CN101474264A

CN101474264A - 一种白芍的有效组分及其制备方法与用途

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Publication number: CN101474264A
Application number: CNA2009100955882A
Authority: CN
Inventors: 程翼宇; 瞿海斌; 吴斌
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2009-01-22
Filing date: 2009-01-22
Publication date: 2009-07-08
Anticipated expiration: 2029-01-22
Also published as: CN101474264B

Abstract

本发明提供一种白芍的有效组分，通过加热提取，浓缩，硅胶柱分离，洗脱，洗脱液浓缩干燥，再用液相色谱继续分离，收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。本发明提供的白芍有效组分可在制备治疗、预防心血管疾病药物中的应用。本发明方法设计合理，能快速准确的得到有效成分，在生产中更易于药物的质量控制。

Description

一种白芍的有效组分及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及一种治疗心血管疾病的中药提取物，具体地说涉及从白芍中提取的有效组分及其制备方法与用途。

背景技术

心血管疾病严重威胁人类的健康，近年来，随着我国人口老年化以及人们工作、生活、饮食结构及环境等的变化，冠心病等心脑血管疾病的发生率也逐年增多，严重威胁着人民的身心健康。天然产物中许多活性物质具有抗心肌缺血、缺氧作用，其中一些已开发成治疗冠心病和心绞痛的新药，如治疗冠心病的药物地奥心血康，它是由从中药中提取的8种甾体皂甙制成的纯中药制剂；心达康是以沙棘为原料提取加工而成的纯天然药物，其有效成分为沙棘总黄酮。因而从天然产物中寻找具有抗心肌缺血、缺氧生理活性的有效物质，是发现、开发新药的有效途径之一。我国药用生物资源十分丰富，其生理活性物质是研究和发现新药先导化学物，开发新药的天然宝库。目前，我国从天然产物中提取活性物质，用于开发成治疗冠心病、安全性好、毒性低的新药还很少，从天然产物中提取活性物质，开发成具有抗心肌缺血，用于治疗冠心病和心绞痛的新药，具有重要应用价值和广阔发展前景。

白芍(Pasonia lactiflora Pall)系毛莨科植物的去外皮干燥根，性微寒，味苦酸。有养血柔肝、缓中止痛、敛阴收汗的功能。我国民间用于治疗胸腹胁肋疼痛、泻痢腹痛、自汗、阴虚发热、月经不调、崩漏、带下。现代研究表明，白芍中主要含芍药苷(paeoniflorin)类化合物，还含有苯甲酸，β-谷甾醇，1，2，3，4，6-黄倍酰单宁，倍单宁，以及没食子鞣质，没食子酸、没食子酸乙酯，d-儿茶素等成分。

发明内容

本发明的目的是提供一种白芍的有效组分，通过以下制备方法获得：将白芍药材粉碎后加入乙醇溶液，加热回流提取得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液II，弃之，然后再改换甲醇作为流动相，得洗脱液III，将洗脱液III浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件：色谱柱为制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)，流动相为水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序如下：0分钟时，流动相为95％的水溶液和5％的乙腈溶液；45分钟时，流动相为75％的水溶液和25％的乙腈溶液；55分钟时，流动相为30％的水溶液和70％的乙腈溶液。流速为10ml/min，柱温为室温；样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在32.9～38.2min时间段收集溶液，减压浓缩，冷冻干燥，得有效组分一，在52.2～55.0min时间段收集溶液，减压浓缩，冷冻干燥，得有效组分二。

优选的白芍有效组分制备方法，包括下列步骤：将白芍药材粉碎后加入乙醇溶液(体积百分比50％～95％)，加热回流0.8～1.2小时，提取1～3次，合并滤液得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(体积比47～53:1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇(体积比8～13:1)作为流动相，得洗脱液II，弃之，然后改换甲醇作为流动相，得洗脱液III，将洗脱液III浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件：色谱柱为制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)，流动相为水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序如下：0分钟时，流动相为95％的水溶液和5％的乙腈溶液；45分钟时，流动相为75％的水溶液和25％的乙腈溶液；55分钟时，流动相为30％的水溶液和70％的乙腈溶液。流速为10ml/min，柱温为室温；样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在32.9～38.2min时间段收集溶液，减压浓缩，冷冻干燥，得有效组分一，在52.2～55.0min时间段收集溶液，减压浓缩，冷冻干燥，得有效组分二。

