CN101477126A - 一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丙型肝炎病毒(HCV)抗原抗体联合检测的方法，将抗HCV核心抗原的单克隆抗体与嵌合抗原同时包被酶联板进行检测，能大大缩短HCV病毒检出的“窗口期”。此外，通过对HCV全长核心抗原进行改构、嵌合非结构区并实现嵌合抗原的表达，能尽可能检出血清中的HCV抗体并与包被的单抗相容，避免了嵌合抗原与单抗相互结合，其阳性检出率和PCR阳性检出率接近。本发明的HCV检测方法还具有操作简单、价格低廉的优点，适于推广使用。

Description

一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测的方法

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测的方法。

背景技术

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染而引起的一种全球性传染病。据估计目前全世界有1.7亿丙肝病毒感染者，我国的丙肝感染率大约为3.0％，目前至少有4000～6000万丙肝患者。其中有80～85％的感染者将发展为慢性丙型肝炎，其中又有20％可发展为肝纤维化，最终有4～5％的肝纤维化患者发生肝细胞性肝癌，危害十分严重。

目前，尚无针对丙型肝炎病毒的特效治疗药物，丙型肝炎疫苗的研制也因HCV快速变异而困难重重，短期内难有突破进展。因此，HCV的早期诊断对于筛查HCV传染源、指导临床治疗和预后判断有重大意义。

现有HCV常用检测方式主要有：(1)间接检测：用来检测体内抗HCV抗体，由于HCV感染后到抗HCV抗体的出现有一个约40～70天的“窗口期”，所以抗HCV不能作为HCV感染的早期诊断指标；(2)直接检测：通过定性或定量检测HCV病毒粒子的组成成分以确定病毒的存在。由于HCV感染后6～15天感染者血液中即有HCV-RNA的出现，并在血清阳转之前达到一个较高的水平，因此采用该检测技术对献血员进行常规筛选可以大大降低“窗口期”感染的危险，虽然定性或定量检测HCV病毒粒子的方法具有早期、敏感和特异等特点，但由于该技术需要昂贵精密的仪器、较高的实验技巧、昂贵的试剂，且容易导致交叉污染导致假阳性偏高，导致其很难推广到单个献血员，在发展中国家的应用也受到很大程度的限制。

鉴于以上HCV病毒检测方法的局限性，尽快研制出快速、准确、低廉并在各大医院可普及的HCV检测方法成为必要。目前尚未有对HCV抗体和HCV核心抗原的联合检测，从而使HCV感染的“窗口期”大大缩短的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对HCV核心抗原和HCV抗体联合检测的方法，使HCV感染的″窗口期″缩短至2周，从而达到准确、快速、便捷的检测目的。

为实现上述目的，本发明的方法包括如下步骤：

1)通过计算机分析丙型肝炎病毒不同亚型的核心抗原序列，确定2个高度保守、抗原性强的氨基酸序列：QDVKFPGGGQIVGGVY、PRGSRPSWGPTDPRRR，再通过基因工程技术克隆表达HCV的全序列抗原，纯化重组HCV-cAg并进行活性鉴定；

2)利用单克隆抗体技术制备2株高效分泌特异性抗HCV核心抗原的鼠源杂交瘤细胞株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCCNO：C200823、CCTCC NO：C200824，进行抗体纯化得到高比活的抗HCV核心抗体；

3)酶结合物制备：将冻干的辣根过氧化物酶纯化后，与制备的单抗混合使其形成酶结合物，再对酶结合物进行双重纯化并浓缩，-20℃保存备用；

4)重构HCV核心抗原和其它非结构蛋白的嵌合抗原：所述的嵌合抗原通过以下方式制备：根据HCV全基因序列设计合成8条引物，用PCR分片段克隆NS-3，NS-4、NS-5和Core核心的相应基因片段，构建重组载体并转化大肠杆菌诱导表达蛋白，表达产物用亲和层析进行纯化再采用Western blot法鉴定活性。

所述8条引物分别为：

①HCV-core-F：TTG CTC GAG AGG CGA CAA CCT ATC C；

②HCV-core-R：GGC GGA GAC GGG CAG TCG GGG TGA CAG GAG；

③HCV-NS3-F：CTC CTG TCA CCC CGA CTG CCC GTC TCC GCC；

④HCV-NS3-R：GCT ATC AGC CGG TTC ATG TCT ACA TTG GTG TAC；

⑤HCV-NS4-F：GTA CAC CAA TGT AGA CAT GAA CCG GCT GAT AGC；

⑥HCV-NS4-R：GGA GTA CGA CTC AAC CTG GGT AAC ACG CGC；

⑦HCV-NS5-F：GCG CGT GTT ACC CAG GTT GAG TCG TAC TCC；

⑧HCV-NS5-R：CAC TCG GGC ACA GGG AAG TTT GGC CTT GAC。

5)包被酶联板并检测：将以上制备的抗HCV cAg的单克隆抗体和嵌合抗原同时包被酶联板，加入待测样品进行检测。

所述鼠源杂交瘤细胞株140-1已于2008年8月14保藏于中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC，地址为：中国武汉珞珈山武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：C200823；鼠源杂交瘤细胞株140-2已于2008年8月14保藏于中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC，地址为：中国武汉珞珈山武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：C200824。

