CN101474186B - 具有抗肿瘤活性的2,3,4,7,8-多取代吡啶并[4,3-d]嘧啶衍生物 - Google Patents
具有抗肿瘤活性的2,3,4,7,8-多取代吡啶并[4,3-d]嘧啶衍生物 Download PDFInfo
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Abstract
通式为I的具有抗肿瘤活性的多取代吡啶并[4，3-d]嘧啶衍生物，其涵盖了如下通式I-1、通式I-2所示两类化合物。该多取代吡啶并[4，3-d]嘧啶衍生物对口腔底癌细胞KB；对常春新碱耐药的口腔底癌细胞KBv200；人乳腺癌细胞株MCF-7；对阿霉素耐药的人乳腺癌细胞株MCF-7/Adr；人肺癌细胞株SW1573；对阿霉素耐药的人肺癌细胞株SW1573/2R120；人肝癌细胞株HepG2；人卵巢癌细胞株OVCAR3；人结肠癌细胞株LoVo等多种肿瘤细胞具有显著的抑制作用，可用作抗肿瘤药物的有效成分，与任何一种药剂学上所述的辅料混合制成的任何一种药剂学上所说的剂型，可用于治疗肿瘤病症。
Description
技术领域
本发明涉及一类具有抗肿瘤活性的2，3，4，7，8-多取代吡啶并[4，3-d]嘧啶衍生物。
背景技术
吡啶并[4，3-d]嘧啶类化合物是近年来国内外研究得非常热门的一类杂环化合物。该类化合物既具有医药活性又具有农药活性，特别是在医药研究方面显示了广泛的生理和药理活性，可用于治疗各种类型的肿瘤，癌症，白血病，艾滋病及许多神经性疾病，另外亦可用于止痛、消炎、抗过敏等保健性医疗方面。
我们在前期工作中研究发明了具有通式I的新颖的吡啶并[4，3-d]嘧啶类化合物合成方法，研究发现该类化合物具有良好的杀菌或除草活性，可作为杀菌剂或除草剂的先导体。如利用氮杂维悌希反应合成具有通式I-1的化合物，生物活性测试表明其具有良好的杀菌活性(中国发明专利：具有杀菌活性的噻吩并[3’，2’，5，6]吡啶并[4，3-d]嘧啶-4(3H)-酮及制备，专利号：CN1727343A，申请号：200510019153.1)；通式I-2的化合物可经由中间体醚脒合成得到，生物活性测试结果表明其具有优良的杀菌和除草活性(中国发明专利：一类具有杀菌除草活性的多取代吡啶并[4，3-d]嘧啶及制备，ZL200510019576.3；以及中国发明专利：具有杀菌活性的2，3，4，7-多取代吡啶并[4，3-d]嘧啶衍生物及制备，申请号：200810047941.5)。
本发明通过对前期合成的具有通式I的化合物进行细胞毒性试验，研究其抗肿瘤活性以及可能的作用靶点，以期扩展该类化合物在医药领域的应用范围。
发明内容
本发明的目的在于探索具有通式I的多取代吡啶并[4，3-d]嘧啶衍生物在抗肿瘤活性方面的应用。
本发明的一类多取代吡啶并[4，3-d]嘧啶衍生物的结构通式如I：
式I中，R表示：C1-C2的烷基，苯基或取代苯基，苯基C1-C4烷基或取代苯基C1-C4烷基，所涉及的苯环上的取代基主要为：卤素、C1-C3的烷基或烷氧基，取代基在苯环任一位置上的单取代或多取代，在苯环上的取代基相同或不相同；
