CN101481394B - 2,3,4,6-四-o-乙酰基-d-吡喃葡萄糖基-[n, n′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺的制备方法 - Google Patents
2,3,4,6-四-o-乙酰基-d-吡喃葡萄糖基-[n, n′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了2，3，4，6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺I与它的α构型II和β构型化合物III。通过抗癌药效学试验，表明该类化合物对小鼠移植瘤有抑制作用，药物毒理试验结果显示该类药物的毒副作用较小，可用于制备抗癌药物。本发明还提供了化合物I、II、III的制备方法，该方法反应步骤少，产率高，成本低，适于工业化生产。
Description
技术领域：
本发明属于药物化学技术领域。具体涉及2，3，4，6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺及其制备方法和用途。
背景技术：
目前癌症的高发病率已是构成严重威胁人类健康的因素之一。虽然人们正在开发治疗癌症基因工程药物和癌症的基因治疗方法，但要大规模应用于临床，距离还相当遥远。因此在癌症治疗中，需要开发更多的毒副作用小而疗效好的化学治疗剂。氮芥、鬼臼毒素及磷酸二酰胺等都属哺乳动物的细胞毒素，但有的因毒性太大，有的难以进入癌细胞，从而影响疗效。为了使相关功能基因易于进入癌细胞，降低毒副作用，药学家们通常将细胞毒素与碳水化合物结合，通过细胞膜上运载碳水化合物的载体将抗癌药引入癌细胞，然后，在细胞内的酶和酶系作用下释放抗癌基因，抑制癌细胞生长。因此数十年来已合成了许多细胞毒素的碳水化合物衍生物，Vargha et al(1957)第一个应用碳水化合物作为生物载体合成了氮芥衍生物；Thomas(1961)用半乳糖合成了乙基-N-双(β-氯乙基)-α-D-6-吡喃半乳糖甲酰胺酯，小鼠每天皮下注射2mg，共14天，对哺乳动物腺体癌抑制率达到40％；Kitty et al.(1962)合成2，3，4，6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双-β-氯乙基]磷酸二酰胺糖浆，小鼠每日口服250mg.kg-1，共7天，对哺乳动物腺体抑制率达到40～50％；Gudkova et al.(1968)合成2，3，5，6-二-O-异丙叉-D-吡喃甘露糖基-1-异丁基磷酸酯。Ovrutskii et al(1974)还合成了N-烷基-N，N′-双(2-氯乙基)二酰胺磷酸的2，3，4，6-四-O-吡喃葡萄糖酯。1983年美国FDA批准了用β-D-吡喃葡萄糖，鬼臼毒素及甲醛合成的商品名“Vepesid”(依托泊甙，足叶乙甙，VP-16-213)的抗癌药。Dickes et al.(1988)合成了β-D-吡喃葡萄糖基[N，N′-双(2-氯乙基)]- 磷酸二酰胺(Glufosfamide，Glc-IPM，GLU-IPM)，在体外使用4×10-5摩尔剂量时，两小时内对小鼠蜂窝肉瘤生长的抑制作用大约为20％，而对胰腺、乳腺及白血病等癌症均有良好的疗效。但是从葡萄糖原料合成Glufosfamide，反应步骤太多，收率很低，成本极高，且Glufosfamide在溶剂中极难结晶，需要制备冻干品或冻干制剂。且Glufosfamide是极性物质，进入人体后需通过受体SAATI转运，需消耗能量。同时它在化学上和酶学上还存在相对不稳定性，在18℃以上的水，甲醇及乙醇等溶液中可自动降解，可能致使细胞毒异磷酸酰胺扩散，导致毒副作用增加和疗效降低(U.S.pat.NO.20040029815)。因此，在药学上Glufosfamide尚存在难以克服的困难。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计疗效好、副作用小的抗癌药。
本发明提供了一种式I的新化合物2，3，4，6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺。
式(I)中AC＝CH3CO-
本发明化合物具有α构型(式II)及β构型(式III)，两者均为白色粉末，式II的熔点：热热分析为单峰，mp91.2℃，比旋光：[α]D 20-4.820(C1，乙醇)；式III的熔点：差热分析单峰mp119.70℃，比旋光[α]D 20-6.31°(C0.4，乙醇)。
2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺(II)及2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺(III)。
式(II)、(III)中AC＝CH3CO-。
本发明的另一目的是提供了2，3，4，6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺(I)的制备方法。