本发明的技术方案能产生以下技术效果：

1、将抗HCV核心抗原的单克隆抗体与嵌合抗原同时包被酶联板进行检测，在大大缩短HCV“窗口期”的同时能有效降低病毒漏检率；

2、对全长核心抗原进行改构，嵌合非结构区并实现嵌合抗原的表达，能尽可能检出血清中的HCV抗体并与包被的单抗相容，避免了嵌合抗原与单抗相互结合，其阳性检出率和PCR阳性检出率接近；

3、抗原抗体联合检测操作简单、与目前酶联免疫设备相容、价格低廉易于推广。

附图说明

图1：HCV核心片段的PCR扩增结果

M、分子量标准。1阴性血清；2、阳性血清样品

图2：纯化后的IgG的SDS-PAGE电泳图

1、单克隆抗体株NO：C200823；2、单克隆抗体株NO：C200824

图3：融合蛋白的纯化结果

M、蛋白分子量标准；1、包涵体；2、嵌合蛋白

具体实施方式

以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定，本发明可以按发明内容所述的任一方式实施。此外，本领域普通技术人员应能理解，HCV抗原、抗体的检测是可以分开或同时进行的。

实施例一：丙肝抗原抗体联合检测

一、HCV核心重组抗原的制备

1、选择HCV核心抗原决定簇表位

对不同亚型HCV核心抗原氨基酸序列进行分析，以及对HCV-cAg的抗原性、亲水性、抗原表位的Macvector程序分析，选择序列保守、抗原性强的抗原部位，确定了2个不同抗原决定簇氨基酸(AA)序列，如表1所示：

表1 四个不同HCV亚型抗原决定簇序列

2、HCV核心重组抗原的克隆表达

选择2-160位氨基酸序列进行重组克隆表达，用pBVIL1表达的基因来源如表2所示：

表2 pBVIL1质粒表达基因来源

在用于扩增基因的引物中均含有酶切位点(正向引物中为XhoI，反向引物中为XbaI)，扩增产物经双酶切后插入以同样双酶切的载体pBVIL1。上述构建的HCV-c抗原基因片段表达质粒，转化用常规氯化钙法致敏的E.coli菌HB101，经含有氨苄抗菌素的平板培养，选取菌落扩增培养后，以碱变性法抽提质粒，以PCR法筛选阳性克隆，扩增产物以琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1)。

3、重组HCV-cAg的纯化和活性鉴定

HCV-C抗原经S-Sepharose柱阶段梯度洗脱，收集0.15M NaCl洗脱峰，再经Sephadex G50柱脱盐，收集第一个洗脱峰。用SDS-PAGE方法鉴定抗原纯度，蛋白质上样量为10μg的条件下仅存一条带，扫描纯度≥95％。用已纯化HCV-c抗原对室内质控血清进行ELISA试验以测定活性。纯化后的抗原于-20℃低温保存。已纯化HCV-c抗原对室内质控血清(10份HCV抗体阳性血清，10份HCV抗体阴性血清)进行ELISA试验以测定活性。

二、抗丙型肝炎病毒核心抗原的单克隆抗体制备

1、不同表位抗丙型肝炎病毒核心抗原的单克隆抗体制备

以重组HCV-cAg免疫Balb/c小鼠(鼠龄6-8周)，取脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)按9:1比例混合，PEG促融合，于HAT培养液(20％胎牛血清/DMEM1×HAT)上融合成杂交瘤细胞。

当杂交瘤克隆生长达总面积15％-20％时即可开始对其上清检测，利用培养基与包埋目标抗原的多孔培养板结合，用ELISA方法检测杂交瘤细胞是否产生抗体，从而筛选出目标克隆系。

将杂交瘤细胞由皮下植入小鼠体内制备腹水。取腹水用ELISA方法筛选出抗体高分泌性细胞，转移至常规1640培养基克隆化培养，收集至10-20L细胞株培养液。用1640常规培养基稀释后转移到的培养罐中，克隆化培养出抗体特异性单克隆细胞系。培养罐中细胞培养遵守物料平衡，上清收集率为99％，残余细胞收集率为1％。