R1表示：H；六氢吡啶基，吗啡啉基，苯氧基或取代苯氧基，单取代或双取代烷氨基，烷氨基上的取代基主要为：C1-C6的烷基，苄基或取代苄基，苯乙基或者取代苯乙基；所涉及的苯环上的取代基主要为：卤素、烷基或烷氧基，取代基在苯环任一位置上单取代；
X表示CN时，Y表示直链烷硫基或芳烷硫基，其中芳基指苯基，烷基指C1-C2的烷基；或X、Y共同表示2，3-二甲基噻吩或六氢吡啶[b]噻吩；
Z表示：O，亚甲基；
其中，通式I涵盖了如下通式I-1、通式I-2所示两类化合物；
通式I-1中的R1和通式I中的含义相同；R表示：苯基或取代苯基，所涉及的苯环上的取代基主要为：卤素、C1-C3的烷基或烷氧基，取代基在苯环任一位置上的单取代或多取代，在苯环上的取代基相同或不相同；当X表示CN时，Y仅表示甲硫基；或X、Y共同表示2，3-二甲基噻吩或六氢吡啶[b]噻吩；
通式I-2中的R和通式I中的含义相同；Y表示直链烷硫基或芳烷硫基，其中烷基指C1-C2的烷基，芳基指苯基。
本发明人试验表明具有结构通式I的化合物对人口腔底癌细胞KB、对长春新碱耐药的人口腔底癌细胞KBv200、人乳腺癌细胞株MCF-7、对阿霉素耐药的人乳腺癌细胞株MCF-7/Adr、人肺癌细胞株SW1573、对阿霉素耐药的人肺癌细胞株SW1573/2R12、人肝癌细胞株HepG2、人卵巢癌细胞株OVCAR3和人结肠癌细胞株LoVo等多种肿瘤细胞具有显著的抑制作用，可用作抗肿瘤药剂的有效成分。可与任何一种药剂学上所述的辅料混合制成的任何一种药剂学上所说的剂型，用于治疗肿瘤病症。
所述的以通式I-1、I-2表示的化合物可作为对于人口腔底癌细胞株KB具有细胞毒活性的抗肿瘤药物的有效成份。
所述的以通式I-1、I-2表示的化合物可作为对于对常春新碱耐药的人口腔底癌细胞KBv200具有细胞毒活性的抗肿瘤药物的有效成份。
所述的以通式I-1、I-2表示的化合物可作为对于人肝癌细胞株HepG2具有细胞毒活性的抗肿瘤药物的有效成份。
所述的以通式I-1、I-2表示的化合物可作为对于人卵巢癌细胞株OVCAR3具有细胞毒活性的抗肿瘤药物的有效成份。
所述的以通式I-1、I-2表示的化合物可作为对于对阿霉素耐药的人乳腺癌细胞株MCF-7/Adr具有细胞毒活性的抗肿瘤药物的有效成份。
所述的以通式I-1表示的化合物可作为对于人肺癌细胞株SW1573具有细胞毒活性的抗肿瘤药物的有效成份。
所述的以通式I-1表示的化合物可作为对于对阿霉素耐药的人肺癌细胞株SW1573/2R120具有细胞毒活性的抗肿瘤药物的有效成份。
所述的以通式I-2表示的化合物可作为对于人结肠癌细胞株LoVo具有细胞毒活性的抗肿瘤药物的有效成份。
所述的以通式I-2表示的化合物可作为对于人乳腺癌细胞株MCF-7具有细胞毒活性的抗肿瘤药物的有效成份。
附图说明
图1是化合物89对KB细胞的裸鼠移植瘤模型体内抗肿瘤结果
其结果表明，化合物89具有明显的体内抗肿瘤活性。
图2是化合物89对EGFR酪氨酸激酶磷酸化及其下游信号通路中的AKT、ERK酪氨酸激酶磷酸化的抑制作用
其结果表明，化合物89明显抑制了EGFR酪氨酸激酶磷酸化，对下游信号通路中的AKT、ERK酪氨酸激酶磷酸化也具有显著抑制作用。
具体实施方式
