CN101428144A - 流脑多糖联合疫苗及制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种流脑多糖联合疫苗，运用超速离心法除去内毒素技术制备冻干ACYW135脑膜炎球菌多糖疫苗，从而确保ACYW135群脑膜炎球菌多糖原液的内毒素含量较离心前大大降低。使用本发明疫苗对患者来说一针就可以预防流脑的疾病传染，达到并超过以前打四针才能达到的预防效果，减少了患者的痛苦，降低了预防成本。
Description
技术领域：
本发明涉及流脑多糖联合疫苗的制备方法，尤其是提供了流脑多糖联合疫苗制剂及制备工艺，用于脑脊髓膜炎重要疫病的免疫预防，属于疫苗生产制备技术领域。
背景技术：
流行性脑脊髓膜炎是由脑膜炎球菌(Meningococcus)引起的细菌性脑膜炎(简称流脑)，为急性呼吸道传染病。主要临床表现为发热、头痛、呕吐、皮肤粘膜瘀点、瘀斑及脑膜刺激征。重者可有败血症性休克和脑膜脑炎。此病发病急，病死率高，且在各年龄组中都可发生，15岁以下儿童发病占75％以上。为有效控制流行性脑脊髓膜炎的发生，应提前预防接种疫苗。
1984年Ambrosch等制备出A、C、W135和Y群四联流脑多糖菌苗，对成人志愿者免疫后，血清阳转率分别达到92.5％、92.5％、97.5％和95％，免疫效果是肯定的。WHO与1976年制定了单价A群和C群流脑多糖菌苗的制检规程，又于1980年进行了修订；补订了W135、Y群流脑多糖菌苗及A和C，A、C、W135及Y群二联和四联多糖菌苗制检规程。
适合中国人群的A、C、W135和Y群四联流脑多糖菌苗未见公开文献报道。
发明内容
本发明提供一种流脑多糖联合疫苗，具有一针多种免疫的功能。
本发明的流脑多糖(ACYW135群)联合疫苗，每支成品(复溶后体积0.5ml)含以下组分及含量：
A群脑膜炎球菌多糖疫苗： 50μg
C群脑膜炎球菌多糖疫苗： 50μg
Y群脑膜炎球菌多糖疫苗： 50μg
W135群脑膜炎球菌多糖疫苗： 50μg
乳糖： 2.5～3.0mg。
本发明联合疫苗的制备工艺，包括以下步骤：
1.菌种的的选用：选用A、C、Y、W135群脑膜炎奈瑟氏球菌，用于冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的制备。
2.生产用菌种
启开工作种子批，经传代，经检定合格后，接种于改良半综合培养基或其他适宜培养基，制备数量适宜的生产用种子。
3.生产用培养基
采用改良半综合培养基或经批准的其他适宜培养基。培养基不应含有与十六烷基三甲基溴化铵形成沉淀的成分。
4.培养
采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检查，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
5.收获和杀菌
于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌。以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜。
6.去核酸
将已杀菌的培养液(单批或多批混合)离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为1mol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25％，2—8℃静置1—3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。
7.沉淀多糖
于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80％，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在—20℃以下，待纯化。
8.多糖纯化
将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10—20mg/ml；按1:2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75％～80％；离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液。提取过程应在15℃以下进行。
9.内毒素去除
取A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖原液，经超速离心法除去内毒素，在用0.2μm滤膜除菌后取样检测，以凝胶法测定内毒素含量。
10.半成品配制及分装
将检定合格的ACYW135群脑膜炎球菌多糖原液与乳糖按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放2～8℃库待检。
11.冻干
将ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗半成品进行冷冻干燥，步骤为：-35℃预冻2小时，制品-40℃冷冻4～5小时，逐渐升温真空干燥10～12小时，30℃以下恒温真空干燥5～6小时，全过程累计20～24小时，制备出冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗成品，根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。
12.成品检定
根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。
本发明生产工艺的特点：培养基不含有马血清或其他致敏物质；不含有能与cetavlon形成沉淀的成分或有害物质；培养基适于脑膜炎球菌繁殖生长，并适于产生丰厚的荚膜多糖物质；常用酸水解酪蛋白做基础液，加入酵母透析液、硫酸镁、葡萄糖等制成半综合培养基。美国则采用Frantz培养基，pH7.4～7.6。
本发明与WHO规程有几点不同：
①细菌培养时间不通，WHO规程培养10-12h，国内只培养6-8h；②WHO规程对中间产品进行冻干，国内则放低温(-20℃)保存；我国ACYW135群流脑多糖疫苗质量控制指标与WHO规程比较见表1：
表1：本发明多糖疫苗规程质控指标与WHO规程比较
本发明的积极效果在于：运用超速离心法除去内毒素技术制备冻干ACYW135脑膜炎球菌多糖疫苗，从而确保ACYW135群脑膜炎球菌多糖原液的内毒素含量较离心前大大降低。使用本发明疫苗对患者来说一针就可以预防流脑的疾病传染，达到并超过以前打四针才能达到的预防效果，减少了患者的痛苦，降低了预防成本。