2、单抗纯化及鉴定

采用辛酸-硫酸铵沉淀法沉淀单抗腹水或收集液，透析分离纯化单抗成分，将透析液上清Sephadex G-50层析柱进行离子交换层析，用pH7.2/0.01MPBS洗脱，收集第一洗脱峰，再用PEG2000浓缩收集。将最后得到浓缩液稀释10倍，测280nm OD值，计算纯化抗体的浓度。本工艺制得抗体浓度标准为不低于3ug/ml。

用SDS-PAGE方法鉴定纯度：上样量10ug，纯化后的抗-IgG在SDS-PAGE上呈二条区带(见图2)。检定合格后分装，冻干，-20℃保存备用。

用合成不同丙型肝炎病毒核心抗原的多肽氨基酸位置：20-35aa，35-50aa，100-115aa，115-130aa分别包被酶联板进行单克隆抗体的筛选，筛选阳性克隆进行亚克隆，挑选出不同表位的单克隆。从而对不同表位的抗丙型肝炎病毒的单克隆抗体筛选与鉴定。

三、酶结合物制备

取5mg的HRP溶于1.0ml NaHCO₃溶液中，加入适量0.06M的NaIO₄室温避光搅拌30分钟，移入透析袋，用0.01M pH9.6碳酸盐缓冲液透析过夜。取纯化酶标单抗5mg，用0.01M NaHCO₃溶液充分溶解后与酶液混合，装入透析袋，用0.01M pH9.6碳酸盐缓冲液4℃避光透析20小时，中间换液3次。取透析后结合液加入0.4％NaBH₄ 0.2ml，搅拌30分钟后，4℃放置4小时。

将酶结合物装入透析袋，用pH 7.2 0.01M PBS透析48小时。SephadexG-200凝胶过滤：将透析液上Sephadex G-200层析柱，用pH 7.2、0.01M的PBS洗脱，收集第一个的洗脱峰，再用PEG2000浓缩，—20℃保存备用。抗人IgG酶标记物采用方阵滴定，以间接ELISA法测定效价。为1：5000倍。

四、重构HCV核心抗原和其它非结构蛋白的嵌合抗原

参照Hepatitis C virus subtype 1b(AY460204)的基因序列，设计8条重叠延伸PCR引物，引物由上海生工合成：

1)HCV-core-F：TTG CTC GAG AGG CGA CAA CCT ATC C；

2)HCV-core-R：GGC GGA GAC GGG CAG TCG GGG TGA CAG GAG；

3)HCV-NS3-F：CTC CTG TCA CCC CGA CTG CCC GTC TCC GCC；

4)HCV-NS3-R：GCT ATC AGC CGG TTC ATG TCT ACA TTG GTG TAC；

5)HCV-NS4-F：GTA CAC CAA TGT AGA CAT GAA CCG GCT GAT AGC；

6)HCV-NS4-R：GGA GTA CGA CTC AAC CTG GGT AAC ACG CGC；

7)HCV-NS5-F：GCG CGT GTT ACC CAG GTT GAG TCG TAC TCC；

8)HCV-NS5-R：CAC TCG GGC ACA GGG AAG TTT GGC CTT GAC。

用PCR分片段克隆NS-3、NS-4、NS-5和Core核心的相应基因片段，然后用重叠延伸PCR将这四个片段连接成嵌合基因，再将其插入表达载体pBV-IL2构建成重组载体，以其转化大肠杆菌(JM109)诱导表达蛋白，表达产物用Q型离子交换层析法和分子筛进行纯化(图3)。

纯化产物采用Western blot法鉴定活性：首先进行SDS-PAGE(凝胶浓度为100g/L)，再转移到硝酸纤维膜上，依次加100g/L脱脂奶粉、1∶1000稀释的人HCV抗体阳性血清及1∶20 000HRP2鼠抗人IgG，最后以二氨基联苯胺(DAB)显色。

五、HCV抗原抗体联合检测

1、材料

1)HCV抗原抗体的血液阳性标本：

来自湖南景达生物工程有限公司岳阳君山单采血浆站和屈原单采血浆站收集的HCV抗原或抗体或抗原抗体同时阳性标本，这些HCV抗体或抗原阳性的确认使用的检测试剂来自罗氏公司试剂盒(COBAS AMPLICOR HCV MONITORKIT；HCV ELISA TEST KIT(SP-NANBASE C-96 3.0))和深圳匹基公司HCV核酸定量检测试剂盒.