下面通过部分实例来具体地说明本发明的式I化合物的制备方法，这些实施例仅对本发明进行说明，而不是对本发明进行限制。更多实例请参考中国发明专利：具有杀菌活性的噻吩并[3’，2’：5，6]吡啶并[4，3-d]嘧啶-4(3H)-酮及制备，专利号CN 1727343A；一类具有杀菌除草活性的多取代吡啶并[4，3-d]嘧啶及制备，专利号ZL200510019576.3；以及具有杀菌活性的2，3，4，7-多取代吡啶并[4，3-d]嘧啶衍生物及制备，申请号200810047941.5。
实施例1
化合物8
2-正丁胺基-3-对氟苯基-5-甲基-7-甲硫基-8-氰基-3，4-二氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-4-酮制备
在100毫升三口瓶中加入10毫摩尔2-甲基-3-乙氧羰基-5-氰基-6-甲硫基-4-吡啶胺，40毫升乙醇，10毫摩尔三苯基膦，保持温度在0℃以下逐滴加入10毫摩尔六氯乙烷，滴加完毕后固体消失溶液变澄清，逐滴滴加10毫摩尔三乙胺，滴加完毕出现大量固体，室温搅拌12小时后，大部分固体消失，所得反应液脱溶除掉大部分溶剂，再加入无水乙醇与水重结晶，得到白色固体即膦亚胺，熔点为153～155℃，收率为75.6％。
1H NMR(400MHz CDCl3)δ(ppm)：1.09(t，J＝7.2Hz，3H，CH3)，2.37(s，3H，SCH3)，2.51(s，3H，CH3)，3.95(q，J＝7.2Hz，2H，CH2)，4.46(s，1H，NH)，7.44～7.71(m，15H，Ph-H)。
在反应瓶中加入1.0毫摩尔膦亚胺和15毫升无水二氯甲烷，通氩气5分钟以赶净空气，室温快速加入1.1毫摩尔对氟苯基异氰酸酯，静置反应20小时。向反应液中加入1.2毫摩尔正丁胺，静置反应6～8小时后脱去溶剂，向残余物中加入25毫升无水乙醇和催化量的乙醇钠，室温反应1.5小时，有大量固体析出，过滤后用二氯甲烷和石油醚重结晶得纯品白色固体，收率65％，m.p.＞280℃。
化合物1，2，4，5，6，9按照化合物8类似的的方法制备。
实施例2
化合物10
2-异丁胺基-3-对氟苯基-5-甲基-7-甲硫基-8-氰基-3，4-二氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-4-酮制备
在100毫升三口瓶中加入10毫摩尔2-甲基-3-乙氧羰基-5-氰基-6-甲硫基-4-吡啶胺，40毫升丙酮，30毫摩尔三苯基膦，保持温度在0℃以下逐滴加入30毫摩尔六氯乙烷，滴加完毕后固体消失溶液变澄清，逐滴滴加60毫摩尔三乙胺，滴加完毕出现大量固体，室温搅拌20小时后，大部分固体消失，所得反应液脱溶除掉大部分溶剂，再加入无水乙醇与水重结晶，得到白色固体即膦亚胺。
在反应瓶中加入1.0毫摩尔膦亚胺和15毫升无水二氯甲烷，通氩气5分钟以赶净空气，室温快速加入1.5毫摩尔对氟苯基异氰酸酯，静置反应12小时。向反应液中加入1.5毫摩尔异丁胺，静置反应6～8小时后脱去溶剂，向残余物中加入25毫升无水乙醇和催化量的乙醇钠，室温反应2小时，有大量固体析出，过滤后用二氯甲烷和石油醚重结晶得纯品。
所得纯品为白色固体，收率71％，m.p.＞280℃.
