CN101463365A - 一种燃料电池耗氢技术用于提高扁藻光解海水产氢的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及绿藻光解水制氢，具体地说是，以具有光解海水产氢功能的海洋绿藻—亚心形扁藻为体系产氢材料，在光反应器上外接碱性氢氧燃料电池持续耗氢系统来维持体系内较低氢分压，依据电路中电子数量与氢原子数的一一对应关系，通过测量电池外电路电流变化来反映体系内氢浓度的变化，研究扁藻在解偶联剂CCCP调控下连续光照和非连续光照产氢过程的特征。在燃料电池持续耗氢下，细胞密度为8×10⁶ cells ml^－1，非连续光照(L/D＝9h∶6h)比连续光照产氢时间延长3倍，为120h；氢气产量提高1.6倍，为126ml l^－1，且产氢过程中pH值、PSII光化学活性、体外氢酶活性变化有一定的对应关系。本发明实现了对产氢过程高效、灵敏的实时检测，方法简便，在产氢机理和工程基础研究中具有广泛应用前景。

Description

一种燃料电池耗氢技术用于提高扁藻光解海水产氢的方法

技术领域

本发明涉及绿藻光解水制氢，具体地说是一种燃料电池耗氢技术用于提高扁藻光解海水产氢的方法。

背景技术

绿藻制氢的主要问题是氧对氢酶抑制严重问题，因产氢的同时产氧，如不能消除氧的抑制，产氢速率低且不能长期持续产氢。美国国家可再生能源实验室(NREL)和加州大学成功研究了淡水衣藻可逆氢酶两步法间接光水解制氢工艺，利用筛选到的C.reinhardtii CC 124耐氧菌株突变体，实现氢氧时间和空间上的分离，避免了可逆氢酶遇氧失活问题。该研究用细胞密度为6×10⁶cells ml^-1，产气速率为2.0 1H₂h^-1l^-1持续70h，产氢能力比直接光解水提高100倍。

中科院大连化物所在国内率先开展绿藻光解水制氢的研究工作，首次筛选发现的海洋单细胞绿藻-亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)，利用解偶联剂羰基化物间氯苯腙CCCP调控光合放氢，其氢气产量和持续时间均显著提高，产氢速率与衣藻结果相近，但时间偏短。目前绿藻光解水制氢的研究仍处于基础研究阶段，包括物质代谢和能量代谢等机理研究仍需深入；目前两步法间接光解水制氢的研究也处于单个步骤的机理研究和效率提高阶段，用燃料电池耗氢系统实时监测扁藻产氢过程尚未见报导。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单，并可实时监测研究的燃料电池耗氢技术用于提高扁藻光解海水产氢量的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明在光反应器上外接碱性燃料电池持续耗氢系统来实现实时监测扁藻在解偶联剂CCCP胁迫调控下连续光照和非连续光照产氢过程的特征并加以示范；具体为，以一种具有光解海水产氢功能的海洋绿藻—亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)为体系产氢材料，采用新型的解偶联剂调控间接法产氢工艺，在光反应器上外接碱性氢氧燃料电池持续耗氢系统来维持体系内较低氢分压，依据电路中电子数量与氢原子数的一一对应关系，通过测量电池外电路电流变化来计算体系内氢浓度的变化，实时监测扁藻在CCCP胁迫调控下连续光照和非连续光照产氢过程的特征并加以示范。并可保持体系内较低氢分压，消除产物抑制，提高产氢量。根据产氢过程中pH值、PSII光化学活性、体外氢酶活性变化的对应关系，阐明产氢机理。实现了对产氢过程进行高效、灵敏的实时检测，在产氢机理研究和工程基础示范中具有重要应用。

