252248x+844.92	0.9990	Re	1.16-11.56	y＝248568x-30166	0.9994
20(S)-Rh₁	1.98-19.76	y＝428030x-19720	0.9998	Re	1.16-11.56	y＝248568x-30166	0.9994
20(S)-Rh₁	1.98-19.76	y＝428030x-19720	0.9998	20(R)-Rh₁	2.03-20.28	y＝424336x+102968	0.9998
Rk₁	1.28-12.8	y＝787009x+8562	0.9996	20(R)-Rh₁	2.03-20.28	y＝424336x+102968	0.9998
Rk₁	1.28-12.8	y＝787009x+8562	0.9996	20S-Rg3	0.67-19.97	y＝284936x+1061	0.9995
20R-Rg3	0.36-10.75	y＝300605x-1537	0.9993	20S-Rg3	0.67-19.97	y＝284936x+1061	0.9995
20R-Rg3	0.36-10.75	y＝300605x-1537	0.9993	Rh₄	5.09-81.44	y＝311669x+353686	0.9995
Rg₅	5.19-103.80	y＝147159x+77540	0.9995	Rh₄	5.09-81.44	y＝311669x+353686	0.9995
Rg₅	5.19-103.80	y＝147159x+77540	0.9995	Rk₃	2.04-20.44	y＝515676x+102434	0.9997

样品测定：精密吸取样品溶液，按前述方法进行HPLC检测，进行含量测定。计算结果分别见表1及表2。

表1.熟三七粉中各皂苷含量：

皂苷	Rh₄	20(S)-Rh₁	20(R)-Rh₁	Rk₃	Rg₅	Rk₁	20(S)-Rh₁	20(R)-Rh₁
皂苷	Rh₄	20(S)-Rh₁	20(R)-Rh₁	Rk₃	Rg₅	Rk₁	20(S)-Rh₁	20(R)-Rh₁	含量(％)	3.81	0.84	0.47	1.41	4.73	0.69	0.946	0.422

表2.熟三七标准提取物PNS450中各皂苷含量：

皂苷	Rh₄	20(S)-Rh₁	20(R)-Rh₁	Rk₃	Rg₅	Rk₁	20(S)-Rg₃	20(R)-Rg₃
皂苷	Rh₄	20(S)-Rh₁	20(R)-Rh₁	Rk₃	Rg₅	Rk₁	20(S)-Rg₃	20(R)-Rg₃	含量(％)	27.86	8.75	4.02	9.91	34.85	4.58	6.59	3.40

实施例6：

按实施例1、2、3的方法先制得的熟三七和熟三七标准提取物PNS450，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于2安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

实施例7：

将按实施例1、2、3的方法制得的熟三七和熟三七标准提取物PNS450与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。

实施例8：

取按实施例1、2、3的方法制得的熟三七和熟三七标准提取物PNS450，按其与赋形剂重量比为1:5-1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例9：

取按实施例1、2、3的方法制得的熟三七和熟三七标准提取物PNS450，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。

实施例10：

取按实施例1、2、3的方法制得的熟三七和熟三七标准提取物PNS450，按其与赋形剂重量比为3:1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。

实施例11：

取按实施例1、2、3的方法制得的熟三七和熟三七标准提取物PNS450，加入淀粉600克，乳糖200克，薄荷醇5克，羧甲基淀粉钠183克，制成含片，作为功能食品。

Claims

1、熟三七，取三七地下部分为原料，经破碎或不破碎、100℃蒸汽或高于100℃高压蒸汽蒸制、干燥、粉碎或不粉碎，总皂甙含量为10％以上，其中人参皂甙Rh₄和人参皂甙Rg₅的含量不低于3％。

2、熟三七标准提取物PNS450，取熟三七，粉碎后用乙醇或甲醇或丙醇或丁醇加热提取，减压回收有机溶剂，通过大孔吸附树脂柱层析，用水充分洗涤后，用乙醇或甲醇或丙醇或丁醇洗脱，减压回收洗脱液，浓缩后干燥，得率为10％以上，总皂甙含量为90％以上，其中人参皂甙Rh₄和人参皂甙Rg₅的和为总皂甙的50％以上。

3、如权利要求1和2的熟三七和熟三七标准提取物PNS450，所用原料三七地下部分优选人参属植物三七的新鲜或干燥的地下部位，包括各种商品规格的根茎、主根、支根和须根以及按各种比例混合的上述不同部位。

4、如权利要求1和2的熟三七和熟三七标准提取物PNS450，还含有一定量的人参皂甙

20(S)-Rg₃，20(R)-Rg₃，20(S)-Rh₁，20(R)-Rh₁，Rk₁和Rk₃以及其它微量的达玛烷型四环三萜配糖体。

5、如权利要求1的熟三七可单品或配伍于中药复方中，也可于生产各种中成药产品，其剂型包括但并不限于散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂。

6、如权利要求2的熟三七标准提取物PNS450，其制备所用的大孔吸附树脂为苯乙烯型的非极性，非离子型的交联聚合物。包括但不限于：Diaion HP，AmberliteXDA，DA201，DA201，CAD-40，HZ，MD，GD-105，KB-8；干燥包括但不限于热风干燥、真空干燥法、冷冻干燥法，喷雾干燥法。

7、熟三七和熟三七标准提取物PNS450在制备天然药物中的应用。

8、熟三七和熟三七标准提取物PNS450在制备预防和治疗癌症、免疫调节、抗衰老、抗疲劳、抗应激反应、治疗心脑血管疾病、神经系统疾病中的应用。

9、熟三七和熟三七标准提取物PNS450在制备功能保健食品中的应用。

10、熟三七和熟三七标准提取物PNS450在制备治疗或预防皮肤过敏、皮炎、牛皮癣中的应用。

11、根据权利要求1所述的方法，其特征在于检测熟三七和熟三七标准提取物PNS450中所含皂甙成分优选用薄层层析和高效液相色谱HPLC分析方法。