化合物12，13，14，15，16，17按照化合物10类似的的方法制备。
实施例3
化合物7
2-正丙胺基-3-对氟苯基-5-甲基-7-甲硫基-8-氰基-3，4-二氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-4-酮制备
在100毫升三口瓶中加入10毫摩尔2-甲基-3-乙氧羰基-5-氰基-6-甲硫基-4-吡啶胺，40毫升二氯甲烷，20毫摩尔三苯基膦，保持温度在0℃以下逐滴加入30毫摩尔六氯乙烷，滴加完毕后固体消失溶液变澄清，逐滴滴加30毫摩尔三乙胺，滴加完毕出现大量固体，室温搅拌24小时后，大部分固体消失，所得反应液脱溶除掉大部分溶剂，再加入无水乙醇与水重结晶，得到白色固体即膦亚胺。
在反应瓶中加入1.0毫摩尔膦亚胺和15毫升无水二氯甲烷，通氩气5分钟以赶净空气，室温快速加入1.2毫摩尔对氟苯基异氰酸酯，静置反应16小时。向反应液中加入1.2毫摩尔正丙胺，静置反应6～8小时后脱去溶剂，向残余物中加入25毫升无水乙醇和催化量的乙醇钠，室温反应3小时，有大量固体析出，过滤后用二氯甲烷和石油醚重结晶得纯品为白色固体，收率55％，m.p.270.5～272.0℃。
化合物18，19，20，21，22，23，24，25按照化合物7类似的的方法制备。
实施例4
化合物3
2-二异丙胺基-3-对氟苯基-5-甲基-7-甲硫基-8-氰基-3，4-二氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-4-酮制备
在100毫升三口瓶中加入10毫摩尔2-甲基-3-乙氧羰基-5-氰基-6-甲硫基-4-吡啶胺，40毫升二氯甲烷30毫摩尔三苯基膦，保持温度在5℃以下逐滴加入30毫摩尔六氯乙烷，滴加完毕后固体消失溶液变澄清，逐滴滴加60毫摩尔三乙胺，滴加完毕出现大量固体，室温搅拌24小时后，大部分固体消失，所得反应液脱溶除掉大部分溶剂，再加入无水乙醇与水重结晶，得到白色固体即膦亚胺。
在反应瓶中加入1.0毫摩尔膦亚胺和15毫升无水二氯甲烷，通氩气5分钟以赶净空气，室温快速加入1.1毫摩尔对氟苯基异氰酸酯，静置反应24小时。向反应液中加入1.2毫摩尔二异丙胺，静置反应6～8小时后脱去溶剂，向残余物中加入25毫升无水乙醇和催化量的乙醇钠，室温反应3小时，有大量固体析出，过滤后用二氯甲烷和石油醚重结晶得纯品白色固体，收率66％，m.p.241.0～243.0℃。
化合物26，27，28，29，30，31，32，33按照化合物3类似的的方法制备。
实施例5
化合物11
2-六氢吡啶基-3-对氟苯基-5-甲基-7-甲硫基-8-氰基-3，4-二氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-4-酮制备
在100毫升三口瓶中加入10毫摩尔2-甲基-3-乙氧羰基-5-氰基-6-甲硫基-4-吡啶胺，40毫升二氯甲烷20毫摩尔三苯基膦，保持温度在10℃以下逐滴加入20毫摩尔六氯乙烷，滴加完毕后固体消失溶液变澄清，逐滴滴加40毫摩尔三乙胺，滴加完毕出现大量固体，室温搅拌48小时后，大部分固体消失，所得反应液脱溶除掉大部分溶剂，再加入无水乙醇与水重结晶，得到白色固体即膦亚胺。
在反应瓶中加入1.0毫摩尔膦亚胺和15毫升无水二氯甲烷，通氩气5分钟以赶净空气，室温快速加入1.3毫摩尔对氟苯基异氰酸酯，静置反应18小时。向反应液中加入1.1毫摩尔六氢吡啶，静置反应6～8小时后脱去溶剂，向残余物中加入25毫升无水乙醇和催化量的乙醇钠，室温反应3小时，有大量固体析出，过滤后用二氯甲烷和石油醚重结晶得纯品白色固体，收率32％，熔点216.0～217.0℃。
