CN101440373B

CN101440373B - 一种截短型的18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白l1基因

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Publication number: CN101440373B
Application number: CN200710170936A
Authority: CN
Inventors: 张高峡; 沈琼; 雷建强; 袁靖宇; 张梦华; 吴克
Original assignee: Shanghai Zerun Biotech Co Ltd
Current assignee: Shanghai Zerun Biotech Co Ltd
Priority date: 2007-11-23
Filing date: 2007-11-23
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2027-11-23
Also published as: CN101440373A

Abstract

本发明提供了一种截短型的18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因以及表达该基因的毕赤酵母表达菌株。本发明提供的L1蛋白的基因序列为毕赤酵母偏爱密码子优化，并对最优的密码子频率进行一定的修正的表达L1蛋白的基因序列。本发明提供的截短型的18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因是一种优化过的L1基因，具有以下优点：经过优化的基因更适合在酵母宿主中高效率表达目标蛋白，而且能够满足工业化生产的要求；同时，而且由于采用毕赤酵母表达系统，因此成本低，产量高，且产品性质更加均一稳定。

Description

一种截短型的18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种人乳头状瘤病毒衣壳蛋白基因，更具体地说，涉及一种截短型的18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因。

背景技术

全球每年有约50万妇女患宫颈癌，其中约27万因宫颈癌死亡(80％以上在发展中国家)，宫颈癌发病率仅次于乳腺癌的。

宫颈癌发病与人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染有直接关系，采用灵敏的检测方法，可以从几乎100％的宫颈癌患者病变组织中检测到高危HPV-DNA。虽然，目前已经确定的HPV型超过100种，但在全世界范围内，虽然只有约14％的宫颈癌患者由HPV-18感染引起，但是，由于HPV18与更具侵略性生长的癌有关并且在较温和的癌前病变(即CINI-II)中很少发现，因此，开发抗HPV18感染的疫苗变得尤其必要。

乳头状瘤病毒是一种DNA病毒，有两个后期基因病毒基因组的开放读码框架(ORF)，用于编码病毒衣壳蛋白，分布被命名为L1和L2。其中，L1蛋白是较大的衣壳蛋白，分子量为55-60kDa，L2蛋白是较小的衣壳蛋白，在病毒壳粒中大多数L2蛋白在L1蛋白内部，而且L1的ORF在不同乳头状瘤病毒之间是高度保守的，而L2蛋白在不同乳头状瘤病毒之间几乎不保守，因此，开发宫颈癌疫苗时，针对衣壳蛋白L1开发具有更好的针对性。

同时，根据现有研究结果，L1基因是一个好的免疫预防靶。在细菌中表达的L1蛋白或使用疫苗载体的L1蛋白用于免疫，可保护动物不受病毒感染。在杆状病毒表达系统中表达乳头状瘤病毒L1基因中或使用疫苗载体导致组装成病毒样颗粒(VLPs)，该病毒样颗粒已经用于诱导与保护免受病毒侵袭有关的高效价病毒中和抗体应答，因此，开发针对衣壳蛋白L1的宫颈癌疫苗是可实现的。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供一种优化的截短型的18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因，以用于开发宫颈癌疫苗。

本发明还有一个目的在于，提供一种表达截短型的18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因的毕赤酵母表达载体。

本发明还有一个目的在于，提供一种表达截短型的18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因的毕赤酵母表达菌株。

本发明还有一个目的在于，提供一种表达截短型的18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因的毕赤酵母表达菌株的构建方法。

本发明的第一个目的通过以下方法实现：首先，对天然的HPV 18L1基因进行改造，对其所有的氨基酸全部采用使用频率最高的密码子，设计出一个全新的HPV DNA序列；然后，为了避免翻译出来的mRNA的GC比例过高，mRNA的二级结构对翻译效率的影响，避开一些常用的酶切位点，对最优的密码子频率进行修正，例如将天冬酰胺(Asn)最高频率密码子AAC修正为AAT；赖氨酸(Lys)最高频率密码子AAG修正为AAA；天冬氨酸(Asp)最高频率密码子GAT修正为GAC；苯丙氨酸(Phe)最高频率密码子TTT修正为TTC；酪氨酸(Tyr)最高频率密码子TAC修正为TAT，甘氨酸(Gly)最高频率密码子GGT修正为GGA，设计出两个HPV DNA序列，最后将获得的三个HPV DNA序列的N端的61个氨基酸缺失，从而设计出三个全新的HPV DNA序列，并合成经过修正和N端缺失的全新的HPV DNA序列。

本发明的第二个目的通过以下方法实现：将合成的L1基因与毕赤酵母表达载体连接，从而构建截短型的HPV 18L1基因的毕赤酵母表达载体。

本发明的第三个目的通过以下方法实现：将获得的上述毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母菌，从而构建截短型的HPV 18L1毕赤酵母表达菌株。

