CN101464424B

CN101464424B - 一种研究dna分子导电性的测试方法及其测试系统

Info

Publication number: CN101464424B
Application number: CN 200710159995
Authority: CN
Inventors: 郭智勇; 魏丹毅; 王邃; 侯琳熙; 张会娜; 段静; 兰梅花
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2007-12-18
Filing date: 2007-12-18
Publication date: 2013-02-13
Anticipated expiration: 2027-12-18
Also published as: CN101464424A

Abstract

本发明提出一种研究DNA分子导电性的测试方法和系统。该系统由信号发生器、数字示波器、超微集成双环碳电极、微电流放大器、计算机组合构成，通过超微集成双环碳电极形成静电场，诱导DNA分子沿着场强的矢量方向发生极化而形成带正、负电的两端，定向并联排列于内、外环碳电极之间，输入信号送入超微集成双环碳电极后得到输出信号，经微电流放大器放大、数字示波器采集、A/D转换后送入计算机，分析输入信号与输出信号之间的关系，即可研究DNA分子导电性。该系统与方法的作用力轻微而不损伤DNA分子，获知整体的导电性，可实时监测电子转移过程，追踪快速电子传递行为，避免接点质量的影响，表面更新容易，仪器简单。

Description

一种研究DNA分子导电性的测试方法及其测试系统

技术领域

本发明涉及电分析化学、分子电子器件、生物传感器技术领域，具体涉及一种研究DNA分子导电性的系统与方法。

背景技术

近年来，脱氧核糖核酸(DNA)分子的导电性研究引起了众多关注，因其具有双螺旋结构，碱基之间互相配对，在整个分子链间形成大的共轭π键，当DNA分子受到电离辐射或紫外线照射时会产生电子，这个电子在被捕获之前沿着DNA分子链运动，导致DNA损伤，进而干扰DNA复制或是制造蛋白质的过程，造成细胞的异常或死亡。最近的研究结果表明(http://www.its.caltech.edu/～jkbgrp/)，某些蛋白质可以送出电荷沿着DNA长链传播，远处有另一个对应的蛋白质可以侦测这个电荷，但当DNA上出现上述异常时，由于原本的堆栈状态被破坏，造成了电子轨道重叠减少，导电性变差，导致第二个蛋白质接收不到这个测试电荷，修复系统就会启动。因此，研究DNA分子导电性，可加深对光诱导电荷转移损伤DNA、电荷转移导致细胞突变、DNA修复等问题的理解，在肿瘤治疗和基因治疗等方面具有广泛的应用前景。另外，DNA复制过程中所表现的碱基的单纯性、互补法则的恒定性和专一性、遗传信息的多样性以及构象上的特殊性和拓扑靶向性，都是纳米技术所需要的设计原理；且DNA具有稳定的物理化学性质及独特的线性结构，如DNA的直径仅为2nm，其长度跨越微观和宏观，这些性质使DNA有望成为制作纳米导线和纳米器件的理想材料。因此，DNA分子的导电性研究不仅在生命科学领域而且在纳米材料领域都占有极其重要的地位。

