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CN101460055A - 和腺伴随病毒-噬菌体颗粒相关的方法和组合物 - Google Patents

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CN101460055A
CN101460055A CNA2007800210402A CN200780021040A CN101460055A CN 101460055 A CN101460055 A CN 101460055A CN A2007800210402 A CNA2007800210402 A CN A2007800210402A CN 200780021040 A CN200780021040 A CN 200780021040A CN 101460055 A CN101460055 A CN 101460055A
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W·阿拉普
J·格罗瓦尼
F·C·玛丽尼三世
A·哈吉托
M·阿尔奥丁
M·特利佩尔
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University of Texas at Austin
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Abstract

本发明的实施方案普遍指向以位点特异性的方式将一种或多种转基因运输到靶细胞中的组合物和方法，所述靶细胞例如肿瘤细胞，来实现增强的表达，并指向用于这种应用的结构和组合物。在某些方面，可以在对受试者实施治疗或诊断过程之前对治疗核酸的表达进行评价。

Description

和腺伴随病毒-噬菌体颗粒相关的方法和组合物
本申请要求2006年4月7日提交的系列号为60/744,492的美国临时专利申请的优先权，此处引入该申请全文作为参考文献。
根据美国国家卫生研究院(NIH)的授权，美国政府拥有本申请的权利。
发明背景
技术领域
本发明的实施方案通常针对生物学和药学。特别地，本发明针对联合使用AAVP和成像给受试者提供治疗的基因治疗领域。
发明背景
许多生物学疗法的一个限制是不能将生物活性分子可控地并且有效地运输到肿瘤细胞或其周围基质中。进行基因疗法的目标是将生物产物(作为基因表达的结果)有效地递送到其在细胞中的作用位点。基因疗法还能通过在转移的遗传物质中加入特异性启动子/激活子元件，对这些生物活性产物发挥作用的水平、时间和持续时间进行控制，来产生更有效的治疗干涉。正在开发使用DNA新剂型向多种体细胞组织和肿瘤可控地运输基因的方法，以及使用细胞特异性的、复制激活的和药物控制的表达系统控制基因表达的方法。
一种方式是，基因治疗尝试以特殊的方式靶向细胞。因此，治疗基因以某种方式被连接到靶向分子上，来运输该基因到靶细胞或组织中。典型的，目前的方法涉及连上一种靶向分子，例如识别针对裸DNA或含有所需基因的哺乳动物细胞病毒的内化受体的配基或抗体。当使用裸DNA时，必须将其在体外凝缩为紧密几何形状来进入细胞。通常使用多聚阳离子，例如多聚赖氨酸，来中和DNA上的电荷并将其凝缩为超环面结构。但是，人们对这种凝缩过程还不清楚，并且难以控制，因此，导致同质基因治疗药物的制备极为困难。
偶尔试图使用噬菌体，例如λ和丝状噬菌体，来转移DNA进入哺乳动物细胞。总体上，已经发现λ的转导是相对罕见事件，并且报告基因的表达微弱。在试图增强转导效率的努力中，结合使用了λ和采用磷酸钙或脂质体(不特异性靶向细胞表面受体)的方法。已经观察到使用磷酸钙共沉淀基因通过λ噬菌体进行了转移，或者使用二乙氨基乙基葡聚糖(DEAE-dextran)或脂多胺(lipopolyamine)，基因通过丝状噬菌体进行了转移。但是，这些将DNA引入哺乳动物细胞的方法不能用于基因治疗的实践应用中，因为转染效率有可能是较低的、非特异性的，并且转染不仅是麻烦的，并且对于不同的细胞类型是杂乱的。
目前，真核病毒无疑地提供了更好的转基因运输和转导(Kootstra和Verma，2003；Machida，2003)，但是这种载体的配基定向靶向通常需要去除其对细胞膜受体的天然趋向性(Miller等人，2003；Mizuguchi和Hayakawa，2004；White等人，2004)。相反，通常认为原核病毒，例如噬菌体，不是哺乳动物细胞转导的良好载体。但是，尽管其作为“真核”病毒具有内在缺陷，但是噬菌体颗粒对哺乳动物细胞没有趋向性(Zacher等人，1980；Barrow和Soothill，1997；Barbas等人，2001)，并且尽管效率低但是已被用于这些细胞的转导中(Ivanenkov等人，1999；Larocca等人，1999；Poul和Marks，1999；Piersanti等人，2004)。
因此，需要更可靠的将载体靶向到特定细胞(或受体)的方法，以及能够确保基因的运输和表达达到治疗有效程度的方法，这样才能使载体用于治疗应用中。
发明概述
本发明的实施方案通常针对以位点特异性方式运输一种或多种转基因到靶细胞来增强表达的组合物和方法，所述靶细胞例如肿瘤细胞，以及针对用于该用途的组分和组合物。在某些方面，在对受试者进行治疗或诊断程序之前，可以对治疗性核酸的表达进行估定。在进一步的方面，对在需要治疗收益的区域或位置中的表达进行测定或估定，并且可以停止任何非必须的或边际收益疗法，来代替替代疗法。
不受任何特定理论或机制所约束的，本公开基于了如下观察：当一个以上的多重转基因被整合到基因组中时，转基因表达有可能增加。让人特别感兴趣的是嵌合AAVP颗粒向细胞转导一个拷贝以上的转基因(通常以串联体形式)的能力。还可以通过嵌合AAVP颗粒所携带的报告基因的表达来监测转导细胞。在本公开中可以包括任何转基因，并可以从AAVP颗粒中表达。
本发明的特定实施方案包括用于检测转移到受试者靶组织中的基因和/或在受试者靶组织中表达的基因的方法和组合物，包括如下的一个或多个步骤：
(a)在本方法中可能使用的一个步骤，包括向受试者靶组织中运输含有报告基因(可以是在宿主受试者中天然存在或非天然存在的)的AAVP载体。典型的，该报告基因不会在待成像区域和/或待处理区域内表达。在某些方面，该报告基因是一种野生的、突变的、或遗传工程改造过的激酶。在进一步的方面，该激酶是胸苷激酶。在更进一步的方面，该激酶是单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因或2型人胸苷激酶。典型的，转移载体或AAVP被引入到靶组织中的细胞中，并且报告基因在靶组织中的细胞中表达，因此产生只在被AAVP载体有效转染的细胞中积累的报告基因产物(蛋白质)。
(b)可以使用的另一个步骤是，向宿主受试者中给予标记的报告底物，表达报告基因产物的细胞代谢该标记的报告底物，产生标记的报告代谢产物，其中所述的标记的报告底物包括放射标记的核苷类似物。
(c)而在本方法中可以使用的另一个步骤包括对含有标记的报告底物代谢产物的靶组织或细胞进行非侵入式成像。在某些方面，受试者在清除未被报告基因产物从宿主受试者中代谢去除的残留报告底物后接受成像，藉此检测转移到靶组织中并在其中表达的基因。在进一步的方面中，受试者或受试组织在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多分钟、小时、天或周后接受成像，这依赖于未代谢的报告底物的清除代谢。
该方法可以进一步包括在步骤(b)后等待一段时间，该时间足以使大约、至少或最多60、65、67、70、75、77、80、85、87、90、95、97％或更多的、包括其中所有数值和范围的未代谢物(未被表达产物代谢掉的报告底物)被报告基因产物从受试者中清除。未代谢底物可以包括衍生自未代谢的残留报告底物的非特异性标记物。可以通过体外或体内转染(或转导)将AAVP载体引入到靶组织细胞中。在某些方面，通过静脉内、瘤内、动脉内、胸膜内、支气管内和/或经口给药AAVP。
在某些方面，用适用于正电子发射断层摄影术、伽马照相或单光子发射计算体层摄影成像的放射性同位素标记报告底物。该报告底物和/或报告底物的代谢产物是含有一个稳定同位素的核素的化合物，包括但不限于2H，13C，15N和19F。在进一步的方面，通过正电子发射断层摄影对标记的报告代谢产物进行成像。在更进一步的方面，通过伽马照相或单光子发射计算体层摄影对标记的报告代谢产物进行成像。在仍然更进一步的方面，通过磁共振成像对标记的报告代谢产物进行成像。
AAVP载体可以掺入报告基因和合适转录启动子和增强元件，来确保报告基因和治疗基因共表达的组织特异性的、组织选择性的或转录因子特异性的、或信号转导特异性的转录激活。在某些方面，在将多个或单个细胞给予到受试者之前，在体外用偶联到转录调控元件(例如启动子和/或增强子元件)上的报告基因转染器官、组织、多个或单个细胞。标记的2′-氟-核苷类似物包括，但不限于，5-[123I]-2′-氟-5-碘-1β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；5-[124I]-2′-氟-5-碘-1β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；5-[131I]-2′-氟-5-碘-1β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶，5-[18F]-2′-氟-5-氟-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；2-[131I]--2′-氟-5-甲基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；5-([11C]-甲基)-2′-氟-5-甲基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；2-[11C]-2′-氟-5-乙基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；5-([11C]-乙基)-2′-氟-5-乙基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；5-(2-[18F]-乙基)-2′-氟-5-(2-氟-乙基)-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶，5-[123I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；5-[124I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；5-[131I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；5-[123I]-2′-氟-5-碘-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶；5-[124I]-2′-氟-5-碘-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶；5-[131I]-2′-氟-5-碘-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶；5-[123I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶；5-[124I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶；5-[131I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶；或9-4-[18F]氟-3-(羟甲基)丁基]鸟嘌呤。
成像数据可以体现，但不限于，获得的用磁共振成像(MRI)、核医学、正电子发射断层摄影(PET)、计算机断层扫描(CT)、超声检查(US)、光学成像、红外成像、体内显微镜检查和X射线摄影所得到成像。可以将成像和可用于从成像中获得额外信息的医疗设备、药物或化合物、造影剂或其它试剂或刺激剂联用。使用损伤、组织、样本、系统、有机体、受试者或患者的这些形态所获得的成像可以是在时间和/或空间上静止或动态的成像。
可以将成像和从中获得大规模生物数据的组织、样本、系统、有机体、或患者相匹配。从每个成像、一个或多个成像实验或检查中提取成像信息，并且所述成像信息可以包括定量的或定性的影像表现，可以体现但不限于损伤、组织、样本、系统、有机体或患者的形态学、组成、结构、生理学、基因表达或功能的差异。成像信息的范例包括但不限于可以从多相反差增强动态CT、功能成像、磁共振波谱分析、弥散张量成像、基于扩散或灌注的成像以及被核医学或PET包裹的目标成像中所提取出的影像表现。范例可以参见美国专利公布号20030033616和20060223141，在此处将它们整体引用作为参考。
在某些实施方案中，本发明包括治疗受试者的方法，包括如下的一个和多个步骤：
(a)向患有、怀疑患有病理或疾病情况或具有发生病理或疾病情况的危险的受试者给予编码报告分子的治疗性AAVP；以及
(b)通过检测编码的报告分子或报告分子的活性来评价治疗性AAVP在治疗所靶向的组织或细胞中的原位表达。
在某些方面，所述方法可以进一步包括：根据利用AAVP核酸在靶器官、组织或细胞中进行治疗上足够水平的治疗基因的表达，给予受试者癌症治疗。在进一步的方面，如果第一治疗性AAVP的表达未达到治疗上的有效水平，给予第二治疗性AAVP。第二治疗性AAVP可以包含第二个靶向配基或一个结合体或多个配基。并且，第二AAVP可以包含第二个用于在靶器官、组织、多个细胞或一个细胞中表达的控制元件。可以通过对报告分子或报告分子的活性进行非侵入式检测(例如，检测报告蛋白代谢的标记的底物)来进行对AAVP表达的评价。在某些方面，报告分子是治疗性蛋白质。在进一步的一个方面，所述治疗性蛋白质是前体药物转化酶。在更进一步的一个方面，所述报告分子是酶，并且特别是一种激酶。在某些实施方案中，所述激酶是胸苷激酶，例如，HSV-tk或人tk2。典型的，激酶能修饰或代谢可检测的标记的化合物或标记的底物。在某些方面，所述底物或化合物包括可通过如下方法检测到的可检测标记：荧光、化学发光、表面增强拉曼光谱(SERS)、磁共振成像(MRI)、计算机体层扫描摄影(CT)或正电子发射断层摄影(PET)。在某些方面，可检测的标记的化合物是核苷类似物。所述可检测的标记的化合物可以包括，但不限于，氟脱氧葡萄糖(FDG)、2′-氟-2′脱氧-1β-D-阿拉伯呋喃糖基-5-乙基-尿嘧啶(FEAU)、5-[123I]-2′-氟-5-碘-1β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶、5-[124I]-2′-氟-5-碘-1β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶、5-[131I]-2′-氟-5-碘-1β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶，5-[18F]-2′-氟-5-氟-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶、2-[11I]-和5-([11C]-甲基)-2′-氟-5-甲基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶、2-[11C]-2′-氟-5-乙基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶、5-([11C]-乙基)-2′-氟-5-乙基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶、5-(2-[18F]-乙基)-2′-氟-5-(2-氟-乙基)-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶，5-[123I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶、5-[124I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶、5-[131I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶、5-[123I]-2′-氟-5-碘-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶、5-[124I]-2′-氟-5-碘-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶、5-[131I]-2′-氟-5-碘-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶、5-[123I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶、5-[124I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶、5-[131I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶、或9-4-[18F]氟-3-(羟甲基)丁基]鸟嘌呤。
在进一步的一个方面，标记的底物或化合物可以用18F、277Ac、211At、128Ba、131Ba、7Be、204Bi、205Bi、206Bi、76Br、77Br、82Br、109Cd、47Ca、11C、13C、14C、36Cl、48Cr、51Cr、62Cu、64Cu、67Cu、165Dy、155Eu、153Gd、66Ga、67Ga、68Ga、72Ga、198Au、2H、3H、166Ho、111In、113In、115In、123I、125I、131I、189Ir、191Ir、192Ir、194Ir、19F、52Fe、55Fe、59Fe、177Lu、15O、191Os、109Pd、32P、33P、42K、226Ra、186Re、188Re、82Rb、153Sm、46Sc、47Sc、72Se、75Se、105Ag、15N、22Na、24Na、89Sr、35S、38S、177Ta、96Tc、99mTc、201Tl、202Tl、113Sn、117mSn、121Sn、166Yb、169Yb、175Yb、88Y、90Y、62Zn、或65Zn标记。在特别的方面，可检测的标记是131I、125I、123I、111I、99mTc、90Y、186Re、188Re、32P、153Sm、67Ga、201Tl、77Br、或18F标记。
本发明的AAVP可以包含选择性靶向治疗所针对的一种组织或细胞的组分。在某些方面，所述组分被编码或偶联到AAVP的衣壳蛋白和/或重组衣壳蛋白上。在某些方面，所述衣壳蛋白包含靶向肽。靶向肽可以是环状肽、二环的、和/或线形的肽。靶向肽选择性地结合到在细胞表面表达表达整联蛋白的细胞上。整联蛋白可以是αvβ3或αvβ5整联蛋白。在进一步的一个方面，肽包含RGD基序。在更进一步的一个方面，肽可以选择性地结合到表达转铁蛋白受体的细胞上，这种肽可以包含含有CRTIGPSVC的氨基酸序列。
在某些方面，受试者可以患有、怀疑患有过增生疾病、或者具有发生过增生疾病的风险。过增生疾病包括，但不限于，纤维肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、胃癌、食道癌、直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、头颈癌、皮肤癌、脑癌、鳞状细胞癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、肺癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母肿瘤(Wilm′s tumor)、子宫颈癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、或卡波西氏肉瘤。在某一特定的方面、过增生疾病是脑胶质瘤。
