CN101444228B - 一种海洋放线菌发酵提取物及其组合物和在抗生物污损的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种海洋放线菌(Salinispora pacifica)SCSIO 00013发酵提取物在抗生物污损方面的应用。其特征是通过将海洋放线菌SCSIO 00013菌种接种到高氏一号培养基中发酵，将得到菌丝体和发酵液分离后分别用有机溶剂提取，浓缩并合并提取物得到粗提取物，将粗提取物悬浮于水，用氯仿或乙酸乙酯萃取，将萃取物经常压硅胶柱层析，以氯仿-丙酮等溶剂系统为洗脱剂，进行梯度洗脱，馏分进行薄层层析分析，以以体积比4∶1的氯仿-丙酮为溶剂展开系统，收集比移值R_f 0.20～0.75的馏分，合并并除去色素，得到目标提取物。本发明的发酵提取物可用于抗海洋生物污损，由该发酵提取物与成膜材料组成的涂料不含重金属，对环境无害，可用于海洋珍珠贝的养殖中。

Description

一种海洋放线菌发酵提取物及其组合物和在抗生物污损的应用 

技术领域

本发明涉及一种海洋放线菌发酵提取物及其组合物和在抗生物污损方面的应用，具体来说涉及了由海洋放线菌(Salinispora pacifica)SCSIO 00013发酵得到的提取物及含有该提取物的组合物和该提取物在抗海洋生物污损方面的应用。

海洋水产养殖中的水下设施，如网箱，船体，捕鱼网，浮标，排水管等，常容易受到来自于海洋细菌、海洋真菌、海洋藻类、海洋原生动物和软体动物等海洋生物的污损，这些污损生物还会在水下设施上最终形成污损生物群落，从而增加了水下设施的能耗和重量，降低了效率和速度，还会堵塞管路，降低营养物质和氧的输送，甚至导致海洋养殖产品的死亡。生物腐蚀和生物污损几乎是同时存在的，而且还存在着相互促进的关系，即生物污损能够加速生物腐蚀的速度，生物腐蚀又能促使污损生物的进一步聚集，以海洋水产养殖为例，生物污损导致网箱、珍珠贝笼等的堵塞，养殖的水产品鱼、虾、贝等的缺氧或缺养料而死亡，另外污损生物附着在船体上增加了船体的重量，加大了阻力，降低了船体的动力效率，增加了油耗，使船体的腐蚀进一步加快，因而大大缩短了船体的使用寿命。因为海洋生物污损的巨大破坏作用，每年导致的直接经济损失就达到几十亿美元。

现阶段对海洋污损的处置措施主要是人工或机械的物理清除法和采用化学品的化学清除法。但是物理清除法效率太低，化学清除法所用的化学品毒性又太大，势必影响周边的海洋环境。

本发明的目的在于通过海洋放线菌开发出无毒并能高效抗生物污损的物质，另一目是提供其组合物，进一步的目的是开发出这种物质在抗海洋生物污损方面的应用。

我们通过将海洋放线菌(Salinispora pacifica)SCSIO 00013菌种用高氏一号培养基培养，得到的菌丝体和发酵液用有机溶剂提取后，再经硅胶柱梯度洗脱，得到的混合物无毒且具有抗海洋生物污损的特性，与成膜材料混合后涂布于水下设施表面，能有效地防止海洋生物对水下设施表面的污损，从而实现了本发明的目的。

本发明的海洋放线菌发酵提取物，其特征是由海洋放线菌(Salinispora pacifica)SCSIO00013通过下述的步骤发酵得到的：

(1)将海洋放线菌SCSIO 00013菌种接种到有高氏一号培养基的摇瓶中，在摇床上温度28℃，速度40转/分钟，培养3天后，再转接到种子瓶中，经过在高氏一号培养基中，温度28 ℃，速度40转/分钟，培养7天后，转接到有高氏一号培养基的摇瓶中，在温度28℃，速度40转/分钟，培养10天，然后将得到菌丝体和发酵液分离，所述的高氏一号培养基，pH 7.0～7.2，每升水含可溶性淀粉10～30g，K₂HPO₄ 0.5～1g，KNO₃ 0.5～1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5～1.0g，海盐1.5％～3％；

(2)将步骤(1)的菌丝体和发酵液分别用溶剂提取，浓缩得到提取物1和提取物2，然后将两提取物合并，得到粗提取物，所述的菌丝体溶剂提取是用超声波破坏细胞壁，再用乙酸乙酯进行提取，所述的发酵液溶剂提取是用乙酸乙酯进行提取；