具体实施方式：
下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1：200502批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的制备
1、取A群脑膜炎球菌29201菌株、C群脑膜炎球菌29205菌株、Y群脑膜炎球菌29028菌株、W135群脑膜炎球菌29037菌株，接种于含10％羊血普通琼脂培养基，脑膜炎球菌在25℃不生长。于35—37℃二氧化碳的环境中培养16—20小时，长出光滑、湿润、灰白色的菌落，菌苔易取下，在生理氯化钠溶液中显现均匀混悬液。染色镜检应为革兰阴性双球菌、单球菌。
2、采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检查，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌。以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜。
3、将已杀菌的培养液(单批或多批混合)离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为1mol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25％，2—8℃静置1—3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80％，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在—20℃以下，待纯化。
4、将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10—20mg/ml；按1:2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75％～80％；离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液。提取过程应在15℃以下进行。
5、内毒素去除
取A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖原液，经超速离心法除去内毒素，在用0.2μm滤膜除菌后取样检测，以凝胶法测定内毒素含量。
6、半成品配制及分装
将检定合格的A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖原液与乳糖按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放2～8℃库待检。
6、冻干
将ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗半成品进行冷冻干燥，步骤为：-35℃预冻2小时，制品-40℃冷冻4～5小时，逐渐升温真空干燥10～12小时，30℃以下恒温真空干燥5～6小时，全过程累计20～24小时，制备出冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗成品，根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。
实施例2：200503批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的制备
1、取A群脑膜炎球菌29201菌株、C群脑膜炎球菌29205菌株、Y群脑膜炎球菌29028菌株、W135群脑膜炎球菌29037菌株，接种于含10％羊血普通琼脂培养基，脑膜炎球菌在25℃不生长。于35—37℃二氧化碳的环境中培养16—20小时，长出光滑、湿润、灰白色的菌落，菌苔易取下，在生理氯化钠溶液中显现均匀混悬液。染色镜检应为革兰阴性双球菌、单球菌。
2、采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检查，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌。以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜。
3、将已杀菌的培养液(单批或多批混合)离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为1mol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25％，2—8℃静置1—3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80％，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在—20℃以下，待纯化。
4、将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10—20mg/ml；按1:2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75％～80％；离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液。提取过程应在15℃以下进行。
5、内毒素去除
取A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖原液，经超速离心法除去内毒素，在用0.2μm滤膜除菌后取样检测，以凝胶法测定内毒素含量。
6、半成品配制及分装
将检定合格的A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖原液与乳糖按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放2～8℃库待检。
6、冻干
将ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗半成品进行冷冻干燥，步骤为：-35℃预冻2小时，制品-40℃冷冻4～5小时，逐渐升温真空干燥10～12小时，30℃以下恒温真空干燥5～6小时，全过程累计20～24小时，制备出冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗成品，根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。