具体操作过程为：

1)亚心形扁藻采用康维方营养盐通入1～15％CO₂(V/V)培养，培养到对数生长后期收集或高密度培养至产氢藻液浓度(4～8)×10⁶cells ml^-1；

2)采用扁藻两步法光解水制氢的方法，其流程如图1所示。取容积为650ml的搅拌式光产氢反应器，其内装入反应器体积80-95％的步骤1)中所获取的藻液，，密封反应器瓶口，用纯氮(99.9％)置换空气10min，放置到25℃培养箱中进行暗诱导2～24h；

3)暗诱导后，加入终浓度为7.5～15μM CCCP到藻液中，调节藻液pH值为6.5～8.5，然后打开光照培养箱的光源，光强为50～100μEm^-2s^-1，连续光照或非连续光照，光暗比为(3～24：3～24)，由光反应器下部的磁力搅拌器搅拌藻液，使光反应器内的藻液产氢；光反应器的气体体积变化通过刻度气体取样管采用排水法收集计量，燃料电池耗氢电流由数据采集记录系统自动检测记录。

4)根据电流变化曲线依据电子数与消耗的氢原子数的一一对应关系积分计算氢气产量

5)pH值的测定是用标准pH溶液校准好精密pH电极(pHS-3B型)放入密闭藻液在线记录pH值变化。

6)光系统II的有效量子产量用WATER-PAM叶绿素荧光仪测定，用WinControl软件分析。按照仪器说明书，先在液体样品杯中加入3ml培养基，再从光生物反应器中取3μl藻放到样品杯中，搅拌约30s后盖上密封盖测量荧光动力学参数。Ft表示任一给定时间测量得到的荧光产量，它反映了样品的还原状态和能态。Fm’表示光适应的样品(光化光150μEm^-2s^-1)打开饱和脉冲时(0.8s，4000μEm^-2s^-1)得到的最大荧光产量。光系统II的有效量子产量Yield最接近于光合作用的实际量子产量。Yield根据下式计算：Yield＝(Fm’-Ft)/Fm’＝ΔF/Fm’。

7)氢酶活性的测定在厌氧环境中进行。密闭小瓶中装入0.5ml 100mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)，0.2ml 10％Triton X-100溶液，20μl 1M的甲基紫晶溶液，80μl dd H₂O，旋涡振荡10秒，通氮气5min；加入0.2ml 1M连二亚硫酸钠溶液，通氮气5min；待溶液变为深蓝色，再加入1ml藻液，通氮气5min，旋涡振荡10秒，40℃水浴1h。取0.5ml气体，用气相色谱检测氢气组分含量。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1.本发明方法灵敏度、准确度与精密度高，抗干扰力强。在燃料电池持续耗氢下，细胞密度为8×10⁶cells ml^-1，非连续光照(L/D＝9h：6h)比连续光照产氢时间延长3倍，为120h；氢气产量提高1.6倍，为126ml l^-1，且产氢过程中pH值、PSII光化学活性、体外氢酶活性变化有一定的对应关系。

2.应用范围宽。本发明将检测与示范功能融为一体，既可用于绿藻产氢过程的检测研究，在光反应器上外接碱性燃料电池持续耗氢系统来维持体系内较低氢分压，消除产氢反应的产物抑制现象，提高产氢量。也可准确定量气体体积，并可对整个绿藻产氢过程进行实验室示范，确定关键工艺技术参数，为产氢工程研究提供重要数据；由于配备自动化数据采集与处理系统，可用作筛选绿藻产氢能力的检测平台。

3.简便省时。目前现有技术方法均需多次采样、离线检测，费力费时；本发明操作步骤仅包括绿藻收集、暗诱导、耗氢系统连接、光照调控产氢和检测，各步操作简便。本发明实现了对产氢过程高效、灵敏的实时检测，方法简便。

4.应用方便。根据本发明检测方法可开发出相应的标准系统，即标准检测系统和产氢示范系统，其应用方便快捷，结果可比性强。

总之，本发明方法可提高扁藻光解海水制氢的持续时间和氢气产量，并可对产氢过程进行高效、灵敏检测，方法简便，抗干扰力强，在绿藻光解水产氢的机理研究、工程研究及其系统示范具有广泛应用前景。

