CN101473821B - Calbistrins族化合物在植物病害防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的是Calbistrins族化合物在植物病害防治中的应用，其特征在于：将Calbistrins化合物的固体粉剂形式或液体乳油形式防治植物病害。本发明的优点在于：Calbistrins族化合物对疫霉属病原真菌有极其强烈的抗生作用，其中Calbistrin B对辣椒疫霉的MIC(最小抑制浓度)仅为1.25μg/ml。Calbistrins族化合物能溶解于多种有机溶剂中，有利于产品的剂型开发。Calbistrins族化合物既可以人工合成，也可以从微生物液体培养产物中的代谢产物中分离纯化，涉及的提取工艺简洁。本发明为新农药的创制和仿生农药的研制开发提供新的资源。

Description

Calbistrins族化合物在植物病害防治中的应用

技术领域

本发明涉及一种化合物在植物病害防治中的应用，具体是一种Calbistrins族化合物在植物病害防治中的应用。属于对农作物病害的防治领域。

背景技术

微生物可分泌多种抗菌物质，主要有脂肽类、肽类、磷脂类、细菌素、抗生素等小分子物质及大分子的抗菌蛋白及蛋白酶，如几丁质酶、β-1，3葡聚糖酶。San-Lang Wang等从枯草芽孢杆菌W-118中分离获得了分子量为20.6D的几丁质酶，对Fusarium oxysporum具有很强的抑菌活性。Wichitra L.等人分离和纯化了枯草芽孢杆菌NSRS89-24的β-1，3葡聚糖酶并研究其部分特征，发现该酶对水稻稻瘟病菌和纹枯病菌具有抑菌活性。Lee等从土壤中分离到了Pseudomonas aeruginosa GC-B26菌株，此菌株对辣椒疫霉菌Phytophthoracapsici及Colletotrichum orbiculare有很强的抑制能力，并纯化和鉴定了此菌株产生的抗菌物质，通过质谱、紫外光谱、核磁共振等确定此抗菌物质为吩嗪-1-羧酸(分子式：C₁₃H₈N₂O₂)。

在放线菌中，大多生防菌为链霉菌(Streptomyces spp)属，代谢产生抗生素是该属菌抑菌防病的重要机制，抗生素种类有杀虫剂、杀菌剂、除草剂，其分子化学结构主要为氨基糖苷类、大环内酯类、小环内酯类、多肽类、杂环类等。杀菌剂主要有春日霉素(Kasugamycin)、链霉素、多氧霉素(Polyoxins)、有效霉素(Validamycin)、灰黄霉素(Griseofulvin)、灭瘟素(Blastlcldln)、灭胞素(Cellocidin)。我国从50年代开始对农用抗生素开展研究以来，相继成功生产了放线菌酮和灭瘟素，研制成功了春雷霉素、庆丰霉素、井冈霉素、多抗霉素、公主岭霉素(Gongzhulingmycin)、多效霉素、农抗120、中生菌素(Zhongshengmycin)、宁南霉素(Ningnanmycin)和华光霉素(Nikkomycin)等农用抗生素品种。

木霉菌是目前植物病害生物防治最有效的真菌之一。郭润芳等报道，木霉菌的生防作用是由于其产生的抗菌类物质，主要有木霉素(trichodermin)、胶霉素(gliotoxin)、绿木霉素(viridin)、抗菌肽(peptide antibiotic)、trichobrachin、trichovirin等，这些代谢物能破坏立枯丝核菌菌丝细胞壁，使细胞内物质外渗，原生质凝聚，菌丝断裂。

已经报道的青霉属生防真菌有多种防病机理，其中草酸青霉已被成功用来防治豌豆苗期病害和番茄枯萎病，其防病机理主要是产生抗菌物质和诱导植物产生抗病性。青霉Penicillium funiculosum通过对病原菌细胞壁的穿透作用及分泌抗菌物质对杜鹃花和柑橘苗的疫病有较好的防治效果。