化合物34，35，36，37，38，39，40，41按照化合物11类似的的方法制备。
实施例6
化合物42
2-对甲苯氧基-3-对氟苯基-5，8，9-三甲基-噻吩并[3’，2’：5，6]吡啶并[4，3-d]嘧啶-4-酮
在干燥圆底烧瓶中，加入2毫摩尔膦亚胺，再加入10毫升DMSO(二甲基亚砜)溶解，逐滴加入对氯苯基异氰酸酯1.7毫摩尔，在50℃以下反应5小时后，加入1.7毫摩尔4-溴苯酚，再加入20毫升乙腈与0.3毫摩尔固体碳酸钾，在30℃以下，搅拌反应4小时，减压除去乙腈，残余物用DMSO/H2O重结晶，得纯品白色固体，收率78％，熔点.254.7～255.3℃。
化合物43～47，64～80按照化合物42类似的方法制备。
实施例7
化合物48
2-正丁氨基-3-苯基-5-甲基-4H-8，9，10，11-四氢苯并[4’，5’]噻吩并[3’，2’：5，6]吡啶并[4，3-d]嘧啶-4-酮
在干燥圆底烧瓶中，加入1毫摩尔膦亚胺，再加入15毫升无水二氯乙烷溶解，逐滴加入苯基异氰酸酯1.1毫摩尔，在10℃以下静置6小时后，再加入1.1毫摩尔正丙胺，搅拌反应1小时，反应完全之后，在减压下脱去大部分溶剂，再加入15毫升无水乙醇与0.6毫摩尔醇钠溶液，在15℃以下，搅拌反应12小时，有沉淀析出，过滤，用二氯乙烷/石油醚重结晶，所得纯品为浅黄色固体，产率为72％，熔点233.6～233.7℃。
化合物49～63按照化合物42类似的方法制备。
采用上述类似的方法，可以制备通式I-1其他的化合物。表1-1，1-2中所列的为本发明合成的通式I-1部分化合物。
表中省略的符号的含义：Me-甲基Ph-苯基allyl-烯丙基Imidazole-咪唑基
表1-1已合成的部分化合物
表1-2已合成的部分化合物
实施例8
化合物81
3-正丙基-5-甲基-4-亚甲基-7-甲硫基-3，4-二氢-吡啶[4，3-d]并嘧啶-8-腈的制备
将15毫摩尔2-甲基-3-乙酰基-5-氰基-6-甲硫基-4-吡啶胺加入到50毫升的反应瓶中，用20毫升二氯甲烷溶解，加入15毫摩尔原甲酸三乙酯，在0℃反应25小时，反应完全后减压蒸出没有反应的原甲酸三乙酯和溶剂，残余物减压柱层析得白色晶体吡啶醚脒，熔点16.5-16℃，产率65.6％。MS(m/z，％)：277(M+，63.21)，199(31.34)，183(22.45)，152(27.81)，77(100)。
将2毫摩尔2-甲基-3-乙酰基-5-氰基-6-甲硫基吡啶-4-亚胺甲叉基乙基醚、15毫升无水乙醇加入到50毫升的反应瓶中，加入3毫摩尔正丙胺，在20℃搅拌反应12小时，析出白色固体，过滤，乙醇重结晶，得到白色晶体，收率为69％。m.p.147～148℃。
化合物82～105按照化合物81类似的方法制备。
实施例9
化合物108
3-(3-氟苄基)-5-甲基-4-亚甲基-7-乙硫基-3，4-二氢吡啶幷[4，3-d]嘧啶-8-腈制备
将15毫摩尔2-甲基-3-乙酰基-5-氰基-6-乙硫基-4-吡啶胺加入到50毫升的反应瓶中，加入45亳摩尔原甲酸三乙酯，加入催化量对甲苯磺酸，在130℃反应12小时，反应完全后减压蒸出没有反应的原甲酸三乙酯，残余物减压柱层析得白色晶体吡啶醚脒。
将1毫摩尔2-甲基-3-乙酰基-5-氰基-6-乙硫基吡啶-4-亚胺甲叉基乙基醚、15毫升乙腈加入到50毫升的反应瓶中，加入2毫摩尔2-氟苄胺水溶液，加热到40～50℃反应2小时，析出固体，抽滤，丙酮与石油醚混合溶剂重结晶，所得纯品为白色固体，收率为49％。m.p.145.1～146.1℃。
化合物106，107，109～112按照化合物81类似的方法制备。
实施例10
化合物113
3-乙基-5-甲基-4-亚甲基-7-苄硫基-3，4-二氢吡啶幷[4，3-d]嘧啶-8-腈制备