在进一步的实施方案中，报告分子和/或治疗基因被操作偶联到组织或细胞选择性启动子上，或偶联到组织或细胞特异性启动子上。在某些方面，对表达的评价包括给予标记的化合物或底物，所述标记的化合物或底物被表达AAVP核酸的细胞代谢，并且典型的不被非靶组织显著代谢。
治疗性AAVP还可以编码第二个治疗基因。第二个治疗基因可以是，但不限于，肿瘤抑制子、抑制RNA、抑制DNA、或前导药物转化酶。
在更进一步的实施方案中，本发明的组合物可以包括治疗性AAVP核酸，所述治疗性AAVP核酸包含含有抑制RNA或抑制DNA的核酸片段。抑制RNA可以是siRNA、miRNA或反义RNA或DNA。在某些方面，AAVP核酸被包含到噬菌体颗粒中。在进一步的方面，所述颗粒包含如此处所述的靶向配基。
某些实施方案包括调节基因表达的组合物和方法，包括给予AAVP核酸或包含这种核酸的颗粒。
根据本发明，选择的基因或多肽可以指向任何蛋白质、多肽或肽。治疗基因或多肽是能够被给予到受试者中用于治疗或预防疾病的基因或多肽。例如，治疗基因可以是给予到受试者中用于治疗或预防癌症的基因。治疗基因的例子包括，但不限于，Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11IL-12、GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶、Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri、Fas-L、mda-7、fus、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、p53、ABLI、BLC1、BLC6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS2、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3、YES、MADH4、RB1、TP53、WT1、TNF、BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、ApoAI、ApoAIV、ApoE、Rap1A、胞嘧啶脱氨酶、Fab、ScFv、BRCA2、zac1、ATM、HIC-1、DPC-4、FHIT、PTEN、ING1、NOEY1、NOEY2、OVCA1、MADR2、53BP2、IRF-1、zac1、DBCCR-1、rks-3、COX-1、TFPI、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、ab1、E1A、p300、VEGF、FGF、凝血酶敏感蛋白、BAI-1、GDAIF、或MCC。
治疗基因的其它例子包括编码酶的基因。例子包括，但不限于，ACP去饱和酶、ACP羟化酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucosepyrophorylase)、三磷酸腺苷酶(ATPase)、乙醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、环氧合酶、脱羧酶、糊精酶、酯酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、透明质酸合成酶(hyaluronsynthase)、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、鸟苷三磷酸酶(GTPase)、螺旋酶、半纤维素酶、半纤维素酶、整合酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂肪氧化酶、分解酶、溶菌酶、果胶脂酶、过氧物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白水解酶、肽水解酶(peptidease)、普鲁兰酶(pullanase)、重组酶、逆转录酶、拓扑异构酶、木聚糖酶、报告基因、白(细胞)介素或细胞因子。
治疗基因的进一步的例子包括编码氨基甲酰合成酶I、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨酸琥珀酸盐合成酶、精氨琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-1胰蛋白酶抑制剂、葡萄糖-6-磷酸酶、低密度脂蛋白受体、胆色素原脱氨酶、因子VIII、因子IX、胱硫醚β合酶(cystathione beta.-s ynthase)、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰辅酶A脱氢酶、丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酸单酰辅酶A、戊二酰-辅酶A脱氢酶、胰岛素、-葡糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝脏磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H-蛋白、T-蛋白、门克斯病铜运输ATPase、肝豆状核变性铜运输ATPase、胞嘧啶脱氨酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、1-磷酸半乳糖尿苷酸转移酶、苯丙氨酸羟化酶、葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、-L-艾杜糖醛酸酶、6-磷酸葡糖脱氢酶、HSV胸苷激酶或人胸苷激酶的基因。
治疗基因还包括编码激素的基因。例子包括，但不限于，编码生长激素，催乳素，胎盘生乳素，促黄体激素，卵泡刺激素，绒毛膜促性腺激素，促甲状腺激素，瘦素，促肾上腺皮质激素，血管紧张素I，血管紧张素II，β黑素细胞刺激素，胆囊收缩素，内皮缩血管肽，肠抑胃肽，胰高血糖素，胰岛素，促脂解素，后叶激素运载蛋白类、生长抑素、降钙素，降钙素基因相关肽，β-降钙素基因相关肽，恶性因子的高钙血症，甲状旁腺激素相关蛋白，甲状旁腺激素相关蛋白，胰高血糖素样多肽，胰抑素，胰多肽，肽YY，PHM，分泌素、血管活性肠肽，催产素，加压素，加压催产素，脑啡肽酰胺(enkephalinamide)，甲硫脑啡肽酰胺(metorphinamide)，α黑素细胞刺激素，心钠素，淀粉素，淀粉样蛋白P成分，促肾上腺皮质释放激素，生长激素释放因子，促黄体激素释放激素，神经肽Y，K物质，P物质，或促甲状腺素释放激素的基因。
本申请全文还讨论了本发明的其它实施方案。就本发明的一个方面而进行讨论的任何实施方案都可以应用于本发明的其它方面，反之亦然。可以理解，实施例部分的实施方案是可以应用于本发明所有方面的本发明的实施方案。
术语“抑制”，或“减少”，或“预防”，或这些术语的任何变体，当用于权利要求和/或说明书中时包括任何可测定的下降或完全的抑制，来得到所需结果。
当在权利要求书和/或说明书中术语“a”或者“an”与术语“包含”结合使用时，其表示“一个”，不过它也和“一个或者多个”，“至少一个”，“一个或者一个以上”的意思是一致的。
可以预想在此讨论的涉及本发明的任何方法或组合物的任何实施方案都是能够实现的，反之亦然。而且，本发明的组合物和试剂盒可以在实现本发明的方法中使用。
在整个申请中，术语“大约”用于表明数值包括了所采用的用于测量数值的仪器或方法的误差标准偏差。
在权利要求中术语“或者”的使用用于表达“和/或”，除非明确地表明指的是仅仅两者选一或者所述二者择一是互相排斥的，所述公开支持指的是仅仅两者选一和“和/或”的定义。
如在本说明书和权利要求中所用，单词“包含”(以及任何形式的包含，例如单数第三人称形式或复数形式)、“具有”(以及任何形式的具有，例如单数第三人称形式或复数形式)、“包括”(以及任何形式的包括，例如单数第三人称形式或复数形式)或“含有”(以及任何形式的含有，例如单数第三人称形式或复数形式)是包括在内的或可扩充的，并且不排除另外的、未列举的元素或方法步骤。
根据后面的详细描述，本发明的其它目标、特征和优点是明显的。可以理解，指示本发明中特定的实施方案的详细描述和特定例子仅用于举例阐述，因为根据本发明的详细描述，在本发明的宗旨和范围内的多种改变和修饰对于本领域的技术人员而言是很明显的。
附图简述
本说明书包括以下图例，并用其进一步说明本发明。结合一个或多个图例并参考本文所述具体实施案例可更好的理解本发明。为理解公开的某些具体实施案例(部分)可参考以下附图及描述。
图1A-1E：图1A所示柱形图表示RGD-4C AAVP与表达αv整合素的哺乳细胞相结合，对照组为无靶点的AAVP或是携带阴性对照肽的AAVP(阴性对照肽可为RGE-4C或RGD-4C序列的多种错乱版本)。图1B显示RGD-4C AAVP携带报道基因，显示其配体介导的内化。图1C表示由RGD-4C AAVP-β-半乳糖苷酶(病毒)介导的靶基因向KS 1767细胞的转移。图1D表示合成的RGD-4C多肽抑制转导(transduction)，而非相关对照多肽不抑制转导；用无靶点的AAVP检测非特异性转导水平。用免疫荧光检测基因表达，用抗β-gal抗体复染。图1E表示感染RGD-4C AAVP的细胞对重组AAV的拯救。用靶定的RGD-4C AAVP-GFP(106转导单位/细胞)或用阴性对照(靶定的非嵌合RGD-4C噬菌体-GFP，无靶点的AAVP-GFP)孵育人293细胞。感染4天后，用AAV rep-和cap-表达质粒转染细胞，并用5型腺病毒(Ad)重复感染细胞。腺病毒感染72小时后收集细胞，用上清感染其他293细胞。48小时后用流式细胞术分析GFP的表达。图例所示为相对于背景值，各构建体在拯救实验中产生的重组AAV-GFP平均值增高情况。
图2A-2C：柱形图2A概述了稳定转导的293克隆的流式细胞分析，该克隆被导入AAVP-GFPneo(n＝9)或噬菌体-GFPneo(n＝9)。空白三角形表示绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞的百分率，黑色条柱表示GFP的表达水平(平均荧光密度(MFI：mean fluorescent intensity))。图2B为RGD-4C AAVP-GFPneo或RGD-4C噬菌体-GFPneo稳定转导细胞株的Southlrn印记分析，以显示克隆细胞系中转基因盒的持久性。用Af1II-XhoI双酶切非转导293母细胞的总细胞DNA或各转导细胞株(#1-9组)的总细胞DNA(携带转基因盒的构建DNA中仅有一个该酶的限制性酶切位点)。图2C显示用Southern印记分析转基因盒潜在的头尾相连串联体结构。Southern印记之前先用Xho-I消化总细胞DNA(转基因盒3’ITR附近只有单个限制性酶切位点)。
图3A-3B：图3A为KS1767衍生移植瘤的噬菌体免疫组化染色结果。将RGD-4C AAVP(5 x 1010TU)或阴性对照(无靶点的AAVP、错乱的RGD-4C AAVP或RGE-4C AAVP)经全身给药(尾静脉注射)注入携带KS1767衍生移植瘤的深度麻醉裸鼠，让AAVP病毒载体在体内循环5分钟，而后灌注并手术移除肿瘤。用抗噬菌体的多克隆抗体对石蜡包埋的肿瘤切片进行染色。箭头表示肿瘤血管中的噬菌体染色。图3B为用RGD-4C AAVP-GFP或阴性对照(无靶点、错乱的或突变的结构)全身给药7天后，KS1767衍生移植瘤中GFP表达的免疫荧光分析。
图4A-4E：图4A为用靶定AAVP全身给药后萤火虫荧光素酶的体内生物发光成像结果。携带DU145衍生移植瘤的裸鼠被全身施用单剂量的RGD-4C AAVP-Luc(5 x 1011TU，静脉注射)或对照物(无靶点的AAVP-Luc或错乱的RGD-4C AAVP-Luc)。10天后，用生物发光成像(BLI，bioluminescence imaging)来分析携带肿瘤小鼠中转基因的表达情况。附图显示较准标度(calibration scale)。图4B为靶定的RGD-4C AAVP-HSVtk全身给药后携带肿瘤小鼠的多轨PET成像结果(multi-tracer PET imaging)。携带DU145衍生移植瘤的裸鼠(每组n＝9只携带肿瘤小鼠)被全身施用单剂量的(5 x 1011TU，静脉注射)RGD-4C AAVP-HSVtk或无靶点AAVP-HSVtk。图中所示为GCV处理前后的[18F]-FDG和[18F]-FEAU PET图像。T：肿瘤；H：心脏；BR：脑；BL：膀胱。附图显示较准标度。代表性肿瘤携带小鼠的PET图像和摄影图像用于简化说明[18F]-FDG和[18F]-FEAU的生物分布。图4C显示施用AAVP后单个移植瘤的生长曲线。图4D表示HSVtk基因表达的时间动态曲线，根据施用AAVP后不同天数的[18F]-FEAU PET图像制定。图4E表示用[18F]-FDG PET图像评估的GCV处理前后肿瘤活力的变化。
图5A-5G：图5A表示不同时间点肿瘤体积平均值±标准偏差(SD)。多组携带人移植瘤(衍生于KS1767细胞，大小约为50mm2)的免疫缺陷裸鼠被检测。裸鼠被全身施用单剂量(5 x 1010TU，静脉注射)的RGD-4C AAVP-HSVtk或对照物(无靶点的AAVP-HSVtk、RGD-4C AAVP-GFP或空载体)。从处理后第二天直到实验结束，向小鼠施用更昔洛韦(GCV，gancyclovir)。用RGD-4C AAVP-HSVtk处理后除了对照组不服用GCV外，所有小鼠都接受GCV处理。图5B表示不同时间点肿瘤体积平均值±标准偏差(SD)。多组携带人移植瘤(衍生于膀胱UC3癌细胞，大小约为50mm2)的免疫缺陷裸鼠被检测。裸鼠被全身施用单剂量(5 x 1010TU，静脉注射)的RGD-4C AAVP-HSVtk或对照物(无靶点的AAVP-HSVtk、RGD-4C AAVP-GFP或空载体)。从处理后第二天直到实验结束，向小鼠施用更昔洛韦(GCV，gancyclovir)。用RGD-4C AAVP-HSVtk处理后除了对照组不服用GCV外，所有小鼠都接受GCV处理。图5C表示不同时间点肿瘤体积平均值±标准偏差(SD)。多组携带人移植瘤(衍生于前列腺DU145癌细胞，大小约为50mm2)的免疫缺陷裸鼠被检测。裸鼠被全身施用单剂量(5 x 1010TU，静脉注射)的RGD-4C AAVP-HSVtk或对照物(无靶点的AAVP-HSVtk、RGD-4C AAVP-GFP或空载体)。从处理后第二天直到实验结束，向小鼠施用更昔洛韦(GCV，gancyclovir)。用RGD-4C AAVP-HSVtk处理后除了对照组不服用GCV外，所有小鼠都接受GCV处理。所示图为不同时间点肿瘤体积平均值±标准偏差(SD)。图5D表示全身施用单剂量(5 x 1010TU，静脉注射)的RGD-4C AAVP-HSVtk对大型DU145衍生移植瘤(约150mm2)的生长抑制。图5E表示向免疫活性BALB/c小鼠单剂量(5 x 1010TU)静脉注射RGD-4C AAVP-HSVtk对EF43-FGF4小鼠乳腺癌(大小匹配在大约50mm2)的生长抑制。图5F为RGD-4C AAVP-HSVtk和GCV的长期效应，通过向携带等基因EF43-FGF4肿瘤的免疫活性BALB/c小鼠重复施用AAVP(每次5 x 1010TU，静脉注射)而得。多组肿瘤携带小鼠(每组n＝10只小鼠)的独立实验所得治疗结果一致。箭头指示AAVP的施用时间。图5G显示用RGD-4C AAVP-HSVtk处理后针对噬菌体的体液免疫应答效应。先用RGD-4C AAVP-GFP向BALB/c免疫活性小鼠(每组n＝7只小鼠)全身给药三次(每星期1010TU，持续三星期，静脉注射)。而后将EF43-FGF4细胞移植入小鼠。肿瘤形成后(约50mm2)，将RGD-4CAAVP-HSVtk或无靶点AAVP-HSVtk单剂量全身施用于肿瘤携带小鼠，并持续施用GCV(起始于施用AAVP后的第二天)。在接种开始前后及接种末期AAVP施用前收集小鼠的血清样本，用ELISA确定体内循环的抗噬菌体IgG是否为高效价(可约为1:10,000)。尽管抗噬菌体抗体存在，预先接种并不影响病毒的抗肿瘤效应。
图6A-6B：图6A上层图为肿瘤携带小鼠，下层为从所有治疗组手术移除的相应肿瘤(BALB/c免疫活性小鼠的EF43-FGF4乳腺癌)。图6B为处理组EF43-FGF4肿瘤的组织病理分析。EF43-FGF4肿瘤回收后，切片并染色。高倍放大图源于系列肿瘤切片低倍放大图中插入框选定区域的高倍图像。其中左侧图片为无靶点AAVP-HSVtk处理的肿瘤、中间图片为外缘和肿瘤中心区之间区域、右侧图片为RGD-4C AAVP-HSVtk处理的肿瘤中心区域。图示包括肿瘤切片的苏木精-伊红染色(H&E，hematoxylin and eosin)、抗CD31免疫染色和TUNEL染色。箭头指示肿瘤血管和凋亡细胞。
图7：图7为图解说明RGD-4CAAVP的构建、克隆策略和所得载体的结构。
图8A-8C：图8A为RGD-4C AAVP-GFPneo或RGD-4C噬菌体-GFPneo转导的293细胞株的DNA Southern印记分析。从非转导的293母细胞或各稳定转导细胞株(每载体#1-9)中提得的总细胞DNA与StuI(载体DNA中无此限制性酶切位点)、Xba-I(载体DNA中只有一个此限制性酶切位点)或SacI-MluI一起孵育。用0.8％琼脂糖胶分离所得DNA片断、转到尼龙膜上并用标记的neo探针杂交。消化的载体质粒也用作对照。图8B显示用RGD-4C噬菌体-GFPneo或RGD-4C AAVPGFPneo稳定转导的293细胞株中，转基因盒串联体的PCR分析。用非转导的293母细胞作为阴性对照；图中也显示了其他阴性对照和100bp的分子量标记(Invitrogen)。用引物在转基因盒5’和3’端附近退火的巢式PCR鉴定RGD-4C AAVP和RGD-4C噬菌体相应DNA的串联体结构。箭头指示引物(H：头；T：尾)。用2％琼脂糖胶检测PCR扩增产物，串联载体DNA仅存在于AAVP转导的细胞株。图8C显示AAVP DNA不同串联形式的测序结果(大写字母表示转基因盒的3’端、斜体字母表示转基因盒的5’端)，结果显示出敲除ITRs后的头尾串联结构。
图9：图9显示小鼠静脉注入(5 x 1010TU)RGD-4C AAVP-GFP或无靶点AAVP-GFP的第七天，其对照器官：脑、肝、胰腺和肾中报道基因GFP表达的的免疫染色。
图10A-10B：图10A为肿瘤组织针对AAVP的免疫组化染色结果。向携带EF43-FGF4肿瘤的免疫活性BALB/c小鼠静脉注入RGD-4C AAVP(右侧图片)或无靶点的AAVP(中间图片)，让构建物在体内循环5分钟，而后如所述进行灌注和组织回收。用噬菌体的多克隆抗体染色。左侧图片显示用抗CD31抗体对肿瘤血管的染色。箭头标示肿瘤血管。图10B显示对携带EF43-FGF4肿瘤的小鼠静脉注射无靶点AAVP-GFP(左侧图片)或RGD-4C AAVP-GFP(中间图片)，1周后EF43-FGF4肿瘤中GFP表达的免疫荧光分析。右侧图片显示EF43-FGF4肿瘤中抗αv-整合素的免疫染色(右侧图片)。
图11：图11显示用无靶点AAVP-HSVtk、RGD-4C AAVP-HSVtk载体或空载体处理并用GCV维持的小鼠中，其对照器官：肝、心和肾的组织化学分析。这些器官的H&E染色未发现毒性组化信号。
图12A-12C：用RGD靶定的AAVP感染哺乳细胞，其细胞可表达功能基因产物。(图12A)用AAVP、表达TNF-α的无靶点噬菌体fdTNF-α(上层图片)和表达TNF-α的靶定噬菌体RGDTNF-α(下层图片)感染人黑色素瘤细胞M21，用fd特异性一抗检测，用FITC标记的二抗显色。(图12B)用PBS、无靶点空病毒(fd)、靶定空病毒(RGD)、表达TNF-α的无靶点噬菌体fdTNF-α和表达TNF-α的靶定噬菌体RGDTNF-α感染M21细胞。感染5天后，用ELISA检测培养液上清中TNF-α含量。图中也显示了感染12天后培养液上清的数据。(图12C)用多种物质感染M21细胞，如：PBS、fd(无靶点空病毒)、RGD(靶定空病毒)、fdTNF(无靶点TNF-α表达病毒)和RGDTNF(靶定TNF-α表达病毒)。收集感染第五天的M21细胞上清，用其处理人脐带静脉内皮细胞(HUVEC，human umbilical vein endothelial cell)并分析组织因子(TF，tissue factor)产物。用重组TNF-α作为阳性对照。为检测特异性，在用于HUVEC前，用TNF-α特异性抗体孵育RGDTNF感染的M21细胞上清。同时检测了感染后第23天上清中TF的分泌情况。