从特异青霉Penicillium notatum Westling中发现青霉素开创了人类利用抗生素的先河。从此，从青霉属真菌中筛选、分离抗菌物质一直被人们所关注。随着分离技术和手段的不断进步，有关这方面的报道也日益增多。如发现最早的抗菌化合物之一多酚酸(mycophenolic acid)，就是从Penicilliumbrevicompactum代谢物中分离获得，后来又相继在其他青霉中发现，patulin、3-O-Methylfunicone也广泛存在于许多种青霉的代谢物中。R.Nicoletti从被立枯丝核菌侵染而感病的烟草根部分离到3种拮抗青霉P.brevicompactum，P.expansum和P.pinophilum，并且分别从这3种青霉的液体培养物中分离到了对立枯丝核菌有抗生作用的多酚酸(mycophenolic acid)、展青霉素(patulin)及3-O-methylfunicone，这些抗菌物质可造成病原菌的原生质水解和/或菌丝细胞泡囊化；在灭菌土壤中分别接种立枯丝核菌和3种青霉，培养18天后在土壤中也检测到了上述3种抗菌物质的存在，说明这些抗菌物质的生成并不依赖合成培养基中的营养物质。Penicillium verrucosum被报道代谢产生多种大分子的毒素，对多种真菌有拮抗作用，如ochratoxin A，verrucolon，citrinin和verrucins等。

Calbistrins是一类稀有真菌抗生素，对真菌特别是假丝酵母(白念珠菌)有高度选择性，能溶解于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等常见的有机溶剂，不溶于水，遇光、碱不稳定。该族抗生素具有多种医药用途，具有多种生物活性，如抗真菌，抑制肿瘤，降低胆固醇生成以及作为神经生长因子生成的促进剂等，目前报道只在Aspergillus versicolor，Penicillium restrictum，Penicilliumstriatisporum 3种真菌中发现该族化合物。Brill和Jackson分别于1993年首次报道从Penicillium restrictum代谢物中分离到Calbistrins族中的4个化合物并申请了该族化合物在医药上应用的专利保护。这4个化合物分别为CalbistrinA，B，C，D，其中A和B互为同分异构体，为三环缩醛；Calbistrin C和D互为同分异构体，为还原的二环缩醛类似物。2005年，Michael在澳大利亚分离获得一株Penicillium striatisporum，并从该菌代谢物中分离纯化到7种活性物质，其中包括一种新的、稀有真菌代谢物calbistrin E、新的三烯酸striatisporin A及四丁烯苷酸striatisporolide A。1997年，日本的Tatsuta K等人通过对Calbistrin A的化学合成明确了其全部的立体化学结构。江苏省农业科学院从植物根际筛选得到一株青霉penicilliumstriatisporum，并从其液体培养产物中分离纯化获得calbistrin A和calbistrin B两种化合物，它们互为同分异构体，分子式为C₃₁H₄₀O₈，分子量540.26。

迄今为止，所有的公开报道都只是关于Calbistrins族化合物在医学上的应用研究，还没有将该族化合物应用于农业病害防治的报道。

发明内容

本发明的目的在于：针对目前植物病害防治中，有效的生物农药种类不多、防治效果不稳定，特别是针对疫病等卵菌类病害的防治较为困难、而近几年蔬菜疫病连年大面积爆发等农业问题，提出了利用Calbistrins族化合物对植物病害进行防治。

本发明的目的是这样实现的：Calbistrins族化合物在植物病害防治中的应用，其特征在于：将Calbistrins化合物的固体粉剂形式或液体乳油形式防治植物病害。

在本发明中：所述的Calbistrins族化合物是指：Calbistrin A，或Calbistrin B，或Calbistrin C，或Calbistrin D，或Calbistrin E化合物；Calbistrins族化合物的分子结构分别如下：

Calbistrin A和Calbistrin B的分子结构为：

分子式为C₃₁H₄₀O₈，分子量540.26；

Calbistrin C和Calbistrin D的分子结构为：

分子式为C₃₁H₄₂O₈，分子量542.26；

Calbistrin E的分子结构为：

分子式为C₃₁H₃₈O₇，分子量522.26。

在本发明中：Calbistrins族化合物可以从微生物代谢产物中分离纯化获得，或通过人工合成获得。

在本发明中：以固体粉剂形式防治植物病害是这样实现的：将固体粉剂与普通风干菜园土以1∶300～500的重量比混合后穴施，每穴2～3克；或将固体粉剂与育苗土以1∶500～600的重量比混合后装钵育苗；或将固体粉剂与水以1∶500～600的重量比混合后灌根或叶面喷施。

