CN101463327B

CN101463327B - 爪哇正青霉菌株在生产纤维素酶上的应用

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Publication number: CN101463327B
Application number: CN200810237494XA
Authority: CN
Inventors: 王义强; 陈介南; 刘海波; 何钢; 周再魁
Original assignee: Central South University of Forestry and Technology
Current assignee: Central South University of Forestry and Technology
Priority date: 2008-12-30
Filing date: 2008-12-30
Publication date: 2011-02-09
Anticipated expiration: 2028-12-30
Also published as: CN101463327A

Abstract

本发明公开了一种爪哇正青霉菌株的应用，该菌株的保藏号为CCTCC M208204，该爪哇正青霉的菌株可用于生产纤维素酶，其步骤包括：将所述菌株接入种子培养基中，在30℃条件下培养72小时得种子液；将种子液按5％的接种量接入发酵培养基中，发酵培养基的初始pH值为5.5，在30℃、175r/min的条件下培养120小时得发酵液；发酵液经4000r/min离心得到含纤维素酶的粗酶液；该粗酶液中羧甲基纤维素酶活为24.52IU/ml，滤纸酶活为2.68IU/ml，β-葡萄糖苷酶为2.03IU/ml；其中种子培养基是由羧甲基纤维素钠1.5％、MgSO₄·7H₂O0.05％、KH₂PO₄ 0.1％、NH₄NO₃ 0.1％和余量的水组成；发酵培养基是由稻草粉0.7％、麸皮粉0.3％、KNO₃ 1％、KH₂PO₄ 0.4％、CaCl₂·2H₂O 0.03％、MgSO₄·7H₂O 0.03％、吐温0.4％和余量的水组成。通过本发明的爪哇正青霉菌株生产出的纤维素酶具有活性高、成本低等优点。

Description

爪哇正青霉菌株在生产纤维素酶上的应用

技术领域

本发明涉及一种真菌的菌株的应用，尤其涉及一种生产高活性纤维素酶的菌株的应用。

背景技术

目前，纤维素酶已广泛应用于酿造、果汁与蔬菜汁加工、粮食加工、食品、饲料、造纸、中草药有效成分提取、植物基因工程、细胞工程以及原油开采等各技术领域，纤维素酶的主要用途是实现对纤维素的分解与转化，纤维素酶作用的机理主要是通过水解使连接葡萄糖分子的β-1，4-糖苷键断裂，最终将纤维素分解与转化成小分子糖类。当前，本领域技术人员普遍认为，完全降解纤维素至少需要三种功能不同但又具互补作用的活性酶组分：内切β-1，4-葡聚糖酶(Cx酶)、外切β-1，4-葡聚糖酶(C₁酶)和β-葡萄糖苷酶。然而，本领域技术人员尚未能研发出一种能够高产纤维素酶，且使上述三种组成酶的活性同时达到较高指标的制酶方法。

随着生物工程技术的发展，利用微生物产酶的技术逐渐进入人们的视野。当前，能够用于生产纤维素酶且所得纤维素酶分解能力较强的菌种主要包括：木霉属(Trichoderma)的菌株、曲霉属(Aspergillus)的菌株、青霉属(Penicillium)的菌株以及枝顶孢霉属(Acremonium)的菌株，但这些菌种的菌株生产制备的纤维素酶活性还不够高，即使上述菌株制得的纤维素酶中某一组成酶的活性能够达到较好的效果，但由于其他组成酶的活性较低也会对纤维素酶的整体活性形成制约。因此，对于本领域技术人员来说，培养筛选出一种高酶活(即Cx酶、C₁酶和β-葡萄糖苷酶三种组成酶的活性同时达到较高的指标)的纤维素分解菌，对今后纤维素酶在各个技术领域的广泛应用将具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种爪哇正青霉菌株在制备生产纤维素酶上的应用，通过优化该菌株生产纤维素酶的发酵方法，以制备出活性高、成本低的纤维素酶。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种爪哇正青霉菌株，其特征在于所述爪哇正青霉菌株的保藏名称为爪哇正青霉(Eupenicillium javanicum)ZN-205，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M208204。