图13A-13H：AAVP特异性靶定肿瘤血管。用细菌噬菌体特异性抗体和CD31血管抗体对注入PBS或RGDTNF-α的人黑色素移植瘤进行染色。用Alexa Flour 488、Alexa Flour 594和DAPI来分别标记检测血管、AAVP和细胞核(250X)。注入PBS的动物在任何时间都不显示AAVP。从注入PBS 15分钟后的动物中获得的代表性肿瘤切片列于图13A。将表达RGDTNF-α的AAVP注射入动物后，仅15分钟就显示病毒颗粒和血管壁的共定位(图13B)，该共定位也显示在后续时间点：第一天(图13C)、第二天(图13D)、第三天(图13E)、第四天(图13F)、第八天(图13G)和第十天(图13H)。
图14A-14E：在正常肝组织中检测不到AAVP颗粒。肝样取自携带人黑色素瘤的动物，该动物被注入RGDTNF-α并用细菌噬菌体特异性抗体和CD31血管抗体染色。用Alexa Flour 488、Alexa Flour 594和DAPI来分别标记检测血管、AAVP和细胞核(250X)。将表达RGDTNF-α的AAVP注射入动物后，其肝组织在第一天就可见一些病毒颗粒染色(图14A)。然而，第二天其染色的病毒就减少到最小水平(图14B)，在第三天(图14C)、第八天(图14D)和第十天(图14E)未见病毒染色。所有肝组织在不同的时间点都显示出很好的血管染色。
图15A-15E：在正常肾组织中检测不到AAVP颗粒。肾样取自携带人黑色素瘤的动物，该动物被注入RGDTNF-α并用细菌噬菌体特异性抗体和CD31血管抗体染色。用Alexa Flour 488、Alexa Flour 594和DAPI来分别标记检测血管、AAVP和细胞核(250X)。检测的任何时间点在肾样里都观测不到AAVP，图示为第一天(图15A)、第二天(图15B)、第三天(图15C)、第八天(图15D)和第十天(图15E)。然而，所有肾组织在不同的时间点都显示出很好的血管染色。
图16：AAVP在体内表达特异性基因产物。携带人黑色素移植瘤并被注入PBS或RGDTNF-α的动物，其冷冻切片被用来提取总蛋白。用ELI SA检测50μg总蛋白中TNF-α的蛋白水平两次。在所有检测的组织中都可见内源TNF-α的本底表达水平。在任一检测时间点，注入PBS的动物都没有高于内源水平的表达。而注入RGDTNF-α AAVP的小鼠在第四天可见TNF-α的表达，而后表达水平逐步升高至直第十天。
图17A-17B：AAVP在血管中表达TNF-α并诱导体内细胞凋亡。(图17A)用TNF-α特异性抗体对冷冻切片染色进行免疫组化分析，该切片来自于携带人黑色素移植瘤并被注入RGDTNF-α AAVP的动物。TNF-α染色可见于环绕血管的棕色染色(左侧图片，100X；右侧图片，400X)。(图17B)染色冷冻切片用于检测凋亡细胞，该切片来自于携带人黑色素移植瘤并被注入RGDTNF-α AAVP的动物。用TACS蓝色标记染色血管及周围凋亡的肿瘤细胞，此类细胞显示为蓝色(左侧图片，200X)。样本用核固红(nuclear fast red)复染。右侧图片显示用CD31特异性抗体染色的血管(200X)。
图18A-18B：用AAVP处理TNF-α敏感性人黑色素瘤M21(图18A)和TNF-α抗性人黑色素瘤Pmel(图18B)。对皮下植入M21/Pmel肿瘤的裸鼠尾静脉注射AAVP，在不同时间点测量肿瘤体积。对处理后不同天数的肿瘤体积作图。(图18A)用RGDTNF-α处理的动物肿瘤体积在第二十天明显减小，具有统计学意义(p<0.05)。(图18B)用AAVP传送EMAP-II并用重组TNF-α处理可使TNF-α抗性人黑色素瘤对TNF-α疗法敏感。用rTNF-α或靶定表达EMAP-II的AAVP(RGDEMAP-II)单独处理小鼠，该小鼠与PBS或fdEMAP-II组相比仅显示微弱的效果，但无显著性差异。用RGD-EMAP-II病毒和rTNF-α联合处理的小鼠显示出肿瘤体积的明显减小(p＝0.007)。
图19A-19B：用CRTIGPSVC(SEQ ID NO：1)AAVP-Luc U87体外转导人胶质瘤细胞，人源胶质瘤细胞以每孔40,000细胞的浓度接种于24孔板，37℃培养过夜。第二天，根据Nature Method氏流程，用AAVP培育细胞。用RGD-4C AAVP GFP和RGD-4C AAVP Luc作为转导效率的阳性对照。在第七天成像。噬菌体摄入较低，但当细胞用AAVP铁凝胶(Iron AAVP hydrogel)培育时，噬菌体摄入明显增高(最后一个平板及柱图)。
本公开适于各种改良和替换形式，在附图中显示了特定的实施例并在文中对其进行了更为详细的介绍。然而，应当理解描述特定的实施例的用意并不是将本发明局限于公开的特定形式。相反，本公开涵盖所有变更及通过权利要求书中而附加的其局部等同形式。
发明详述
本公开，根据特定的实施方案，通常针对以位点特异性方式运输一种或多种转基因到靶细胞来增强表达的组合物和方法，所述靶细胞例如肿瘤细胞，以及针对用于该用途的组分和组合物。在某些方面，在对受试者进行治疗或诊断程序之前，可以对治疗性核酸的表达进行估定。在进一步的方面，对在需要治疗收益的区域或位置中的表达进行测定或估定，并且可以停止任何非必须的或边际收益疗法，来代替替代疗法。
不受任何特定理论或机制所约束的，本公开基于如下观察：当一个以上的多重转基因被整合到基因组中时，转基因表达有可能增加。让人特别感兴趣的是嵌合AAVP颗粒向细胞转导一个拷贝以上的转基因(通常以串联体形式)的能力。还可以通过嵌合AAVP颗粒所携带的报告基因的表达来监测转导细胞。在本公开中可以包括任何转基因，并可以从AAVP颗粒中表达。
I.腺伴随病毒/噬菌体(AAVP)颗粒
腺伴随病毒(AAV)是细小病毒家族中的有缺陷成员。AAV基因组被包装为带有正或负极性的单链DNA分子。两种极性的链都被包装，但被包装到不同的病毒颗粒中，并且两种链都具有感染性。2型人腺伴随病毒(AAV2)的单链DNA基因组长为4681个碱基，侧面为反向末端重复序列(ITRs)，每个长为145个碱基对。此外，病毒rep蛋白好像通过ITRs介导了非同源重组。相应的，因为微小病毒的基因组的每个末端都具有ITRs，所述ITRs在重组中扮演一定角色的，并且通常是微小病毒复制和包装所需要的，本公开的AAVP通常含有至少一个ITR或其功能等同物的所有或一部分。
可以容易地获得AAV，并且已经在，例如，Muzyczka，1992；美国专利4,797,368，和PCT公开号WO 91/18088中描述了AAV用作载体用于基因的运输。在一些发表物中描述了AAV载体的构建，包括Lebkowski等人，1988；Tratschin等人，1985；Hermonat和Muzyczka，1984。
本公开提供了在细菌中产生的腺伴随病毒的(AAV)噬菌体载体(例如AAV-M13载体)(AAVPs)，和通过向细胞中引入AAVP，在靶细胞中表达转基因的方法，所述靶细胞例如肿瘤细胞。经纯化后，用靶向的含有噬菌体序列和带有转基因盒的AAV序列的噬菌体颗粒转染哺乳动物细胞。载体内化到哺乳动物细胞中后，转基因被整合到靶细胞的基因组中。此处所用的术语“载体”被定义为用于将感兴趣的核酸运输到细胞中的核酸载体。载体可以是线性分子或环形分子。
将AAVP和噬菌体与AAV载体系统的选择元件相结合，得到一种容易在细菌中生产、没有包装限制的载体，并能感染哺乳动物细胞并整合到宿主染色体中。可以购买到含有许多合适元件的载体，并且可以采用标准方法进一步修饰所述载体来引入必要序列。至少，使用本公开的方法时，载体必须接受含有启动子和转基因的盒。本公开的AAVP载体能够通过整合到靶细胞基因组中来增强转基因表达。在某些实施方案中，转基因可以以串联体被整合到靶细胞基因组中。
在其它方面，AAVP不需要辅助病毒或反式作用因子。此外，因为没有形成AAV衣壳，所以AAV对于哺乳动物细胞的天然趋向性也被去除了。
A.AAVP靶向
本公开的AAVP可以通过在噬菌体颗粒表面表达配体来靶向特定受体。在某些实施方案中，可以整合能够允许或促进载体(以及附着其上或包裹于其中的任何分子)从内涵体中逃脱的肽或其它组分，并在噬菌体表面表达。所述“其它组分”包括本身不是肽但是具有破坏内涵体膜的能力的分子，因此促进载体的逃脱，还包括在其它方面模拟所述肽序列(参见，例如，已发表的PCT公布号WO 96/10038和Wagner等人，1992)的内体逃脱特性的分子。
本公开的AAVP通常包括在颗粒表面表达一种或多种预先选定的配基(无论配基以何种方式附着)的丝状噬菌体。因此，无论配基的附着方式是共价方式还是通过衣壳蛋白，本公开的AAVP都能够通过配基结合受体随后通过载体的内摄，将一种或多种转基因运输到靶细胞中。例如，在颗粒表面表达的配基可以是二环的CDCRGDCFC(RGD-4C)(SEQ ID NO：2)肽，该肽选择性结合αvβ3和αvβ5整联蛋白。这些整联蛋白在侵袭肿瘤内皮细胞细胞上高度过表达。如此处所用，“丝状噬菌体颗粒”指的是含有噬菌体基因组或嗜菌粒基因组的颗粒。该颗粒可以含有除了丝状衣壳蛋白以外的其它分子。如此处所用，“配基”指的是能够结合细胞表面分子并内在化的任意肽、多肽、蛋白或非蛋白，所述非蛋白例如素拟肽。如此处所用，“结合到受体上”指的是以标准的体外或体内检测方法检测，配基特异性地识别并可检测的结合到受体上的能力。
典型的，本公开的AAVP包含了编码靶向肽的、插入在噬菌体质粒基因组中的寡核苷酸，该肽使载体具有了配基-受体靶向特性。
可以通过将衣壳蛋白多核苷酸或该多核酸编码的蛋白质的整个部分或一部分偶联或融合到靶向配基上来修饰噬菌体衣壳蛋白。所述靶向配基可以直接的、间接的、靶向或增强本发明的AAVP结合到特定的细胞、组织和/或器官。
最初创建靶向的病毒是为了解决基因治疗载体的天然宿主细胞趋向性问题。近年来，已经通过了许多基因治疗专利，其中含有用于使载体靶向到特定细胞的异源多肽的载体，例如含有嵌合融合糖蛋白的载体(Kayman等人，美国专利5,643,756，此处引用作为参考)和含有针对病毒衣壳蛋白的抗体的载体(Cotten等人，美国专利5,693,509)。可以以这样的方式对本发明的AAVP进行遗传修饰，使其靶向特定的细胞类型(例如，平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞、成纤维细胞、角质化细胞、干细胞、间质干细胞、骨髓细胞、软骨细胞、上皮细胞、肠细胞、肿瘤或癌细胞和领域已知的其它细胞)，因此核酸基因组被运输到非分裂目标细胞、正在分裂的目标细胞、或具有增殖或其它疾病的目标细胞。使病毒靶向的一种方法是通过优先结合到在细胞外表面具有某种分子的细胞上来指引病毒到达目标细胞。这种使病毒靶向的方法通过使靶向配基在病毒衣壳上表达或掺入到病毒衣壳，来协助病毒靶向到具有受体或结合分子的细胞或组织上，所述受体或结合分子能和病毒表面上的靶向配基相互作用。在病毒感染细胞之后，遗传物质得到处理，并在宿主细胞中表达。遗传物质有可能被整合到宿主细胞的基因组中，或者游离地保存于宿主细胞中。
在本发明的某些实施方案中，可以对衣壳蛋白进行修饰使其包含靶向组分，这样AAVP就可以被运输到特定的细胞类型或组织中。基于配基的运输系统的靶向特异性根源于配基受体在不同细胞类型中的分布。靶向配基可以非共价的或共价的结合到衣壳蛋白上。
在某些实施方案中，感兴趣的异源核酸序列可以被插入到本发明的病毒载体中。例如，可以将衣壳蛋白有效地偶联到针对特定目标细胞上的受体的配基上。
靶向配基是特异性针对目标区域特征组分的任意配基。优选的靶向配基包括蛋白质，例如多克隆或单克隆抗体、抗体片段、或嵌合抗体、酶、肽或激素、或糖例如单-、寡-和多糖。在本发明的某些实施方案中，设想了靶向配基和整联蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白、受体或转运蛋白的相互作用。合适的配基包括对于目标器官中的细胞、或对于由于局部病理而暴露于循环中的目标器官结构具有特异性或选择性的任意配基。
在本发明的某些实施方案中，为了增强抗性细胞的转导、增强靶细胞的转导、或者限制非所需细胞的转导，可以将抗体或环肽靶向组分(配基)连到AAVP上。在特定的实施例中，抗体靶向组分是单克隆抗-EGF受体抗体。EGF受体分布在多种器官的细胞表面上，并且出现于灼伤、创伤、真皮和肿瘤中。肽靶向组分还可以是其序列中含有RGD整联蛋白结合基序的环肽。和细胞表面上的整联蛋白相结合的配基例如RGD肽可以介导内化，因此增强靶向复合物的运输效率。所述靶向肽可以包括RGDFV(SEQ ID NO：3)序列，其中所述肽包括RGD序列，其中肽长度为3到30个氨基酸。在其它实施方案中，RGD整联蛋白结合基序的长度为3到20个氨基酸，或4到10个氨基酸。在本发明的特定的实施方案中，RGD整联蛋白结合基序是长度为5个氨基酸的肽。虽然优选在其序列中含有RGD整联蛋白结合基序的环肽，但是在本发明中也可以使用线性肽。20060239968使用靶向肽用于人癌症的诊断和治疗的方法和组合物：美国专利公布号20060094672、20050191294、20050187161、20050074812、20050074747、20050037417、20050003466、20040170955、20040131623、20040096441、20040071689、20040048243、20030152578、20030113320、和20010046498、以及PCT公开WO 2006/060171、WO 2006/010070、WO2005/065418、WO 2005/026195、WO 2004/020999、WO 2003/022991、WO 2002/020822、WO 2002/020769、WO 2002/020723、和WO2002/020722，描述了多种鉴定靶向配基的组合物和方法，在此处全部整体引用作为参考。
如此处所用，“配基”指的是能够结合细胞表面分子并内化的任意肽、多肽、蛋白质或非蛋白质，例如素拟肽。如此处所用，“结合到受体上”指的是配基特异性识别受体、并且以标准的体外或体内检测方法进行检测可以检测出的结合受体的能力。
在本发明的上下文中，所述配基被偶联到噬菌体蛋白(例如，衣壳蛋白)上(或者以融合蛋白或者通过化学结合)，并用于将核酸运输到细胞中。在本发明中可以使用配基片段，只需要该片段保留有结合到合适的细胞表面分子的能力。同样，也可以使用带有置换或其它改变、但是保留有结合能力的配基。并且，特定的配基也适用于具有天然配基氨基酸序列的、以及修饰序列(例如，和天然蛋白相比发生了氨基酸置换、删除、插入或增加(突变蛋白))的多肽，只要该配基保留有结合位于内皮细胞上的它的受体、并将核酸运输到细胞中的能力。
配基还包括具有和细胞表达的其受体相结合并内化的能力的突变蛋白。这种突变蛋白包括，但不限于，用丝氨酸置换一个或多个半胱氨酸所得到的蛋白。典型的，这种突变蛋白将具有保守的氨基酸改变。在至少是低严紧性条件下，编码这种突变蛋白的DNA将，除非通过简并密码子置换进行修饰，和编码野生型配基的天然DNA序列杂交。
可以根据已知的氨基酸或DNA序列，合成制备编码配基的DNA，使用本领域技术人员已知的方法分离(例如，PCR扩增)，或者从市场中或其它来源来获得。通过简并密码子置换或通过编码不同的氨基酸，编码配基的DNA可以和上面的序列不同。氨基酸序列的差异是可忍受的，例如在不同物种的同源配基中、以及在个别有机体或物种中所发生的差异，只要所述配基结合其受体。可以从天然来源中分离配基，或者合成制备配基，例如通过重组体方法或化学合成。
在本发明上下文中使用的配基不必保留其任何体内活性，只有结合细胞上的受体并被内化除外。如果已经修饰该配基来去除一种或多种生物活性，结合并内化仍应容易地检出，例如，采用下述检测或本领域已知的其它检测。通常，这些检测包括标记配基、使其和靶细胞孵育、以及显影或检测细胞内标记。例如，简而言之，可以用FITC荧光标记配基或用125I放射性标记配基，使其和细胞孵育，并用荧光显微镜或共聚焦显微镜显微检测内化情况。
可以通过重组体或其它方法制备配基，使其联接到噬菌体衣壳蛋白上。DNA序列以及获得这些配基的序列的方法是熟知的。根据DNA序列，可以通过合成(对于小蛋白)、从细胞基因组或cDNA中扩增、从基因组或cDNA文库中分离等方法合成所述基因。可以掺入用于帮助克隆进入噬菌体或嗜菌粒载体的限制性位点，例如在扩增引物中。
这种分子包括，非限定，结合癌细胞、内皮细胞、基质细胞等的蛋白质。这种配基包括生长因子和细胞因子。许多生长因子和生长因子家族享有相同的结构和功能特征，并且可用于本发明中。生长因子家族包括成纤维细胞生长因子FGF-1到FGF-15，和血管内皮生长因子(VEGF)。其它生长因子，例如PDGF(血小板衍生的生长因子)、TGF-α(转化生长因子)、TGF-β、HB-EGF、血管紧缩素、蛙皮素、erythopoietin、干细胞因子、M-CSF、G-CSF、GM-CSF、和endoglin也和细胞表面上的特异性鉴别的受体相结合，并且可以用于本发明中。细胞因子，包括白细胞介素、CSFs(集落刺激因子)、和干扰素，具有特异性受体，并且可以如此处所述进行使用。
例如，配基和配基/受体对包括尿激酶/尿激酶受体(GenBank登记号s.X02760/X74309)；α-1，3岩藻糖转移酶、α1-抗胰蛋白酶/E-选择蛋白(GenBank登记号M98825，D38257/M87862)；P-选择蛋白糖蛋白配基、P-选择蛋白配基/P-选择蛋白(GenBank登记号U25955，U02297/L23088)，VCAM1/VLA-4(GenBank登记号X53051/X16983)；E9抗原(Blann等人，Atherosclerosis 120：221，1996)/TGFβ受体；纤维结合蛋白(GenBank登记号.X02761)；I型α1-胶原(GenBank登记号.Z74615)，I型β2-胶原(GenBank登记号.Z74616)、透明质酸/CD44(GenBank登记号.M59040)；CD40配基(GenBank登记号.L07414)/CD40(GenBank登记号.M83312)；EFL-3、对于elk-1(GenBank登记号.M25269)的LERTK-2配基(GenBank登记号L37361，U09304)；VE-钙粘蛋白(GenBank登记号.X79981)；对于链蛋白的配基；对于LFA-1的ICAM-3(GenBank登记号.X69819)配基、和血管假性血友病因子(GenBank登记号.X04385)、对于αvβ3整联蛋白(GenBank登记号.U07375，L28832)的纤维蛋白原和纤维结合蛋白(GenBank登记号.X92461)配基。
其它配基包括CSF-1(GenBank登记号.M11038，M37435)；GM-CSF(GenBank登记号.X03021)；IFN-α(干扰素)(GenBank登记号.A02076；WO 8502862-A)；IFN-γ(GenBank登记号.A02137；WO8502624-A)；IL-1-β(白细胞介素1α)(GenBank登记号.X02531，M15329)；IL-1-β(白细胞介素1β)(GenBank登记号.X02532，M15330，M15840)；IL-1(GenBank登记号.K02770，M54933，M38756)；IL-2(GenBank登记号.A14844，A21785，X00695，X00200，X00201，X00202)；IL-3(GenBank登记号.M14743，M20137)；IL-4(GenBank登记号.M13982)；IL-5(GenBank登记号.X04688，J03478)；IL-6(GenBank登记号.Y00081，X04602，M54894，M38669，M14584)；IL-7(GenBank登记号.J04156)；IL-8(GenBank登记号.Z11686)；IL-10(GenBank登记号.X78437，M57627)；IL-11(GenBank登记号.M57765M37006)；IL-13(GenBank登记号.X69079，U10307)；TNF-α(肿瘤坏死因子)(GenBank登记号.A21522)；TNF-β(GenBank登记号.D12614)；对于erbB2的GP30配基(S68256)；和对于转铁蛋白受体的转铁蛋白(GenBank登记号.DQ923758)。