最佳的白芍有效组分制备方法，包括下列步骤：将白芍药材粉碎后加入乙醇溶液(体积百分比70％～80％)，加热回流1小时，提取2次，合并滤液得提取液；将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(体积比50:1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇(体积比8:1)作为流动相，得洗脱液II，弃之，然后改换甲醇作为流动相，得洗脱液III，用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件：色谱柱为制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)，流动相为水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序如下：0分钟时，流动相为95％的水溶液和5％的乙腈溶液；45分钟时，流动相为75％的水溶液和25％的乙腈溶液；55分钟时，流动相为30％的水溶液和70％的乙腈溶液。流速为10ml/min，柱温为室温；样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在32.9～38.2min时间段收集溶液，减压浓缩，冷冻干燥，得有效组分一，在52.2～55.0min时间段收集溶液，减压浓缩，冷冻干燥，得有效组分二。

本发明的另一个目的是提供该白芍有效组分在制备治疗、预防心血管疾病药物中的应用。

本发明的白芍有效组分可以作为活性成分，加入药剂学上接受的药物赋形剂或载体，按照药剂学上记载的方法制成制剂。

本发明的白芍有效组分还可以作为活性成分之一，还含有其他药物，加入药剂学上接受的药物赋形剂或载体，按照药剂学上记载的方法制成制剂。

所述药物的制剂形式包括液体制剂、固体制剂、胶囊剂、胶丸剂。包括注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩片、微丸等。

通过本发明方法获得的白芍有效组分，具有显著的抗氧化活性，分可在制备治疗、预防心血管疾病药物中的应用。本发明方法设计合理，能快速准确的得到有效成分，在生产中更易于药物的质量控制。

具体实施方式

本发明结合下面实施例进一步详细说明本发明的实质内容，该实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。

实施例一白芍有效组分的制备

将200g白芍药材粉碎后加入乙醇溶液，加热提取得提取液，将提取液浓缩成浸膏10g，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液II，弃之，然后改换甲醇作为流动相，得洗脱液III，将洗脱液III浓缩干燥后得样品2.3g；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件：色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱。样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段32.9～38.2min收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分一0.20g，在时间段52.2～55.0min收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分二0.18g。

实施例二白芍有效组分的制备

将500g白芍药材粉碎后加入体积百分数为90％乙醇，加热回流0.8～1.2小时，提取1～3次，合并滤液得提取液，将提取液浓缩成浸膏22.1g，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(体积比47～53:1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇(体积比8～13:1)作为流动相，得洗脱液II，弃之，然后改换甲醇作为流动相，得洗脱液III，将洗脱液III浓缩干燥后得样品5.1g；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件：色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为9～11ml/min，柱温为室温。样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段32.9～38.2min收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分一0.42g，在时间段52.2～55.0min收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分二0.38g。

实施例三白芍有效组分的制备

取白芍药材250g，将其粉碎后加入体积分数为80％乙醇，加热回流1小时，提取1次，滤液合并得提取液。将提取液浓缩成浸膏得9.8g，将浸膏和硅胶拌样，用正相硅胶柱进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(体积比50:1)作为流动相，得洗脱液I，然后改换氯仿和甲醇(体积比10:1)作为流动相，得洗脱液II，弃之，然后改换甲醇作为流动相，得洗脱液III，将洗脱液III浓缩干燥后得样品2.1g样品。用制备液相色谱继续分离得到的样品。制备色谱的分离条件：色谱柱为Agient制备柱(Zorbax SB-C₁₈；21.2mm×250mm)，流动相为水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序如下：0分钟时，流动相为95％的水溶液和5％的乙腈溶液；45分钟时，流动相为75％的水溶液和25％的乙腈溶液；55分钟时，流动相为30％的水溶液和70％的乙腈溶液。流速为10ml/min，柱温为室温。样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段32.9～38.2min收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分一0.41g，在时间段52.2～55.0min收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分二0.38g。