目前研究DNA分子导电性的方法主要有：光谱学方法、生物化学法、电化学方法、电子显微镜和原子力显微镜法。光谱学方法(J.Am.Chem.Soc.，2000，122：5893；Biochemistry，2000，39：6190；J.Am.Chem.Soc.，2000，122：11545)将光氧化剂共价键合在DNA链上，光诱导电子传输而引发碱基氧化，造成DNA损伤来研究DNA导电性，该方法不足之处在于：以损伤DNA分子为代价，获知的是寡聚核苷酸片段的导电性而非DNA分子整体的导电性；生物化学法(J.Am.Chem.Soc.，1995，117：6406；Biochem.Biophys.Res.Commun.，1992，188：1)将一种化合物嵌插到DNA螺旋的一个尾端，在光诱导下氧化鸟嘌呤，用哌啶处理使DNA在氧化的鸟嘌呤位置上断链，用放射能照像观察得到的DNA片段以研究其导电行为，该方法的主要不足是这种生化技术只能观测由电子传递引发的最终的反应结果，不能实时监测电子转移过程，且也不能研究DNA分子整体的导电性；电化学方法(Curr.Opin.Chem.Biol.，2001，5：209)通过检测电活性物质在DNA修饰电极上的电化学行为来研究DNA的导电性，即选用能与DNA分子特异结合的电活性物质作为电化学探针，调节碱基序列控制其在DNA链上插入的位置，用循环伏安法可研究电活性物质与电极之间的距离、碱基堆积及序列对电荷传递的影响，该方法不足之处在于：所采用的电化学技术为循环伏安技术，可以提供的信息有限，且可以使用的扫描速度较小，即便采用目前已知最快的超快伏安法，也仅有1MHz左右，无法追踪DNA分子内部的快速电子传递；电子显微镜法(Nature，1999，398：407)和原子力显微镜法(中国专利申请号：200610147822.8)，以一条DNA连结金属电极的两端，直接测量其电流一电位关系，该方法直接了当，但其不足之处在于：由于仅有一条DNA与金属电极相连结，其间的接点质量严重影响测量结果，如果DNA与电极之间的接合状况不佳的话，有可能DNA本身导电，但是却测量到绝缘的结果，反之，如果测量用的电极基版有短路的情况，也有可能DNA本身绝缘，却测量到导电的结果，总而言之，结果的稳定性和可靠性不佳。

发明内容

本发明所要解决的首要技术问题是针对现有背景技术而提供一种研究DNA分子导电性的测试方法，它不损伤DNA分子，获知的是DNA分子整体的导电性；可实时监测电子转移过程；激发信号多样且速度快，可提供丰富信息，追踪DNA分子内部的快速电子传递；接触分子数目相对较多，避免接点质量不高对结果的影响；表面更新容易，切断电极前端形成新的截面即可；所使用的仪器简单。

本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有背景技术而提供一种相关的研究DNA分子导电性的测试系统。

本发明解决上述首要技术问题所采用的技术方案为：一种研究DNA分子导电性的测试方法，其特征在于采用内外层面为导电层的电极，使电极的内外导电层之间建立起电场，在电场诱导下，自由分散在溶液中的DNA分子沿着场强的矢量方向发生极化而形成带正、负电的两端，形成DNA分子在电极的内外导电层之间的定向并联排列，电极的一导电层输入电信号，另一导电层输出电信号，经过放大和A/D转换，用计算机进行分析输入电信号与输出电信号的关系，从而研究DNA分子的导电性。

本发明解决上述另一个技术问题所采用的技术方案为：一种研究DNA分子导电性的测试系统，其特征在于采用内外层面为导电层的电极，电极的一导电层连接信号发生器，另一导电层连接放大器，使电极的内外导电层之间建立起电场，在电场诱导下，自由分散在溶液中的DNA分子沿着场强的矢量方向发生极化而形成带正、负电的两端，形成DNA分子在电极的内外导电层之间的定向并联排列，放大器的信号输出经过A/D转换器，连接计算机进行分析处理，根据输入电信号与输出电信号的关系，从而研究DNA分子的导电性。

作为改进，所述的电极采用双环电极，其内外导电层分布在环状电极基材的内表面和外表面之间，呈现环形状，构成了内环电极和外环电极，这样便于在基材上进行制作成型。

作为改进，所述的双环电极的制作方法包括如下步骤：

(1)取玻璃毛细管基材一支，用胶带包裹其外壁一定长度如1/3长度；

(2)通过加热裂解有机物气体如低沸点的烷烃，在玻璃毛细管基材内外壁形成内、外碳层，内碳层分别成为外导电层和内导电层，内导电层充当内环碳电极，经导电胶由导线引出，用环氧树脂固定作为一连接端；除去外壁包裹的胶带，剩余2/3长度的外导电层充当外环碳电极，经导电胶由导线引出，用环氧树脂固定作为另一连接端；

(3)将上述结构浸渍包覆上内绝缘层和外绝缘层；

(4)涂覆有碳层和绝缘层的玻璃毛细管基材前端垂直切断，露出的整齐截面即为超微集成双环碳电极。

作为优选，所述的碳层涂覆采用加热裂解CH₄的方法，其厚度通过改变加热裂解的时间进行调节，控制在5～10nm之间，这样便于在低温下进行操作和作业。

作为优选，所述的内绝缘层和外绝缘层的浸渍包覆是将上述结构浸渍在绝缘漆中，5～15分钟后取出，然后在80～100℃下烘干，形成内绝缘层、外绝缘层，这样制作会十分方便和容易，成本也十分低廉。