其它配基还包括PDGF(GenBank登记号.X03795，X02811)，血管紧缩素(GenBank登记号.K02215)，以及所有含RGD的肽和蛋白，例如和整联蛋白受体结合的ICAM-1(GenBank登记号.X06990)和VCAM-1(GenBank登记号.X53051)。其它配基包括TNFα(GenBank登记号.A21522，X01394)，IFN-γ(GenBank登记号.A11033，A11034)，IGF-I(GenBank登记号.A29117，X56773，S61841，X56774，S61860)，IGF-II(GenBank登记号.A00738，X06159，Y00693)，心房钠尿肽(GenBank登记号.X54669)，内皮缩血管肽-1(GenBank登记号.Y00749)，凝血因子Xa(GenBank登记号.L00395，L00396，L29433，N00045，M14327)，TGF-β1(GenBank登记号.A23751)，IL-1β(GenBank登记号.X03833)，IL-1β(GenBank登记号.M15330)，和内皮因子(GenBank登记号.X72012)。
目前，FGF蛋白家族包括FGF-1(酸性FGF或aFGF)，FGF-2(碱性FGF或bFGF)，FGF-3(int-2)，FGF-4(hst-1/K-FGF)，FGF-5，FGF-6(hst-2)，FGF-7(角质化细胞生长因子或KGF)，FGF-8，FGF-9，FGF-11(WO 96/39507)，FGF-13(WO 96/39508)，FGF-14(WO 96/39506)，和FGF-15(WO 96/39509)。在本发明中如下的其它多肽也是合适的，所述多肽和FGF受体反应，是能够特异性地和FGF受体(优选高亲和力FGF受体)相互作用的任意多肽，并由于其和FGF受体相互作用而通过内颗粒途径运输到细胞中。配基还包括此处鉴定的配基的4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30或更多的氨基酸片段。
还设想了靶向部分是抗体及其片段。可以使用单克隆抗体片段来靶向运输到哺乳动物中的特定器官，包括脑、心脏、肺或肝。使病毒颗粒靶向到缺乏单独的细胞特异性标记的细胞的示例性方法已经被描述(美国专利5,849,718)。例如，抗体A可以对肿瘤有特异性，但是对正常心脏和肺组织也有，而抗体B对肿瘤和正常肝细胞有特异性。显然，单独使用抗体A或抗体B来向肿瘤运输抗增殖核酸将有可能导致对心脏和肺或者肝细胞带来不想要的损伤。但是，可以一起使用抗体A和抗体B来增强细胞靶向。因此，将抗体A偶联到编码抗增殖核酸的基因上，并通过受体介导的摄取系统运输到肿瘤以及心脏和肺组织中。但是，该基因在这些细胞中未转录或激活。可以将抗体B偶联到激活子或编码对于抗增殖核酸的转录或激活所需要的因子的核酸的普通活化基因上，并运输到肿瘤和肝细胞中。因此，在心脏和肺细胞中，只有未激活的抗增殖核酸被运输，而其未被转录，导致不产生副作用。在肝细胞中，编码激活因子的基因得到运输，但是没有效果，因为不存在抗增殖核酸基因。但是在肿瘤细胞中，两种基因都被运输，而激活因子可以激活抗增殖核酸，导致肿瘤特异性的毒性作用。
在本发明的上下文中，针对在细胞表面表达的分子的抗体是有用的。这种抗体包括，但不限于，针对FGF受体、VEGF受体、尿激酶受体、E-和P-select ins、VCAM-1、PDGF受体、TGF受体、内皮唾(液)酸蛋白、αvβ3整联蛋白、LFA-1、E9抗原、CD40、钙粘着糖蛋白、和elk-1的抗体。可以以单克隆或多克隆抗血清形式容易地制备特异性针对细胞表达的细胞表面分子的抗体。目前已有许多这种抗体(例如，从美国马里兰州Rockville的美国标准培养收集所)。此外，还可以使用针对结合/内化配基的抗体。在此策略中，噬菌体颗粒将在其表面具有抗体，于是和配基形成复合物。
可以使用其它许多配基用于AAVP制剂的靶向步骤，依赖于AAVP运输的靶向位置。在某些实施方案中，设想了通过受体介导的胞吞作用使AAVP靶向到特定的细胞类型中。例如，乳糖基酰基鞘氨醇，和靶向LDL受体相关蛋白的肽，例如已经使用载脂蛋白E3(＂Apo E＂)使脂质体靶向到肝中(Spanjer和Scherphof，1983；WO 98/0748)。还证明，含有末端半乳糖残基的脱唾液酸糖蛋白、无涎胎球蛋白(asialofetuin)可以使脂质体靶向到肝中(Spanjer和Scherphof，1983；Hara等人，1995)。当将糖：类甘露糖基(mannosyl)、岩藻糖基(fucosyl)或N-乙酰葡糖胺偶联到多肽骨架上时，和高亲和力甘露糖受体结合(美国专利5,432,260，此处特别整体引用作为参考)。因此，可以将这些糖蛋白结合到本发明的AAVP上，设想用于靶向特定细胞(例如，巨噬细胞)。
叶酸盐和叶酸盐受体也被描述能用于细胞靶向(美国专利5,871,727)。在该范例中，维生素叶酸盐被偶联到AAVP衣壳蛋白上。所述叶酸盐受体对其配基具有高亲和力，并且在数种恶性细胞系表面高表达，包括肺肿瘤、乳房肿瘤和脑肿瘤。转铁蛋白介导的运输系统靶向范围广泛的、正在复制的、表达转铁蛋白受体的细胞(Gilliland等人，1980)。
加入靶向配基用于基因运输来治疗过度增殖疾病能够运输其基因产物的毒性大于非靶向系统的基因。可以运输的毒性更大的基因的例子包括前凋亡基因，例如来自病毒和其它病原体例如腺病毒E4或f4的Bax和Bak加基因，以及大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶，一种所谓的“自杀基因”，该基因将前药6-甲基嘌呤脱氧核糖核苷转化为有毒的嘌呤6-甲基嘌呤。前药治疗使用的自杀基因的其它例子为大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因和HSV胸苷激酶基因。
在某些方面，AAVP可用于靶向肿瘤脉管系统。肿瘤内皮是癌症治疗中重要的靶点。将感兴趣的治疗性基因靶向于肿瘤内皮，而对其它组织毒性极小，仍然是抗血管基因疗法的主要目标。最近，已经描述了靶向肿瘤内皮的AAVP。发明者研究了这种载体将潜在的抗血管试剂人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)运输到黑素瘤中的能力。通过AAVP运输内皮单核细胞激活多肽-II(EMAP-II)，使TNF-α抗性黑素瘤对TNF-α治疗敏感。
在体外和体内对携带有两种基因(TNF-α和EMAP-II)的AAVP载体进行了评价。利用人黑素瘤细胞(M21)研究了AAVP内化和TNF-α基因在体外的表达。通过尾静脉注射，对M21/Pmel皮下生长肿瘤的裸鼠进行系统性治疗。使用免疫荧光染色、TaqMan RT-PCR和免疫组织化学分析对靶向肿瘤脉管系统的AAVP的定位、TNF-α基因表达和凋亡进行了检测。
在M21细胞中观察到了靶向AAVP的内化，导致TNF-α在培养基上清中功能活性的高水平。在这些细胞中未观察到非靶向载体的内化。系统注射AAVP显示出肿瘤靶向的病毒运输，并且只要极少的病毒定位到正常器官中。AAVP运输导致TNF-α基因产物的表达。TNF-α的表达，诱导了血管和周围肿瘤细胞的凋亡，导致肿瘤明显消退。此外，表达EMAP-II的AAVP的靶向运输使TNF-α抗性人黑素瘤对TNF-α治疗敏感。靶向AAVP载体可用于将抗血管试剂特异性地运输到肿瘤脉管系统中，因此降低系统毒性。
可以通过结合特定的靶向配基，将本发明的AAVP靶向到躯体的特定区域，从而在指定组织中提供AAVP以及相对应的核酸分子的快速积累和浓度。可以通过多种方法将设想中的本发明所使用配基连接到AAVP上。在本领域中已知多种将靶向配基偶联到衣壳蛋白的组合物和方法。
II.核酸
本公开的AAVP具有将一种或多种转基因运输到靶细胞核中的能力，因此增强转基因在靶细胞中的表达。AAVP还可以通过形成转基因盒串联体，改变转基因盒的命运的方式，来增强基因表达，从而在基因表达中具有优势。
如此处所用，术语“转基因(transgene)”指的是从一种有机体转移另一种中的基因或遗传物质。转基因可以包括一个或多个基因和/或一个或多个寡核苷酸。例如，转基因可以包括受体基因、自杀基因、前药转化酶、和/或一个或多个治疗性基因。如此处所用，“寡核苷酸”指的是具有20或更少碱基对的短的核酸序列。如此处所用，术语“治疗性基因”的定义是，为疾病、医疗条件、器官、组织、细胞或有机体生理特征提供治疗效果的一种核酸区域。如此处所用，术语“盒”是一种能够表达感兴趣的蛋白质、多肽或RNA的核酸。
除了配基以外，AAVP可以包含含有报告基因的转基因，所述报告基因的产物能被选择或检测。如此处所述，“报告基因”是一种编码能被检测的产物的核酸区域，例如通过荧光、对可检测的标记的化合物或生色底物或荧光底物的酶活性、等等进行检测；或者用于通过生长条件进行选择的核酸区域。这种报告基因包括，非限定，绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤光素酶，新霉素磷酸转移酶、分泌型碱性磷酸酶(SEAP)、人生长激素(HGH)，胸苷激酶等等。在某些实施方案中，可以使用编码能在血液、其它体液或组织中检测的分泌蛋白的报告基因，来检测报告基因的表达水平。
在报告基因以外，转基因还可以包括治疗性基因。携带这种转基因的AAVP可以对受试对象(例如，人类)进行体外或体内成像(以及其它事情)。在体外成像中，可以用于整个受试者的非侵入成像或受试者靶区域的成像。在引入这些转基因后，可以使用本领域已知的成像技术(例如，BLI成像、PET成像、应该成像等等)对表达进行成像。如此处所用，“受试者”指的是任意哺乳动物实体，例如，受试者可以是需要基因治疗或其它治疗的人体。
在其它实施方案中，AAVP可以包含自杀基因。如此处所用，术语“自杀基因”被定义为通过给予前药，影响基因产物转变为杀死其宿主细胞的化合物的一种核酸。可以使用自杀基因/前药组合的例子为单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)和更昔洛韦(ganciclovir)、阿昔洛韦(acyclovir)或FIAU；氧化还原酶和氧化还原酶；胞嘧啶脱氨酶和5-氟胞嘧啶；胸苷激酶胸苷酰胺激酶(Tdk::Tmk)和AZT；以及脱氧胞苷激酶和胞嘧啶阿糖核苷。在某些实施方案中，自杀基因杀死其宿主细胞，因此为疾病或医疗条件提供了治疗效果，所以可以以治疗基因方式发挥作用。
术语“核酸”是本领域所熟知的。如此处所用，“核酸”通常指的是DNA、RNA或其衍生物或类似物分子，包括核碱基(核碱基)。核碱基包括，例如，在DNA中发现的天然产生的嘌呤或嘧啶碱基(例如，腺嘌呤＂A＂，鸟嘌呤＂G＂，胸腺嘧啶＂T＂或胞嘧啶＂C＂)或RNA(例如，A，G，尿嘧啶＂U＂或”C”)。术语“核酸”包括了术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”，后两者都是术语“核酸”的亚属。术语“寡核苷酸”指的是长度介于大约8和大约100个核碱基之间的分子。术语“多核苷酸”指的是长度至少大于100个核碱基的分子。
在此处的某些实施方案中，“基因”指的是转录的核酸。在某些方面，基因包括涉及到转录、或信息产物或组合物的调控序列。本领域技术人员将能理解，这个有用的术语“基因”包括基因组序列、RNA或cDNA序列或较小的工程设计的核酸片段，包括基因的非转录部分核酸片段，包括但不限于基因的非转录的启动子或增强子区域。采用核酸操作技术，较小的工程设计的基因核酸片段可以表达，或可以适合表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白、突变体和/或等等。
本发明的多核苷酸可以形成“表达盒”。“表达盒”是提供用于表达特定转录单位的多核苷酸。即它包括了启动子元件和其它多种在基因或转录单位转录中发挥作用的元件。表达盒还可以是更大的复制多核苷酸或表达载体或构造的部分。
这些定义通常指的是单链分子，但是在特定的实施方案中也包括额外的、和所述单链分子局部、大体上的或完全互补的一条链。因此，核酸可以包括包含一条或多条互补链的双链分子，或特定序列的“互补体”，包括一个分子。
“和其它编码序列实质性地分离”的意思是，感兴趣的基因形成了核酸编码区的重要部分，或者指的是该核酸不含有天然产生的编码核酸的大部分，例如大的染色体片段、其它功能基因、RNA或cDNA编码区域。当然，这指的是最初分离的核酸，并且不排除后来通过人工加入到核酸中的基因或编码区域。
如此处所用，＂核碱基＂指的是杂环碱基，例如在至少一种天然产生的核酸(即，DNA和RNA)中发现的天然产生的核碱基(即，A，T，G，C或U)，以及这种核碱基的天然或非天然产生的衍生物和模拟物。核碱基通常能够以替代天然产生的核碱基配对(例如，A和T、G和C、以及A和U之间的氢键)的方式，和至少一个天然产生的核碱基形成一个或多个氢键(“退火”或“杂交”)。
如此处所用，“核苷”指的是进一步包含“骨架部分”的核苷。骨架部分通常将一个核苷共价地附加到另一个包含核苷的分子上，或者附加到另一个核苷上，来形成一个核酸。在天然产生的核苷中，“骨架部分”典型地包含磷部分，所述磷部分被共价附加到5-碳糖上。“骨架部分”的附加典型地发生在5-碳糖的3′-或5′-位置上。但是，在本领域中已经其它类型的附加，特别是当核苷包含天然产生的5-碳糖或磷部分的衍生物或模拟物的时候。
A.表达结构体
本发明的表达结构体可包括编码治疗性核酸和/或成像蛋白的核酸。在其它方面，所述表达结构体可以是可用于治疗组合物和本发明的方法中的治疗性表达结构体。在特定的实施方案中，可以操作遗传物质来产生编码成像蛋白、靶向蛋白和/或治疗性基因的表达盒和/或表达结构体。
本发明的实施方案可包括两种单独类型的表达盒或包含表达盒的表达结构体。一个盒用于表达成像蛋白，即，可直接检测的蛋白质或具有间接检测活性特征的蛋白。另一个表达盒可以编码治疗性基因。在治疗载体背景下，治疗性基因可以是此处讨论的用于疾病条件的预防或治疗疗法的治疗性基因。在基因治疗背景下，所述基因可以是异源DNA，意味着包括了来自于病毒基因组以外来源的DNA，所述病毒基因组提供了载体的骨架。该基因可来自于原核或真核来源，例如细菌、病毒、酵母、寄生虫、植物或甚至动物。异源DNA还可来自于一个来源以上，即，多基因结构或融合蛋白。所述异源DNA还可以包括可能来自于一个来源的调控序列和
B.控制区
本发明的表达盒和/或结构，无论其编码成像蛋白或治疗性基因，将典型的包含多种控制区。这些调控区典型地控制感兴趣基因的表达。
1.启动子
在整个申请中，术语“表达结构体”意味着包括任意类型的含有编码基因产物的核酸的遗传结构，其中部分或整个的所述核酸编码序列能被转录，即，整个的或部分的成像蛋白或治疗性蛋白。所述转录本可被翻译为蛋白质，但是不需要。在某些实施方案中，表达包括基因转录和mRNA翻译为基因产物。在其它实施方案中，表达只包括治疗性核酸的转录，例如抑制性RNA或DNA。
编码基因产物的核酸受启动子的转录调控。“启动子”指的是被细胞机器、或引入的机器所识别的DNA序列，是起始基因特异性转录所需要的。在特定的方面，转录可以是组成型的、可诱导的、和/或可抑制的。短语“受转录调控”意味着相对于该核酸，该启动子位于正确的位置并且定向正确，来调控RNA聚合酶的启动以及基因的表达。
在此处将使用术语启动子来表述集簇在RNA聚合酶II起始位点周围的一组转录调控模块。通过分析数种病毒启动子，包括对多种逆转录启动子、HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单元的分析，人们对启动子是如何组织的进行很多研究。
另外，启动子元件调控转录起始的频率。典型的，它们位于起始位点上游30-110bp区域，但是最近发现一些启动子在起始位点下游也含有功能元件。启动子元件的间距经常是可变的，因此当元件互相倒置或移动时启动子功能仍能保持。依赖于所述启动子，元件可以或者以合作方式或者单独发挥功能，来激活转录。
用于调控感兴趣的核酸序列表达的特定的启动子被认为是不重要的，只要它能指导核酸在靶细胞中的表达就可以。因此，在靶向的人细胞中，优选将核酸编码区域定位于能够在靶向人细胞中得到表达的启动子旁边并受其调控。总之，这种启动子有可能包括人、病毒启动子或其组合。
在几个实施方案中，可以使用人巨细胞包含体病毒即刻早期基因启动子(CMVIE)、SV40早期启动子、Rous肉瘤病毒长末端重复序列、β-肌动蛋白、大鼠胰岛素启动子和3-磷酸甘油醛脱氢酶来获得感兴趣的编码序列的高水平表达。假如对于指定目的表达水平是足够的，还设想了使用本领域所熟知的其它病毒、逆转录病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子，来获得感兴趣的编码序列的表达。通过采用已熟知其特性的启动子，可以优化转染或转化后感兴趣蛋白质的表达水平和模式。
和在非诱导条件下的细胞相比，选择根据特定的生理或合成信号受到调控的启动子能使基因产物发生可诱导表达。例如，当一个或多个(当使用多顺反子载体时)转基因的表达对产生载体的细胞有毒时，希望抑制或减少一个或多个转基因的表达。有可能对生产者细胞系有毒的转基因的例子是凋亡前和细胞因子基因。已有一些可诱导启动子系统，用于生产病毒载体，其中转基因产物有可能有毒。
蜕皮激素系统(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)就是这样的一种系统。该系统被设计为能使感兴趣基因在哺乳动物细胞中调控表达。它包含一种严紧调控的表达机制，使得事实上没有转基因的基础水平表达，但具有超过200倍的诱导能力。另一种可使用的可诱导系统是Tet-OffTM或Tet-OnTM系统(Clontech，Palo Alto，CA)，最初由Gossen和Bujard开发(Gossen和Bujard，1992；Gossen等人，1995)。该系统也能使高水平的基因表达受到四环素或四环素衍生物例如多西环素(doxycycline)的调控。
在一些情况下，希望对治疗性表达载体中的转基因的表达进行调控。例如，根据所需表达水平，可以使用具有不同活力强度的不同的病毒启动子。在哺乳动物细胞中，经常使用CMV立即早期启动子来提供强转录活性。当需要降低转基因的表达水平时，也使用效果差一些的修饰版本的CMV启动子。当希望在造血细胞中表达转基因时，经常使用逆转录病毒启动子，例如来自于MLV或MMTV的LTR。根据所需效果可以使用其它的病毒启动子，包括SV40、RSV LTR、HIV-1和HIV-2LTR、腺病毒启动子例如来自于E1A、E2A、或MLP区域、AAV LTR、花椰菜花叶病毒、HSV-TK和禽肉瘤病毒。
类似的，可以使用组织特异性或选择性启动子来影响在特定组织或细胞中的表达，来降低对于非靶组织的潜在毒性或不良效果。例如，可以使用启动子例如PSA，前列腺碱性蛋白，前列腺酸性磷酸酶或前列腺-特异性腺体激肽释放酶(hK2)，使基因在前列腺中靶向表达。相似的，可以使用下面的启动子，使基因在其它组织中靶向表达(表1)。
在某些实施方案中，希望在给予基因治疗载体后的特定时间里激活转录。这可以通过使用可受激素或细胞因子调控的启动子来得以实现。例如在适应症部位为性腺组织的治疗应用中，该部位产生或传递特异性甾类，使用雄激素或雌激素调控的启动子有可能是有益的。这种可受激素调控的启动子包括MMTV，MT-1，蜕皮激素和RuBisco。预计在本发明中其它可受激素调控的启动子例如对甲状腺、脑下垂体和肾上腺激素响应的启动子也是有用的。可以使用的细胞因子和炎性蛋白响应启动子包括K和T激肽原(Kageyama等人，1987)c-fos，TNF-α，C-反应蛋白(Arcone等人，1988)，触珠蛋白(Oliviero等人，1987)，血清淀粉样A2，C/EBPα，IL-1，IL-6(Poli和Cortese，1989)，补体C3(Wilson等人，1990)，IL-8，α-1酸性糖蛋白(Prowseand Baumann，1988)，α-1抗胰蛋白酶，脂蛋白脂肪酶(Zechner等人，1988)，血管紧张素原(Ron等人，1990)，纤维蛋白原，c-jun(受佛波醇酯，TNF-α，紫外线辐射，维a酸和过氧化氢诱导)，胶原酶(受佛波醇酯和维a酸的诱导)，金属硫蛋白(可受重金属和糖皮质激素诱导)，基质降解酶(受佛波醇酯，白细胞介素-1和EGF诱导)，α-2巨球蛋白和α-1抗胰凝乳蛋白酶。还可以使用肿瘤特异性启动子例如骨钙素，缺氧-效应元件(HRE)，MAGE-4，CEA，甲胎蛋白，GRP78/BiP和酪氨酸酶来调控基因在肿瘤细胞中的表达。