本发明方法以市售葡萄糖及2-氯乙胺盐酸盐为基本原料先合成2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖溴及N，N′-双(2-氯乙基)-磷酸二酰胺两种中间体。将上述两种中间体缩合成了2，3，4，6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺 (I)。合成的产物分α-型(II)及β-型(III)两种结构，经分离纯化及结晶获得高纯度α-型(II)及β-型(III)两种产物。
本发明方法具体包括下列步骤：
(1)2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖溴的制备
以葡萄糖，醋酐及三溴化磷或溴水及红磷为原料，制备2，3，4，6四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖溴，反应如下：
式中(VI)为D-吡喃葡萄糖
(V)为2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖溴
反应在冰浴下(5℃～-10℃)加高氯酸作催化剂(1∶0.01～1∶0.3)，在加入葡萄糖过程中反应温不超过40℃。结晶产物经硅胶G薄层层析和纸层析(正丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶5，V/V)及105℃烘烤后自动显示棕色斑点。结晶产物乙醇溶液与3，5-二硝基水杨酸试剂直火加热产生红棕色反应。
(2)[N，N′-双(2-氯乙基)-磷酸二酰胺]的制备
以三氯氧磷及2-氯乙胺盐酸盐为主要原料，制备[N，N′-双(2-氯乙基)-磷酸二酰胺(异磷酰胺)，其反应如下：
式中(VI)为[N，N′-双(2-氯乙基)-磷酸二酰胺]
Et3N为三乙胺、THF为四氢呋喃
该反应在-10℃以下的无水溶剂氯仿、二氯甲烷或二氯乙烷中进行，三乙胺用于中和生成的盐酸。制得结晶产物VI；产物结晶经硅胶G试剂薄层层析(正丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶5，V/V)，烘干后喷定磷试剂(3mol/L H2SO4∶水∶2.5％钼酸铵∶10％抗坏血酸＝1∶2∶1∶1，V/V)呈蓝色斑点。产物结晶的1％NaOH溶液与定磷试剂混合于40～50℃保温30分钟，溶液呈蓝色反应。
(3)2，3，4，6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺的制备
在二氯甲烷或氯仿等无水溶剂中，2，3，4，6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖溴(V)与[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺(VI)两种中间体缩合成2，3，4，6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺，其反应为：
该反应在于30～70℃搅拌或回流反应20～25小时。产物经硅胶G薄层层析(正丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶5，V/V)，烘干后喷定磷试剂呈蓝色斑点。产物(I)的乙醇溶液与3，5-二硝基水杨酸试剂直火加热产生红棕色反应，与定磷试剂混合于40～50℃保温30分钟，呈蓝色反应。
(4)分离步骤(3)缩合产物I的α-型II和β型III：
步骤(3)缩合产物(I)是α-型(II)及β-型(III)两种构型的混合物，经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝80∶20，V/V)分离、再通过结晶和重结晶，则分离出3～5％的α-型(II)及95％以上的β-型(III)，并用于急性毒性试验及抗肿瘤药效学试验。
在本发明的方法中，所述步骤(3)缩合反应2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡 喃葡萄糖溴与[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺的摩尔比为1～1.5∶1。反应温度为30～70℃；溶液pH值为6～9；搅拌反应时间为16～30小时；所用无水溶剂为氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、1，1-二氯乙烷、醋酸乙酯、四氢呋喃、乙醚、苯、甲苯、石油醚或吡啶。所述步骤(4)硅胶柱层析用洗脱剂为氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷、石油醚、四氢呋喃、甲苯、苯、乙醚或醋酸乙酯或它们的混合溶剂；式I、式II或式III化合物的结晶及重结晶溶剂为氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷、醋酸乙酯、甲苯、苯、四氢呋喃、石油醚、乙醚或吡啶或它们的混合溶剂，结晶和重结晶的温度为-5℃～-20℃。
本发明的又一目的是提供了本发明式I、式II化合物和式III化合物在制备抗癌药物中的应用。
本发明进行了上述化合物的急性毒性及抗癌药效学试验如下：