作为优选，所述的内环电极接输入电信号，而外环电极接输出电信号，减少测量误差，更加利于测试。

最后，所述的信号发生器发生的输出信号分为两路，一路直接连接数字示波器被采集，另一路经超微集成双环碳电极的内环碳电极从DNA分子一端进入，通过整个DNA分子，再经外环碳电极得到输出信号，该输出信号经微电流放大器放大后连接数字示波器被采集，最后将数字示波器采集的模拟信号经A/D转换为数字信号送入连接到计算机进行分析处理和记录。这样便于各种输入信号和输出信号的实时观察对比。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明在超微集成双环碳电极的内环碳电极、外环碳电极上，分别施加适当正、负直流电位以形成静电场，在该静电场诱导下，自由分散在溶液中的DNA分子沿着场强的矢量方向发生极化而形成带正、负电的两端，带负电的一端搭在带正电的内环碳电极上，带正电的一端搭在带负电的外环碳电极上，形成DNA分子在内环碳电极、外环碳电极之间的定向并联排列。作用力主要为静电引力，轻微而不损伤DNA分子；

(2)本发明中DNA分子一端搭在内环碳电极上，另一端搭在外环碳电极上，输入信号经内环碳电极从DNA分子一端进入，通过整个DNA分子，再经外环碳电极得到输出信号，故获知的是DNA分子整体而非DNA片段的导电性；

(3)本发明由信号发生器发生的输入信号送入超微集成双环碳电极后，可立即得到输出信号，分析输入信号与输出信号之间的关系，即可研究DNA分子导电性，实现实时监测电子转移过程；

(4)本发明可以使用信号发生器的多种波形作为激发信号进行研究，信息丰富多样；

(5)本发明可以使用高频输入信号，追踪DNA分子内部的快速电子传递行为；

(6)本发明在内环碳电极、外环碳电极之间有较多的DNA分子定向并联排列，接触分子数目相对较多，避免接点质量不高对测量结果的影响；

(7)本发明获知的是较多的DNA分子并联排列的导电性而非一个DNA分子的导电性，DNA分子的数目可根据DNA分子自身和内环碳电极(2)的尺寸、DNA分子之间的相互排斥作用进行估算；

(8)本发明中超微集成双环碳电极表面更新非常容易，将其前端垂直切断露出新鲜表面即可，操作简单，稳定性好；

(9)本发明用于研究DNA分子导电性，所需使用的仪器简单价廉，仅需任意波形发生器(或函数发生器)、数字示波器、微电流放大器、计算机搭建一个系统，总价仅约STM或CF-AFM价格的1/30～1/50左右，且该研究系统无需运行成本；

(10)本发明中超微集成双环碳电极的制作工艺简单、实用，操作容易，制作条件容易控制，成本低廉，在一般化学实验室均可制作，具有较好的推广应用价值。

本发明提供的研究DNA分子导电性的系统与方法，通过超微集成双环碳电极形成静电场，诱导自由分散在溶液中的DNA分子沿着场强的矢量方向发生极化而形成带正、负电的两端，定向并联排列于内环碳电极与外环碳电极之间以研究DNA分子导电性，作用力轻微而不损伤DNA分子，获知DNA分子整体的导电性，实时监测电子转移过程，可追踪DNA分子内部的快速电子传递行为，避免接点质量不高对结果的影响，表面更新容易，所使用的仪器简单，可用于研究DNA分子导电性。

附图说明

图1为研究DNA分子导电性的系统示意图；

图2a、图2b分别为本发明中所述的超微集成双环碳电极的结构剖视图(M)和横截面图(N)；

图3为DNA分子在超微集成双环碳电极上的定向并联排列示意图；

图4为天然小牛胸腺脱氧核糖核酸(CTDNA)在超微集成双环碳电极上的电流-电位(I～V)曲线。

其图1中：

1、玻璃毛细管基材，2、内环碳电极，3、外环碳电极，4、导电胶，5、导线，6、环氧树脂，7、导电胶，8、导线，9、环氧树脂，10、内绝缘层，11、外绝缘层；M、纵剖面，N、横截面。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例