根据本发明的一个优选实施例，本发明提供的HPV 18L1蛋白为胞内表达蛋白。

本发明提供的截短型的18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因是一种优化过的L1基因，具有以下优点：经过优化的基因更适合在酵母宿主中高效率表达目标蛋白，而且能够满足工业化生产的要求；同时，由于采用毕赤酵母表达系统，因此成本低，产量高，且产品性质更加均一稳定。

附图说明

图1是pPICZ-18L1载体构建示意图。

图2是HPV 18L1基因PCR扩增图。

图3是pPICZ-18L1载体鉴定图，其中，泳道1为经BstBI+KpnI双酶切的pPICZαB；泳道2为BstBI+KpnI双酶切的pPICZ-18L1。

图4是HPV 18 L1表达Western-Blot鉴定结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。

本发明的实施例中DNA延伸和PCR扩增，均采用购自Stratagene公司的热启动Pfu酶。

本发明的实施例中，使用的pUC18质粒购自捷瑞公司，pPICZaB质粒购自Invitrogen公司。

本发明的实施例中，使用的HPV18 L1的VLPs的兔多抗由上海普欣生物技术有限公司制备，MAB885鼠单抗购自CHEMICON公司，HRP标记的羊抗小鼠IgG购自北京鼎国公司。

本发明的实施例中，使用的BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物责任有限公司。

本发明的实施例中，纯化步骤中使用的清洗缓冲液配方为：100mM PB pH7.0，0.15MNaCl；破菌缓冲液200mM MOPS，pH7.0，0.4M NaCl，0.05％Tween-80；

实施例1、截短型的HPV 18的密码子优化的L1基因的设计与合成

1.1、截短型的HPV 18的密码子优化的L1基因的设计

本发明涉及经过毕赤酵母偏爱密码子优化的编码截短型的18型人乳头状瘤病毒(HPV18)主要衣壳蛋白L1的DNA分子，通过密码子最优化和对最优密码子频率进行一定修正并截短N端部分61个氨基酸，获得三段DNA序列，其序列分别如SEQ ID NO：1、2和3所示，具体如下：

首先，对天然的HPV 18L1基因进行改造，对其所有的氨基酸全部采用使用频率最高的密码子，设计出一个全新的HPV DNA序列。

然后，为了避免翻译出来的mRNA的GC比例过高，mRNA的二级结构对翻译效率的影响，并避开一些常用的酶切位点，对最优的密码子频率进行一定的修正，例如将天冬酰胺(Asn)最高频率密码子AAC修正为AAT；赖氨酸(Lys)最高频率密码子AAG修正为AAA；天冬氨酸(Asp)最高频率密码子GAT修正为GAC；苯丙氨酸(Phe)最高频率密码子TTT修正为TTC；酪氨酸(Tyr)最高频率密码子TAC修正为TAT，并截短N端部分61个氨基酸，从而，设计出三个全新的截短型的HPV DNA序列，其中：

SEQ ID NO：1为未进行密码子修正的DNA序列；

SEQ ID NO：2是SEQ ID NO：1序列中修正天冬酰胺(Asn)，赖氨酸(Lys)，天冬氨酸(Asp)这三个密码子所得的DNA序列；

SEQ ID NO：3是SEQ ID NO：1序列中修正苯丙氨酸(Phe)，酪氨酸(Tyr)，甘氨酸(Gly)这三个密码子所得的DNA序列。

1.2、截短型的HPV 18的密码子优化的L1基因的合成

合成如序列SEQ ID NO：1所示的HPV 18的密码子优化的L1基因，其所需的引物组共有引物32个，分别为引物181，182，183，184，185，186，187，188，189，1810，1811，1812，1813，1814，1815，1816，1817，1818，1819，1820，1821，1822，1823，1824，1825，1826，1827， 1828，1829，1830，1831，1832，上述引物序列分别如SEQ ID NO：4-35所示，其中每4条用下划线相连的引物间形成一个互补群，可通过PCR构建寡聚体片段，并进而构建密码子优化的截短型的HPV 18的L1基因。具体构建方法如下：

1.2.1、寡聚体片段构建

将引物互补对181，182，183和184的在51℃退火延伸10个循环，获得PCR扩增用模板，接着，用相应的两侧引物181和184进行PCR扩增，将获得的PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收获得大小约为200bp的目标片段(片段A)。

同时，采用上述相同的方法，分别使用引物互补群185，186，187和188；189，1810， 1811和1812；1813，1814，1815和1816；1817，1818，1819和1820；1821，1822，1823 和1824；1825，1826，1827和1828；1829，1830，1831和1832制备获得相应的寡聚体片段B，C，D，E，F，G和H。

1.2.2、全长的密码子优化的HPV 18L1基因构建

分别将4个形成互补寡聚群的寡聚体(片段A，片段B，片段C和片段D；片段E，片段F，片段G和片段H)在50℃退火延伸10个循环，获得PCR扩增用模板，而后用相应的两侧引物(前一片段用引物181和1816，后一片段用引物1817和1836)进行PCR扩增，将获得的PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳进行分离，胶回收目标片段，获得2个大小约为750bp的DNA片段，分别命名为片段I，片段J。