可以想像，根据本发明，依赖于所需活性可以单独使用或结合使用上述任意启动子。此外，该启动子列表不应被解释为详尽的或限制性的，本领域技术人员会知道其它的可用于此处揭示的方法中的启动子。
表1.组织特异性启动子
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2.增强子
增强子是位于和启动子相同的DNA分子上的远离位置、增强从启动子的转录的遗传元件。增强子的组织结构类似于启动子。即。它们都由许多单独元件组成，每个都结合一个或多个转录蛋白。增强子和启动子之间的基础距离是可操作的。整个增强子区域必须能够刺激一段距离处的转录；这对启动子区域或其组成元件不需要适用。另一方面，启动子必须具有一个或多个在特定位点、以特定方向直接起始RNA合成的元件，而增强子缺乏这些特异性。启动子和增强子经常重叠或邻接，看起来经常具有非常相似的调控组织结构。
下面是除了上面列出的组织特异性启动子列表以外的启动子列表，在表达结构中可以将细胞启动子/增强子和可诱导启动子/增强子与编码感兴趣的基因结合使用(表2和表3)。此外，还可以使用任意的启动子/增强子组合(按照Eukaryotic Promoter Data Base EPDB)来驱使基因表达。如果提供合适的细菌聚合酶，或者以运输复合物的部分，或者以附加的遗传表达结构，真核细胞可支持从特定细菌启动子的胞质转录。
在本发明优选的实施方案中，治疗性表达结构包括病毒或来自于病毒基因组的改造结构。某些病毒具有的能够通过受体介导的胞吞作用进入细胞并整合到宿主基因组中、并稳定有效地表达病毒基因的能力使其成为有吸引力的、转移外源基因进入哺乳动物细胞的候选物(Ridgeway，1988；Nicolas和Rubenstein，1988；Baichwal和Sugden，1986；Temin，1986)。
表2
 
增强子
免疫球蛋白重链
免疫球蛋白轻链
T细胞受体
HLA DQ α和DQ β
β-干扰素
白细胞介素2
白细胞介素-2受体
II 5类MHC
MHC类II HLA-DR α
β-肌动蛋白
肌肉肌酸激酶
前白蛋白(转甲状腺素蛋白)
弹性蛋白酶I
金属硫蛋白
胶原酶
白蛋白基因
α-铁蛋白
-珠蛋白
β-珠蛋白
e-fos
c-HA-ras
胰岛素
神经细胞粘附分子(NCAM)
α1-抗胰蛋白酵素
H2B(TH2B)组蛋白
小鼠或I型胶原
葡萄糖调节蛋白(GRP94和GRP78)
大鼠生长激素
人血清淀粉样蛋白A(SAA)
肌钙蛋白I(TN I)
血小板来源的生长因子
Duchenne肌营养不良症
SV40
多瘤
反转录病毒
乳头状瘤病毒
乙型肝炎病毒
人免疫缺陷病毒
巨细胞病毒
长臂猿白血病病毒
表3
 
元件 诱导物
MT II 佛波酯(TPA)重金属
MMTV(小鼠乳房肿瘤病毒) 糖皮质激素
β-干扰素 多聚(rI)X多聚(rc)
腺病毒5E2 E1a
c-jun 佛波酯(TPA)，H2O2
胶原酶 佛波酯(TPA)
基质降解酶 佛波酯(TPA)，IL-1
SV40 佛波酯(TPA)
鼠MX基因 干扰素，新城疫病毒
GRP78基因 A23187
α-2-巨球蛋白 IL-6
波形蛋白 血清
MHC I类基因H-2kB 干扰素
HSP70 Ela，SV40大T抗原
殖蛋白 佛波酯-TPA
肿瘤坏死因子 FMA
促甲状腺激素α基因 甲状腺激素
胰岛素E Box 葡萄糖
C.多腺苷酸化信号
可在治疗和/或成像载体中使用多腺苷酸化信号。在采用cDNA插入时，典型地希望包括多腺苷酸化信号来产生正常的基因转录的多腺苷酸化。多腺苷酸化信号的性质未被认为对所述发明的成功实施是关键的，并且可以采用任意的这种序列，例如人或牛生长激素和SV40多腺苷酸化信号。还设想为表达盒元件的是终止子。这些元件可用于增加信息水平并且使从盒到其它序列的通读最小化。
D.治疗性基因
本发明的AAVP颗粒可用于运输多种治疗或成像试剂，包括治疗性表达载体。本发明设想了使用多种不同的治疗基因。例如，设想了编码酶、激素、细胞因子、癌基因、受体、离子通道、肿瘤抑制子、转录因子、药物选择性标志物、毒素和多种抗原的基因来作为适合于根据本发明的使用的基因。此外，源自癌基因的反义和抑制RNA结构是根据本发明感兴趣的其它“基因”。
依据本发明，选择的基因或多肽可以指任意的蛋白质、多肽或肽。治疗基因或多肽是能够给予受试者用于治疗或预防疾病目的的基因或多肽。例如，治疗基因可以是给予受试者用于治疗或预防癌症的基因。治疗基因的例子包括，但不限于，Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11IL-12、GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶、Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri、Fas-L、mda-7、fus、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、ADP、p53、ABLI、BLC1、BLC6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS2、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3、YES、MADH4、RB1、TP53、WT1、TNF、BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、ApoAI、ApoAIV、ApoE、Rap1A、胞嘧啶脱氨酶、Fab、ScFv、BRCA2、zac1、ATM、HIC-1、DPC-4、FHIT、PTEN、ING1、NOEY1、NOEY2、OVCA1、MADR2、53BP2、IRF-1、zac1、DBCCR-1、rks-3、COX-1、TFPI、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、ab1、E1A、p300、VEGF、FGF、凝血酶敏感蛋白、BAI-1、GDAIF、或MCC。
治疗基因的其它例子包括编码酶的基因。例子包括，但不限于，ACP去饱和酶、ACP羟化酶、ADP-葡糖焦磷酸化酶、ATPase、醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、环加氧酶、脱羧酶、糊精酶、酯酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、透明质酸酶合成酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡糖氧化酶、GTPase、解链酶、半纤维素酶、玻璃酸酶、整合酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂氧合酶、分解酶、溶菌酶、果胶酯酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白水解酶、肽水解酶、普鲁兰酶(pullanase)、重组酶、逆转录酶、拓扑易构酶、木聚糖酶、报告基因、白介素或细胞因子。
治疗基因的进一步的例子包括编码氨基甲酰合成酶I，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨酸琥珀酸盐合成酶，精氨琥珀酸裂解酶，精氨酸酶，延胡索酰乙酰乙酸水解酶，苯丙氨酸羟化酶，α-1抗胰蛋白酶，葡萄糖-6-磷酸酶，低密度脂蛋白受体，胆色素原脱氨酶，因子VIII，因子IX，胱硫醚β-合酶，支链酮酸脱羧酶，白蛋白，异戊酰-CoA脱氢酶，丙酰CoA羧化酶，丙二酰CoA变位酶，戊二酰-辅酶A脱氢酶，胰岛素，葡萄糖苷酶，丙酮酸羧化酶，肝磷酸，磷酸激酶，甘氨酸脱羧酶，H-蛋白，T-蛋白，门克斯病铜转运ATP酶，肝豆状核变性铜转运ATP酶，胞嘧啶脱氨酶，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、1-磷酸半乳糖尿苷酸转移酶，苯丙氨酸羟化酶、葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、-L-艾杜糖醛酸酶、6-磷酸葡糖脱氢酶、HSV胸苷激酶或人胸苷激酶的基因。
治疗基因还包括编码激素的基因。例子包括，但不限于，编码生长激素，催乳素，胎盘生乳素，促黄体激素，卵泡刺激素，绒毛膜促性腺激素，促甲状腺激素，瘦素，促肾上腺皮质激素，血管紧张素I，血管紧张素II，β黑素细胞刺激素，β-胆囊收缩素，内皮缩血管肽，肠抑胃肽，胰高血糖素，胰岛素，促脂解素，后叶激素运载蛋白类、生长抑素、降钙素，降钙素基因相关肽，β-降钙素基因相关肽，恶性因子的高钙血症，甲状旁腺激素相关蛋白，甲状旁腺激素相关蛋白，胰高血糖素样多肽，胰抑素，胰多肽，肽YY，PHM，分泌素、血管活性肠肽，催产素，加压素，加压催产素，脑啡肽酰胺，甲硫脑啡肽酰胺，α黑素细胞刺激素，心钠素，淀粉素，淀粉样蛋白P成分，促肾上腺皮质释放激素，生长激素释放因子，促黄体激素释放激素，神经肽Y，K物质，P物质，或促甲状腺素释放激素的基因。
而在另一个实施方案中，异源基因可以包括单链抗体。产生单链抗体的方法是本领域技术人员所熟知的。对于这种方法，技术人员可参考美国专利号5,359,046(此处引用作为参考)。使用短肽联接子将重链和轻链的可变结构域融合在一起产生单链抗体，因此在单个分子上重建了抗原结合位点。
E.多基因结构和IRES
在本发明的某些实施方案中，使用内部核糖体结合位点(IRES)元件来创建多基因多顺反子信息(Pelletier和Sonenberg，1988)。已经描述了来自于细小核糖核酸病毒(picanovirus)家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)，以及来自于哺乳动物信息的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可被交联到异源开放阅读框上。多开放阅读框可一起转录，每个都被一个IRES间隔，产生多顺反子信息。由于IRES元件，每个开放阅读框都容易接近核糖体来进行有效转录。使用单一的启动子/增强子来转录单一的信息，可以是多基因得到有效表达。任何异源开放阅读框都可以交联到IRES元件上。这包括分泌蛋白基因、多亚基蛋白基因、独立基因编码的基因、细胞内或膜结合蛋白基因和可选择标志物基因。以这种方法，可以用一个结构和一个选择标记同时将数种蛋白的表达设计到细胞中。
F.核酸的制备
可以通过本领域普通技术人员已知的任何技术制备核酸，例如，化学合成、酶生产或生物生产。酶生产核酸的非限制性例子包括利用扩增反应例如中的酶进行生产，所述扩增反应例如PCRTM(参见例如，美国专利4,683,202和美国专利4,682,195，在此处每个都被引用作为参考)，或者如在美国专利5,645,897所述合成寡核苷酸，在此处引用作为参考。生物生产的非限定性例子包括在活细胞中的重组核酸生产(即，复制的)，例如在细菌中复制的重组DNA载体(参加例如，Sambrook等人2001，在此处引用作为参考)。
III.药物组合物和给药途径
当设想临床应用时，需要准备AAVP组合物(治疗组合物)的、采用适合于预期应用的形式的药物组合物。通常，需要制备基本不含热原和其它对人或动物有害的杂质的组合物。
人们通常希望使用合适的盐和缓冲剂来使所述组合物适合于引入到病人中。本发明的水的组合物包含有效量的AAVP或其它溶解于或分散于药物可接受载体或水介质中的试剂。短语“药物或药物可接受的”指的是在给予动物或人时不产生有害的、过敏性的、或其它不良反应的分子实体和组合物。
如此处所用，“药物可接受载体”包括任意的和所有的溶剂、分散介质、包被、抗细菌的和抗真菌试剂、等渗和吸收延迟试剂等等。使用这种用于药物活性成分的介质和试剂是本领域所熟知的。任何常规介质或试剂，只要不是与本发明的AAVP组合物不相容的，其作为成像试剂或在治疗组合物中的使用都被设想了。也可以将补充的活性成分(例如其它抗癌试剂)掺入到该组合物中。在普通储存和使用条件下，这些制剂含有保存剂来防止微生物的生长。静脉内运输工具包括流体和营养补充剂。保存剂包括抗微生物试剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。根据熟知额参数调整药物中的pH和多种组合物的确切浓度。
根据预期目标确定所述组合物的有效量，所述预期目标例如成像和/或改善状况或疾病，例如癌症。术语“单位剂量”指的是适合在受试者中使用的物理离散单位，每个单位包含预订量的、经计算将其给药后会产生所需反应的治疗组合物，所述给药即合适的途径和治疗用药法。待给药的量，都根据治疗数量和单位剂量，依赖于待治疗受试者、受试者的状态和所需保护。治疗组合物的精确的量还依赖于从业医生的判断，并且对每个个体都是特有的。
还设想了含有两种活性成分的联合组合物。特别的，本发明提供了含有AAVP组合物和至少第二种治疗药物的组合物，所述第二种治疗药物例如，抗肿瘤药。
A.肠胃外投药
本发明的活性组合物可按照肠胃外投药配方制备，即，按配方制备用于静脉内注射、肌内注射、皮下注射、或甚至采用腹腔进入途径。依据本公开制备含有第二种试剂作为活性成分的含水组合物是本领域技术人员所已知的。典型的，可将这种组合物制备成可注射的，或以液体溶液形式或以悬浮液形式；还可以制备为适用于通过在注射前加入液体制备成溶液或悬浮液的固体形式；并且该制剂还可以被乳化。
适合于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液；成分包括芝麻油、花生油或水丙二醇；以及用于即时制备无菌注射液或分散液的无菌粉末。在所有情况下所述形式都必须是无菌的，并且必须是流体的，达到易于注射流出的程度。
所述载体还可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和蔬菜油的溶剂或分散介质。在分散剂中可以通过维持所需的颗粒大小并通过使用表面活性剂维持适当的流动性，例如，通过使用包被，例如卵磷脂。可以通过多种抗细菌和抗真菌剂实现防止微生物的作用，所述抗细菌和抗真菌剂例如，对羟苯甲酸、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选包括等渗试剂，例如，糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收试剂来实现注射组合物的延长吸收，所述延迟吸收试剂例如，单硬脂酸铝和明胶。
通过在合适的、含有上面列举的多种其它成分(按照需求)的溶剂中掺入所需量的活性化合物来制备无菌注射液，随后进行过滤除菌。通常，通过将多种无菌活性成分掺入到含有基础分散介质和上面列举的所需其它成分的无菌载体中来制备分散液。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末，其特别的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，产生所述活性成分以及所有添加的所需成分的粉末，所述的添加的所需成分来自于其上述过滤除菌溶液。
对于以水溶液形式进行肠胃外投药，例如，如果必须，所述溶液应被合适地缓冲，并且首先用足够的盐或葡萄糖对液体稀释剂进行等渗。这些特别的水溶液尤其适用于静脉注射、肌内注射、皮下注射和腹膜内注射。在这一点上，本领域技术人员依照本发明将会知道可以采用的无菌水介质。例如，一次剂量可以溶解于1ml等渗NaCl溶液中，随后或者加入到1000ml皮下灌注液体中或者在目标灌输部位注射(参见例如，＂Remington′s Pharmaceutical Sciences＂第15th版，1035-1038页和1570-1580页)。根据待治疗的受试者的条件必须对剂量进行一些变化。无论如何，负责给药的人员将要确定对于个别受试者的合适的剂量。
为了便于更好地理解本发明，给出了特定实施方案的下面的实施例。下面的实施例决不能被阅读为对发明整个范围的限制或对定义。
IV.实施例
给予下面的实施例的目的是说明所述发明的多种实施方案，而不意味着以任何方式对本发明进行限制。本领域技术人员将会容易地理解，本发明非常适合于实现目标并达到最终目的和所提到的优势，以及此处所固有的那些目标、目的和优势。提出的实施例，以及此处所述的方法是优选的实施方案的当前代表，是示例，并且意图对发明的范围进行限制。本领域技术人员将能想到包含在权利要求的范围所确定的发明的精神中的其中的变化和其它使用。
实施例1：AAVP射靶
A.实验方法
设计、构建及制备定靶AAVP粒子
用两步法制备了RGD-4C噬菌体和RGD-4C AAVP：制备中间体(RGD-4C fUSE5-MCS)，随即制备RGD-4C噬菌体构建体和RGD-4C AAVP。RGD-4C fUSE5-MCS含有编码特异性靶肽RGD-4C的寡核苷酸插入子和含有用于插入真核生物表达盒的多克隆位点(MCS)的fMCS质粒的片段。从大肠杆菌(E.coli)(MC1061)溶解物中纯化源于RGD-4C噬菌体的fUSE5DNA和源于噬菌体的fMCS DNA。我们通过连接RGD-4CfUSE5质粒的5.4kb的BamHIISac1I片段和fMCS质粒的4.1kb的BamHI/Sac1I片段得到了中间体RGD-4C fUSE5-MCS。接下来，我们通过将pAAV-eGFP(增强型GFP，Stratagene)质粒的PacI片段(2.8kb)从两个ITR之间克隆到RGD4C fUSE5-MCS的PstI位点中而制备了定靶AAVP-GFP。简言之，用PacI消化pAAV以释放2.8kb的片段，用DNA聚合酶将其粘末端补成平末端，并克隆到RGD-4C fUSE5-MCS的平末端PstI位点中。为制备无ITR的定靶噬菌体构建体，通过EcoRI消化释放位于pAAV-eGFP的ITR之间，且含有pCMV-GFP和SV40多聚A的2.3kb的片段，用DNA聚合酶补成平末端，然后克隆到RGD-4C fUSB5-MCS的MCS中。为筛选表达GFP的细胞，将pQBI磷酸甘油酸激酶1(PGK，QBIOgene)启动子的BamHI-Sac1片段且含有GFPneo融合序列的克隆到AAVP或对照噬菌体构建体的NotI位点，以保证表达GFP的细胞具有G418抗性。通过BamHI和Sac1消化释放pQBI PGK的GFPneo片段，用DNA聚合酶补成平末端后添加连接到NotI的磷酸化的接头。用NotI消化后，将1.57kb GFPneo片段克隆到AAVP或非嵌合噬菌体构建体的NotI位点。最后，为制备携带HSVtk基因或Luc基因的定靶AAVP粒子，将含有HSVtk或Luc的BamHI-Not1片段亚克隆到pAAV质粒的BamHI-Not1位点中，替换GFP。从pAAV-HSVtk和pAAV-Luc中摘除ITR-HSVtk-ITR或ITR-Luc-ITR片段后插入到RGD-4C fUSE5-MCS中。通过DNA测序和限制性分析检验构建体，从宿主大肠杆菌(E.coli)(MC1061)的培养上清中纯化所述构建体，重悬于PBS，并离心。将得到的上清滴到大肠杆菌(E.coli)(k91Kan)。将其连续稀释液平板接种于含有四环素和卡那霉素的Luria-Bertani(LB)琼脂平板上，通过菌落计数测定转导单位(TU)。
哺乳动物细胞表面结合和内化实验
发明人使用生物淘筛和选择性相互作用配体快速分析法(称为BRASIL)(Giordano et al.，2001)评估了噬菌体与完整细胞的结合。简言之，用乙二胺四乙酸(EDTA)使KS1767细胞离壁，并以4×106细胞/ml重悬于含有1％ BSA的达尔伯克改良的伊格尔培养液(DMEM)中。使细胞悬液(50μl)与109TU的RGD-4C AAVP或表达乱序RGD-4C(CDCFGDCRC(SEQ ID NO：2)、CDCGFDCRC(SEQ ID NO：3)、CRCDGFCDC(SEQ ID NO：4))的AAVP克隆、RGE-4C突变肽或非定靶对照温育。2小时后，将AAVP/细胞混合物(水相)转移到由邻苯二甲酸二丁酯：环己烷(9:1[v:v]，D＝1.03g/ml)组成的非混相有机相(200μl溶液于400μl的Eppendorf离心管中)上部，以10,000g，于4℃下离心10分钟。将离心管于液氮冷冻，切下离心管底部，分离出细胞-AAVP沉淀，回收膜结合的AAVP(Giordano et al.，2001)。