本实施例中选用Tektronix AFG3021B型任意波形发生器、Tektronix 2012B数字示波器、TJ-110型微电流放大器、P4计算机，搭建研究系统，如图1所示意，采用内外层面为导电层的双环电极，电极的一导电层连接数字信号发生器，另一导电层连接微电流放大器，放大器的输出与数字信号发生器的另一路输出分别连接数字示波器的各个通道输入端，数字示波器采集的模拟信号，再经过A/D转换器转为数字信号，经RS-232接口连接到计算机。

其工作原理是这样的，任意波形发生器产生输入信号，一路直接送入数字示波器的第一通道被采集，另一路送入超微集成双环碳电极后得到输出信号，该输出信号经微电流放大器放大后送入数字示波器的第二通道被采集，最后将数字示波器采集的模拟信号进行A/D转换为数字信号，经RS-232接口送入计算机进行记录与处理，分析输入信号与输出信号之间的关系，即可研究DNA分子导电性。

超微集成双环碳电极的制作选用玻璃毛细管作为基材，用乙醇、双蒸水超声清洗，碳作为电极材料，导电胶采用银导电胶，绝缘层采用绝缘漆。其具体制作方法为：截取长度3～4cm、内径4μm、外径20μm、壁厚8μm的玻璃毛细管，用乙醇、双蒸水超声清洗完全干燥后，用胶带包裹其外壁约1/3长度，使CH₄连续通过毛细管内外，电阻丝加热30分钟，使CH₄裂解产生的碳附着在毛细管内外壁；内壁碳层充当内环碳电极2，经导电胶4由导线5引出，用环氧树脂6固定，成为双环电极的输入电信号的连接端；除去外壁包裹的胶带，剩余的约2/3长度的外碳层充当外环碳电极3，经导电胶7由导线8引出，用环氧树脂9固定，成为双环电极的输出电信号的连接端；将上述结构的前端浸入绝缘漆中，约5～10分钟后取出，然后在80～100℃下烘干，形成内绝缘层10、外绝缘层11；用特种陶瓷石英切割刀片将其前端垂直切断露出新鲜表面，即获得超微集成双环碳电极，见图2。

为维持DNA的生理pH，避免DNA解链或沉淀，选用pH为7.1具有较低离子强度的50mmol/LNaCl+5mmol/LTris-HCl(THB)作为电解质溶液，使DNA充分溶胀分散在其中。将上述制得的超微集成双环碳电极浸泡在含0.1mg/mL的天然小牛胸腺脱氧核糖核酸(CTDNA)的上述底液中，维持内环碳电极的直流电位为+1.8V、外环碳电极的直流电位为-1.8V，30min后，取出在超纯水中轻轻荡洗后，干燥，按附图1安装，任意波形发生器发出线性扫描电位-0.5V～+0.5V，扫速为1V/s，输入信号、输出信号输入示波器分别为X轴、Y轴，记录电流-电位(I～V)曲线，如附图4所示，表明在该实验条件下CTDNA表现为电阻的分子电子器件性质。根据I～V曲线斜率，此时电阻约为10⁹Ω，考虑DNA分子自身直径2nm及其相互之间的排斥，将其影响范围估计为约10nm，本实施例中内环碳电极的周长约为10μm，故可估算此时约有1000个CTDNA分子定向并联排列于内环碳电极与外环碳电极之间，因此估算在此实验条件下CTDNA的电阻为约10¹²Ω

Claims

1.一种研究DNA分子导电性的测试方法，其特征在于采用内外层面为导电层的电极，使电极的内外导电层之间建立其电场，使电场诱导下，使自由分散在溶液中的DNA分子沿着场强的矢量方向发生极化而形成带正、负电的两端，形成DNA分子在电极的内外导电层之间的定向并联排列，电极的一导电层输入电信号，另一导电层输出电信号，经过放大和A/D转换，用计算机进行分析输入电信号与输出电信号的关系，从而研究DNA分子的导电性。