将15毫摩尔2-甲基-3-乙酰基-5-氰基-6-苄硫基-4-吡啶胺加入到50毫升的反应瓶中，加入60毫摩尔原甲酸三乙酯，加入催化量的浓硫酸，在130℃左右反应16小时，反应完全后减压蒸出没有反应的原甲酸三乙酯，残余物减压柱层析得白色晶体吡啶醚脒。
将1毫摩尔2-甲基-3-乙酰基-5-氰基-6-苄硫基吡啶-4-亚胺甲叉基乙基醚、15毫升甲醇加入到50毫升的反应瓶中，加入3毫摩尔乙胺水溶液，加热到回流反应2小时，析出固体，抽滤，丙酮与水混合溶剂重结晶，所得纯品为白色固体，收率为76％。m.p.142.1～143.6℃；
化合物114～128按照化合物113类似的方法制备。
采用上述类似的方法，可以制备通式I-2其他的化合物。表2中所列的为本发明合成的通式I-2部分化合物。
表中省略的符号的含义：Me-甲基Ph-苯基
表2已合成的化合物1-2
| 化合物 | Y | R | 化合物 | Y | R |
| 81 | 105 | ||||
| 82 | SMe | 2-呋喃甲基 | 106 | SEt | PhCH2- |
| 83 | SMe | 苄基 | 107 | SEt | PhCH2CH2- |
| 84 | SMe | 3-吡啶并嘧啶乙基 | 108 | SEt | 2-FPhCH2- |
| 85 | SMe | 苯乙基 | 109 | SEt | 3-CH3PhCH2- |
| 86 | SMe | 3-吡啶甲基 | 110 | SEt | 4-CH3PhCH2- |
| 87 | SMe | 间甲基苯乙基 | 111 | SEt | 4-OCH3PhCH2- |
| 88 | SMe | 对甲基苯乙基 | 112 | SEt | 4-ClPhCH2CH2- |
| 89 | SMe | 对甲基苄基 | 113 | SCH2Ph | CH3CH2- |
| 90 | SMe | 对氯苄基 | 114 | SCH2Ph | CH3CH2CH2- |
| 91 | SMe | 苯丙基 | 115 | SCH2Ph | CH3(CH2)2CH2- |
| 92 | SMe | CH3(CH2)4CH2- | 116 | SCH2Ph | CH3(CH2)3CH2- |
| 93 | SMe | 对甲氧基苄基 | 117 | SCH2Ph | CH3(CH2)4CH2- |
| 94 | SMe | 对氟苄基 | 118 | SCH2Ph | 2-furanyl-CH2- |
| 95 | SMe | 对氟苯乙基 | 119 | SCH2Ph | PhCH2- |
| 96 | SMe | 对溴苄基 | 120 | SCH2Ph | PhCH2CH2- |
| 97 | SMe | 间甲氧基苯乙基 | 121 | SCH2Ph | PhCH2CH2CH2- |
| 98 | SMe | 邻氟苄基 | 122 | SCH2Ph | 2-FPhCH2- |
| 99 | SMe | 间氟苄基 | 123 | SCH2Ph | 3-FPhCH2- |
| 100 | SMe | S-(-)-α-苯乙基 | 124 | SCH2Ph | 2-ClPhCH2- |
| 101 | SMe | 2-氯-5-吡啶甲基 | 125 | SCH2Ph | 3-CH3PhCH2- |
| 102 | SMe | R-(+)-α-苯乙基 | 126 | SCH2Ph | 4-CH3PhCH2- |
| 103 | SMe | 邻氯苄基 | 127 | SCH2Ph | 4-FPhCH2CH2- |
| 104 | SMe | 邻甲基苄基 | 128 | SCH2Ph | 4-ClPhCH2CH2- |