实施例3：200504批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的制备
1、取A群脑膜炎球菌29201菌株、C群脑膜炎球菌29205菌株、Y群脑膜炎球菌29028菌株、W135群脑膜炎球菌29037菌株，接种于含10％羊血普通琼脂培养基，脑膜炎球菌在25℃不生长。于35—37℃二氧化碳的环境中培养16—20小时，长出光滑、湿润、灰白色的菌落，菌苔易取下，在生理氯化钠溶液中显现均匀混悬液。染色镜检应为革兰阴性双球菌、单球菌。
2、采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检查，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌。以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜。
3、将已杀菌的培养液(单批或多批混合)离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为1mol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25％，2—8℃静置1—3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80％，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在—20℃以下，待纯化。
4、将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10—20mg/ml；按1：2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75％～80％；离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液。提取过程应在15℃以下进行。
5、内毒素去除
取A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖原液，经超速离心法除去内毒素，在用0.2μm滤膜除菌后取样检测，以凝胶法测定内毒素含量。
6、半成品配制及分装
将检定合格的A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖原液与乳糖按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放2～8℃库待检。
6、冻干
将ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗半成品进行冷冻干燥，步骤为：-35℃预冻2小时，制品-40℃冷冻4～5小时，逐渐升温真空干燥10～12小时，30℃以下恒温真空干燥5～6小时，全过程累计20～24小时，制备出冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗成品，根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。
试验例1
1、按《中华人民共和国药典》2005版三部对A群脑膜炎球菌多糖疫苗制品的要求，我们对ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗进行热原质试验，以保证制品的安全性。
试验方法：根据《中华人民共和国药典》2005版三部A群脑膜炎球菌多糖疫苗制造及检定3.4.4项A群脑膜炎球菌多糖疫苗热原质试验方法，将三批的ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗每批取样，注射剂量按家兔体重每1Kg注射0.1μg多糖。
表一 三批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗热原质试验结果
2、按《中华人民共和国药典》2005版三部对A群脑膜炎球菌多糖疫苗制品的要求，我们对ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗进行异常毒性试验，以保证制品的安全性。
试验方法：根据《中华人民共和国药典》2005版三部A群脑膜炎球菌多糖疫苗制造及检定3.4.3项要求，将三批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗每批取样各100支，每批注射体重18～22g小白鼠5只、每只腹腔注射(0.5ml/支)，250～350g豚鼠2只，每只腹腔注射(5ml/支)，于注射后第7天进行观察，动物应健康存活，到期体重比注射前增加。结果：按上述方法三批制品分别注射健康豚鼠二只、小白鼠五只，观察结果见表1、表2。
表1 三批四价脑膜炎球菌多糖疫苗豚鼠异常毒性试验结果
表2 三批四价脑膜炎球菌多糖疫苗小白鼠异常毒性试验结果
试验结果显示，动物健康存活，到期动物体重比注射前增加，表明三批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗是安全的，完全符合药典要求。
Claims (3)
1.一种流脑多糖联合疫苗，每支成品(复溶后体积0.5ml)含以下组分及含量：
A群脑膜炎球菌多糖疫苗： 50μg
C群脑膜炎球菌多糖疫苗： 50μg
Y群脑膜炎球菌多糖疫苗： 50μg
W135群脑膜炎球菌多糖疫苗： 50μg
乳糖： 2.5～3.0mg。
2.权利要求1所述的疫苗为冻干剂型。
3.权利要求1所述的疫苗制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种的的选用：选用A、C、Y、W135群脑膜炎奈瑟氏球菌；
(2)生产用菌种：
启开工作种子批，经传代，检定合格后，接种于改良半综合培养基，制备生产用菌种；
(3)生产用培养基：
采用改良半综合培养基或经批准的其他适宜培养基；
(4)培养：
采用培养罐液体培养，在培养过程中取样进行纯菌检查，涂片做革兰氏染色镜检，废弃污染杂菌；
(5)收获和杀菌：
于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养；取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌；