上述爪哇正青霉菌株的菌落呈青绿色，菌落背面呈橙褐色，无渗出液；菌丝质地呈地毯状，在显微镜下可见菌丝分枝繁杂、透明、有隔，细胞壁光滑；所述菌株的分生孢子梗丛束疏松，簇状排列，由菌丝直立生出，无色；主分枝呈树状，其上有很多次级分枝，对生或互生2～3级分枝，末端为小梗，小梗瓶形，瓶梗短，基部变细，中间膨大，以大角度伸出；分生孢子呈球形或长椭圆形，聚集成球状绿色的分生孢子头，分生孢子壁光滑，孢子小。上述爪哇正青霉CCTCC M208204的孢子梗形态如图1所示；在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上培养后的菌落形态如图2所示；经分子生物学鉴定，其18S rDNA序列全长为1687bp。

本发明还提供一种上述爪哇正青霉菌株的筛选培养方法，具体包括以下步骤：

(1)初筛：将收集的菌株放入富集培养基中，在28℃、150r/min的条件下振荡培养3～5d，然后稀释涂布于羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基上，30℃倒置培养4d后挑取单菌落再次稀释涂布，直到获得纯菌株；将分离得到的纯菌株点种到CMC-Na培养基上培养4d后用1mg/mL的刚果红溶液染色，再用蒸馏水清洗，最后用1mol/L的NaCl溶液脱色，然后比较各个菌落直径、透明圈直径和菌落直径与透明圈直径的比值；

(2)复选：将初筛后的各菌株按5％的接种量(接种量是指接种菌株体积占待发酵培养基的体积百分数)接种到液体产酶培养基中于30℃、150r/min下振荡培养5d，然后将培养液在5000r/min的条件下离心，取其上清液，测定和比较各个菌落的羧甲基纤维素酶活、滤纸酶活和β-葡萄糖苷酶活；

(3)筛选出同时满足以下两个条件的菌株：

(a)所述初筛后测定的菌落直径、透明圈直径和菌落直径与透明圈直径的比值均表现最大的；

(b)所述复选后测定的羧甲基纤维素酶活、滤纸酶活和β-葡萄糖苷酶活均表现最大的。

本发明还提供一种上述爪哇正青霉菌株在生产纤维素酶上的应用。

所述爪哇正青霉菌株是通过以下步骤来生产纤维素酶：

将所述菌株接入种子培养基中，在25～32℃条件下培养48～84小时得种子液；将种子液按3～10％的接种量接入发酵培养基中，发酵培养基的初始pH值为4.5～6.0，在25～32℃条件下培养96～120小时得发酵液；发酵液经离心得到含纤维素酶的粗酶液。

上述制得的粗酶液具有以下酶学性质：纤维素酶的羧甲基纤维素酶活(CMC酶活)的最适作用pH值为5，在pH值4～5之间，酶的稳定性较好，在pH值小于4和大于5的区域，酶的稳定性都急剧下降；最适作用温度为60℃。纤维素酶的滤纸酶活(FPA酶活)最适作用pH值为5，在pH值5～7之间，酶的稳定性比较好，而当pH值大于7和小于5时，酶活急剧下降；最适作用温度为50℃。

上述种子培养基是由以下质量分数的组分组成：CMC-Na1～2％、MgSO₄·7H₂O 0.02～0.1％、KH₂PO₄0.05～0.5％、NH₄NO₃0.05～0.2％和余量的水。上述富集培养基和液体产酶培养基均为普通的培养基，其组分也可与种子培养基的组分相同。

上述发酵培养基是由以下质量分数的组分组成：稻草粉0.5～1.5％、麸皮粉0.1～0.5％、KNO₃ 0.5～2％、KH₂PO₄ 0.05～0.5％、CaCl₂·2H₂O 0.01～0.1％、MgSO₄·7H₂O 0.02～0.1％、吐温0.1～0.8％和余量的水。