在本发明中：以液体乳油形式防治植物病害是这样实现的：将乳油与水以1∶500～600的体积比混合后灌根或叶面喷施。

在本发明中：所述的植物病害是指疫霉属病原真菌，或核盘菌属病原真菌，或瓜枝孢霉属病原真菌通过土传或气传引起的植物疫病或菌核病或黑星病。

在本发明中：所述的疫霉属病原真菌是：辣椒疫霉Phytophthora capsiciLeonian，或致病疫霉Phytophthora infestans de Bary，或大豆疫霉Phytophthoramegasperma Drecgsler，或烟草疫霉Phytophthora nicotianae Breda Hann，或掘氏疫霉Phytophthora drechsleri Tucker；所述的核盘菌属病原真菌是：油菜菌核病菌Sclerotinia scleroitorum，或小核盘菌Sclerotinia minor；所述的瓜枝孢霉属病原真菌是：黄瓜黑星病菌Cladosporium cucumerinum。

本发明的优点在于：疫霉属植物病原真菌由于具有特殊的细胞壁结构，许多化学药剂对其无效；并且疫霉菌能在短时间内形成大量的孢子囊并释放游动孢子，因此农作物疫病的防治一直较为困难，亟待挖掘新的、天然的抑菌防病的新型农药。Calbistrins族化合物对疫霉属病原真菌有极其强烈的抗生作用，其中Calbistrin B对辣椒疫霉的MIC(最小抑制浓度)仅为1.25μg/ml。Calbistrins族化合物能溶解于多种有机溶剂中，有利于产品的剂型开发。该青霉菌株液体培养操作简单，从液体培养产物中提取Calbistrins族化合物工艺简洁。本发明为新农药的创制和仿生农药的研制开发提供新的资源。

具体实施方式

实施例1：培养青霉Penicillium striatisporum的培养基的配置

试管斜面培养基的配制：称取：葡萄糖10克，蛋白胨5克，KH₂PO₄ 1克，MgSO4·7H₂O 0.5克，溶解在1000毫升水中，加入琼脂15～20克，加热煮沸至琼脂溶化，补足体积至1000毫升，适当冷却后分装到试管中，装量为试管高度的1/5～1/6，用试管塞塞好试管口，121℃高压灭菌25min，趁热取出后摆斜面至冷却备用，斜面高度不超过试管高度的1/3。

液体种子培养基的配制：称取葡萄糖10克，蛋白胨5克，KH₂PO₄ 1克，MgSO4·7H₂O 0.5克，溶解在1000毫升水中，然后分装，装液量为80～100ml/250ml三角瓶，用棉塞塞好瓶口，121℃高压灭菌25min，冷却后备用。

大量培养液体培养基的配制：称马铃薯200克，去皮，切成块煮沸半小时，然后用两层纱布过滤，再加葡萄糖20克，溶化后补足水至1000毫升，121℃高压灭菌20分钟备用。

实施例2：青霉Pst10的大量液体培养产物的制备

本发明涉及的Calbistrins族化合物是由青霉penicillium striatisporum液体培养代谢产生，该菌株由江苏省农业科学院从植物根际筛选得到，并采用斜面保藏菌种或安瓿管冷冻干燥保藏菌种。

a)菌种的活化

采用斜面保藏菌种的活化方法：将斜面保藏的菌种挑取一块直径8mm左右的菌种接种到试管斜面培养基中活化，在28±2℃的环境中培养3～5天后备用。

采用安瓿管冷冻干燥保藏菌种的活化方法：在超净工作台中用70％酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中挫一道沟，用无菌纱布垫或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿，向其中加入0.5～1.0ml液体培养基，慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水，然后再将此转接到试管斜面培养基中活化，在28±2℃的环境中培养3～5天后备用。

b)液体种子培养

将在试管活化好的青霉挑取三块直径8mm左右的菌块分别接种在容积为250ml的装有100ml液体种子培养基的三角瓶中，置于摇床，摇床的转速160r/min，在28±2℃的环境中继续培养，培养3～4天后备用。

c)大量液体培养

将液体种子培养物以1～3％(V/V)的接种量接入大量液体培养基中，装液量为800毫升/2000毫升三角瓶，培养5瓶，置于摇床，摇床的转速160r/min，在28±2℃的环境中培养7～8天后备用。