附图说明

图1为本发明绿藻光解水制氢的流程图；

图2为本发明碱性氢氧燃料电池的结构示意图；其中：15为氢气，16为多孔阴极，17为致密电解质层，18为多孔阳极，19为双极板，20为空气；

图3为本发明燃料电池绿藻光解水制氢系统示意图；

其中：1为磁力搅拌器，2为光源，3为光反应器，4为排气口(取液体样口)，5为导气管，6为真空阀，7为燃料电池，8为智能无纸记录仪，9为外电阻，10为导气管，11为液面，12为气体收集管，13为水槽，14为pH计；

图4为本发明碱性燃料电池连续光照和非连续光照产生的电流

图5为本发明碱性燃料电池连续光照和非连续光照产氢过程中pH值的比较；

图6为本发明碱性燃料电池连续光照和非连续光照产氢过程中PSII光化学活性的比较；

图7为本发明碱性燃料电池连续光照和非连续光照产氢过程中体外氢酶活性的比较；

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行进一步地说明：

本发明使用解偶联剂CCCP胁迫调控扁藻产氢，使用碱性氢氧燃料电池外接10欧姆电阻持续发电耗氢，检测并记录电阻两端电压计算得到电流，对电流曲线积分计算获得通过电路的电量值，由电子数与消耗的氢原子数的一一对应关系，计算氢气产量。解偶联剂为羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)；解偶联剂CCCP胁迫调控扁藻产氢采用申请人已申报的专利技术(申请号03110981.0，发明名称：一种海洋绿藻两步法生物光解水制氢方法)，所用的碱性氢氧燃料电池及数据采集处理系统为实验室自行组装研制，具体为从外到内采用不锈钢板、聚四氟垫圈、塑料分布板、电极、石棉膜的次序压制电池，电池结构如图2所示，电池阳极为银材料制备的氧电极，阴极为Pd材料制备的氢电极，电解液隔层采用饱和KOH浸泡的石棉膜。在制备前，用电解液充分浸泡石棉膜，并用不锈钢板、聚四氟板、电极、石棉进行预压后再压制电池，以保证电池性能的稳定性与重复性。

碱性氢氧燃料电池的输出电极通过导线与外电阻9相连通，外电阻9上并联有智能无纸记录仪8，智能无纸记录仪8与计算机信号连接，构成本发明的数据采集处理系统。

其他试剂均为商业化的试剂。

按照常规方法配制1000倍康维方营养盐母液：NaNO₃ 100g/L，NaH₂PO₄·H₂O 20g/L，EDTA—Na 45g/L，H₃BO₃ 33.6g/L，FeCl₃·6H₂O 1.3g/L，MnCl₂·4H₂O 0.36g/L，ZnCl₂ 0.021g/L，CoCl₂·6H₂O 0.02g/L，CuSO₄·5H₂O 0.02g/L，(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O 0.009g/L

用经砂滤的天然海水110℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后添加1000倍康维方营养盐母液，配制成康维方培养基(NaNO₃100mg/L，NaH₂PO₄·H₂O20mg/L，EDTA—Na 45mg/L，H₃BO₃ 33.6mg/L，FeCl₃·6H₂O 1.3mg/L，MnCl₂·4H₂O 0.36mg/L，ZnCl₂ 0.021mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.02mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.02mg/L，(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O 0.009mg/L)；