(1)2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺(III)的急性毒性试验(LD50)结果。
1)小鼠ig给药后结果LD50＝2424.0mg.Kg-1，95％可信限为1922.1-3057.5mg.Kg-1。死亡动物尸体解剖结果，肉眼未见心、肝、脾、肺、肾及胃肠道等重要脏器的明显变化。存活动物给药14天后处死，尸体解剖后肉眼未见异常变化。
2)小鼠ip给药后结果LD50＝384.3mg.Kg-1，95％可信限为331.5-445.6mg.Kg-1
(2)2，3，4，6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺(I)2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺
(III)抗肿瘤药学试验
1)2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺(III)对动物移植性肿瘤生长的抑制作用
给药组剂量分别为0.6g.Kg-1、0.3g.Kg-1、及0.15g.Kg-1，阳性对照组给予环磷酰胺(CTX)0.025g.Kg-1，空白对照组给予生理盐水。给药体积均为0.4ml/20g，每天给药一天，共给药7天。给药结束2天后处理动物。分别对Heps.S180及EC三 种移植性肿瘤生长的抑制作用进行实验，结果见表1、2及3。
给药组剂量分别为0.6g.Kg-1、0.3g.Kg-1、及0.15g.Kg-1，阳性对照组给予10-羟基喜树碱以0.5mg/kg静脉注射，空白对照组给予生理盐水。给药体积均为0.4ml/20g，每天给药一天，共给药7天。给药结束2天后处理动物。对Lewis肺癌种移植性肿瘤生长的抑制作用进行实验，结果见表4。
给药组对人胃癌MGC803裸小鼠移植瘤有一定的生长抑制作用。给药组灌胃给药0.6g/kg、0.3g/kg、0.15g/kg剂量时，对人胃癌MGC803裸小鼠移植瘤的抑瘤率最高分别可达57.3％、和38.9％、15.4％。同样条件下Topotecan以2mg/kg静脉注射时对人胃癌MGC803裸小鼠移植瘤的抑瘤率为66.5％。普胺磷的抗肿瘤作用呈一定的剂量效应关系。结果见表5。
表1对小鼠移植瘤Heps的抑制作用( 
)(n＝10)
*P＜0.05 **P＜0.01与空白对照组比较
表2对小鼠移植瘤S180的抑制作用( 
)(n＝10)
*P＜0.05 **P＜0.01与空白对照组比较
表3对小鼠移植瘤EC的抑制作用( 
)(n＝10)
*P＜0.05 **P＜0.01与空白对照组比较
表4.对Lewis肺癌小鼠移植肿瘤生长的抑制作用(X±sD，n＝8)
*P＜0.05 **P＜0.01与空白对照组比较
表5.对MGC803人胃癌裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用(X±SD，n＝8)
与空白组比较，**P＜0.01
表1，2及3显示，2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺(III)经ig给药后，对动物移植瘤Heps.S180e及EC均有显著抑制作用。且在0.6g.Kg-1剂量与阳性组(0.025mg.Kg-1)一样，对动物体重增长均有显著抑制作用。
表4显示，2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺经ig给药后，对肺癌Lewis作用也呈一定的剂量效应关系，且在0.15g.Kg-1 剂量与阳性组(0.5mg.Kg-1)接近，对对动物体重增长均有显著抑制作用。
表5显示，2，3，4，6-四-0-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺(III)经ig给药后，对人胃癌MGC803裸小鼠移植瘤有一定的生长抑制作用。给药0.6g/kg剂量时，对人胃癌MGC803裸小鼠移植瘤的抑瘤率最高分别可达57.3％。
(2)2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺(II)对肿瘤细胞生长的抑制作用。
抗肿瘤生物活性体外筛选试验
筛选方法：四氮唑盐(Methyl-Thiazol-Tetrozlium，MTT还原法)
磺酰罗丹明B(sulforhodamine B，SRB)蛋白梁色法。
细胞株：HL60人白血病*
作用时间：72小时
结果评定：无效：10-5mol/L＜85％；
弱效：10-5mol/L≥85％或10-6mol/L＞50％；
强效：10-6mol/L≥85％或10-7mol/L＞50％。
对肿瘤细胞生长的抑制率％
根据上面试验结果显示，2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺(II)对HL60人白血病*有强效。
(3)2，3，4，6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺
(I)对肿瘤细胞生长的抑制作用。
抗肿瘤生物活性体外筛选试验
筛选方法：四氮唑盐(Methyl-Thiazol-Tetrozlium，MTT还原法)