2)单克隆抗体：

单克隆抗体c20-35由鼠源杂交瘤细胞株CCTCC NO：C200823分泌，针对HCV核心蛋白的N-末端部分(氨基酸20-35)；单克隆抗体c100-115由鼠源杂交瘤细胞株CCTCC NO：C200824分泌，针对HCV核心蛋白的C-末端部分(氨基酸100-115)。c100-115抗体与辣根过氧化物酶(HRP)用标准方法偶联。

3)嵌合抗原：

嵌合抗原含有399个氨基酸残基，其中融合了核心(氨基酸60-100)、NS3(1000-1105)、NS4(1917-1947)和NS5(2383-2453)的片段，并与白介素(IL2，含150个氨基酸基)融合多肽在大肠杆菌中表达纯化得到。

2、方法

将2mg/ml纯化的抗HCV cAg的单克隆抗体C20-35和1×PBS(pH7.4)，pH7.5并充分混合。在同一缓冲液中加入2mg/ml重组嵌合蛋白(包含核心片段C-NS3-NS4-NS5)，混合溶液20分钟，包被酶标板100μL/每孔，放置平板于4℃冰箱16-24小时。然后用1 x PBS洗涤平板三次.然后在抗原抗体包被的微孔板中每孔加入300μL封闭缓冲液(1％的BSA，1×PBS(pH7.4)，甘露醇，聚乙二醇，明胶)一小时，吹洗平板并在4℃冻干器上干燥24小时，平板在有干燥剂的条件下保存。

在平板中加入100mLPBS溶液以稀释100mL待测样品，用微量管把稀释过的样品移入HCV抗原/抗体包被的微孔中，然后在37℃培养60分钟，然后用含有0.5％Tween20的PBS溶液洗涤5次。往微孔中加入200μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠源抗人IgG和HRP标记的抗HCV核心单克隆抗体(AntiC100-115)，培养30分钟后用含有Tween20的PBS溶液洗涤5次。再往微孔中加入邻苯二胺和过氧化氢，避光显色10分钟，最后加入2mol/L硫酸50μL终止反应。用BIO-RAD酶标仪测在A450nm的光下检测微孔板，计算待测样品孔A450nm与阴性对照孔平均A450nm的比值(P/N)，P/N≥2.1判定为阳性。任何一个微孔中显现橙色光就表明被测试样品被HCV感染。

3、结果

试验的结果如表3所示，对感染HCV的血液样品进行检测。抗体/抗原联合检测可以同时检测出血液中的HCV病毒粒子和抗体。提高HCV感染的检出率。

表3：HCV阳性样品ELISA检测结果

Claims (3)

1、一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测的方法，其特征在于通过以下步骤实现：

1)通过计算机软件分析丙型肝炎病毒不同亚型的核心抗原序列，确定2个高度保守、抗原性强的氨基酸序列：QDVKFPGGGQIVGGVY、PRGSRPSWGPTDPRRR；

2)利用单克隆抗体技术制备2株高效分泌特异性抗HCV核心抗原的鼠源杂交瘤细胞株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCCNO：C200823、CCTCC NO：C200824，进行抗体纯化得到高比活的抗HCV核心抗体；

3)将冻干的辣根过氧化物酶纯化后，与制备的单抗混合形成酶结合物；

4)重构HCV核心抗原和其它非结构蛋白的嵌合抗原；

5)将以上制备的抗HCV cAg的单克隆抗体和嵌合抗原同时包被酶联板，加入待测样品进行检测。

2、根据权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测的方法，其特征在于，所述的嵌合抗原通过以下方式制备：根据HCV全基因序列设计合成8条引物，用PCR分片段克隆NS-3，NS-4、NS-5和Core核心的相应基因片段，构建重组载体并转化大肠杆菌诱导表达蛋白，表达产物用亲和层析进行纯化再采用Western blot法鉴定活性。

3、根据权利要求2所述的一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测的方法，其特征在于，所述8条引物分别为：

1)HCV-core-F：TTG CTC GAG AGG CGA CAA CCT ATC C；

2)HCV-core-R：GGC GGA GAC GGG CAG TCG GGG TGA CAG GAG；

3)HCV-NS3-F：CTC CTG TCA CCC CGA CTG CCC GTC TCC GCC；

4)HCV-NS3-R：GCT ATC AGC CGG TTC ATG TCT ACA TTG GTG TAC；

5)HCV-NS4-F：GTA CAC CAA TGT AGA CAT GAA CCG GCT GAT AGC；

6)HCV-NS4-R：GGA GTA CGA CTC AAC CTG GGT AAC ACG CGC；

7)HCV-NS5-F：GCG CGT GTT ACC CAG GTT GAG TCG TAC TCC；

8)HCV-NS5-R：CAC TCG GGC ACA GGG AAG TTT GGC CTT GAC。

Images