再将上步获得的片段I和片段J在51℃退火延伸10个循环，获得PCR扩增用模板，然后用引物a1和a2作为引物，进行PCR扩增，引物a1和a2序列如下所示：

a1：5’-ATAGAATTCATGGCTTTGTGGAGACCTTC-3’；

a2：5’-ATTGGTACCTTACTTTCTAGCTCTAACTCTA-3’。

将获得的PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳进行分离，胶回收目标片段，获得大小约为1.5kbp的片段，并将该片段测序，该片段的序列测序结果如SEQ ID NO：1所示，根据测序结果显示该片段即是全长的密码子优化的截短型的HPV 18L1基因。获得的HPV 18L1基因两端以EcoRI和KpnI酶切位点装入pUC18质粒(捷瑞公司)中，命名为pUC-18L1，并经测序验证为正确。

按照类似的方法获得SEQ ID NO：2和3所示的截短型的HPV 18的密码子优化的L1基因。

为验证优化序列的可行性，下面以实施例1制备获得的HPV 18L1基因优化序列中的一个(SEQ ID NO：1)为例，构建表达质粒并验证其表达。

实施例2、截短型的HPV 18L1基因的表达载体构建

将SEQ ID NO：1的优化序列克隆到毕赤酵母表达载体中，构建方法如图1所示，具体步骤如下：

2.1、合成扩增HPV 18L1所需的正向引物和反向引物，序列如下所示：

正向引物：5’-TCCCAATCTTCGAAACGATGGCTTTGTGGA-3’；

反向引物：5’-AATGGTACCCTATTACTTTCTAGCTCTAACT-3’。

其中，正向引物包括一个BstBI限制性内切酶位点；反向引物包括位于终止密码子侧翼的KpnI限制性内切酶位点，所述酶切位点分别如引物序列中的下划线所示。

2.2、用上述引物对为引物，以实施例1获得的pUC-18L1’为模板，进行PCR扩增，将扩增获得的产物进行电泳检测，结果如图2所示，证明获得了全长密码子优化的截短型HPV 18L1基因；将扩增获得的PCR片段，经限制性内切核酸酶BstBI和KpnI双酶切消化，再与BstBI/KpnI双酶切消化的pPICZaB(Invitrogen公司)连接。再用连接液转化大肠杆菌菌株Top10(捷瑞公司)的感受态细胞，铺板于含25μg/ml零霉素的LB琼脂上。

由于pPICZaB载体上携带有零霉素抗性基因，因此转化细胞能够在含零霉素的LB培养基上生长。分离已转化细胞的单菌落，制备质粒DNA，并经限制性图谱(结果如图3所示)和核苷酸序列分析检测HPV 18L1基因和载体序列，鉴别出包含截短型的HPV 18L1基因的正确构建体，命名为pPICZ-18L1’，由于构建的质粒的分泌信号(a-factor signal)已经被切去，因此，表达的HPV 18L1蛋白应该是胞内表达蛋白。

实施例3、截短型的HPV 18L1基因的表达菌株构建和表达

3.1、截短型的HPV 18L1基因的表达菌株构建

用Sac I限制性内切酶单酶切pPICZ-18L1’质粒使其线性化，对空质粒pPICZaB进行同样的酶切作为阴性对照。

酶切反应液加入无水乙醇，获得DNA沉淀，用少量双蒸水溶解线性化的pPICZ-18L1’片段，电击转化毕赤酵母菌X-33(Invitrogen公司)，电转化条件为：

DNA片段5微克，电压1500伏，电阻25欧姆，电击时间为5毫秒。

将电转化产物铺板于含200ug/ml零霉素(Zeocin公司)的YPDS琼脂上，由于pPICZaB载体上携带有零霉素抗性基因，因此转化产物能够在含零霉素的YPDS琼脂上生长。分离已转化细胞的单菌落，即为截短型的HPV 18L1的毕赤酵母表达菌株。

3.2、截短型的HPV 18L1毕赤酵母表达菌株的表达

将获得的截短型的HPV 18L1毕赤酵母表达菌株接种至含1000ug/ml、1500ug/ml零霉素抗性平板上。高浓度抗性平板上获得的克隆，分别用4ml YPD液体培养基培养，24hr后换成BMMY培养基诱导基因表达，表达48hr后离心收获菌体。

取一部分菌体破菌处理，破菌上清用West-Blotting鉴定，结果如图4所示，根据该图结果，破菌上清中有截短型的HPV 18L1蛋白表达。

虽然在本发明的实施例2和3中，使用的是SEQ ID NO：1序列进行克隆和表达，但对于本领域的技术人员来说，使用SEQ ID NO：2和3序列进行克隆和表达，以获得相似的结果是显而易见的，因此，属于本发明的保护范围；而且，根据本发明的构思，对于本领域的技术人员来说，构建相似的序列并利用该构建的序列，使用毕赤酵母进行克隆和表达以获得相似甚至更优的结果，也是显而易见的，因此，也属于本发明的保护范围。