上述种子培养基中培养时、发酵培养基中培养时转速均控制在160～200r/min；发酵液离心时转速控制在1000～8000r/min。

与现有技术相比，本发明的优点在于：通过研究筛选出一种高酶活纤维素分解菌——爪哇正青霉CCTCC M208204，本发明通过优化该菌株生产纤维素酶的发酵方法以及创造良好的产酶条件，可以制备得到活性高、成本低的纤维素酶。本发明筛选爪哇正青霉CCTCCM208204的方法相对简单，容易操作；利用本发明的爪哇正青霉CCTCC M208204生产制备的纤维素酶，可以将纤维素物质转化为小分子糖。因此，本发明的应用可能成为开辟饲料、发酵工艺原料和人类食品的新来源，并且对处理废物、消除公害、保护环境等都具有重要意义。

本发明的爪哇正青霉菌株已于2008年11月6日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC M208204。

附图说明

图1为本发明的爪哇正青霉菌株的孢子梗形态图；

图2为本发明的爪哇正青霉菌株在PDA培养基上培养后的菌落形态图；

图3为本发明的爪哇正青霉菌株通过刚果红平板分离筛选的照片。

具体实施方式

实施例1：

从长沙岳麓山森林腐烂树木和土壤中筛选和分离出一株高活力纤维素酶生产菌ZN-205，具体方法如下：

(1)初选：将收集的菌株样品放入含50mL富集培养基的三角瓶中，在28℃、150r/min的条件下振荡培养4d，然后稀释涂布于CMC-Na培养基上，30℃倒置培养4d后挑取单菌落再次稀释涂布，直到获得纯菌落为止。将分离得到的纯菌株点种到CMC-Na培养基上培养4d后用1mg/mL的刚果红溶液染色30min，再用蒸馏水清洗，最后用1mol/L的NaCl溶液脱色30min，以透明圈的直径和菌落直径的比值大小作为筛选的标准。通过刚果红平板分离筛选(见图3)，得到透明圈直径和菌落直径比值较大的8个菌落(见表1)，结果表明，相对其他菌株，菌株ZN-205生长情况最好，其菌落直径、透明圈直径以及透明圈直径与菌落直径比值也均为最大。进一步将筛选到的菌株接种到滤纸液体培养基中，在30℃、150r/min的条件下培养5d，以不接种任何菌株的滤纸液体培养基作为空白对照，重复三次实验，以滤纸的失重率(X)作为这次筛选的标准，X＝(M-M₁)/M(其中M为最初滤纸质量，M₁为降解后滤纸经烘干后的质量)，结果见表2，相对其他七株菌，菌株ZN-205降解滤纸后的失重率最大，说明其酶活最高。

表1 刚果红平板分离筛选结果

筛选菌株	菌落直径D/cm	透明圈直径d/cm	d/D
				ZN-1	0.61	1.6	2.63
ZN-39	0.8	1.62	2.1
				ZN-72	0.6	1.07	1.79
ZN-205	1.1	2.97	2.7
				ZN-85	0.4	0.97	2.42
ZN-201	1.0	2.5	2.5
				ZN-73	0.5	0.89	1.78
ZN-207	0.7	1.54	2.2

表2 滤纸失重率结果

菌株

ZN-1

ZN-39

ZN-72

ZN-205

ZN-85

ZN-201

ZN-73

ZN-207

失重率

34.04％

27.6％

25.6％

35.4％

27.1％

24.3％

30.7％

26.6％

(2)复选：将初筛得到的菌株按5％的接种量接种到液体产酶培养基中于30℃、150r/min下振荡培养5d，然后将培养液在5000r/min的条件下离心10min，取其上清液测定各个酶活大小，以里氏木霉(Trichoderma reesei)RUT-C30为对照株，各菌株粗酶液酶活见表3。结果表明，ZN-205的各个酶活均较好。