实施例四白芍有效组分的制备

取白芍药材250g，将其粉碎后加入体积分数为70％乙醇，加热回流1小时，提取2次，滤液合并得提取液。将提取液浓缩成浸膏得11.1g，将浸膏和硅胶拌样，用正相硅胶柱进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(体积比50:1)作为流动相，得洗脱液I，然后改换氯仿和甲醇(体积比10:1)作为流动相，得洗脱液II，弃之，然后改换甲醇作为流动相，得洗脱液III，将洗脱液III浓缩干燥后得样品2.5g样品。用制备液相色谱继续分离得到的样品。制备色谱的分离条件：色谱柱为Agient制备柱(Zorbax SB-C₁₈；21.2mm×250mm)，流动相为水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序如下：0分钟时，流动相为95％的水溶液和5％的乙腈溶液；45分钟时，流动相为75％的水溶液和25％的乙腈溶液；55分钟时，流动相为30％的水溶液和70％的乙腈溶液。流速为10ml/min，柱温为室温。样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段32.9～38.2min收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分一0.44g，在时间段52.2～55.0min收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分二0.42g。

实施例五滴丸制剂的制备

取实施例三的白芍有效组分一0.5g与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6～8℃液体石蜡中，除油，制得滴丸400粒。

实施例六片剂的制备

取实施例三的白芍有效组分二适量与微晶纤维素混合均匀，加3％聚维酮乙醇溶液制软材，过18目筛制颗粒，60℃干燥1小时，整粒，加入滑石粉适量，混匀，压片，即得。

实施例七胶囊剂的制备

取白芍有效组分一与花生油按2：18的比例水溶式不锈钢搅拌灌中，同时加入适量明胶和甘油混合，放出再用胶体磨磨浆，磨出的混合液搅拌，制成药液；将甘油与蒸馏水在40-50℃温度下搅拌混溶，再将甘油液温至80-90℃，取明胶加入其中混合搅拌，直至全部溶化成胶液，然后在60℃温度下使胶液静置4小时，用制板机制成胶板供制丸工序使用；将上述制成的药液和胶板送入压丸机制丸，然后在22-25℃温度下吹风4小时作滚筒定型，又在25-30℃温度下吹风干燥16-20小时，检选合格胶丸，用95％乙醇清洗，在25-30℃下吹风干燥4小时，即得。

实施例八注射液的制备

取白芍有效组分一适量用40℃注射用水溶解，加入适量药用载体等渗剂，调节溶液的pH值为7.0-8.0，加注射用水至全量，用超滤器超滤除热源，测定pH值后，用膜过滤，分装后，高压灭菌，检验、包装，即得。

实施例九冻干粉针制剂的制备

取降香油1.5g，加入到13ml饱和的羟丙基β-环糊精中，搅拌溶解，滤过，滤叶低温干燥，的降香油和羟丙基β-环糊精的包合物粉末。除上述降香油合羟丙基β-环糊精的包合物粉末外，再取实施例三的白芍有效组分二0.5g、甘露醇5.5g、依地酸钙钠0.9g和蒸馏水2ml，上述组分混匀后，冷冻干燥，分装300支，即得。