实施例4、截短型的HPV18 L1蛋白检测

以纯化的截短型的HPV18 L1的VLPs做标准蛋白浓度曲线，以诱导前菌体做阴性对照，采用ELISA夹心法检测HPV 18L1基因在毕赤酵母中发酵表达量，具体步骤如下：

用包被液2000倍稀释HPV18 L1的VLPs的兔多抗，向酶标板的凹孔中各加入0.1mL稀释后的兔多抗，于4℃过夜后，移去包被液，并用0.3mL PBST洗涤凹孔，然后用0.3mL封闭液于37℃保温2小时，进行封闭。

用稀释液以对倍稀释的方式，将纯化的HPV18 L1的VLPs从浓度2μg/mL梯度稀释到0.0625μg/mL，同时将获得的发酵菌体的破菌上清稀释200倍，然后分别向凹孔中加入0.1mL梯度稀释后不同浓度的HPV 18 L1的VLPs溶液或稀释后的破菌上清，于37℃保温1小时后，移去抗原液，并用0.3mL洗涤液洗涤凹孔；然后用稀释缓冲液将MAB885鼠单抗(购自CHEMICON公司)1000倍稀释后加入到凹孔中，每孔各0.1mL，37℃保温1小时后，移去单抗溶液后，用0.3mL洗涤液洗涤凹孔；再向凹孔中加入用稀释缓冲液5000倍稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG各0.1mL，在37℃保温0.5小时后，移去酶标液，并用0.3mL洗涤液洗涤凹孔后，向凹孔中各加入0.1mL DAB显色液，室温下作用20分钟后，向每个凹孔中加入0.05mL 2M H₂SO₄终止液以终止反应，并用酶标比色仪测定OD₄₅₀值。

利用梯度稀释的HPV18 L1的VLPs的OD₄₅₀的检测结果，制作标准蛋白浓度曲线，再通过标准蛋白浓度曲线换算获得截短型的HPV 18 L1蛋白的发酵表达量，结果如表1所示，其中：

用已测定浓度的纯化目的蛋白原液稀释一系列浓度，例如：2μg/mL，1μg/mL，0.5μg/mL，0.25μg/mL，0.125μg/mL，作为标准浓度，通过ELISA检测，用浓度做纵坐标，对应OD₄₅₀检测值做横坐标，建立标准线性回归方程。

发酵破菌液上清稀释一系列倍数，例如50，100，200，400倍。测出的OD450值通过标准线性回归方程求得对应浓度(单位为μg/mL)，再乘以稀释倍数即为发酵破菌液上清目的蛋白浓度(单位为μg/mL)。由于破菌液是由菌泥湿重∶破菌缓冲液＝1∶5配制的，所以发酵菌泥的目的蛋白表达量(单位为μg/g菌泥)为5×发酵破菌液上清目的蛋白浓度(单位为μg/mL)。再乘以发酵液菌体密度(单位为g菌泥/L发酵液)，则为发酵目的蛋白表达量浓度(单位为μg/L发酵液)。

发酵破菌液上清目的蛋白浓度(μg/mL)＝稀释倍数×标准目的蛋白浓度(μg/mL)×OD₄₅₀(发酵破菌液上清)/OD₄₅₀(标准目的蛋白浓度)；

发酵目的蛋白表达量浓度(μg/L发酵液)＝5×发酵破菌液上清目的蛋白浓度(μg/mL)×发酵液菌体密度(g菌泥/L发酵液)。

表1、VLPs发酵表达结果

样品	VLPs浓度(μg/mL)	发酵密度(g/L)	发酵表达量(mg/L发酵液)
				破菌液上清1	176	438	385
破菌液上清2	152	413	314

由表1的结果可见，本发明的HPV 18L1蛋白基因的优化序列，不仅能够在毕赤酵母中表达HPV 18L1蛋白，而且表达量较高，能够满足工业化生产的要求。

实施例5、截短型的HPV 18L1蛋白纯化

将实施例3中制备的菌体破菌离心后，取破菌上清经过层析方法纯化，得到自组装成病毒样颗粒的L1蛋白，具体步骤如下：

将表达HPV 18L1 VLP的毕赤酵母细胞，按1∶3加入清洗缓冲液混合，充分混匀，于8000rpm，离心5min，收集细胞，重复以上操作二遍。

将清洗后的细胞按1∶5加入破菌缓冲液混合，充分混匀后，高压破碎以上细胞悬液，并重复操作，使90％的细胞破碎。将高压破碎的破菌液，于9000rpm，30min，10℃离心分离，收集离心上清。