表3 各菌株粗酶液酶活 IU/ml

菌株	ZN-1	ZN-39	ZN-72	ZN-205	ZN-85	ZN-201	ZN-73	ZN-207	里氏木霉 RUT-C30
										CMC酶活	3.71	1.85	1.74	5.37	2.27	2.6	1.87	2.29	10.4
FPA酶活	1.59	1.04	0.65	2.11	1.71	0.84	0.71	1.71	1.91
										β-葡萄糖苷酶	1.05	0.99	0.59	1.06	0.08	0.98	1.02	0.29	0.33

上述富集培养基和液体产酶培养基的组分相同，各组分的质量分数为：CMC-Na1.5％、MgSO₄·7H₂O 0.05％、KH₂PO₄0.1％、NH₄NO₃0.1％和余量的水。

菌株ZN-205经形态和分子鉴定(鉴定结果如下)为爪哇正青霉，该菌株名称为爪哇正青霉(Eupenicillium javanicum)ZN-205，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC M208204。

形态鉴定：将分离得到的菌株接种到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板上培养3天后观察菌落的特征，在平板上挑菌体少许，涂于载玻片上并置于显微镜下观察。菌落呈青绿色，菌落背面呈橙褐色，无渗出液；菌丝质地呈地毯状，在显微镜下可见菌丝分枝繁杂、透明、有隔，细胞壁光滑；菌株分生孢子梗丛束疏松，簇状排列，由菌丝直立生出，无色；主分枝呈树状，其上有很多次级分枝，对生或互生2～3级分枝，末端为小梗，小梗瓶形，瓶梗短，基部变细，中间膨大，以大角度伸出；分生孢子呈球形或长椭圆形，聚集成球状绿色的分生孢子头，分生孢子壁光滑，孢子小。

分子鉴定：将分离得到的菌株接种到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板上培养3天，取菌丝体抽提DNA，用18S rDNA基因通用引物进行扩增(上游引物5′-ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG-3′，下游引物5′-CCGATCCCTAGTCGGCATAG-3′)，扩增片断由上海生物工程公司测序，获得18S rDNA基因全序列如下所示：