实施例3：从青霉的液体培养物中分离Calbistrin A和Calbistrin B原药

将4000毫升青霉的大量液体培养物经两层纱布过滤除去菌丝，将滤液在离心机中6000r/min，离心15分钟，收集上清液，将该上清液经40℃，真空浓缩到40毫升，将浓缩液与乙酸乙酯以1∶1体积比混合萃取2次，合并萃取液，将萃取液40℃真空旋转蒸发至干，用100％乙醇洗下烧瓶中的有机物，称为乙醇粗提物，将该粗提物在1毫米厚的制备型薄层层析板上分离，展开剂为丙酮与甲醇的体积比9∶1，将Rf＝0.57的第五条带的硅胶刮下，用甲醇浸泡6小时后离心，收集上清液经硅胶60A的层析柱(3cm×40cm，填充物颗粒径为60A)分离，洗脱液为丙酮与甲醇的体积比9∶1，洗脱速度14ml/4min，每管收集洗脱液14ml，收集第5～8管洗脱液合并后40℃真空旋转蒸发至干，用甲醇溶解旋转烧瓶中的干燥物，将甲醇溶解物经HPLC分离，分离条件为：分离柱为Waters Symmetry C18，7.8×300mm，填充物颗粒直径7μm，流速3mL/min；洗脱剂：A为Milli Q H₂O+0.1％甲酸，B为乙腈+0.1％甲酸，波长317nm，洗脱时间70min。洗脱剂组成随时间变化如下：

时间 0  ～10 ～60 ～61 ～70min

B％  10 ～45 ～45 ～10 ～10

分别收集出峰时间为33.889s及42.253s洗脱液，真空旋转蒸发至呈黄色油状，即分别获得Calbistrin A原药和Calbistrin B原药。

实施例4：Calbistrins对辣椒疫霉菌游动孢子的影响

采用液滴法在微孔板中测定Calbistrin A原药和Calbistrin B原药对辣椒疫霉菌游动孢子萌发的影响，结果显示：培养8～10小时后，Calbistrin A原药浓度为7.5μg/mL就能完全抑制孢子的萌发，而Calbistrin B原药浓度仅为1.25μg/mL就能完全抑制孢子萌发，而此时空白对照的辣椒疫霉孢子已萌发长出许多菌丝。

实施例5：Calbistrins固体粉剂的使用

固体粉剂是这样获得的：在100克白碳黑中加入0.5克Calbistrins原药、0.5～1克吐温-20、0.5～0.8克农乳33#，均匀搅拌后经气流粉碎后包装。在本实施例中，Calbistrins原药为实施例3获得的Calbistrin B原药。

Calbistrins固体粉剂可以在苗床上使用：将本发明涉及的固体药剂与育苗土以重量比为1∶600～800混合后装钵育苗，对苗床土传病害的防效可达90～95％。Calbistrins固体粉剂还可以在移栽时使用：栽苗前，将本发明涉及的固体粉剂用500～600倍(重量)菜园土拌匀后穴施，每穴含固体粉剂10～15微克。

以黄瓜移栽试验为例：将2片真叶的黄瓜苗栽种在穴施10～15微克固体粉剂的大棚中，可预防掘氏疫霉Phytophthora drechsleri Tucker侵染引起的黄瓜疫病，防效达40～70％，比使用传统的农药甲霜灵防治效果高20～25％。

实施例6：Calbistrins乳油的使用

液体乳油是这样获得的：在100毫升水中加入0.5克Calbistrins原药、0.5～1克的农乳500#，0.5～0.8克农乳33#，均匀搅拌后包装。在本实施例中，Calbistrins原药为实施例3获得的Calbistrin B原药。