(6)去核酸：
将已杀菌的培养液离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为1mol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25％，2—8℃静置1—3小时或过夜，离心收集澄清的上清液；
(7)沉淀多糖：
于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80％，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在—20℃以下，待纯化；
(8)多糖纯化：
将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10—20mg/ml；按1：2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75％～80％；离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液；
(9)内毒素去除：
取A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖原液，经超速离心法除去内毒素，在用0.2μm滤膜除菌后取样检测，以凝胶法测定内毒素含量：
(10)半成品配制及分装：
将检定合格的A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖原液与乳糖按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放2～8℃库待检；
(11)冻干：
将ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗半成品进行冷冻干燥，-35℃预冻2小时，制品-40℃冷冻4～5小时，逐渐升温真空干燥10～12小时，30℃以下恒温真空干燥5～6小时，全过程累计20～24小时，制备出冻干疫苗成品。
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| CN (1) | CN101428144A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103721249A (zh) * | 2014-01-16 | 2014-04-16 | 华兰生物工程股份有限公司 | 一种流脑疫苗及其制备方法 |
| CN106075421A (zh) * | 2016-08-02 | 2016-11-09 | 成都欧林生物科技股份有限公司 | 一种A群C群脑膜炎球菌b型流感嗜血杆菌联合疫苗的制备方法 |
| CN109513001A (zh) * | 2017-09-18 | 2019-03-26 | 辽宁茂康源生物科技有限公司 | 一种a群c群脑膜炎球菌多糖吸附白喉破伤风联合疫苗及生产工艺 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1460521A (zh) * | 2003-06-06 | 2003-12-10 | 长春生物制品研究所 | 重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗及制备方法 |
| US20050002957A1 (en) * | 2003-05-07 | 2005-01-06 | Ryall Robert P. | Multivalent meningococcal derivatized polysaccharide-protein conjugates and vaccine |
-
2008
- 2008-12-19 CN CNA2008100516221A patent/CN101428144A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050002957A1 (en) * | 2003-05-07 | 2005-01-06 | Ryall Robert P. | Multivalent meningococcal derivatized polysaccharide-protein conjugates and vaccine |
| CN1460521A (zh) * | 2003-06-06 | 2003-12-10 | 长春生物制品研究所 | 重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗及制备方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 国家药典委员会 编: "A群脑膜炎球菌多糖疫苗", 《中华人民共和国药典.2005年版 三部》 * |
| 屠宇平 摘译: "脑膜炎球菌病的预防和控制（二）", 《疾病监测》 * |
| 朱威 主编: "全国中等卫生职业学校教材 生物制品基础及技术 （供医学生物技术专业用）", 《全国中等卫生职业学校教材 生物制品基础及技术 （供医学生物技术专业用）》 * |
| 黄镇 等: "A、C、W135 、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗的研制", 《中国生物制品学杂志》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103721249A (zh) * | 2014-01-16 | 2014-04-16 | 华兰生物工程股份有限公司 | 一种流脑疫苗及其制备方法 |
| CN103721249B (zh) * | 2014-01-16 | 2015-06-24 | 华兰生物工程股份有限公司 | 一种流脑疫苗及其制备方法 |
| CN106075421A (zh) * | 2016-08-02 | 2016-11-09 | 成都欧林生物科技股份有限公司 | 一种A群C群脑膜炎球菌b型流感嗜血杆菌联合疫苗的制备方法 |
| CN109513001A (zh) * | 2017-09-18 | 2019-03-26 | 辽宁茂康源生物科技有限公司 | 一种a群c群脑膜炎球菌多糖吸附白喉破伤风联合疫苗及生产工艺 |
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