实施例1

如图3所示为光生物产氢系统示意图，其中3为光反应器，采用玻璃材料制造，光反应器3内的气体体积变化通过刻度气体取样管12在水槽13中采用排水法收集计量，燃料电池耗氢电流由智能无纸记录仪8自动检测记录。亚心形扁藻采用康维方营养盐通入3％ CO₂(V/V)培养，培养到对数生长后期后离心收集至产氢藻液浓度8×10⁶cells ml^-1。采用扁藻两步法光解水制氢的方法，其流程如图1示。取容积为650ml的搅拌式光产氢反应器，装入600ml藻液，密封瓶口，用氮气置换空气10min，放置到25℃培养箱中暗诱导4h后，光照前加入终浓度为15μM CCCP，并调节pH值为7.5。光反应器3在光强为80μEm^-2s^-1的光源2光照下，磁力搅拌器1为150rpm的搅拌速度下搅拌藻液，使光反应器内的藻液连续光照或非连续光照产氢。在光反应器上外接燃料电池7持续耗氢，外电路电阻9为10欧姆，结果见图4。

在燃料电池7持续耗氢非连续光照，产氢时间延长，可连续产氢120h；燃料电池检测产氢过程的依据是电子数与消耗的氢原子数的一一对应关系，积分电流变化曲线计算氢气产量，计算方法为：氢气产量 $H_2=\frac{\frac{1}{2}{N}_e}{N_0}\×22.4\×\frac{298.15}{273.15};$ N₀＝6.02×10²³，N_e＝∫Idt/q_e，I为电流，q_e＝1.6×10^-19。根据图4电流曲线积分，计算氢气产量达126ml H₂l^-1，是连续光照氢气产量的1.6倍。燃料电池持续耗氢维持体系内较低氢分压，消除了反应中的氢抑制现象，提高产氢量。

对比实施例：亚心形扁藻采用康维方营养盐通入3％CO₂(V/V)培养培养，培养到对数生长后期后离心收集至产氢藻液浓度8×10⁶cells ml^-1。采用扁藻两步法光解水制氢的方法，其流程如图1示。取容积为500ml的搅拌式光产氢反应器，装满藻液，密封瓶口，用氮气置换空气10min，放置到25℃培养箱中暗诱导4h后，光照前加入终浓度为15μM CCCP，并调节pH值为7.5。系统在光强为80μEm^-2s^-1，150rpm的搅拌速度下搅拌藻液，使光反应器内的藻液光照放氢。产氢系统不外接燃料电池耗氢检测系统。产氢时间持续24h，氢气产量为48ml H₂l^-1。

实施例2

亚心形扁藻采用康维方营养盐通入3％CO₂(V/V)培养，培养到对数生长后期后离心收集至产氢藻液浓度8×10⁶cells ml^-1。采用扁藻两步法光解水制氢的方法，其流程如图1示。取容积为650ml的搅拌式光产氢反应器，装入600ml藻液，密封瓶口，用氮气置换空气10min，放置到25℃培养箱中暗诱导4h后，光照前加入终浓度为15μM CCCP，并调节pH值为7.5。光反应器3在光强为80μEm^-2s^-1，磁力搅拌器为150rpm的搅拌速度下搅拌藻液，使光反应器内的藻液连续光照或非连续光照产氢。在光反应器上外接燃料电池持续耗氢，外电路电阻为10欧姆。燃料电池耗氢电流由智能无纸记录仪自动检测记录。

相应的pH值的测定是用标准pH溶液校准好精密pH电极(pHS-3B型)放入密闭藻液在线记录pH值变化。

光系统II的有效量子产量用WATER-PAM叶绿素荧光仪测定，用WinControl软件分析。按照仪器说明书，先在液体样品杯中加入3ml培养基，再从光生物反应器中取3μl藻放到样品杯中，搅拌约30s后盖上密封盖测量荧光动力学参数。Ft表示任一给定时间测量得到的荧光产量，它反映了样品的还原状态和能态。Fm’表示光适应的样品(光化光150μEm^-2s^-1)打开饱和脉冲时(0.8s，4000μEm^-2s^-1)得到的最大荧光产量。光系统II的有效量子产量Yield最接近于光合作用的实际量子产量。Yield根据下式计算：Yield＝(Fm’-Ft)/Fm’＝ΔF/Fm’。