将经过离心澄清的破菌上清通过POROS 50HS(Applied Biosystems公司)层析柱进行初纯，洗脱方式为：100％缓冲液A(0.5M NaCl，50mM MOPS pH7.0，0.05％Tween-80)至100％的缓冲液B(1.5M NaCl，50mM MOPS pH7.0，0.05％Tween-80)的线性梯度洗脱，收集洗脱组分，并采用SDS-PAGE，Western-blot检测。

将含有HPV 18L1蛋白的洗脱组分合并后，使用CHT(BIO-RAD TypeII)层析柱精纯，洗脱方式为：100％缓冲液A(20mM PB，0.6M NaCl，50mM MOPS pH76.5，0.05％Tween-80)至100％的缓冲液B(200mM PB，0.6M NaCl，pH6.5，0.05％Tween-80)的线性梯度洗脱。收集洗脱组分，并采用SDS-PAGE，Western-blot检测，将含有HPV 18L1 VLP的组分合并，即为最后的纯化样品，其纯度＞90％。

实施例6、截短型的HPV 18L1疫苗制备

参考《中华人民共和国药典》(2005年版)中的方法，将实施例5中纯化获得的L1蛋白，吸附铝佐剂，制备获得具有免疫原性的HPV 18L1疫苗。

实施例7、截短型的HPV 18L1基因表达产物免疫原性的测定

选取6～8周龄的SPF级BALB/c小鼠，分为4组，每组6只小鼠。第1组小鼠用0.1mL含有铝佐剂的缓冲液(0.32M氯化钠，0.35mM硼酸钠，0.01％吐温-80，0.01M组氨酸，pH6.5)进行免疫(作为阴性对照组)，其它3组分别用0.1mL浓度为5μg/mL、0.5μg/mL、0.05μg/mL的吸附铝佐剂的VLP(作为检测组)，分别于第0、7、21天皮下注射免疫，共免疫三次，第三次免疫后两周采血。将采集得到的血液于37℃放置2h后，4000g离心10min，吸取上清，即得到鼠多抗血清，于-20℃存放，并检测鼠血清的转阳率和滴度，具体方法如下：

7.1、血清转阳率的检测：

用包被液稀释纯化的毕赤酵母表达的截短型的HPV18 L1至1μg/mL，向酶标板每个凹孔中各加0.1mL，4℃过夜。移去包被液，用0.3mL PBST洗涤凹孔。用0.3mL封闭液(5％脱脂奶粉+PBST)于37℃保温2小时。每凹孔加入用稀释缓冲液(2％脱脂奶粉+PBST)以1∶400稀释的被检血清(免疫过HPV18 L1和铝佐剂的鼠血清和只免疫铝佐剂的鼠血清)各0.1mL，于37℃保温1小时后移去血清液，用0.3mL洗涤液洗涤凹孔。然后向每凹孔加入用稀释缓冲液以1∶5000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG各0.1mL，37℃保温0.5小时后移去酶标液，用0.3mL洗涤液洗涤凹孔；然后向凹孔中加入0.1mL DAB显色液，室温避光作用20分钟后加2M H₂SO₄ 0.05mL终止液终止反应，并用酶标比色仪测定OD₄₅₀值，OD₄₅₀值如表2所示。

表2、OD₄₅₀读数

	鼠1	鼠2	鼠3	鼠4	鼠5	鼠6
							5ug免疫组	0.964	0.990	0.901	0.820	1.040	1.193
0.5ug免疫组	0.769	0.898	0.830	1.706	0.763	0.982
							0.05ug免疫组	0.933	0.953	1.422	1.502	0.572	1.489
铝佐剂组	0.097	0.146	0.114	0.176	0.110	0.158
							Cutoff值	0.226

Cutoff值为阴性对照被检血清(免疫铝佐剂的鼠血清)抗体的OD₄₅₀值的平均值加上3倍标准差，OD₄₅₀值大于Cutoff值的小鼠判定为阳性，OD₄₅₀值小于Cutoff值的小鼠判定为阴性。

三个检测组的转阳率结果如表2所示。

表3、转阳率结果

	5ug/mL免疫组	0.5ug/mL免疫组	0.05ug/mL免疫组
				转阳率	100％	100％	100％

7.2、血清滴度的测定

用包被液稀释纯化的截短型的HPV18 L1至1μg/mL，取0.1mL加于酶标板的各凹孔中，4℃过夜；移去包被液，用0.3mL PBST洗涤上述凹孔，再用0.3mL封闭液(5％脱脂奶粉+PBST)于37℃，保温封闭2小时。将被检血清(免疫过HPV18 L1的鼠血清)用稀释缓冲液(2％脱脂奶粉+PBST)采用对倍稀释方式，从1∶500稀释度一直稀释到1∶32000，阴性对照被检血清(免疫铝佐剂的鼠血清)以1∶10000稀释，每个凹孔分别加入0.1mL稀释后血清(被检血清或阴性对照血清)，37℃保温1小时。移去血清液，用0.3mL洗涤液洗涤凹孔。每个凹孔加入用稀释缓冲液以1∶5000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG0.1mL，37℃保温0.5小时。移去酶标液后，用0.3mL洗涤液洗涤凹孔，并向凹孔中加入0.1mL DAB显色液，于室温作用20分钟后，加入2M H₂SO₄ 0.05mL终止液终止反应。用酶标比色仪测定OD₄₅₀值。