通过将KS1767培养于组织室玻片(Lab-Tek II Chamber SlideSystem；Nalge Nunc International Corp)中，用PBS洗两遍，在含有1％BSA的DMEM中于37℃下与109TU的RGD-4C AAVP或表达乱序RGD-4C的对照AAVP或RGE-4C温育，温育4小时后，用PBS漂洗以除去未结合的AAVP来进行细胞内化。通过用20mM甘氨酸(pH2.3)漂洗细胞来化学洗脱结合于细胞膜的克隆。然后，用PBS漂洗细胞三次，于室温下用含有4％多聚甲醛(PFA)的PBS固定15分钟，用PBS漂洗，用0.2％ Triton X-100渗透，用PBS漂洗，再用含有1％BSA的PBS阻断。然后将细胞于室温下与含有1％ BSA的PBS中的抗-M13细菌噬菌体第一抗体(Amersham)的1:200稀释液温育2小时，用PBS漂洗，再于室温下与含有1％ BSA的PBS中的缀合Cy3的抗兔第二抗体的1:200稀释液温育1小时。最后用PBS漂洗细胞，用含有4％PFA的PBS固定，封片，于光学荧光显微镜下观察。
从转到AAVP粒子的细胞中回收重组AAV
用RGD-4C AAVP-GFPneo或GRD-4C噬菌体-GFPneo感染人293细胞。感染后4天，用表达AAV rep和cap的质粒(pXX2)转染细胞(Xiaoet al.，1998)，再用野生型5型腺病毒(Ad)超感染。从而通过转染递送了AAV rep和cap基因，并通过超感染提供了腺病毒辅助功能。腺病毒感染后72小时时收获细胞，再将上清用于感染新的293细胞。48小时后通过FACS分析GFP表达。此实验中，仅在转导RGD 4CAAVP-GFP嵌合体的细胞中产生有功能的重组AAV，而未在转导非嵌合噬菌体-GFP或几个对照的细胞中产生。在所有RGD-4C AAVP克隆中，而非噬菌体克隆中得到类似结果。
克隆哺乳动物细胞系的建立
用RGD-4C AAVP-GFPneo或GRD-4C噬菌体-GFPneo感染人293细胞(均以106TU/细胞)。G418筛选下分离单个克隆(n＝9/组)，并于筛选后12周通过FACS分析了GFP表达。将稳定克隆称为噬菌体克隆#1-9(对于噬菌体-GFPneo)和AAVP克隆#1-9(对于AAVP-GFPneo)。
肿瘤模型
动物实验得到美国动物研究委员会(Institutional AnimalResearch Committee)的评审并批准。制备荷瘤小鼠(Pasqualini etal.，1997；Arap et al.，1998；Ellerby et al.，1999；Hajitou etal.，2001；Arap et al.，2004；Marchib et al.，2004)。通过腹膜内实施阿佛丁B或通过吸入气体(2％异氟醚和98％氧气)麻醉小鼠。静脉内实施定靶构建体或对照。肿瘤细胞经胰酶消化、计数、离心并重悬于无血清的培养液中。用来自Kaposi肉瘤(KS1767)、膀胱癌(UC3)或前列腺癌(DU145)系的共106细胞皮下接种6周龄的免疫缺陷裸鼠。用EF43-FGF4小鼠乳腺癌细胞(5×104)皮下接种6周龄的免疫活性BALBIc雌鼠。计算肿瘤体积(Pasqualini et al.，1997；Arap et al.，1998；Ellerby et al.，1999；Hajitou et al.，2001；Arap et al.，2004；Marchib et al.，2004)，并用平均肿瘤体积*标准偏差(SD)表示。当肿瘤体积达到50mm2(设定为小)或150mm2(设定为大)时，来自DU145的移植物(0日)、荷瘤小鼠静脉内接受单次剂量的RGD-4C AAVP-HSVtk或对照。两天后开始对大小符合的荷瘤小鼠同期组群实施GVC治疗(每天80mg/kg，腹膜内给药)。
荷瘤小鼠的分子遗传成像
为得到非感染性分子图像，我们使用了基于人细胞系DU145的前列腺癌模型，其中使用了在右肩皮下区荷带肿瘤移植物雌性裸鼠。为得到萤火虫Luc基因的表达图像，给荷瘤小鼠腹膜内实施单次剂量(150mg/kg)的底物D-荧光素(Xenogen)。尾静脉实施携带Luc基因的定靶RGD-4C AAVP或对照(非定靶AAVP-Luc或乱序RGD-4CAAVPLuc)后，使用活体成像系统200(IVIS200；Xenogen，CA)描绘光子发射。成像参数：图像采集时间，1分钟；面元，2；无滤波器；flstop，1；视场，10cm。手动定义肿瘤中测量信号强度(以光子/秒/cm2/sr表示)的兴趣区域(ROI)。
尽管在实验系统中BLI可估计表达转基因的细胞的活力，其不可临床应用。因此，为估计建立的肿瘤移植物的活力，静脉实施100μCi/小鼠的[18F]-FDG后，使用microPET扫描仪(ConcordeMicrosystems，TN)扫描小鼠。[18F]-FDG是市售品(PETNet，Houston，TX)。为得到HSVtk基因表达的图像，静脉实施放射性标记的核苷类似物[18F]-FEAU后1-2小时时进行PET成像。用配备有电脑控制的定位床(视场(FOV)长10.8cm，宽8cm的，无光谱，且仅限在3维表模式下操作)的microPET R4(Concorde Microsys tems，Inc.)进行PET成像。使用350-750keV的能量窗和6ns的时间窗收集完整的3维表模式数据。首先将全部原始数据分类整理成3维正弦图，然后使用ASIPOR VM软件(Concord Mi crosystems，TN)进行傅立叶面元重建和OSEM图像重建。图像的象素大小约长1mm，层厚1.2mm。
如Alauddin等人首先报道(2003)，使用作为用于作为与1-溴-2-脱氧-2-[18F]氟-3，5-二-O-苯甲酰-α-D-阿拉伯呋喃糖冷凝的嘧啶碱的5-乙基尿嘧啶-2，5-双-三甲基甲硅烷醚合成了放射化学纯度大于99％的放射性标记的[18F]-FEAU。为定量肿瘤和其他器官和组织中源于[18F]-FEAU或[18F]-FDG的放射性浓度，在图像上拖动兴趣区域，并将测量值由nCi/mm2转化为％注射剂量/克(％ID/g，Tjuvajev et al.，1998)。如上所述，在实施携带HSVtk基因的定靶AAVP或对照非定靶AAVP后第3、5、10和16天时重复进行[18F]-FEAU PET成像；在第11天和19天之间实施GCV治疗。注意，16天时的PET成像在实施GCV后24小时时进行，以使GCV充分消失，否则，所述GCV会与FEAU竞争由HSVtk酶的磷酸化。在实施AAVP后用[18F]-FDG重复第17天时的PET成像，以估计残留肿瘤(如果有)的活力。
免疫组织化学实验
杀死麻醉的小鼠，并用含有4％ PFA的PBS灌注。使用大鼠-抗-小鼠CD31抗体(BD Biosciences)评价了冷冻切片的肿瘤血管化。使用TUNEL试剂盒(Promega)对石蜡包埋的切片进行凋亡分析。通过使石蜡切片与兔抗噬菌体第一抗体(Sigma)温育，然后再与缀合过氧化物酶的抗兔第二抗体(Dako)温育对组织中的噬菌体进行免疫检测。用底物-色素原3，3’-二氨基联苯胺染色切片，并用苏木精复染。通过将器官和组织在含有2％PFA的PBS中固定2小时，再用含有15％蔗糖的PBS平衡48小时来进行GFP免疫染色。用含有4％PFA的PBS后固定冰冻切片20分钟后，用含有1％BSA和0.1％ Triton X-100的PBS(PBS-T)中的5％山羊血清阻断。接下来，使组织切片与2％山羊血清和1％ BSA中的兔亲和纯化GFP抗体(Molecular Probes)温育。然后用含有1％ BSA的PBS-T中的缀合AlexaFluor 488山羊-抗-兔第二抗体(Molecular Probes)染色切片。对丙酮固定的从用灌注PBS的动物中摘除的肿瘤的冷冻切片进行αv整合素免疫染色。使切片与大鼠抗整合素αv单克隆第一抗体(Chemicon)温育1小时，再与缀合Cy3的山羊抗大鼠第二抗体(Jackson ImmunoResearch)温育。
配体引导的粒子在哺乳动物细胞中有功能
构建了由重组AAV和表达双环肽CDCRGDCFC(SEQ ID NO：2)的fd-tet噬菌体克隆(称为RGD-4C噬菌体(Pasqualini et al.，1997；Arap et al.，1998))构成的定靶嵌合病毒。RGD-4C肽结合αv整合素，所述αv整合素是在肿瘤细胞和肿瘤血管的新生成血管内皮细胞中过表达的细胞表面受体(Brooks et al.，1994；Pasqualini etal.，1997；Arap et al.，1998；Sipkins et al.，1998；Ellerby etal.，1999；Hood et al.，2002)。为得到嵌合病毒(还称为AAV/噬菌体；AAVP)，发明人将来自重组AAV的真核基因盒插入RGD-4C噬菌体(RGD-4C AAVP)、无插入子的噬菌体(非定靶AAVP)或表达对照肽(如乱序RGD-4C AAVP或D至E突变体(称为RGE-4C)AAVP)的噬菌体的基因组间区内，并将其与噬菌体DNA一并包装到噬菌体衣壳中(图7)。为显示得到的αv整合素定靶嵌合病毒的反式元件仍具有功能，发明人评估了AAVP中RGD-4C肽的配体性质和反向末端重复(ITR)的回收性质。首先，为评估肽特异性，有显示RGD-4C AAVP结合表达αv整合素的哺乳动物细胞，这与非定靶AAVP或表达阴性对照肽(例如RGE-4C或几种RGD-4C乱序序列)的AAVP相反(图1A)，它们既不结合，也不影响哺乳动物细胞。也证实携带报告基因的RGD-4C AAVP相比对照可介导配体引导的内化(图1B)和哺乳动物细胞的转导(图1C)。细胞内化实验中使用的阴性对照包括非定靶AAVP、多种RGD-4C乱序AAVP或RGE-4C AAVP(图1B)；细胞转导实验中使用的阴性对照则包括非定靶AAVP(图1C)、乱序RGD-4C AAVP或RGE-4CAAVP。与这些结果相同，发明人之前还证实，合成的RGD-4C肽特异性抑制多种基于定靶RGD-4C噬菌体的构建体的细胞结合和内化(Giordano et al.，2001；Chen et al.，2004，及未公示的结果)。最后显示，相比阴性对照，例如非定靶AAVP(图1D)、乱序RGD-4C或RGE-4C，哺乳动物细胞转导也可被合成的RGD-4C肽特异性竞争。为排除其中一些结果(图1A和1B)是由从细胞膜除去AAVP的甘氨酸(低pH)漂洗步骤的选择性失误造成的假象的可能性，进行温度(冰冷)控制实验(Giordano et al.，2001)，其中观察到细胞结合，但未观察到RGD-4C AAVP介导的内化。
接下来，为评估AAVP粒子中的ITR是否仍有功能，我们进行了回收实验。结果显示，仅在转导RGD-4C AAVP的哺乳动物细胞中产生有功能的重组AAV粒子，而非转导阴性对照构建体的细胞(图1E)。这些结果表明，通过基因嵌合制备RGD-4C AAVP粒子不在根本上改变(1)配体引导的RGD-4C噬菌体的肽定靶性质或(2)从转导RGD-4C AAVP的哺乳动物细胞回收重组AAV粒子的能力。报告转基因表达的并行时间进程表明，相比RGD-4C噬菌体，可更持久检测到RGD-4C AAVP的转导(表4)。
表4  体外转基因表达
Figure A200780021040D00591
两个独立的观察者于每个时间点以半定量的方式对三个平行孔中的293细胞的GFP表达进行了评分。
转基因表达的分子机制
为洞悉AAVP粒子介导的转基因表达的分子机制，发明人研究了哺乳动物细胞中转导基因组的命运。首先，使用表达GFPneo的AAVP产生稳定转导的细胞系，以筛选单个转导细胞克隆。将RGD-4CAAVP-GFPneo或缺失AAV ITR的RGD-4C噬菌体-GFPneo用于转导表达αv整合素的人293细胞(Nakamura et al.，2002)，在G418筛选下分离克隆。回收实验显示，所有RGD-4C AAVP-GFPneo 293细胞克隆产生有功能的重组AAV-GFPneo，但RGD-4C噬菌体-GFPneo克隆则不产生，因此证实，嵌合的单个克隆含有有功能的ITR。尽管用非嵌合RGD-4C噬菌体-GFPneo转导的细胞保有G418抗性，但GFP表达一般比RGD-4C AAVP-GFPneo克隆弱(图2A)。然后发明人着手通过综合限制性内切酶消化基因组DNA及随后的DNA印记和基于聚合酶链式反应(PCR)的分析测定了稳定转导的克隆中的GFPneo转基因盒的命运(图2、图3和表5)。为证明转基因盒的持久性，用Af1II和XhoI消化基因组DNA，以检测分析前的全长转基因盒的释放。在100％的RGD-4CAAVP转导的克隆中观察到所述释放(9个克隆中n＝9)，与此相比，只在33％的非嵌合RGD-4C噬菌体构建体转导的克隆(9个克隆中n＝3)中观察到所述释放(图2B)。设计另一个基因组DNA的限制性内切酶消化，以检测潜在的转基因盒的串联形式(Lieber et al.，1999；Hsiaoet al.，2001)。在67％的RGD-4C AAVP转导的克隆中检测到转基因盒头尾串联体的存在(9个克隆中n＝6)，而未在非嵌合RGD-4C噬菌体构建体转导的克隆中检测到所述串联体(图2C)。为鉴定转基因盒的可能的另外的串联形式，使用定位于构建体的5’和3’末端侧翼的引物进行多重PCR。仍未在非嵌合RGD-4C噬菌体构建体转导的克隆中发现串联体，而在100％的RGD-4C AAVP转导的克隆中含有串联形式(9个克隆中n＝9)，发现所有的串联形式都是头尾串联(图8B)。小PCR产物的TOPO克隆也显示了缺失ITR的转基因盒的头尾串联(图8C)(Yang et al.，1997)。最终，尽管不能对大PCR产物进行测序，其大尺寸提示，存在于连接位点含有完整ITR的串联体。还对个别DNA的单个克隆做了详细分析(表5)。无意被理论或机理束缚，这些数据提示，AAVP通过维持整个哺乳动物转基因盒，更好的游离DNA持久性、转基因盒串联体的形成或也许通过结合这些非相互排斥的机理在通过改变转基因盒的命运的方法的基因表达中具有优点。这些发现与有关AAV认识的最新进展一致(McCarty et al.，2004)。
表5：载体DNA在稳定转导RGD-4C AAVP-GFneo或RGD-4C噬菌体-GFneo的293细胞克隆中的命运
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Figure A200780021040D00611
体内肿瘤射靶和分子遗传成像
在证实定靶嵌合病毒粒子的中心元件(即RGD-4C肽和AAV ITR)是完整且有功能后，且在阐明哺乳动物细胞中AAVP介导的基因表达的分子机制后，评价了全身实施AAVP后基因递送至肿瘤的特异性和效力。将荷带源于人Kaposi肉瘤KS1767细胞的皮下肿瘤移植物的裸鼠用作初始临床前模型(Arap et al.，1998；Eller by et al.，1999)。首先，为检验病毒构建体靶向小鼠的源于KS1767的移植物，静脉内实施RGD-4C AAVP或几个阴性对照(非定靶AAVP、乱序RGD-4C AAVP或RGE-4C AAVP)之一。血循环3-5分钟后，在接受RGD-4C AAVP的小鼠，而非对照小鼠的肿瘤血管中观察到强抗AAVP着色(图3)。将编码绿色荧光蛋白(GFP)基因的RGD-4C AAVP变体用作报告分子，使用原位免疫荧光显微成像法测定此载体(RGD-4C AAVP-GFP)是否可转导源于KS1767的移植物。给荷瘤小鼠全身实施RGD-4C AAVP-GFP或阴性对照构建体后7天时进行抗肿瘤和不同器官中的GFP的免疫染色。免疫荧光实验显示，GFP在接受RGD-4C AAVP的小鼠的肿瘤血管及周围肿瘤细胞中大量表达。与此相反，未在接受非定靶、乱序或突变AAVP-GFP的对照小鼠的肿瘤中检测到GFP着色(图3B)。此着色模式提示，配体引导的转导受αv整合素靶向肿瘤血管内皮细胞的介导(Brooks et al.，1994；Pasqualini et al.，1997；Arap et al.，1998；Sipkins et al.，1998；Ellerby et al.，1999；Giordano etal.，2001；Hood et al.，2002；Chen et al.，2004)。几个非定靶对照器官(脑、肝脏、胰和肾)组织中仍缺乏GFP表达(图9)。综上，这些结果表明，RGD-4C AAVP粒子经体内全身实施后，可通过配体引导的机制特异性靶向肿瘤移植物并予转导。
接下来，发明人为对活体荷瘤小鼠中萤火虫荧光素酶(Luc)和HSVtk报告基因表达的时间动力学性质和空间异质性分别进行非侵染性监控，在全身实施RGD-4C AAVP后，使用[18F]-FEAU估计了临床前生物发光成像(BLI)和可临床应用的分子遗传PET成像的效力。在人前列腺癌临床前模型中进行这些分子遗传成像研究，因为适当成像患者的此常见肿瘤仍是挑战。发明人首先使用标准实验装置对荷瘤小鼠的萤火虫荧光素酶(Luc)转基因报告基因进行了体内成像(图4A)。发明人选择了Luc表达的BLI，因为其是用于小鼠报告基因成像的非常敏感的方法，且图像中事实上无非特异性背景活性(Gross andPiwnica-Worms，2005a；Gelovani and Blasberg，2003；Uhrbom etal.，2004；Walensky et al.，2004)。在接受RGD-4C AAVP-Luc的小鼠的DU145肿瘤中观察到Luc的非常肿瘤特异性的表达。相反，不能在接受非定靶AAVP-Luc或乱序RGD-4C AAVP-Luc的对照小鼠中观察到伴随肿瘤的生物发光信号。使用所有类型的AAVP载体(非定靶AAVP-Luc、乱序RGD-4C AAVP-Luc、RGE-4C AAVP-Luc或RGD-4CAAVP-Luc)，未在正常器官(如肝、脾或肾)中观察到生物发光。这些数据证实RGD-4C AAVP介导的射靶的肿瘤特异性，及免疫荧光显微成像研究观察到的使用RGD-4C AAVP的转寄因表达。与之前给出的结果一致(图9)，分布动力学研究提示，尽管存在噬菌体粒子的非特异性肝清除(Geier et al.，1973；Pasqualini et al.，1997；Arapet al.，1998；Barbas et al.，2001)，该现象不导致不期望的肝基因转导。这些观察结果与哺乳动物病毒基因递送载体非特异性转导正常器官(如肝)的记载(Shayakhmetov et al.，2005)形成鲜明对比。通过体内使用BLI，在实施AAVP后3天时可清晰检测到肿瘤中Luc报告转基因的表达，并逐渐增多，于10天时达到最大值。隔日进行Luc报告基因表达的重复2维BLI，并提供初始的费用有效的策略，以研究AAVP介导的报告转基因表达的特异性、时间动力学性质和空间异质性。但因为Luc报告基因表达的BLI不可临床应用，发明人接下来将HSVtk基因导入AAVP载体，所述HSVtk基因可用作自杀基因(当结合丙氧鸟苷(GCV)时)，且可用作用HSVtk特异性放射性标记的核苷类似物(如[124F]-FAIU、[18F]-FHBG和[18F]-FEAU)进行的可临床应用的PET成像的报告基因。