实施例11抗肿瘤活性试验
供试靶标：人口腔底癌细胞KB、对长春新碱耐药的人口腔底癌细胞KBv200、对阿霉素耐药的人乳腺癌细胞株MCF-7/Adr、人肺癌细胞株SW1573、对阿霉素耐药的人肺癌细胞株SW1573/2R120、人肝癌细胞株HepG2和人卵巢癌细胞株OVCAR3。
试验方法：
MTT体外细胞毒试验方法：取对数生长期的人癌细胞制成2×104个细胞/毫升的细胞悬液，按0.19毫升/孔接种到96孔板，于37℃、5％CO2培养24小时后，按0.01毫升/孔加入不同浓度的样品溶液，另设生理盐水对照孔，每浓度设4个平行孔，加药后再培养72小时，培养结束前3小时按0.01毫升/孔加入浓度为10毫克/毫升的MTT(噻唑兰MTT-生化试剂)，培养结束时吸出培养液，每孔加0.1毫升的DMSO，于测量波长540纳米参比波长655纳米下测量OD值。按下式计算细胞生长抑制率(IR)，以简化概率单位法计算半数抑制浓度(IC50)。
IR％＝[1-加药组平均OD值/对照组平均OD值]×100％
测定结果见表3，4，5。
表3部分式I-1化合物的抗肿瘤活性数据(IC50值)
表4部分式I-1化合物的抗肿瘤活性数据(IC50值)
表5部分式1-2化合物的抗肿瘤活性数据(IC50值)
实施例12抗肿瘤活性试验
供试靶标：人结肠癌细胞株LoVo、人乳腺癌细胞株MCF-7和对阿霉素耐药的人乳腺癌细胞株MCF-7/Adr。
试验方法：
MTT体外细胞毒试验方法：取对数生长期的人癌细胞制成2×104个细胞/毫升的细胞悬液，按0.19毫升/孔接种到96孔板，于37℃、5％CO2培养24小时后，按0.01毫升/孔加入不同浓度的样品溶液，另设生理盐水对照孔，每浓度设4个平行孔，加药后再培养72小时，培养结束前3小时按0.01毫升/孔加入浓度为10毫克/毫升的MTT，培养结束时吸出培养液，每孔加0.1毫升的DMSO，于测量波长540纳米参比波长655纳米下测量OD值。按下式计算细胞生长抑制率(IR)，以简化概率单位法计算半数抑制浓度(IC50)。
IR％＝[1-加药组平均OD值/对照组平均OD值]×100％
测定结果见表6。
表6部分式1-2化合物的抗肿瘤活性数据(IC50值)
实施例13化合物89(LghIII-5)抑制肿瘤生长与抑制EGFR酪氨酸激酶磷酸化的相关性
试验目的：靶点筛选发现化合物89具有抑制EGFR酪氨酸激酶的活性，同时显示了强的体外抗肿瘤活性。本研究探讨化合物89体内抗肿瘤作用、对EGFR酪氨酸激酶磷酸化的抑制作用及其下游信号通路的影响。
试验方法：建立KB细胞的裸鼠移植瘤模型用以进行体内抗肿瘤作用的研究。给药方案为：对照组(生理盐水)、CTX阳性对照组(50mg/kg，i.p.，q3d×2)、高剂量化合物89组(80mg/kg，p.o.，qd×15)、中剂量化合物89组(40mg/kg，p.o.，qd×15)、低剂量化合物89组(20mg/kg，p.o.，qd×15)。同时，设以不同浓度的化合物89与人肺腺癌细胞Calu-3共培养48h，收集细胞，抽提蛋白质，进行western blot测定，研究对EGFR酪氨酸激酶磷酸化的影响。
试验结果见图1，2。图1是化合物89对KB细胞的裸鼠移植瘤模型体内抗肿瘤结果。结果表明化合物89具有明显的体内抗肿瘤活性。图2是化合物89对EGFR酪氨酸激酶磷酸化及其下游信号通路中的AKT、ERK酪氨酸激酶磷酸化的抑制作用，结果表明化合物89明显抑制了EGFR酪氨酸激酶磷酸化，对下游信号通路中的AKT、ERK酪氨酸激酶磷酸化也具有显著抑制作用。由此得出结论：化合物89可能通过抑制EGFR酪氨酸激酶磷酸化，进而抑制肿瘤生长。
Claims (13)