磺酰罗丹明B(sulforhodamine B，SRB)蛋白梁色法。
细胞株：BEL-7402人肝癌，P338小鼠白血病＊，A-549人肺腺癌
作用时间：72小时
结果评定：无效：10-5mol/L＜85％；
弱效：10-5mol/L≥85％或10-6mol/L＞50％；
强效：10-6mol/L≥85％或10-7mol/L＞50％。
对肿瘤细胞生长的抑制率％
根据上面试验结果显示，2，3，4，6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺(I)对BEL-7402人肝癌、P338小鼠白血病＊、A-549人肺腺癌有强效。
本发明以葡萄糖及2-氯乙胺盐酸盐为主要原料，合成了2，3，4，6四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺(I)，该化合物包括α-型(II)及β-型(III)成分，因此采用硅胶柱层析、结晶和重结晶从合成产物中分别获得了高纯度2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺(II，α-型)及高纯度2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺(III，β-型)。本发明反应步骤少，产物收率高，生产成本低，且该类化合物是疏水性的酯类物质，易于结晶，化学上和酶学上均有相对稳定性，进入人体后通过被动扩散作用，无需消耗能量即可被癌细胞吸收，在癌细胞内通过酯酶、酰基化酶及糖甙作用则释放出细胞毒异磷酸酰胺，达到掏抑制癌细胞生长作用。
本发明的化合物可以作为活性化合物与药用辅料按常规方法制成片剂，冲剂，胶囊剂或注射剂。
本发明的化合物可用于制备治疗肺癌、肝癌、直肠结肠癌、胃癌、口腔癌、食道癌、鼻咽癌、何杰金淋巴癌、摄护腺癌、胰脏癌、子宫颈癌、非何杰金淋巴癌、胆囊癌、乳腺癌或白血病等抗癌药物。
具体实施方式
通过以下实例阐述2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺的新合成技术及产物中α-型(II)及β-型(III)两种异构体的分离技术。同时对产物进行元素分析(分析仪：Elementar Vario ELIII)；熔点测定(测定仪：MetzscH DSC204或毛细管熔点测定仪)；比旋光测定(测定仪：Perkin Elmer214MC)及红外谱分析(分析仪：NICOLET impact 410)
实例一[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺的合成
在2000ml三颈瓶中加入1000ml二氯甲烷及170g 2-氯乙胺盐酸盐，冰浴冷却至-10℃以下，滴加65ml三氯氧磷。然后于0℃左右滴加500ml 50％三乙胺的二氯甲烷溶液并搅拌2.5小时后，滤液于20～25℃蒸除四氢呋喃，冰浴下搅拌反应1.5小时，滤取结晶，用冷水、石油醚依次洗涤，甲醇重结晶得38.7g，mpl08～110℃。硅胶G薄层层析(正丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶5，V/V)，定磷试剂显色呈蓝色斑点，Rf＝0.26～030。
实例二2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖溴的合成
在250ml三颈瓶中加入120ml醋酐，冰浴下加入0.4ml高氯酸并分次加入葡萄糖结晶共32g，于25～35℃搅拌30分钟，再于18～25℃滴加7.8ml三溴化磷，搅拌20分钟后，加入12ml水，室温下搅拌3小时，加入150ml二氯甲烷，用200ml水洗涤，分出有机相，用10％NaHCO3溶液洗涤至中性。有机相加无水硫酸钠干燥过夜，滤除硫酸钠，用活性炭脱色过滤，滤液蒸干后用无水乙醚结晶和重结晶得58g。mp86～88℃；[α]0 20+191.34℃(C3.3，乙醇)[α]0 20+105.86℃(24小时后)；硅胶G薄层层析(正丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶5，V/V)，Rf＝0.85～0.86。
实例三2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺的合成及其α-型(II)及β-型(III)异构体的分离
在500ml的三颈瓶中加入350ml无水二氯乙烷、28.5g[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺、35g 2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖溴、于45℃搅拌反应24小时，过滤，滤液用5％氯化钠溶液及冷水依次洗涤。分出有机相用活性炭脱色，脱色液加70g无水硫酸钠干燥过夜，过滤，滤液经减压浓缩得糖浆，用硅胶柱层析(二氯乙烷：石油醚)，分出α-型(II)及β-型(III)产物，经浓缩结晶与重结晶分别得α-型(II)产物1.4g及β-型(III)产物28.8g。它们的结构性质分析如下：
(1)2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺(II)的结构性质分析：