acttcctcta atgaccgagt ttgaccaact ttccggctct ggggggtcgt tgccaaccct

cctgagccag tccgaaggcc tcactgagcc attcaatcgg tagtagcgac gggcggtgtg

tacaaagggc agggacgtaa tcggcacgag ctgatgactc gtgcctacta ggcattcctc

gttgaagagc aataattgca atgctctatc cccagcacga cagggtttaa caagattacc

cagacctctc ggccaaggtg atgtactcgc tggccctgtc agtgtagcgc gcgtgcggcc

cagaacatct aagggcatca cagacctgtt attgccgcgc acttccatcg gcttgagccg

atagtccccc taagaagcca gcggcccgca aatgcggacc gggctattta agggccgagg

tctcgttcgt tatcgcaatt aagcagacaa atcactccac caactaagaa cggccatgca

ccaccatcca aaagatcaag aaagagctct caatctgtca atccttattt tgtctggacc

tggtgagttt ccccgtgttg agtcaaatta agccgcaggc tccacgcctt gtggtgccct

tccgtcaatt tctttaagtt tcagccttgc gaccatactc cccccagaac ccaaaaactt

tgatttctcg taaggtgccg aacgggtcat catagaatcc cgtccgatcc ctagtcggca

tagtttatgg ttaagactac gacggtatct gatcgtcttc gatcccctaa ctttcgttcc

ctgattaatg aaaacatcct tggcgaatgc tttcgcagta gttagtcttc agcaaatcca

agaatttcac ctctgacagc tgaatactga cgcccccgac tatccctatt aatcattacg

gcggtcctag aaaccaacaa aatagaaccg cacgtcctat tctattattc catgctaatg

tattcgagca aaggcctgct ttgaacactc taattttttc acagtaaaag tcctggttcc

ccccacagcc agtgaaggcc atgaggttcc ccagaaggaa aggtccagcc ggaccagtac

tcgcggtgag gcggaccggc cagccagacc caaggttcaa ctacgagctt tttaactgca

acaactttaa tatacgctat tggagctgga attaccgcgg ctgctggcac cagacttgcc

ctccaattgt tcctcgttaa gggatttaaa ttgttctcat tccaattacg agacccaaaa

gagccccgta tcagtattta ttgtcactac ctccccgtat cgggattggg taatttgcgc

gcctgctgcc ttccttggat gtggtagccg tttctcaggc tccctctccg gaatcgaacc

ctaattcccc gttacccgtt gccaccatgg taggccacta tcctaccatc gaaagttgat

agggcagaaa tttgaatgaa ccatcgccgg cgcaaggcca tgcgattcgt taagttatta

tgattcacca aggagccccg aagggcgttg gttttttatc taataaatac accccttcct

gaagtcgggg tttttagcat gtattagctc tagaattacc acaggtatcc atgtagtaag

gtactatcaa ataaacgata actgatttaa tgagccattc gcagtttcac agtataaagt

gcttata

上述序列全长1687bp，经登陆GeneBank进行Blast分析，菌株ZN-205的18S rDNA基因序列与爪哇正青霉18S rDNA基因序列同源性高达99％。

实施例2：

一种本发明的爪哇正青霉菌株，其是通过以下步骤来生产纤维素酶：

将已经筛选、培养出的菌株接入种子培养基中，在30℃、175r/min的条件下培养72小时得种子液；将种子液按5％的接种量接入发酵培养基中(在发酵瓶中装20～50％体积的发酵培养基)，发酵培养基的初始pH值为5.5，在30℃、175r/min的条件下培养120小时得发酵液；发酵后的发酵液经4000r/min离心得到含纤维素酶的粗酶液。经测定，该菌株粗酶液的CMC酶活为24.52IU/ml，FPA酶活为2.68IU/ml、β-葡萄糖苷酶为2.03IU/ml，与现有其他菌株产酶进行比较(见表4)，本发明菌株所产的纤维素酶其CMC酶活最高；虽然FPA酶活和β-葡萄糖苷酶酶活不是最高，但三种酶活的整体性和均衡性表现最好。

表4 爪哇正青霉ZN-205与其他菌株产酶比较

注：“--------”表示未作过测定

上述种子培养基的组分及各组分的质量分数为：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)1.5％、 MgSO₄·7H₂O 0.05％、KH₂PO₄0.1％、NH₄NO₃0.1％和余量的水。

上述发酵培养基的组分及各组分的质量分数为：稻草粉0.7％、麸皮粉0.3％(稻草粉与麸皮比例为7∶3)、KNO₃1％(氮源添加浓度)、KH₂PO₄0.4％、CaCl₂·2H₂O 0.03％、MgSO₄·7H₂O0.03％、吐温0.4％和余量的水。

本发明方法用到的培养基以稻草和麸皮(0.5元/kg)作碳源、以KNO₃(5元/kg)作氮源，相比通常以微晶纤维素(5元/kg)为碳源、蛋白胨(50元/kg)为氮源，具有价格低、来源广等优点，能够使本发明技术方案的成本降低、操作更加简便易行。

上述实施例中是采用我国轻工行业标准(QB2583-2003)中规定的纤维素酶活测定方法来进行酶活测定。酶活单位采用国际定义方法，以1mL酶液每分钟产生1微摩尔的葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位IU。

<110>中南林业科技大学

<120>爪哇正青霉菌株及其筛选培养方法和应用

<160>1687

<210>1

<211>1687bp

<212>DNA

<213>爪哇正青霉(Eupenicillium javanicum)

<220>

<221>RRNA

<222>(1)...(1687)