之前的研究证实，HSVtk表达的PET成像提供确定转寄因表达的位置、量和持续时间的能力(Tjuvajev et al.，1998；Tjuvajev etal.，1999；Ray et al.，2001；Massoud and Gambhir，2003)。之前也确定转导HSVtk的细胞系和肿瘤中放射性标记的示踪物的体内蓄积量与HSVtk表达水平相关(Blasberg and Tjuvajev，2003；Grossand Piwnica-Worms，2005a；Tai and Laforest，2005)。本研究中，发明人选择、合成并使用了放射性标记的核苷类似物2’-[18F]-氟-2’-脱氧-1-β-D-阿拉伯-呋喃糖基-5-乙基-尿嘧啶([18F]-FEAU)，尤其从药物动力学角度考虑(在所有正常器官和组织中非常低的背景活性)，其是HSVtk酶的相比其他核苷类似物更好的放射性标记的底物(Kang et al.，2005)。通过用[18F]-FEAU(在第0、3、5、10和16天)进行重复PET成像，发明人将RGD-4C AAVP-HSVtk或非定靶AAVP-HSVtk单次全身实施到裸鼠的源于DU145的肿瘤移植物和其他器官和组织中后，观察并定量了HSVtk基因表达的时间动力学性质和空间异质性(图4B)。实施RGD4C AAVP-HSVtk或非定靶AAVP-HSVtk之前的肿瘤移植物大小(约150mm2)及实施之后的肿瘤生长率在两个同期组群小鼠中相似(图4C)。用[18F]-FEAU成像显示，实施RGD-4CAAVP-HSVtk后的头五天肿瘤中HSVtk转基因表达水平逐渐升高(升高％静脉内实施剂量/克)，然后HSVtk表达水平逐渐稳定至实施载体后的第10天。相比之下，接受非定靶AAVP-HSVtk的对照荷瘤小鼠中仅观察到在第3天时肿瘤中的[18F]-FEAU蓄积量有少量增加，其很快降低到背景水平(图4D)。与之前的BLI实验一致，未在非定靶器官或组织中观察到[18F]-FEAU PET可检测的HSVtk表达(图4B)。事实上，PET成像中的低水平的异源活性代表正常的背景活性，其在图像中强度加强，说明未截断低水平放射性，以人工“提高”相比非定靶组织，在肿瘤中的HSVtk表达特异性。当肿瘤生长到可靠的可触及大小(约350-400mm2)时，肿瘤中HSVtk表达达到平台期，开始用GCV治疗所有同期组群动物(图4C)。用[18F]-氟脱氧葡萄糖([18F]-FDG)进行PET成像，以监控葡萄糖代谢和GCV诱导的肿瘤活力变化。开始GCV治疗前2天(实施载体后第9天)，两组小鼠的DU145肿瘤是有活力的且活跃地蓄积[18F]-FDG(图4E)。GCV治疗后，接受RGD-4CAAVP-HSVtk的小鼠的肿瘤体积比接受非定靶AAVP-HSVtk的小鼠显著小(p<0.05；图4C)。[18F]-FDG蓄积减少也证明，肿瘤移植物也被代谢性地抑制。最后一次实施GCV后24小时时(以避免与FEAU竞争)PET成像中[18F]-FDG蓄积锐减证明，GCV治疗后，实施RGD-4CAAVP-HSVtk的小鼠肿瘤中HSVtk的表达水平也显著降低(图4D)。这些研究证实RGD-4C AAVP靶向肿瘤的特异性，并显示HSVtk转基因表达水平足够高，以有效活化GCV药物前体。
为横向评估在其他临床前模型中的效力，我们集合了一组来自不同种和组织源的肿瘤细胞系，并在免疫抑制小鼠或免疫活性小鼠中制造肿瘤。荷带源于Kaposi肉瘤(KS 1767)的荷瘤小鼠同期组群全身性接受单次静脉内剂量的RGD-4C AAVP-HSVtk或非定靶AAVP-HSVtk(对照)，所有组再接受GCV处理。相比用赋形剂处理的小鼠或接受非定靶AAVP的小鼠，在接受RGD-4C AAVP-HSVtk的荷瘤小鼠中观察到显著的肿瘤生长抑制(图5A)。在裸鼠的源于UC3的膀胱癌(图5B)和源于DU145的前列腺癌(图5C)中，即便处理更大的肿瘤移植物(图5D)，也观察到类似的肿瘤生长抑制效应，并与成像结果显示的一致(图4)。为排除所观察的抗肿瘤效应是种特异性或异种特异性的可能性，我们在标准小鼠肿瘤模型中分析了RGD-4C AAVP-HSVtk的效力。我们选择等基因肿瘤，其中将EF43-FGF4小鼠的乳腺细胞皮下实施给免疫活性小鼠，以诱导高带血管蒂肿瘤快速生长(Hajitou et al.，2001)。首先，抗噬菌体免疫染色显示，RGD-4C AAVP在配体引导下靶向源于EF43FGF4的肿瘤(图10)。给荷带等基因乳腺癌的小鼠静脉内实施RGD-4C AAVP-GFP或非定靶AAVP-GFP3-5分钟的循环时间。不同于非定靶AAVP-GFP，RGD-4C AAVP GFP在肿瘤中呈现强抗噬菌体着色(图10A)。接下来，我们在静脉内实施后7天时用抗GFP抗体进行了免疫荧光实验，以揭示接受RGD-4C AAVP-GFP的小鼠肿瘤中的强GFP表达；相比之下，未在接受非定靶AAVPGFP的小鼠肿瘤中检测到GFP着色；仍检测到抗av整合素抗体在EF43-FGF4肿瘤中的强表达(图10B)。再次实施单次全身剂量的RGD-4C AAVP-HSVtk后实施GCV，发现显著抑制EF43-FGF-4肿瘤生长(图5E～图5G和图6)。不仅如此，当终止治疗后肿瘤重新增大时，重复实施RGD-4C AAVP-HSVtk再一次抑制EF43-FGF4肿瘤生长，并提高荷瘤小鼠的生存率(图5F)。基于噬菌体的粒子被认为具有免疫原性，但可通过靶向自身调节此特性(Trepel et al.，2001)。实际上，尽管血循环中抗噬菌体IgG的滴度极高，RGD-4C AAVP-HSVtk+GCV在接种噬菌体的免疫活性小鼠中仍令人惊讶地有效(图5G)。筛选实验中，使用了各种阴性实验对照组合，包括：仅赋形剂、赋形剂+GCV、非定靶AAVP、非定靶AAVP+GCV、定靶RGD-4C AAVP、定靶RGD-4C AAVP-GFP及定靶RGD-4CAAVP-GFP+GCV(模拟转导)(图6A)。
未检查治疗后效应，发明人对治疗后7天回收的EF43FGF4肿瘤进行了详细的组织病理学分析。观察到由单次全身剂量的RGD-4CAAVP-HSVtk+GCV引起的增强的肿瘤破坏。特别是通过苏木精和曙红(H&E)染色显示，肿瘤的中央区域和只有小的有活力的外边缘均匀破坏；相比之下，非定靶AAVP-HSVtk没有该效应(图6B)。用抗CD31抗体染色证实，肿瘤中心区域的肿瘤血管被破坏，伸向外边缘的脉管系统被保存，但未在用非定靶AAVP-HSVtk处理的肿瘤中观察到破坏作用(图6B)。发明人还评估了肿瘤的标记凋亡细胞的末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP生物素切口末端标记(TUNEL)染色，因为HSVtk/GCV策略与细胞凋亡性死亡有关(Hamel et al.，1996)。在用RGD-4CAAVP-HSVtk+GCV处理的肿瘤中，TUNEL染色检测到了肿瘤中心区域，而非外边缘的凋亡，也未在接受非定靶AAVP-HSVtk嵌合体的小鼠肿瘤中观察到凋亡(图6B)。从用相同的实验方法处理的荷瘤小鼠摘除的对照器官未显示出组织病理性异常(图11)。综上，这些结果显示，维持单次全身剂量的RGD-4C AAVP-HSVtk+GCV可抑制肿瘤生长。
靶向肿瘤不同部分的倾向(即是肿瘤细胞，还是肿瘤血管内皮细胞和/或间质)取决于配体-受体系统和所使用的模型。例如，肿瘤细胞中膜靶物(即αv整合素)的表达从弱(EF43 FGF4)到强(KS1767)变化。然而暂且不论每个所用模型转导(和应用)的特异性最佳剂量，还有检查转基因表达的最佳时间。换言之，报告基因表达的化学计量学性质不仅依赖于个体细胞中报告基因表达的水平和模式，还依赖于增殖的表达转基因的细胞相比死亡的表达转基因的细胞的相对数量。因此，尽管发明人在这些实例中使用了固定的参数，仍可基于个案将这些参数用于进一步确定定靶AAVP的最佳剂量和时帧。
发明人认为通过定靶AAVP(尤其是将其与不同的临床前和临床分子遗传成像设备结合)可解决目前分子癌症学研究中难解的广泛的生物学问题。例如，通过向靶点全身递送含有组织和/或疾病特异性启动子(替换CMV启动子)的配体引导的构建体，可监控其相应体内天然基因的表达；报告分子的所述启动子驱动的转录活性可用于研究细胞运输和移植。几个非侵染性成像应用可通过报告基因反式激活、互补或重构策略用于实验监控细胞内和整个动物内的如底物特异性降解、蛋白-蛋白相互作用及其他分子事件(Luker et al.，2004；De andGambhir，2005；Gross and Piwnica-Worms 2005b)。发明人最近描述了将金纳米粒子和细菌噬菌体用作生物传感器和细胞射靶制剂的网络(Souza et al.，2006)，该技术可与配体引导的AAVP结合，以进一步改进分子遗传成像。换个角度来说，AAVP本身(相比AAV载体)可提供适合的制剂，以研究ITR结构在转基因持久性和染色体整合中的机械原理，因为基于噬菌体的无ITR的构建体可用作阴性实验对照。因此，将很多其他全身性射靶和分子成像的平台及其衍生工具用于相对短的时帧中也相继成为可能。
实施例2：AAVP在将TNF-α靶向肿瘤血管中的用途
A.方法
细胞培养
从Cambrex(Walkersville，Maryland)得到人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并如上所述培养于内皮细胞生长培养液-2(Tandle et al.，2005)。所有实验在HUVEC传至第3-5代时进行。将M21人黑色素瘤细胞培养于含有10％血清、2mM谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、100μg/ml庆大霉素和两性霉素的RPMI1640中。将Pmel细胞培养于含有10％血清、2mM谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、100μg/ml庆大霉素和两性霉素的DMEM培养液中。
构建表达TNF-α/EMAP-II的定靶AAVP
AAVP骨架的总体设计和构建描述于Hajitou等人(2006)的文献中。两步构建表达TNF-α的AAVP构建体。第一步，消化来自pG1SiTNF的880bp的NotI/HindIII片段，并连接到替换了GFP基因序列的pAAV-eGFP/NotI/HindIII载体中(Hwu et al.，1993)。第二步，用PvuII消化fMCS/RGDMCS和AAV-TNF。然后将具有反向末端重复(ITR)的AAV-TNF-α重新连接到fMCS-/RGDMCS的PvuII位点，从而得到AAVP载体。因此，pfdTNF-α是非定靶载体，而pRGDTNF是具有向细胞表面αv整合素受体的结合亲和力的定靶载体。
三步构建表达EMAP-II的AAVP构建体。表达成熟EMAP-II的pET-20b质粒来自位于美国加州拉霍亚的斯克利普斯研究院的PaulSchimmel的捐赠。第一步，从pET-20bEMAP-II扩增EMAP-II序列，使用3个引物合并PCR产物中的限制性内切酶位点和可分泌的信号序列。引物1是在5’末端具有NotI限制性内切酶位点，随后是用于基因产物胞外分泌的信号序列(从pSecTag2载体中设计，Invitrogen，Carlsbad，California)及EMAP-II序列的132bp的正向引物。引物2是引物1的截短型，用于辅助PCR产物扩增。引物3是在3’末端具有HindIII限制性内切酶位点的反向引物。PCR扩增产生具有NorI和HindIII酶切位点和信号肽的667bp的产物。第二步，将EMAP-IIPCR产物克隆到pCRII-TOPO克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，California)中。测序得到的克隆，然后如上所述将667bp的NotI/HindIII片段连接到pAAV-eGFP/NotI/HindIII载体中。第三步，用PvuII消化fMCS/RGDMCS和AAV-EMAP-II并连接得到AAVP载体。因此，pfdEMAP-II是非定靶载体，而pRGDEMAP-II是具有向细胞表面αv整合素受体的结合亲和力的定靶载体。引物1：5’ATTTGCGGCCGCTTTACCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGCGGCCCAGCCGGCCAGGCGCGCCGTAATGTCTAAGCCAATAGATGTT3’(SEQ ID NO：4)；引物2：5’ATTTGCGGCCGCTTTACCACCATGG3’(SEQ ID NO：5)；引物3：5’CCCAAGCTTGGGTTATTTGATTCCACTGTTGC3’(SEQ ID NO：6)。
AAVP粒子纯化
为得到非定靶和定靶AAVP粒子，将DNA电转染到MC1061大肠杆菌(E.Coli)中。从培养物上清中纯化细胞和病毒粒子。从渗透性k91Kan细胞纯化大型AAVP粒子。为测定细菌转导单位(TU)的数量，用噬菌体粒子的连续稀释液感染k91细胞，并平板接种于含有四环素和卡那霉素的Luria-Bertani琼脂平板上，然后通过细菌菌落计数测定TU。
体外噬菌体内化实验
在6-孔组织培养板中过夜培养M21细胞。为研究载体内化，用培养液漂洗细胞，然后用病毒粒子于37℃下感染3小时。温育后，将平板放在冰上5分钟，以中止病毒内化。通过再用Hank’s平衡盐溶液(HBSS)漂洗细胞除去未结合粒子。通过用枯草杆菌蛋白酶(3mg/ml枯草杆菌蛋白酶、20mM Tris pH7.5、2mM EDTA pH8.0，溶于无钙和镁的HBSS中)在冰上处理1小时灭活胞外病毒粒子(Ivanenkow et al.，1999)。然后通过轻轻吹打使细胞离壁，并用2mM EDTA在冰上灭活枯草杆菌蛋白酶15分钟。用溶解缓冲液(10mM Tris pH7.5、2mM EDTApH8.0和2％正钒酸钠)溶解细胞，释放内化的AAVP粒子。如上所述测定内化的AAVP浓度作为TU。
免疫荧光(IF)测定
用IF观察M21细胞中内化的病毒粒子。简言之，于37℃下在含有10％血清的DMEM中用AAVP粒子感染培养于8孔Lab-Tek室玻片(Nunc，Rochester，New York)中的细胞16小时。感染后，用PBS洗细胞，移开小室，用3.7％的多聚甲醛固定细胞10分钟。用含有0.1％皂苷(Sigma，St.Louis，Missouri)的PBS渗透细胞，然后用阻断缓冲液(含有1％ BSA、0.025％叠氮化钠和0.1％皂苷的PBS)阻断15分钟。用渗透缓冲液漂洗后，将细胞与小鼠抗细菌噬菌体抗体温育1小时，再与缀合FITC的抗小鼠IgG抗体温育1小时。分开衬垫，用抗衰剂(Antifade)(MPBiomedicals，Solon，Ohio)给细胞封片，并在Zeiss Axiovert荧光显微镜下检查。
由噬菌体的基因表达
如内化实验，用AAVP粒子感染M21细胞。48小时时更换培养液。第4天和12天时收集培养上清，通过ELISA测量可分泌的细胞因子水平(Invitrogen，Carlsbad，California)。
组织因子(TF)测定
为检测分泌的TNF-α/EMAP-II是否有功能，我们检测了其在内皮细胞(ECs)中诱导TF合成中的能力。简言之，将2×105细胞/孔的HUVEC平板接种于6孔组织培养板上。第二天用M21培养上清在无血清的RPMI培养液中处理细胞6小时。用PBS漂洗细胞，并于室温下与25mM Tris pH7.5温育10分钟。将培养板于-80℃下温育2小时。用组织因子测定缓冲液(20mM Tris pH7.5、150mM NaCl和0.1％ BSA)制备总细胞溶解物。于13,000rpm下离心澄清溶解物10分钟。取100μl溶解物，通过用Amelung KC 4A Micro Coagulation Analyzer(Sigma，St，Louis，Missouri)测量CaCl2存在下缺乏因子VIII的血浆(Geroge King Biomedical Inc，Overl and Park，Kansas)的凝固所需时间分析了组织因子的存在。使用已知浓度的组织因子标绘的标准曲线将缺乏因子VIII的血浆的凝固所需时间转化为组织因子单位。
体内AAVP递送和免疫荧光染色检测
根据NIH动物实验管理委员会批准的流程进行了所有动物实验。无胸腺雌性裸鼠得自Jackson实验室，并饲养于美国癌症研究所的动物饲养设施中。将人黑色素瘤细胞(4×106)皮下接种于裸鼠右胁。测量肿瘤三维，并以长×宽×高×0.52计算肿瘤体积(mm3)。当肿瘤体积达到约100～150mm3时，静脉注射(通过尾静脉)1×1011AAVP粒子。在不同的时间段给动物实施安乐死。将切下来的肿瘤组织和对照组织(肾和肝)冷冻，以做进一步分析。
为检测AAVP的存在，对5μM厚的冰冻切片进行双重IF染色。简言之，用4％的多聚甲醛固定切片5分钟，然后用PBS洗两遍10分钟。用含有1％ Triton-X-100的PBS渗透10分钟。将切片与成像-iT FX信号增强剂于室温(RT)下温育30分钟，然后用含有1％ Triton-X-100的PBS洗三遍。用5％山羊血清于室温下阻断非特异性结合30分钟。于4℃过夜温育第一抗体：抗fd细菌噬菌体抗体(Sigma，St，Louis，Missouri)的1:2000稀释液和抗小鼠CD31(BD Biosciences，San Jose，California)的1:50稀释液。用含有1％ Triton-X-100的PBS洗三遍10分钟，然后与第二抗体(Invitrogen，Carlsbad，California)：山羊抗兔Alexa Fluor 594的1:400稀释液和山羊抗大鼠Alexa Fluor488的1:400稀释液避光温育30分钟。用含有1％ Triton-X-100的PBS洗三遍10分钟，再用PBS洗一遍后，用含有DAPI的Vectashield封片液(Vector labs，Burlingame，California)封片。
TNF-α体内表达
为检测TNF-α蛋白表达，用含有蛋白酶抑制剂混合物(Roche，Branchburg，New Jersey)的溶解缓冲液(50mM Tris pH7.4、140mMNaCl、0.1％SDS、1％NP40和0.5％脱氧胆酸钠)从5μM冷冻组织切片制备总细胞溶解物。于13,000rpm离心10分钟澄清溶解物。使用BioRAD的蛋白测定试剂定量蛋白量。通过ELISA测定相当于50μg总蛋白量的溶解物中的人TNF-α。
为检测TNF-α表达定位，如下染色5μM冰冻组织。简言之，用4％的多聚甲醛固定切片20分钟，然后用PBS洗三遍，每次5分钟，并用5％山羊血清阻断非特异性结合20分钟。切片与抗fd抗体(Sigma，St，Louis，Missouri)的1:200稀释液或TNF-α抗体(NovusBiologicals，Littleton，Colorado)的1:100稀释液，或大鼠抗小鼠CD31(BD Biosciences，San Jose，California)温育1小时，然后用漂洗缓冲液(含有50mM Tris pH7.6和0.02％吐温-20的PBS)洗三遍，每次5分钟。用3％过氧化氢阻断内原性过氧化物酶5分钟后，漂洗并与抗小鼠-HRP或生物素化的驴抗大鼠第二抗体的1:200稀释液温育30分钟。用二氨基联苯胺四盐酸盐底物(Dako，Carpinteria，California)染色切片5分钟，再用苏木精复染30秒，用自来水漂洗，脱水、清洁并封片。
凋亡测定
使用原位凋亡检测试剂盒TACS TdT(R&D System，Minneapolis，Minnesota)，根据生产商的建议检测凋亡。
肿瘤生长分析
将人黑色素瘤细胞(3×106)皮下接种于裸鼠右胁。当肿瘤体积达到约100mm3时，通过尾静脉实施1×1011AAVP粒子。7天后再重复实施一次AAVP粒子。然后每三天以动物不知情的方式测量荷瘤小鼠的肿瘤体积。
统计分析
通过方差分析(ANOVA)和Tukey comparison post test(GraphPadInstat Software，Inc，San Diego，California)比较各组。将P值<0.05视为统计学显著。
B.结果
哺乳动物细胞内化AAVP粒子
之前的研究显示，噬菌体粒子可由整合素介导的受体内化而内化(Hajit ou et al.，2006)。M21细胞在其细胞表面表达αvβ3受体(数据未显示)。为检测M21细胞是否可内化AAVP粒子，我们用AAVP粒子感染细胞后，对内化的噬菌体计数。感染后，通过枯草杆菌蛋白酶处理灭活整个胞外病毒，溶解细胞并回收溶解物中的内化噬菌体。以TU测量内化的AAVP浓度(表6)。相比用定靶空载体(RGD)或表达TNF-α的定靶AAVP(RGDTNF-α)感染的M21细胞，用非定靶空载体(fd)或表达TNF-α的非定靶病毒(fdTNF-α)感染的细胞的AAVP内化最小。
表6  噬菌体内化测定
 
试剂 Pfu/μl 噬菌体粒子总数(102)
PBS 0 0
Fd 3×102 1500
RGD 140×102 70,000
fdTNF-α 6×102 3000
RGDTNF-α 215×102 107,500
使用IF显示M21细胞中内化AAVP粒子的定位。用表达TNF-α的非定靶病毒(fdTNF-α)感染的细胞未显示噬菌体定位(图12A，上图)。相比之下，用表达TNF-α的定靶AAVP(RGDTNF-α)感染的细胞显示在M21细胞内的增强的定位(图12A，下图)。
AAVP介导的基因表达
测定定靶AAVP可感染并定位于哺乳动物细胞内后，我们研究了病毒感染是否可导致基因产物的表达。再用表达TNF-α的AAVP感染M21细胞，并通过ELISA测定了TNF-α基因产物的产生。所述基因产物是可分泌的，且可在培养上清中检测到(图12B)。5天的感染后检测上清显示TNF-α水平是800pg/ml。12天时检测到的基因产物高于4天时。用稀释剂对照(PBS)，非定靶空载体(fd)、表达TNF-α的非定靶病毒(fdTNF-α)和定靶空载AAVP(RGD)感染无可检测水平的TNF-α分泌(图12B)。