采用终点滴度法计算血清的滴度值，其结果如表4所示。

表4、滴度测定结果

	鼠1	鼠2	鼠3	鼠4	鼠5	鼠6
							5ug免疫组	418416	83602	252997	192334	470324	215223
0.5ug免疫组	1073694	13854	189584	18371	226400	192297
							0.05ug免疫组	79083	68971	61310	11819	2000	14099

综上所述，本发明提供的18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因是一种优化过的L1基因，具有以下优点：经过优化的基因更适合在酵母宿主中高效率表达目标蛋白，而且能够满足工业化生产的要求；同时，本发明提供的18型人乳头状瘤病毒疫苗，能够自组装形成VLPs结构，纯化的VLPs吸附佐剂后，通过血清转阳率和血清滴度的测定，说明该疫苗能在小鼠体内产生较强的免疫原性，而且由于采用毕赤酵母表达系统，因此该方法具有以下优点：成本低，产量高，产品性质更加均一稳定。

序列表

<110>上海惠生生物工程有限公司

<120>一种截短型的18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因

<130>P5071080

<160>35

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1524

<212>DNA

<213>毕赤酵母

<400>1

atggctttgt ggagaccttc tgacaacact gtttacttgc cacctccatc cgttgctaga 60

gttgttaaca ctgatgacta cgttactaga acttctattt tctaccacgc tggttcctct 120

agattgttga ctgttggtaa cccttacttt agagttccag ctggtggtgg taacaagcaa 180

gatattccta aggtttccgc ttaccaatac agagttttca gagttcaatt gccagaccct 240

aacaagtttg gtttgccaga tacttctatt tacaaccctg agactcaaag attggtttgg 300

gcttgtgctg gtgttgaaat tggtagaggt caaccattgg gtgttggttt gtccggtcat 360

cctttctaca acaagttgga cgatactgag tcttcccacg ctgctacttc taacgtttcc 420

gaagacgtta gagataacgt ttctgttgac tacaagcaaa ctcaattgtg tattttgggt 480

tgtgctccag ctattggtga gcattgggct aagggtactg cttgtaagtc cagacctttg 540

tctcaaggtg attgtccacc tttggaattg aagaacactg ttttggagga cggtgatatg 600

gttgacactg gttacggtgc tatggatttc tccactttgc aagacactaa gtgtgaagtt 660

ccattggata tttgtcaatc tatttgtaag taccctgact acttgcaaat gtccgctgat 720

ccatacggtg actctatgtt cttttgtttg agaagagagc aattgttcgc tagacacttt 780

tggaacagag ctggtactat gggtgatact gttcctcaat ccttgtacat taagggtact 840

ggtatgagag cttctccagg ttcctgtgtt tactctcctt ccccatctgg ttccattgtt 900

acttctgact cccaattgtt caacaagcct tactggttgc ataaggctca aggtcacaac 960

aacggtgttt gttggcataa ccaattgttt gttactgttg ttgatactac tagatccact 1020

aacttgacta tttgtgcttc cactcaatct ccagttcctg gtcaatacga cgctactaag 1080

ttcaagcaat actccagaca cgttgaagag tacgatttgc aattcatctt ccaattgtgt 1140

actattactt tgactgctga cgttatgtct tacattcatt ccatgaactc ttccattttg 1200

gaagattgga actttggtgt tccacctcca cctactactt ctttggttga cacttacaga 1260

ttcgttcaat ccgttgctat tacttgtcaa aaggatgctg ctccagctga gaacaaggac 1320

ccttacgata agttgaagtt ttggaacgtt gacttgaagg aaaagttctc tttggatttg 1380

gaccaatacc cattgggtag aaagtttttg gttcaagctg gtttgagaag aaagcctact 1440

attggtccaa gaaagagatc cgctccttct gctactactt cctctaagcc agctaagaga 1500

gttagagtta gagctagaaa gtaa 1524

<210>2

<211>1524

<212>DNA

<213>毕赤酵母

<400>2

atggctttgt ggagaccatc tgacaatact gtttacttgc caccaccatc tgttgctaga 60

gttgttaata ctgacgacta cgttactaga acttctattt tttaccatgc tggttcttct 120

agattgttga ctgttggtaa tccatacttt agagttccag ctggtggtgg taataaacaa 180

gacattccaa aagtttctgc ttaccaatac agagttttta gagttcaatt gccagaccca 240

aataaatttg gtttgccaga cacttctatt tacaatccag aaactcaaag attggtttgg 300

gcttgtgctg gtgttgaaat tggtagaggt caaccattgg gtgttggttt gtctggtcat 360

ccattttaca ataaattgga cgacactgaa tcttctcatg ctgctacttc taatgtttct 420

gaagacgtta gagacaatgt ttctgttgac tacaaacaaa ctcaattgtg tattttgggt 480

tgtgctccag ctattggtga acattgggct aaaggtactg cttgtaaatc tagaccattg 540

tctcaaggtg actgtccacc attggaattg aaaaatactg ttttggaaga cggtgacatg 600

gttgacactg gttacggtgc tatggacttt tctactttgc aagacactaa atgtgaagtt 660

ccattggaca tttgtcaatc tatttgtaaa tacccagact acttgcaaat gtctgctgac 720

ccatacggtg actctatgtt tttttgtttg agaagagaac aattgtttgc tagacatttt 780

tggaatagag ctggtactat gggtgacact gttccacaat ctttgtacat taaaggtact 840

ggtatgagag cttctccagg ttcttgtgtt tactctccat ctccatctgg ttctattgtt 900

acttctgact ctcaattgtt taataaacca tactggttgc ataaagctca aggtcataat 960