实施例十白芍有效组分的药理实验

药理模型：H9C2心肌细胞抗氧化模型

配药：用适量DMSO溶解提取物组分，浓度为约50mg/ml，最后作用于细胞的提取物组分浓度为50μg/ml。震荡溶解，若有大量液滴粘壁，可适当离心。储存-20℃。细胞培养：使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氢钠]90％，胎牛血清(Gibco)10％，非必需氨基酸(Gibco)1％，双抗(青霉素，链霉素，浓度都是10万单位/ml)0.1％混合培养H9C2细胞。H9C2细胞种板：取96孔板，由于边缘效应，96孔板最外围一圈加150μl/孔PBS。其他孔按照1万/孔的细胞密度接种细胞，每孔150μl。同时留孔做空白对照，不接种细胞。把该96孔板置于细胞培养箱(37℃，95％空气+5％CO2)培养24小时。细胞加药：每个提取物组分筛选做3次平行操作。用H9C2细胞培养液稀释30％H2O2至200μmol/l浓度，混匀，记做A液。提取物组分稀释分两步：先精密移取50mg/ml的提取物组分1μl至200μl A液中。再精密移取该稀释液30μl至含120ulA液的H9C2接种板中。最后每孔体积为150μl。DMSO组，取1μl至200μl A液中。再精密移取该稀释液30μl至含120μlA液的H9C2接种板中。维生素C组，取50mmol/l的维生素C溶液1μl至200μlA液中。再精密移取该稀释液30μl至含120ulA液的H9C2接种板中。放置细胞培养箱(37℃，95％空气+5％CO2)培养24小时。MTT法测定细胞保护率：小心吸干净每孔中体液，加入100μl/孔，0.5mg/ml的MTT(将5mg/ml的MTT贮备液用H9C2细胞正常培养液稀释10倍)。放置于细胞培养箱(37℃，95％空气+5％CO2)培养4小时。之后拿出96孔板，吸去上清，尽量吸干净，加入150μl/孔DMSO，500rpm转速摇床混匀10分钟，使沉淀充分溶解。立即在酶标仪595nm波长下测定每孔OD值。治疗率＝(加药孔OD值-加DMSO孔OD值)/(加DMSO孔OD值-空白孔OD值)×100％

Claims

1.一种白芍有效组分，其特征在于：通过以下制备方法获得：将白芍药材粉碎后加入乙醇溶液，加热回流提取得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液II，弃之，然后再改换甲醇作为流动相，得洗脱液III，将洗脱液III浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件：色谱柱为Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱程序为：0分钟时，流动相为95％的水溶液和5％的乙腈溶液，45分钟时，流动相为75％的水溶液和25％的乙腈溶液，55分钟时，流动相为30％的水溶液和70％的乙腈溶液；流速为9～11ml/min，柱温为室温；样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在32.9～38.2min时间段收集溶液，减压浓缩，冷冻干燥，得有效组分一，在52.2～55.0min时间段收集溶液，减压浓缩，冷冻干燥，得有效组分二。

2.根据权利要求1所述的一种白芍有效组分，其特征在于：制备方法中将白芍药材粉碎后加入体积百分比50％～95％的乙醇溶液，加热回流0.8～1.2小时，提取1～3次，合并滤液得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和体积比47～53:1的乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和体积比8～13:1的甲醇作为流动相，得洗脱液II，弃之，然后改换甲醇作为流动相，得洗脱液III，将洗脱液III浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件如权利要求1。

3.根据权利要求1所述的一种白芍有效组分，其特征在于：制备方法中将白芍药材粉碎后加入体积百分比70％～80％的乙醇溶液，加热回流1小时，提取2次，合并滤液得提取液；将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和体积比50:1的乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和体积比8:1的甲醇作为流动相，得洗脱液II，弃之，然后改换甲醇作为流动相，得洗脱液III，用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件如权利要求1。

4.根据权利要求1-3任一项所述的一种白芍有效组分在制备治疗、预防心血管疾病药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的一种白芍有效组分的应用，其特征是：所制备的药物还含有制剂允许的药物赋形剂或载体。

6.根据权利要求4所述的一种白芍有效组分的应用，其特征是：所制备的药物还含有其他药物。

7.根据权利要求4所述的一种白芍有效组分的应用，其特征是：所述药物的制剂形式包括液体制剂、固体制剂、胶囊剂、胶丸剂。

8.根据权利要求7所述的一种白芍有效组分的应用，其特征是：所述药物的给药方式包括口服给药、注射给药。