1.具有通式I所表示的一类化合物的应用，其特征是，作为活性成分在制备抗肿瘤药物中的应用，
式I中，R表示：C1-C2的烷基，苯基或取代苯基，苯基C1-C4烷基或取代苯基C1-C4烷基，所涉及的苯环上的取代基为：卤素、C1-C3的烷基或烷氧基，取代基在苯环任一位置上的单取代或多取代，在苯环上的取代基相同或不相同；
R1表示：H，六氢吡啶基，吗啡啉基，苯氧基或取代苯氧基，单取代或双取代烷氨基，烷氨基上的取代基为：C1-C6的烷基，苄基或取代苄基，苯乙基或者取代苯乙基；所涉及的苯环上的取代基为：卤素、烷基或烷氧基，取代基在苯环任一位置上单取代；
X表示CN时，Y表示直链烷硫基或芳烷硫基，其中芳基指苯基，烷基指C1-C2的烷基；或X、Y共同表示2，3一二甲基噻吩或六氢吡啶[b]噻吩；
Z表示：O，亚甲基。
2.如权利要求1所述的通式I所表示的一类化合物的应用，其中通式I为通式I-1所示的化合物，其特征是，作为活性成分在制备抗肿瘤药物中的应用，
式I-1中的R1和权利要求1所述的通式I中R1的含义相同；R表示：苯基或取代苯基，所涉及的苯环上的取代基为：卤素、C1-C3的烷基或烷氧基，取代基在苯环任一位置上的单取代或多取代，在苯环上的取代基相同或不相同；当X表示CN时，Y仅表示甲硫基；或X、Y共同表示2，3-二甲基噻吩或六氢吡啶[b]噻吩。
3.如权利要求1所述的通式I所表示的一类化合物的应用，其中通式I为通式I-2所示的化合物，其特征是，作为活性成分在制备抗肿瘤药物中的应用，
式I-2中的R和权利要求1所述的通式I中的含义相同；Y表示直链烷硫基或芳烷硫基，其中烷基指C1-C2的烷基，芳基指苯基。
4.如权利要求2或3所述的以通式I-1或I-2表示的化合物的应用，其特征是，作为活性成分在制备对于人口腔底癌细胞株KB具有细胞毒活性的抗肿瘤药物中的应用。
5.如权利要求2或3所述的以通式I-1或I-2表示的化合物的应用，其特征是，作为活性成分在制备对于对常春新碱耐药的人口腔底癌细胞KBv200具有细胞毒活性的抗肿瘤药物中的应用。
6.如权利要求2或3所述的以通式I-1或I-2表示的化合物的应用，其特征是，作为活性成分在制备对于人肝癌细胞株HepG2具有细胞毒活性的抗肿瘤药物中的应用。
7.如权利要求2或3所述的以通式I-1或I-2表示的化合物的应用，其特征是，作为活性成分在制备对于人卵巢癌细胞株OVCAR3具有细胞毒活性的抗肿瘤药物中的应用。
8.如权利要求2或3所述的以通式I-1或I-2表示的化合物的应用，其特征是，作为活性成分在制备对于对阿霉素耐药的人乳腺癌细胞株MCF-7/Adr具有细胞毒活性的抗肿瘤药物中的应用。
9.如权利要求2述的以通式I-1表示的化合物的应用，其特征是，作为活性成分在制备对于人肺癌细胞株SW1573具有细胞毒活性的抗肿瘤药物中的应用。
10.如权利要求2所述的以通式I-1表示的化合物的应用，其特征是，作为活性成分在制备对于对阿霉素耐药的人肺癌细胞株SW1573/2R120具有细胞毒活性的抗肿瘤药物中的应用。
11.如权利要求3所述的以通式I-2表示的化合物的应用，其特征是，作为活性成分在制备对于人结肠癌细胞株LoVo具有细胞毒活性的抗肿瘤药物中的应用。
12.如权利要求3所述的以通式I-2表示的化合物的应用，其特征是，作为活性成分在制备对于人乳腺癌细胞株MCF-7具有细胞毒活性的抗肿瘤药物中的应用。
13.如权利要求3所述的以通式I-2表示的化合物的应用，其中通式I-2表示的化合物是Y为SMe，R为对甲基苄基的化合物，其特征是，作为活性成分在制备对EGFR酪氨酸激酶磷酸化具有抑制作用的抗肿瘤药物中的应用。
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