aatggtgttt gttggcataa tcaattgttt gttactgttg ttgacactac tagatctact 1020

aatttgacta tttgtgcttc tactcaatct ccagttccag gtcaatacga cgctactaaa 1080

tttaaacaat actctagaca tgttgaagaa tacgacttgc aatttatttt tcaattgtgt 1140

actattactt tgactgctga cgttatgtct tacattcatt ctatgaattc ttctattttg 1200

gaagactgga attttggtgt tccaccacca ccaactactt ctttggttga cacttacaga 1260

tttgttcaat ctgttgctat tacttgtcaa aaagacgctg ctccagctga aaataaagac 1320

ccatacgaca aattgaaatt ttggaatgtt gacttgaaag aaaaattttc tttggacttg 1380

gaccaatacc cattgggtag aaaatttttg gttcaagctg gtttgagaag aaaaccaact 1440

attggtccaa gaaaaagatc tgctccatct gctactactt cttctaaacc agctaaaaga 1500

gttagagtta gagctagaaa ataa 1524

<210>3

<211>1524

<212>DNA

<213>毕赤酵母

<400>3

atggctttgt ggagaccatc tgataacact gtttatttgc caccaccatc tgttgctaga 60

gttgttaaca ctgatgatta tgttactaga acttctattt tctatcatgc tggatcttct 120

agattgttga ctgttggaaa cccatatttc agagttccag ctggaggagg aaacaagcaa 180

gatattccaa aggtttctgc ttatcaatat agagttttca gagttcaatt gccagatcca 240

aacaagttcg gattgccaga tacttctatt tataacccag aaactcaaag attggtttgg 300

gcttgtgctg gagttgaaat tggaagagga caaccattgg gagttggatt gtctggacat 360

ccattctata acaagttgga tgatactgaa tcttctcatg ctgctacttc taacgtttct 420

gaagatgtta gagataacgt ttctgttgat tataagcaaa ctcaattgtg tattttggga 480

tgtgctccag ctattggaga acattgggct aagggaactg cttgtaagtc tagaccattg 540

tctcaaggag attgtccacc attggaattg aagaacactg ttttggaaga tggagatatg 600

gttgatactg gatatggagc tatggatttc tctactttgc aagatactaa gtgtgaagtt 660

ccattggata tttgtcaatc tatttgtaag tatccagatt atttgcaaat gtctgctgat 720

ccatatggag attctatgtt cttctgtttg agaagagaac aattgttcgc tagacatttc 780

tggaacagag ctggaactat gggagatact gttccacaat ctttgtatat taagggaact 840

ggaatgagag cttctccagg atcttgtgtt tattctccat ctccatctgg atctattgtt 900

acttctgatt ctcaattgtt caacaagcca tattggttgc ataaggctca aggacataac 960

aacggagttt gttggcataa ccaattgttc gttactgttg ttgatactac tagatctact 1020

aacttgacta tttgtgcttc tactcaatct ccagttccag gacaatatga tgctactaag 1080

ttcaagcaat attctagaca tgttgaagaa tatgatttgc aattcatttt ccaattgtgt 1140

actattactt tgactgctga tgttatgtct tatattcatt ctatgaactc ttctattttg 1200

gaagattgga acttcggagt tccaccacca ccaactactt ctttggttga tacttataga 1260

ttcgttcaat ctgttgctat tacttgtcaa aaggatgctg ctccagctga aaacaaggat 1320

ccatatgata agttgaagtt ctggaacgtt gatttgaagg aaaagttctc tttggatttg 1380

gatcaatatc cattgggaag aaagttcttg gttcaagctg gattgagaag aaagccaact 1440

attggaccaa gaaagagatc tgctccatct gctactactt cttctaagcc agctaagaga 1500

gttagagtta gagctagaaa gtaa 1524

<210>4

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>4

atggctttgt ggagaccttc tgacaacact gtttacttgc cacctccatc cgttgctag 59

<210>5

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>5

ggtagaaaat agaagt tcta gtaacgtagt catcagtgt t aacaactcta gcaacggat 59

<210>6

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>6

ctattttcta ccacgctggt tcctctagat tgttgactgt tggtaaccct tactttaga 59

<210>7

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>7

gcggaaacct taggaatatc ttgcttgtta ccaccaccag ctggaactct aaagtaagg 59

<210>8

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>8

taaggtttcc gcttaccaat acagagtttt cagagttcaa ttgccagacc ctaacaagt 59

<210>9

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>9

caatctttga gtctcagggt tgtaaataga agtatctggc aaaccaaact tgttagggt 59

<210>10

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>10

actcaaagat tggtttgggc ttgtgctggt gttgaaattg gtagaggtca accattggg 59

<210>11

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>11

cagtatcgtc caacttgttg tagaaaggat gaccggacaa accaacaccc aatggttga 59

<210>12

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>12