熔点 热热分析为单峰，mp91.2℃
比旋光[α]D 20-4.820(C1，乙醇)
元素分析
IR(KBr)
V(N-H)3407.94cm-1N-H变形振动频率；V(-CH3)2938.63cm-1 -CH3伸缩振动频率吸收；V(-CH2-)2888.06cm-1 -CH2变形振动吸收；V(C＝O)1747.61cm-1伸缩振动吸收；V(-CH3)1434.23cm-1-C-H-变形振动吸收；V(-CH3)1382.31cm-1 -CH3对称变形振动吸收；V(C-O-c)1221.36cm-1反对称伸缩振动吸收。
2、2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-[N，N`-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺(III)的结构性质分析：
硅胶G薄层层析R＝0.84(正丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶5，V/V)，定磷试剂显色。熔点：差热分析单峰mp119.70℃，
比旋光[α]D 20-6.31(C0.4，乙醇)
元素分析
IR(KBr)
V(N-H)3393.50cm-1，3328.52cm-1，3213.00cm-1N-H对称或不对称伸缩振动吸收；V(CH3，-CH2) 2945.85cm-1，2902.53cm-1等三个伸缩振动吸收峰；V(C＝O)1754.64cm-1，C＝O伸缩振动吸收；V(-CH)1435.25cm-1，-C-H变形振动吸收；V1369.37cm-1 C-O酯键伸缩振动吸收及O＝C-CH3变形振动吸收；V(O-C＝O)1239.51cm-1，O-C＝O键的伸缩振动吸收。
Claims (3)
1.2，3，4，6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺I的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖溴V的制备：
在冰浴条件下，以醋酐、葡萄糖和三溴化磷作原料制得V；所述醋酐、葡萄糖和三溴化磷的摩尔比为15∶2∶1；
(2)[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺Ⅵ的制备：
以三氯氧磷及2-氯乙胺盐酸盐为原料，在0℃～-20℃条件下，于氯仿、二氯甲烷或二氯乙烷无水溶剂中反应，然后用三乙胺中和中性制得结晶产物Ⅵ；所述三氯氧磷与2-氯乙胺盐酸盐摩尔比为1.6∶1；
(3)2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖溴与[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺制备I：
在无水溶剂中，2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖溴V与[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺Ⅵ进行缩合反应制得I；所述2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖溴V与[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺VI的摩尔比为1～1.5∶1；
(4)分离步骤(3)缩合产物I的α-型II和β型III：
步骤(3)缩合产物I经硅胶柱层析，二氯甲烷∶甲醇＝80∶20V/V，柱体积100毫升，上柱量1％，流速1～2毫升/分钟，根据流出液的旋光不同，分离得α-构型II和β-构型III，再分别通过结晶和重结晶纯化得化合物II和III
式I、II、Ⅲ中Ac为CH3CO-。
2.根据权利要求1所述的2，3，4，6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺I的制备方法，其特征在于其中步骤(3)的缩合反应中，反应温度为30～70℃；溶液pH值为6～9；搅拌反应时间为16～30小时；所用无水溶剂为氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、1，1-二氯乙烷、醋酸乙酯、四氢呋喃、乙醚、苯、甲苯、石油醚或吡啶。
3.根据权利要求1所述的2，3，4，6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基-[N，N′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺I的制备方法，其特征在于其中步骤(4)式II或式III 化合物的结晶及重结晶溶剂为氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷、醋酸乙酯、甲苯、苯、四氢呋喃、石油醚、乙醚或吡啶或它们的混合溶剂，结晶和重结晶的温度为-5℃～-20℃。
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