2.根据权利要求1所述的测试方法，其特征在于所述的电极采用双环电极，其内外导电层分布在环状电极基材的内表面和外表面之间，呈现环形状，构成了内环电极和外环电极。

3.根据权利要求2所述的测试方法，其特征在于所述的双环电极的制作方法包括如下步骤：

(1)取玻璃毛细管基材(1)一支，用胶带包裹其外壁一定长度；

(2)通过加热裂解有机物气体，在玻璃毛细管基材(1)内外壁形成内、外碳层，外、内碳层分别成为外导电层和内导电层，内导电层充当内环碳电极(2)，经导电胶(4)由导线(5)引出，用环氧树脂(6)固定；除去外壁包裹的胶带，剩余长度的外导电层充当外环碳电极(3)，经导电胶(7)由导线(8)引出，用环氧树脂(9)固定；

(3)将上述结构浸渍包覆上内绝缘层(10)和外绝缘层(11)；

(4)涂覆有碳层和绝缘层的玻璃毛细管基材(1)前端垂直切断，露出的整齐截面即为超微集成双环碳电极。

4.根据权利要求3所述的测试方法，其特征在于所述的碳层涂覆采用加热裂解CH4的方法，其厚度通过改变加热裂解的时间进行调节，控制在5～10nm之间。

5.根据权利要求4所述的测试方法，其特征在于所述的内绝缘层(10)和外绝缘层(11)的浸渍包覆是将上述结构浸渍在绝缘漆中，5～15分钟后取出，然后在80～100℃下烘干，形成内绝缘层(10)、外绝缘层(11)。

6.根据权利要求5所述的测试方法，其特征在于所述的内环电极接输入电信号，而外环电极接输出电信号。

7.一种研究DNA分子导电性的测试系统，其特征在于采用内外层面为导电层的电极，电极的一导电层连接信号发生器，另一导电层连接放大器，使电极的内外导电层之间建立起电场，在电场诱导下，自由分散在溶液中的DNA分子沿着场强的矢量方向发生极化而形成带正、负电的两端，形成DNA分子在电极的内外导电层之间的定向并联排列，放大器的信号输出经过A/D转换器，连接计算机进行分析处理，根据输入电信号与输出电信号的关系，从而研究DNA分子的导电性。

8.根据权利要求7所述的测试系统，其特征在于电极采用双环电极，其内外导电层分布在环状电极基材的内表面和外表面之间，呈现环形状，构成了内环电极和外环电极。

9.根据权利要求8所述的测试系统，其特征在于所述的双环电极的结构为：

(1)中心为玻璃毛细管基材(1)；

(2)在玻璃毛细管基材(1)内外壁通过加热裂解有机物气体形成有内、外碳层，外、内碳层分别成为外导电层和内导电层，内导电层充当内环碳电极(2)，经导电胶(4)由导线(5)引出，用环氧树脂(6)固定在基材的上端；外导电层充当外环碳电极(3)，经导电胶(7)由导线(8)引出，用环氧树脂(9)固定在基材的外表面上；

(3)将上述结构浸渍包覆有内绝缘层(10)和外绝缘层(11)；

10.根据权利要求9所述的测试系统，其特征在于所述的碳层涂覆采用加热裂解CH₄的方法，其厚度通过改变加热裂解的时间进行调节，控制在5～10nm之间。

11.根据权利要求10所述的测试系统，其特征在于所述的内绝缘层(10)和外绝缘层(11)的浸渍包覆是将上述结构浸渍在绝缘漆中，5～15分钟后取出，然后在80～100℃下烘干，形成内绝缘层(10)、外绝缘层(11)。

12.根据权利要求11所述的测试系统，其特征在于所述的内环电极接输入电信号，而外环电极接输出电信号。

13.根据权利要求12所述的测试系统，其特征在于所述的信号发生器发生的输出信号分为两路，一路直接连接数字示波器被采集，另一路经超微集成双环碳电极的内环碳电极(2)从DNA分子一端进入，通过整个DNA分子，再经外环碳电极(3)得到输出信号，该输出信号经微电流放大器放大后连接数字示波器被采集，最后将数字示波器采集的模拟信号经A/D转换为数字信号送入连接到计算机进行分析处理和记录。