tggacgatac tgagtcttcc cacgctgcta cttctaacgt ttccgaagac gttagagat 59

<210>13

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>13

caacccaaaa tacacaattg agtttgcttg tagtcaacag aaacgttatc tctaacgtc 59

<210>14

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>14

tattttgggt tgtgctccag ctattggtga gcattgggct aagggtactg cttgtaagt 59

<210>15

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>15

gttcttcaat tccaaaggtg gacaatcacc ttgagacaaa ggtctggact tacaagcag 59

<210>16

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>16

gaattgaaga acactgtttt ggaggacggt gatatggttg acactggtta cggtgctat 59

<210>17

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>17

tatccaatgg aacttcacac ttagtgtctt gcaaagtgga gaaatccata gcaccgtaa 59

<210>18

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>18

ttccattgga tatttgtcaa tctatttgta agtaccctga ctacttgcaa atgtccgct 59

<210>19

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>19

aattgctctc ttctcaaaca aaagaacata gagtcaccgt atggatcagc ggacatttg 59

<210>20

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>20

aagagagcaa ttgttcgcta gacacttttg gaacagagct ggtactatgg gtgatactg 59

<210>21

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>21

tggagaagct ctcataccag tacccttaat gtacaaggat tgaggaacag tatcaccca 59

<210>22

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>22

agagcttctc caggttcctg tgtttactct ccttccccat ctggttccat tgttacttc 59

<210>23

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>23

cttgagcctt atgcaaccag taaggcttgt tgaacaattg ggagtcagaa gtaacaatg 59

<210>24

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>24

ataaggctca aggtcacaac aacggtgttt gttggcataa ccaattgttt gttactgtt 59

<210>25

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>25

tgagtggaag cacaaatagt caagttagtg gatctagtag tatcaacaac agtaacaaa 59

<210>26

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>26

tgcttccact caatctccag ttcctggtca atacgacgct actaagttca agcaatact 59

<210>27

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>27

acacaattgg aagatgaatt gcaaatcgta ctcttcaacg tgtctggagt attgcttga 59

<210>28

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>28

ttccaattgt gtactattac tttgactgct gacgttatgt cttacattca ttccatgaa 59

<210>29

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>29

taggtggagg tggaacacca aagttccaat cttccaaaat ggaagagttc atggaatga 59

<210>30

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>30

cacctccacc tactacttct ttggttgaca cttacagatt cgttcaatcc gttgctatt 59

<210>31

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>31

tcgtaagggt ccttgttctc agctggagca gcatcctttt gacaagtaat agcaacgga 59

<210>32

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>32

ggacccttac gataagttga agttttggaa cgttgacttg aaggaaaagt tctctttgg 59

<210>33

<211>59

<212>DNA

<213>引物

<400>33

accagcttga accaaaaact ttctacccaa tgggtattgg tccaaatcca aagagaact 59

<210>34

<211>61

<212>DNA

<213>引物

<400>34

tcaagctggt ttgagaagaa agcctactat tggtccaaga aagagatccg ctccttctgc 60

t 61

<210>35

<211>61

<212>DNA

<213>引物

<400>35

ttactttcta gctctaactc taactctctt agctggctta gaggaagtag tagcagaagg 60

a 61

Claims

1.一种截短型的18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种毕赤酵母表达载体，其特征在于，所述表达载体具有权利要求1所述基因的序列。

3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述毕赤酵母表达载体为pPICZaB。

4.一种表达权利要求1所述基因编码的截短型HPV 18L1蛋白的毕赤酵母表达菌株。

5.如权利要求4所述的毕赤酵母表达菌株，其特征在于，所述截短型HPV 18L1蛋白为胞内表达。

6.如权利要求4所述的表达菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、设计并合成密码子优化的截短型的HPV 18的L1基因；

B、构建截短型的HPV 18L1基因的毕赤酵母表达载体；

C、构建截短型的HPV 18L1毕赤酵母表达菌株。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述毕赤酵母表达载体为pPICZaB。