Calbistrins乳油可以用来防治根部/叶面病害：将本发明涉及的乳油用水稀释500～600倍(体积)后在移栽或定植后从根部浇灌，每穴/棵施用100～500毫升，视作物大小而定；或者稀释500～600倍(体积)后从叶面喷施。

以番茄植株施用为例：将乳油稀释500～600倍(体积)后喷洒在番茄植株上，可以预防由致病疫霉Phytophthora infestans de Bary侵染引起的番茄晚疫病，与使用传统的75％百菌清可湿性粉剂比较，明显减少叶、茎及果实上的病斑数，烂果率降低了20～45％。

以黄瓜植株施用为例：将乳油稀释500～600倍(体积)后喷洒在黄瓜植株上，可以预防由黄瓜黑星病菌Cladosporium cucumerium Ellis et Arthur引起的叶面病害，防效可达50～75％，与传统的农药多菌灵相比，防治效果更加明显。

以上各实施例不是对本发明的限制，只要将微生物代谢产物中分离纯化获得或通过人工合成获得的Calbistrins族化合物按照传统的方法配制成固体粉剂形式或液体乳油形式，并按照本发明提出的使用方法，在油菜、番茄、瓜类等农作物育苗或移栽时使用，会发现Calbistrins族化合物配制的固体菌剂或乳油对疫霉属病原真菌的辣椒疫霉Phytophthora capsici Leonian、致病疫霉Phytophthora infestans de Bary、大豆疫霉Phytophthora megaspermaDrecgsler、烟草疫霉Phytophthora nicotianae Breda Hann掘氏疫霉Phytophthora drechsleri Tucker；以及核盘菌属病原真菌的油菜菌核病菌Sclerotinia scleroitorum、小核盘菌Sclerotinia minor；还有瓜枝孢霉属病原真菌的黄瓜黑星病菌Cladosporium cucumerinum等都具有较好的防治效果。

Claims (6)

1.Calbistrins族化合物在植物病害防治中的应用，其特征在于：将Calbistrins族化合物的固体粉剂形式或液体乳油形式防治植物病害；所述的Calbistrins族化合物是指：Calbistrin A或Calbistrin B；所述的植物病害是指疫霉属病原真菌，或核盘菌属病原真菌，或瓜枝孢霉属病原真菌通过土传或气传引起的植物疫病、菌核病或黑星病。

2.根据权利要求1所述的Calbistrins族化合物在植物病害防治中的应用，其特征在于：所述Calbistrin A以及Calbistrin B的分子结构为：

Calbistrin A Δ^8′，9′E

Calbistrin B Δ^8′，9′Z

分子式为C₃₁H₄₀O₈，分子量540.26。

3.根据权利要求2所述的Calbistrins族化合物在植物病害防治中的应用，其特征在于：所述的Calbistrins A以及Calbistrin B通过微生物代谢产物中分离纯化获得，或通过人工合成获得。

4.根据权利要求3所述的Calbistrins族化合物在植物病害防治中的应用，其特征在于：以固体粉剂形式防治植物病害是这样实现的：将固体粉剂与普通风干菜园土以1∶300～500的重量比混合后穴施，每穴2～3克；或将固体粉剂与育苗土以1∶500～600的重量比混合后装钵育苗；或将固体粉剂与水以1∶500～600的重量比混合后灌根或叶面喷施。

5.根据权利要求3所述的Calbistrins族化合物在植物病害防治中的应用，其特征在于：以液体乳油形式防治植物病害是这样实现的：将乳油与水以1∶500～600体积比混合后灌根或叶面喷施。

6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的Calbistrins族化合物在植物病害防治中的应用，其特征在于：所述的疫霉属病原真菌是：辣椒疫霉(Phytophthora capsici Leonian)，或致病疫霉(Phytophthora infestans deBary)，或大豆疫霉(Phytophthora megasperma Drecgsler)，或烟草疫霉(Phytophthora nicotianae Breda Hann)，或掘氏疫霉(Phytophthora drechsleriTucker)；所述的核盘菌属病原真菌是：油菜菌核病菌(Sclerotiniascleroitorum)，或小核盘菌(Sclerotinia minor)；所述的瓜枝孢霉属病原真菌是：黄瓜黑星病菌(Cladosporium cucumerinum)。