为检测AAVP感染的M21细胞分泌的TNF-α是否有功能，我们检测了其在ECs内诱导组织因子(TF)合成的能力。分泌的TNF-α可在ECs内诱导TF表达(图12C)。将重组TNF-α用作阳性对照。可通过温育含有TNF-α单克隆抗体的培养上清阻断TF诱导。感染后23天分析培养上清仍显示有功能的TNF-α分泌(图12C)。因此，用AAVP单次感染直到感染后23天仍可至有功能的基因产物产生。
AAVP体内靶向肿瘤
我们观察到AAVP体外感染哺乳动物细胞及TNF-α基因产物的体外功能性表达。为评估AAVP的体内射靶，将病毒通过尾静脉全身注射给荷瘤裸鼠。
对注射了稀释剂(PBS)或RGDTNF-αAAVP的小鼠于注射后15分钟、1天、2天、3天、4天、8天和10天时实施安乐死。通过双重IF染色分析了肿瘤组织的冷冻切片中病毒粒子的存在。如图13显示，AAVP粒子被染成红色(Alexa Flour 594)，血管被染成绿色(AlexaFlour 488)，DAPI显示核着色。未在注射了PBS的动物于任何时间点观察到AAVP的存在。显示了注射PBS后15分钟的动物肿瘤的有代表性的切片(图13A)。注射了表达RGDTNF-α的AAVP的动物显示病毒粒子在血管中的共定位(图13B-H)。在注射15分钟后的动物中检测到病毒粒子的最多蓄积(图13B)。在所有被检时间点检测到AAVP的存在：1天(图13C)、2天(13D)、3天(图13E)、4天(图13F)、8天(图13G)和10天(图13H)。但我们注意到期间可检测到的病毒粒子逐渐减少。
AAVP不体内靶向正常组织
为检测AAVP在体内靶向肿瘤血管的特异性，我们检测了于不同时间点注射了PBS或表达RGDTNF-的AAVP的裸鼠的两个对照组织(图14和图15)。如上所述，使用双重IF染色检测了病毒的存在。
如图14所示，我们于第1天观察到肝组织中一些病毒粒子着色(图14A)。但在第2天病毒着色降到最低水平(图14B)，到第3天(图14C)、第8天(图14D)和第10天(图14E)就检测不到病毒着色。图15显示肾切片着色，表明存在病毒粒子。但未在任何被检时间点(第1天(图15A)、第2天(图15B)、第3天(图15C)、第8天(图15D)和第10天(图15E))检测到肾中存在AAVP病毒粒子。然而所有肾组织于不同时间点都显示血管被较好着色。
由AAVP的有功能的基因产物的体内表达
为检测靶向肿瘤血管的AAVP粒子是否可表达基因产物，我们通过ELISA重复分析了第3天、第4天、第8天和第10天的肿瘤组织中的TNF-α蛋白水平(图16C)。我们观察了所有被检组织中内原性TNF-α表达的基础水平。注射了PBS的动物未在任何时间点显示任何内原性水平升高。注射了RGDTNF-αAAVP的小鼠在第4天观察到TNF-α表达着色，并逐渐升高至第10天(图16)。
为检测基因产物产生的细胞类型，我们用TNF-α特异性抗体染色了组织切片。我们观察到血管周围存在TNF-α着色(图17A)。为观察对TNF-α表达的影响，我们染色了肿瘤切片的凋亡。用TACS蓝色标记检测到DNA片段化。凋亡细胞被染成蓝色(图17B，左图)。为区别凋亡细胞与坏死细胞，用核坚牢红复染样品，以用形态辅助确认凋亡。我们观察到血管和周围的肿瘤细胞在凋亡。右图显示了用CD31特异性抗体染色的血管(图17B，右图)。
肿瘤生长分析
我们在两个不同肿瘤模型(TNF-α敏感型(M21)和TNF-α耐受型(Pmel))中分析了AAVP对裸鼠的肿瘤移植物生长的影响，以检测表达TNF-α的AAVP的治疗效力。使人黑色素瘤M21肿瘤(其对TNF-α敏感)在裸鼠皮下生长。肿瘤发生后，通过尾静脉注射不同的AAVP构建体或PBS全身处理小鼠。观察所述动物27天。用表达TNF-α的定靶AAVP(RGDTNF-α)处理M21肿瘤显示特有的中心肿瘤坏死和肿瘤皱缩。在第27天(不同同期组群的最后的检测时间点)，经PBS处理的组的肿瘤体积平均值为743±383(±SD)mm3，非定靶fdTNF组的肿瘤体积平均值为613±155(±SD)mm3，定靶空载RGD噬菌体组的肿瘤体积平均值为622±141(±SD)mm3，及表达TNFα的定靶组的肿瘤体积平均值为359±98(±SD)mm3(p<0.048)(图18A)。RGDTNF-α组的肿瘤体积减小从第20天开始统计学显著。
在TNF-α耐受型肿瘤模型中，通过在实施TNF-α前用表达EMAP-II的AAVP预处理人黑色素瘤Pmel肿瘤，将其致敏为TNF-α有效型。我们在之前的研究中证实，用病毒载体递送EMAP-II可将耐受型肿瘤致敏为对全身递送的TNF-α有效。用表达EMAP-II的AAVP全身治疗裸鼠肿瘤皮下生长，再用重组TNF-α(rTNF-α)全身治疗。治疗后对肿瘤观察2周。如图18B所示，用表达EMAP-II的非定靶AAVP(fdEMAP)治疗的小鼠相比仅用PBS处理的小鼠显示出类似的肿瘤生长。仅用rTNF-α或表达EMAP-II的定靶AAVP(RGDEMAP-II)治疗的小鼠显示出很小的效应，与PBS或fdEMAP-II组无显著不同。但经RGD-EMAP-II病毒和rTNF-α联合处理的小鼠显示出肿瘤体积的显著减小(p＝0.007)。
实施例3：人转铁蛋白肽靶向转铁蛋白/转铁蛋白受体系统
用CRTIGPSVC(SEQ ID NO：1)AAVP-Luc转导培养的人神经胶质瘤细胞，将U87人源神经胶质瘤细胞以40,000细胞/孔的密度接种于24孔平板，并于37℃过夜培养。第二天，根据Nature Method的方法将细胞与AAVP温育。将RGD-4C AAVP GFP和RGD-4C AAVP Luc用作测定转导效率的阳性对照。于第7天时成像。噬菌体吸收少，但当细胞培养于铁AAVP水凝胶(平板和图的末栏)(图19A-19B)中时显著升高。我们在向荷带U87源神经胶质瘤细胞的动物全身实施CRTIGPSVC(SEQ ID NO：1)AAVP-Luc后，评估了其特异性和效率。注射噬菌体7天后测量了荧光素酶活性。
参考文献
下述参考文献详细地引入此处作为参考以扩展此处所引用的示例性的方法或者作为其它细节的补充。
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Claims (50)

1.一种治疗受试者的方法，包括：
(a)向患有、怀疑患有病理或疾病情况或具有发生病理或疾病情况的危险的受试者给予编码报告分子的治疗性AAVP；以及
(b)通过检测编码的报告分子或报告分子的活性来评价治疗性AAVP在治疗所靶向的组织或细胞中的原位表达。
2.权利要求1的方法，进一步包括：基于通过AAVP核酸在靶器官、组织或细胞中进行治疗基因的足够治疗水平的表达，给予受试者癌症治疗。
3.权利要求2的方法，如果第一治疗性AAVP的表达未达到治疗上的有效水平，给予第二治疗性AAVP。
4.权利要求1的方法，其中通过对报告分子或报告分子的活性进行非侵入式检测来进行对AAVP表达的评价。
5.权利要求1的方法，其中所述报告分子是治疗蛋白。
6.权利要求5的方法，其中所述治疗蛋白是前药转化酶。
7.权利要求4的方法，其中所述报告分子是酶。
8.权利要求7的方法，其中所述酶是激酶。
9.权利要求8的方法，其中所述激酶是胸苷激酶。
10.权利要求8的方法，其中所述激酶修饰可检测的标记了的化合物。
11.权利要求10的方法，其中所述可检测的标记可通过荧光、化学发光、表面增强拉曼光谱(SERS)、磁共振成像(MRI)、计算机体层扫描摄影(CT)或正电子发射断层摄影(PET)成像检测。
12.权利要求10的方法，其中所述可检测的标记了的化合物是核苷类似物。
13.权利要求10的方法，其中所述可检测的标记的化合物是氟脱氧葡萄糖(FDG)、2′-氟-2′脱氧-1β-D-阿拉伯呋喃糖基-5-乙基-尿嘧啶(FEAU)、5-[123I]-2′-氟-5-碘-1β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶、5-[124I]-2′-氟-5-碘-1β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶、5-[131I]-2′-氟-5-碘-1β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶，5-[18F]-2′-氟-5-氟-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶、2-[11I]-和5-([11C]-甲基)-2′-氟-5-甲基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶、2-[11C]-2′-氟-5-乙基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶、5-([11C]-乙基)-2′-氟-5-乙基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶、5-(2-[18F]-乙基)-2′-氟-5-(2-氟-乙基)-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶，5-[123I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶、5-[124I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶、5-[131I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶、5-[123I]-2′-氟-5-碘-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶、5-[124I]-2′-氟-5-碘-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶、5-[131I]-2′-氟-5-碘-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶、5-[123I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶、5-[124I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶、5-[131I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶、或9-4-[18F]氟-3-(羟甲基)丁基]鸟嘌呤。
14.权利要求10的方法，其中所述可检测的标记包括18F、277Ac、211At、128Ba、131Ba、7Be、204Bi、205Bi、206Bi、76Br、77Br、82Br、109Cd、47Ca、11C、14C、36Cl、48Cr、51Cr、62Cu、64Cu、67Cu、165Dy、155Eu、153Gd、66Ga、67Ga、68Ga、72Ga、198Au、3H、166Ho、111In、113In、115In、123I、125I、131I、189Ir、191Ir、192Ir、194Ir、52Fe、55Fe、59Fe、177Lu、15O、191Os、109Pd、32P、33P、42K、226Ra、186Re、188Re、82Rb、153Sm、46Sc、47Sc、72Se、75Se、105Ag、22Na、24Na、89Sr、35S、38S、177Ta、96Tc、99mTc、201T1、202T1、113Sn、117mSn、121Sn、166Yb、169Yb、175Yb、88Y、90Y、62Zn、或65Zn。
15.权利要求14的方法，其中所述可检测的标记是131I、125I、123I、111I、99mTc、90Y、186Re、188Re、32P、153Sm、67Ga、201T1、77Br、或18F标记。
16.权利要求1的方法，其中所述AAVP包含选择性靶向治疗所针对的组织或细胞的部分。
17.权利要求16的方法，其中所述部分被AAVP的衣壳蛋白编码。
18.权利要求17的方法，其中所述表面蛋白是重组衣壳蛋白。
19.权利要求18的方法，其中所述重组衣壳蛋白包含靶向肽。
20.权利要求19的方法，其中所述靶向肽是环肽。
21.权利要求19的方法，其中所述靶向肽是线形肽。
22.权利要求19的方法，其中所述靶向肽选择性地结合到在细胞表面表达整联蛋白的细胞上。
23.权利要求20的方法，其中所述整联蛋白是αvβ3或αvβ5整联蛋白。
24.权利要求22的方法，其中所述肽包含RGD基序。
25.权利要求19的方法，其中所述肽选择性地结合表达转铁蛋白受体的细胞。
26.权利要求25的方法，其中所述肽包含含有CRTIGPSVC的氨基酸序列。
27.权利要求1的方法，其中所述受试者患有过增生疾病、被怀疑患有过增生疾病、或具有发展为过增生疾病的危险。
28.权利要求27的方法，其中所述过增生疾病是纤维肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、胃癌、食道癌、直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、头颈癌、皮肤癌、脑癌、鳞状细胞癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、肺癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母肿瘤、子宫颈癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、或卡波西氏肉瘤。
29.权利要求1的方法，其中所述报告分子基因可操作地连接到组织或细胞选择性启动子上，或组织或细胞特异性启动子上。
30.权利要求1的方法，其中对表达的评价包括给予被表达AAVP核酸的细胞所代谢的标记。
31.权利要求1的方法，其中所述的治疗性AAVP编码第二治疗基因。
32.权利要求31的方法，其中所述的第二治疗基因是肿瘤抑制子、抑制性RNA、抑制性DNA、或前药转化酶。
33.治疗性AAVP核酸，其包含含有抑制性RNA或抑制性DNA的核酸片段。
34.权利要求33的核酸，其中所述抑制性RNA是siRNA、miRNA或反义RNA。
35.一种包含权利要求33的AAVP核酸的噬菌体颗粒。
36.权利要求35的噬菌体颗粒，进一步包含靶向配基。
37.调节基因表达的方法，包括给予权利要求26的AAVP核酸。
38.检测转移到受试者靶组织并在其中表达的基因的方法，包括：
(a)向宿主受试者靶组织中递送含有在宿主受试者中非天然存在的报告基因的AAVP载体，其中所述报告基因选自于野生型的、突变的、或遗传工程改造过的单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因或2型人胸苷激酶基因，并且其中所述转移载体被引入到靶组织的细胞中，并且所述报告基因在靶组织的细胞中表达，由此产生只在被AAVP载体有效转染的细胞中积累的报告基因产物(蛋白质)；
(b)向宿主受试者给予标记的报告底物，表达步骤(a)的报告基因产物的细胞代谢该标记的报告底物，产生标记的报告代谢产物，其中所述的标记的报告底物包括放射标记的核苷类似物；和
(c)在清除未被报告基因产物从所述宿主受试者中代谢去除的残留报告底物后，对含有标记的报告底物代谢产物的靶组织或细胞进行非侵入式成像，由此检测转移到靶组织中并在其中表达的基因。
39.权利要求1的方法，其进一步包括在步骤(b)后等待一段时间，所述时间足以使至少67％的、来自于未被报告基因产物代谢掉的残留报告底物的非特异标记物清除出受试者。
40.权利要求1的方法，其进一步包括在步骤(b)后等待一段时间，所述时间足以使至少80％的、来自于未被报告基因产物代谢掉的残留报告底物的非特异标记物清除出受试者。
41.权利要求1的方法，进一步包括在步骤(b)后等待一段时间，所述时间足以使至少90％的、来自于未被报告基因产物代谢掉的残留报告底物的非特异标记物清除出受试者。
42.权利要求1的方法，其中通过体外或体内转染或转导将所述AAVP载体引入到靶组织的细胞中。
43.权利要求1的方法，其中用适用于正电子发射断层摄影术、伽马照相或单光子发射计算体层摄影成像的放射性同位素标记报告底物。
44.权利要求1的方法，其中报告底物和报告底物的代谢产物是含有稳定同位素核素的化合物，所述同位素核素选自于2H，13C，15N和19F。
45.权利要求1的方法，其中通过正电子发射断层摄影对所述的标记的报告底物代谢产物进行成像。
46.权利要求1的方法，其中通过伽马照相或单光子发射计算体层摄影对所述的标记的报告底物代谢产物进行成像。
47.权利要求1的方法，其中通过磁共振成像对标记的所述的报告底物代谢产物进行成像。
48.权利要求1的方法，其中所述的AAVP载体，掺入报告基因和合适的转录启动子和增强元件，来确保报告基因和治疗基因共表达的组织特异性的、或转录因子特异性的、或信号转导特异性的转录激活。
49.权利要求48的方法，其中在将细胞给予到宿主受试者之前，离体(体外)使用AAVP载体对所述细胞转染报告基因和合适的转录启动子和增强子元件。
50.权利要求38的方法，其中所述标记的2′-氟-核苷类似物是5-[123I]-2′-氟-5-碘-1β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；5-[124I]-2′-氟-5-碘-1β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；5-[131I]-2′-氟-5-碘-1β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶，5-[18F]-2′-氟-5-氟-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；2-[11I]-和5-([11C]-甲基)-2′-氟-5-甲基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；2-[11C]-2′-氟-5-乙基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；5-([11C]-乙基)-2′-氟-5-乙基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；5-(2-[18F]-乙基)-2′-氟-5-(2-氟-乙基)-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶，5-[123I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；5-[124I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；5-[131I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；5-[123I]-2′-氟-5-碘-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶；5-[124I]-2′-氟-5-碘-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶；5-[131I]-2′-氟-5-碘-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶；5-[123I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶；5-[124I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶；5-[131I]-2′-氟-5-碘代乙烯基-1-β-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶；或9-4-[18F]氟-3-(羟甲基)丁基]鸟嘌呤。
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