(3)将步骤(2)得到的粗提取物悬浮于水，用乙酸乙酯萃取，浓缩得到乙酸乙酯萃取物；

(4)将步骤(3)得到的乙酸乙酯萃取物进行常压硅胶柱层析，以氯仿-甲醇溶剂系统为洗脱剂，按照体积比10∶0到0∶10的梯度进行洗脱，馏分进行薄层层析分析，以体积比4∶1的氯仿-丙酮为溶剂展开系统，收集比移值R_f 0.20～0.75的馏分，合并并除去色素，得到产物。

步骤(1)所述的分离可以采用常规的方法例如离心分离等。

所述的海洋放线菌(Salinispora pacifica)SCSIO 00013是公知的菌株(见参考文献：Jensen P R，Mafnas C.Environmental microbiology，2006，8：1881-1888)，本申请人保证自申请日起的20年内提供该菌种。该菌株于2006年9月分离自南海北部(116°19.945E，20°36.012′N)，水深657米的灰色沙沉积环境，是嗜盐菌，可以采用高氏一号培养液或者其他加盐培养液培养，属放线菌类，其16Sr RNA基因序列与2005年发表的海洋放线菌S.pacifica相比较，相似性达到99％以上，系统分析其与S.pacifica有最近亲缘关系。故该菌鉴定为S.pacifica的一个菌株SCSIO 00013。

本发明海洋放线菌发酵提取物的制备方法同上述。

含有本发明海洋放线菌发酵提取物的组合物，其特征在于由本发明的海洋放线菌发酵提取物和成膜材料组成。所述的成膜材料是合成树脂，天然树脂等。将本发明的由海洋放线菌生产的混合物与成膜材料如合成树脂，天然树脂等混合，使之成膜，再涂布到水下设施的表面上。

通过实验发现本发明的海洋放线菌发酵提取物具有很好的抗菌活性，抗藤壶幼虫附着活性浓度IC₅₀是25.61μg/mL，证明可用于抗海洋生物污损；该提取物对企鹅珍珠贝的LC₅₀＞1000μg/mL，认为该提取物对企鹅珍珠贝幼苗无毒，可用于珍珠贝养殖中抗生物污损。

本发明通过简单的提取方法从海洋放线菌中得到无毒的，能高效地抗海洋生物污损的提取物，由这种混合物制得的涂料不含重金属，对环境无害，可以应用于海洋珍珠贝的养殖和船体等水下设施中的抗生物污损。

以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于以下实施例。

实施例1：

将海洋放线菌(Salinispora pacifica)SCSIO 00013菌种接种到2个经过灭菌的500mL摇瓶中，摇瓶中的培养基为高氏一号培养基(pH 7.0～7.2，每升水含可溶性淀粉10～30g，K₂HPO₄ 0.5～1g，KNO₃ 0.5～1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5～1.0g，海盐1.5％～3％，)，在摇床上温度28℃，速度40转/分钟，培养3天后，分别转接到10个种子瓶中，经过在高氏一号培养基中，温度28℃，速度40转/分钟，培养7天后，把20个种子瓶的放线菌转接到500mL的摇瓶中，摇瓶盛150mL的高氏一号培养基，培养条件是温度28℃，速度40转/分钟，培养10天，待放线菌大量发酵后，用大型离心机离心分离菌丝体和发酵液。将发酵液用等体积的乙酸乙酯提取三次，合并提取液，得到提取液1。用超声波超声处理菌丝体，再用等体积的乙酸乙酯提取三次，合并提取液，得到提取液2。分别将提取液1和提取液2减压浓缩，得到黑褐色物质3.2g。

将上述黑褐色物质悬浮于100mL重蒸水中，然后用等体积的乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物。将乙酸乙酯萃取物过粒径40～60μm，64g的硅胶柱，以氯仿-甲醇为溶剂系统，从10∶0到0∶10进行梯度洗脱，流速2滴/秒，馏分进行薄层层析分析，以体积比4∶1氯仿-丙酮为溶剂展开系统，收集比移值R_f0.20～0.75的馏分，合并并用Sephadex LH-20凝胶柱除色素，得到0.55g本发明的提取物。

实施例2：实施例1提取物抗菌和抗污损生物幼虫附着活性试验

采用琼胶扩散法测定抗菌活性。在涂布细菌的琼胶板上放置浸有50μg目标提取物的无菌纸片(5mm i.d.)，抑菌圈大小单位用mm表示。浸有同样体积DMSO的纸片做空白对照，加有利福平(3-[[(4-甲基-1-哌嗪基)亚氨基]甲基]-利福霉素)的纸片做阳性对照。然后在室温下培养24小时后，测量抑菌圈大小。抗菌结果见表1。

表1目标提取物和利福平的抗菌活性(抑菌圈L的大小单位，mm；每片含量，50μg/disc)

表1中抑菌圈L的大小由游标卡尺测量，不规则形状大小的抑菌圈取平均值(L＝R-r)。由表1显示可知，提取物的抗菌活性较强，特别对幼虫附着诱导菌Staphylococcushaemolyticus，Pseudoalteromonas sp.，Vibrio halioticoli和Rhodovuium sp.具有较强的抑制作用。