<400>

acttcctcta atgaccgagt ttgaccaact ttccggctct ggggggtcgt tgccaaccct 60

cctgagccag tccgaaggcc tcactgagcc attcaatcgg tagtagcgac gggcggtgtg 120

tacaaagggc agggacgtaa tcggcacgag ctgatgactc gtgcctacta ggcattcctc 180

gttgaagagc aataattgca atgctctatc cccagcacga cagggtttaa caagattacc 240

cagacctctc ggccaaggtg atgtactcgc tggccctgtc agtgtagcgc gcgtgcggcc 300

cagaacatct aagggcatca cagacctgtt attgccgcgc acttccatcg gcttgagccg 360

atagtccccc taagaagcca gcggcccgca aatgcggacc gggctattta agggccgagg 420

tctcgttcgt tatcgcaatt aagcagacaa atcactccac caactaagaa cggccatgca 480

ccaccatcca aaagatcaag aaagagctct caatctgtca atccttattt tgtctggacc 540

tggtgagttt ccccgtgttg agtcaaatta agccgcaggc tccacgcctt gtggtgccct 600

tccgtcaatt tctttaagtt tcagccttgc gaccatactc cccccagaac ccaaaaactt 660

tgatttctcg taaggtgccg aacgggtcat catagaatcc cgtccgatcc ctagtcggca 720

tagtttatgg ttaagactac gacggtatct gatcgtcttc gatcccctaa ctttcgttcc 780

ctgattaatg aaaacatcct tggcgaatgc tttcgcagta gttagtcttc agcaaatcca 840

agaatttcac ctctgacagc tgaatactga cgcccccgac tatccctatt aatcattacg 900

gcggtcctag aaaccaacaa aatagaaccg cacgtcctat tctattattc catgctaatg 960

tattcgagca aaggcctgct ttgaacactc taattttttc acagtaaaag tcctggttcc 1020

ccccacagcc agtgaaggcc atgaggttcc ccagaaggaa aggtccagcc ggaccagtac 1080

tcgcggtgag gcggaccggc cagccagacc caaggttcaa ctacgagctt tttaactgca 1140

acaactttaa tatacgctat tggagctgga attaccgcgg ctgctggcac cagacttgcc 1200

ctccaattgt tcctcgttaa gggatttaaa ttgttctcat tccaattacg agacccaaaa 1260

gagccccgta tcagtattta ttgtcactac ctccccgtat cgggattggg taatttgcgc 1320

gcctgctgcc ttccttggat gtggtagccg tttctcaggc tccctctccg gaatcgaacc 1380

ctaattcccc gttacccgtt gccaccatgg taggccacta tcctaccatc gaaagttgat 1440

agggcagaaa tttgaatgaa ccatcgccgg cgcaaggcca tgcgattcgt taagttatta 1500

tgattcacca aggagccccg aagggcgttg gttttttatc taataaatac accccttcct 1560

gaagtcgggg tttttagcat gtattagctc tagaattacc acaggtatcc atgtagtaag 1620

gtactatcaa ataaacgata actgatttaa tgagccattc gcagtttcac agtataaagt 1680

gcttata 1687

Claims

1.一种爪哇正青霉菌株在生产纤维素酶上的应用，该爪哇正青霉菌株的保藏名称为爪哇正青霉(Eupenicillium javanicum)ZN-205，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M208204，其特征在于，所述爪哇正青霉菌株是通过以下步骤来生产纤维素酶：

将所述菌株接入种子培养基中，在30℃、175r/min条件下培养72小时得种子液；将种子液按5％的接种量接入发酵培养基中，发酵培养基的初始pH值为5.5，在30℃、175r/min的条件下培养120小时得发酵液；发酵液经4000r/min离心得到含纤维素酶的粗酶液；该粗酶液中羧甲基纤维素酶活为24.52IU/ml，滤纸酶活为2.68IU/ml，β-葡萄糖苷酶为2.03IU/ml；

所述种子培养基是由以下质量分数的组分组成：羧甲基纤维素钠1.5％、MgSO₄·7H₂O 0.05％、KH₂PO₄ 0.1％、NH₄NO₃ 0.1％和余量的水；

所述发酵培养基是由以下质量分数的组分组成：稻草粉0.7％、麸皮粉0.3％、KNO₃ 1％、KH₂PO₄ 0.4％、CaCl₂·2H₂O 0.03％、MgSO₄·7H₂O 0.03％、吐温0.4％和余量的水，其中KNO₃是按氮源添加浓度计。