氢酶活性的测定在厌氧环境中进行。密闭小瓶中装入0.5ml 100mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)，0.2ml 10％ Triton X-100溶液，20μl 1M的甲基紫晶溶液，80μl dd H₂O，旋涡振荡10秒，通氮气5min；加入0.2ml 1M连二亚硫酸钠溶液，通氮气5min；待溶液变为深蓝色，再加入1ml藻液，通氮气5min，旋涡振荡10秒，40℃水浴1h。取0.5ml气体，用气相色谱检测氢气组分含量。

所有数据点以时间为横坐标，以pH值、PSII活性和氢酶活性变化为纵坐标作图，各指标变化关系曲线分别如图5、图6、图7所示。

Claims (7)

1.一种燃料电池耗氢技术用于提高扁藻光解海水产氢的方法，其特征在于：以一种具有光解海水产氢功能的海洋绿藻—亚心形扁藻为体系产氢材料，在光反应器上外接碱性氢氧燃料电池持续耗氢系统来维持体系内较低氢分压，通过燃料电池的持续耗氢以保持光反应器体系内较低氢分压，消除产物抑制，提高产氢量；依据电路中电子数量与氢原子数的一一对应关系，通过测量电池外电路电流变化来计算体系内氢浓度的变化，研究扁藻在解偶联剂CCCP调控下连续光照和非连续光照产氢过程的特征。

2.按照权利要求1所述的燃料电池耗氢技术用于扁藻光解海水产氢的方法，其特征在于：具体操作过程为：

1)亚心形扁藻采用康维方营养盐通入1～15％CO₂(V/V)培养，培养到对数生长后期收集、浓缩至藻液浓度(4～8)×10⁶cells ml^-1，或直接高密度培养至产氢藻液浓度(4～8)×10⁶cells ml^-1；

2)采用扁藻两步法光解水制氢工艺：取搅拌式光产氢反应器，其内装入反应器体积80-95％的步骤1)中所获取的藻液，密封反应器瓶口，用纯氮置换空气，放置到培养箱中进行室温暗诱导2～24h；

3)暗诱导后，加入终浓度为7.5～15μM解偶联剂CCCP到藻液中，调节藻液pH值为6.5～8.5，然后打开光照培养箱的光源，光强为50～100μEm^-2s^-1，连续光照或非连续光照，光暗比为3～24h：3～24h，使光反应器内的藻液产氢；光反应器的气体体积变化通过刻度气体取样管采用排水法收集计量；光反应器内藻液产生的氢气通过管路导入碱性氢氧燃料电池的氢电极，通过燃料电池的持续耗氢以保持光反应器体系内较低氢分压，消除产物抑制，提高产氢量，燃料电池耗氢电流由数据采集处理系统自动检测记录。

3.按照权利要求2所述的燃料电池耗氢技术用于提高扁藻光解海水产氢的方法，其特征在于：所述步骤1)中的通入1～5％CO₂(V/V)，藻液内细胞终浓度6～8×10⁶cells ml^-1。

4.按照权利要求2所述的燃料电池耗氢技术用于提高扁藻光解海水产氢的方法，其特征在于：所述步骤2)中的暗诱导时间为2～6h。

5.按照权利要求2所述的燃料电池耗氢技术用于提高扁藻光解海水产氢的方法，其特征在于：所述步骤3)中加入终浓度为10～15μM CCCP，调节藻液pH值为7～7.5，光强为60～80μEm^-2s^-1。

6.按照权利要求2所述的燃料电池耗氢技术用于提高扁藻光解海水产氢的方法，其特征在于：步骤3)非连续光照，光暗比为3～24：3～24。

7.按照权利要求2所述的燃料电池耗氢技术用于提高扁藻光解海水产氢的方法，其特征在于：所述碱性氢氧燃料电池的输出电极通过导线与外电阻(9)相连通，外电阻(9)上并联有智能无纸记录仪(8)，智能无纸记录仪(8)与计算机信号连接，构成本发明的数据采集处理系统。

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