实施例3：实施例1提取物抗污损生物幼虫附着活性试验

采用24孔板分别测定实施例1提取物的抗藤壶幼虫附着活性。每个板孔中加入1mL含有10～15个成熟的藤壶幼虫的培养液，实施例1提取物溶于DMSO中，然后用灭菌海水稀释成不同的浓度。每个浓度3个平行，无菌海水做空白对照。将培养板置于室温下培养24小时，在解剖镜下统计附着的幼虫数，用SPSS程序进行统计分析。统计结果见表2：

表2实施例1提取物在不同浓度下藤壶幼虫的附着率(％)

从表2可以看到：跟DMSO对照比对，实施例1提取物4个浓度的幼虫的附着率只有0.1μg/mL为60％，没有明显差异，其它3个浓度都有明显差异。

根据幼虫附着抑制率＝(空白对照-附着率)/空白对照×100％计算化合物的抗幼虫附着活性。

通过分析得到以下结论：(1)实施例1提取物的抗幼虫附着活性浓度IC₅₀是25.61μg/Ml；(2)目标提取物具有抗藤壶幼虫附着的活性。

实施例4：实施例1对珍珠贝幼苗的致死试验

采用小玻璃试管分别测定实施例1提取物对培养7天的珍珠贝幼苗的致死试验。每个小烧杯中加入2mL含有10～15个成熟的企鹅珍珠贝幼苗培养液，实施例1提取物溶于DMSO中，然后用灭菌海水稀释成不同的浓度。每个浓度3个平行，无菌海水做空白对照。将培养板置于室温下培养24小时，在放大镜下统计死亡幼苗数，用LD₅₀程序进行统计分析。统计结果见表3：

表3不同浓度下的实施例1目标提取物对培养7天的企鹅珍珠贝的致死率(％)

根据校正死亡率＝(对照组存活率-处理组存活率)/对照组存活率×100％计算实施例 1提取物对企鹅珍珠贝的致死率和致死浓度。

通过分析得到以下结论：目标提取物对企鹅珍珠贝的LC₅₀＞1000μg/mL，认为化合物对企鹅珍珠贝幼苗无毒。

实施例5：用于珍珠贝养殖中抗生物污损的含本发明提取物的组合物的制备

采用现有制备涂料的技术，在涂料中加入本发明涉及的抗生物污损活性提取物。例如，将本发明的活性提取物掺入合成树脂，天然树脂或者其它成膜材料中，制备，使之成膜，再涂布到珍珠贝养殖过程中使用的箱笼或者其它水下设施上。

Claims (4)

1.一种海洋放线菌发酵提取物，其特征是由海洋放线菌(Salinispora pacifica)SCSIO00013通过下述的步骤发酵得到的：

(1)将海洋放线菌SCSIO 00013菌种接种到有高氏一号培养基的摇瓶中，在摇床上温度28℃，速度40转/分钟，培养3天后，再转接到种子瓶中，经过在高氏一号培养基中，温度28℃，速度40转/分钟，培养7天后，转接到有高氏一号培养基的摇瓶中，在温度28℃，速度40转/分钟，培养10天，然后将得到菌丝体和发酵液分离，所述的高氏一号培养基，pH 7.0～7.2，每升水含可溶性淀粉10～30g，K₂HPO₄ 0.5～1g，KNO₃0.5～1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5～1.0g，海盐1.5％～3％；

(2)将步骤(1)的菌丝体和发酵液分别用溶剂提取，浓缩得到提取物1和提取物2，然后将两提取物合并，得到粗提取物，所述的菌丝体溶剂提取是用超声波破坏细胞壁，再用乙酸乙酯进行提取，所述的发酵液溶剂提取是用乙酸乙酯进行提取；

(3)将步骤(2)得到的粗提取物悬浮于水，用乙酸乙酯萃取，浓缩得到乙酸乙酯萃取物；

(4)将步骤(3)得到的乙酸乙酯萃取物进行常压硅胶柱层析，以氯仿-甲醇溶剂系统为洗脱剂，按照体积比10∶0到0∶10的梯度进行洗脱，馏分进行薄层层析分析，以体积比4∶1的氯仿-丙酮为溶剂展开系统，收集比移值R_f0.20～0.75的馏分，合并并除去色素，得到产物。

2.一种含有权利要求1所述提取物的组合物，其特征在于由权利要求1所述的海洋放线菌发酵提取物和成膜材料组成。

3.权利要求1所述的海洋放线菌发酵提取物在抗海洋生物污损的应用。

4.权利要求3所述的海洋放线菌发酵提取物的应用，是在珍珠贝养殖中抗海洋生物污损的应用。