CN101424614A - 嗜碱性粒细胞分析试剂及测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种嗜碱性粒细胞分析试剂，包括至少一种烷基酚聚氧乙烯醚，至少一种烷基醇聚氧乙烯醚，以及用于调节pH的缓冲剂。本发明还公开了采用所述试剂进行嗜碱性粒细胞测定的方法。本发明的试剂可以裂解红细胞和血小板，并破坏除嗜碱性粒细胞以外的其它白细胞的胞膜，但保留嗜碱性粒细胞的结构完整，从而可通过测定反映细胞大小和内部结构的光信号即可对嗜碱性粒细胞进行分类和计数。

Description

嗜碱性粒细胞分析试剂及测定方法

技术领域

本发明涉及一种细胞分析试剂以及一种细胞分析方法，特别是涉及一种用于嗜碱性粒细胞分析的试剂以及一种对嗜碱性粒细胞进行测定的细胞分析方法。

背景技术

在正常人体内，嗜碱性粒细胞数量较少，仅占白细胞总数的0-1％。但在重金属中毒、何杰金病、慢性粒细胞白血病等疾病中，嗜碱性粒细胞的数量会明显升高，因此嗜碱性粒细胞计数对于这些疾病的诊断具有重要意义。

过去，临床上经常使用一些化学染料来对嗜碱性粒细胞进行染色计数，其中包括瑞氏-吉姆萨复合染色法、甲苯胺蓝染色法和中性红染色法等。这些方法虽然简单、直观、有效，但由于仅能提供嗜碱性粒细胞的百分比计数，同时存在操作时间长、易受操作者主观影响等缺点，因此并不适合临床大规模标本的检测。

Harruet等(Blood，1975，46：279-286)介绍了一种使用全自动血液细胞分析装置对嗜碱性粒细胞进行计数的方法。该方法在低pH值的条件下使用染料阿利新蓝(alcian blue)对白细胞进行染色，然后通过测定细胞的可见光和红外光散射信号将嗜碱性粒细胞与其他白细胞进行区分。然而，阿利新蓝具有不易溶解和易析出等缺点，可能会对仪器的某些部件成损害。

US4,882,284公开了一种对白细胞进行分类计数的方法。方法中使用了荧光染料对白细胞进行染色，然后通过测定荧光、侧向散射光和前向角散射光信号可将白细胞分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞五个亚群。但由于嗜碱性粒细胞的荧光和前向角散射光信号与中性粒细胞、单核细胞的荧光和前向散射光信号有部分重叠，因此使用这个方法对嗜碱性粒细胞数量正常或偏低的标本进行测定时，计数和分类结果并不准确。

US5196346公开了一种用于嗜碱性粒细胞计数的试剂和方法。试剂中含有聚氧乙烯醚类(polyoxyethylene ether)表面活性剂、邻苯二甲酸(pathalicacid)—盐酸混合物、十二烷基硫酸钠(SDS)和抗氧化剂BHT(butylatedhydroxytoluene type anti-oxidizing agent)等组分。此试剂可将红细胞完全溶解，并破坏嗜碱性粒细胞以外的其它白细胞，同时保持嗜碱性粒细胞的结构完整，因此通过测定细胞的阻抗信号可将嗜碱性粒细胞与其他白细胞区分开来。不过这个方法仅使用单一参数(阻抗信号)对嗜碱性粒细胞进行分类计数，与多参数的分类方法相比，其准确性较低。

US5518928公开了一种用于嗜碱性粒细胞计数的方法。方法中使用了由聚氧乙烯醇醚(polyoxyethylene glycol ether)非离子表面活性剂Brij35、邻苯二甲酸和抗氧化剂组成的试剂，可破坏除嗜碱性粒细胞以外的其它白细胞，仅保持嗜碱性粒细胞结构的完整性。然后通过测定细胞的低角和高角散射光信号，可将嗜碱性粒细胞进行分类计数。但是这个方法需要将血液与试剂混和50秒后才能进行测定，因此限制了其在全自动血液分析装置上的应用。

US5538893公开了一种用于嗜碱性粒细胞分析用试剂和方法。试剂中的主要成分包括非离子表面活性剂类的聚氧乙烯醇醚(polyoxyethylene glycolether)、阳离子表面活性剂和用于调节溶液pH值的缓冲剂。此试剂可将除嗜碱性粒细胞以外的白细胞裸核化，唯独保持嗜碱性粒细胞的结构完整。然后通过测定细胞的阻抗或低角散射光获得细胞大小方面的信号，再通过测定细胞的侧向或高角散射光获得细胞内部结构方面的信号，最后将两种信号进行组合即可对嗜碱性粒细胞进行分类计数。不过试剂中使用的阳离子表面活性剂和聚氧乙烯类非离子表面活性剂，二者作用相互独立，不具有协同作用。

US5677183公开了一种白细胞分类和计数的方法。方法中使用了两种试剂，第一个试剂主要用于白细胞的四类细胞分群，而第二个试剂主要用于嗜碱性粒细胞的计数。第二试剂的主要成分包括非离子表面活性剂类的聚氧乙烯醇醚(polyoxyethylene glycol ether)、阳离子表面活性剂和用于调节溶液pH值的缓冲剂。它可将除嗜碱性粒细胞以外的其它白细胞裸核化，但嗜碱性粒细胞的结构仍保持完整。然后通过测定反映细胞大小和反映细胞内部结构的两种信号对嗜碱性粒细胞进行分类计数。不过试剂中使用的阳离子表面活性剂和聚氧乙烯类非离子表面活性剂，二者作用相互独立，不具有协同作用。

US6214625B1公开了一种对嗜碱性粒细胞和嗜酸粒细胞进行分类计数的试剂和方法。试剂由一种溶血剂和一种稳定剂组成，其中溶血剂的主要成分包括乙氧基化的长链胺(ethoxylated long chain amine)、季胺盐类阳离子表面活性剂以及用于调节pH值的有机酸或无机酸。溶血剂与血液细胞混合一定时间后，仅有嗜碱性粒细胞的结构保持完整，随后添加稳定剂终止溶血剂对嗜碱性粒细胞的进一步破坏。最终，通过测定细胞的阻抗、旋转散射光(rotated light scatter)信号，或者射频(radio frequency)、log光散射(log light scatter)即可对嗜碱性粒细胞进行分类计数。不过这一方法测定的参数较多，需要多个特殊的测定装置，仪器结构复杂、价格昂贵。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能方便简单地用于对嗜碱性粒细胞进行分类计数的细胞分析试剂。

本发明的另一目的在于提供一种采用上述细胞分析试剂对嗜碱性粒细胞进行测定的方法。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了一种用于嗜碱性粒细胞分析的试剂，所述试剂包括

i、至少一种烷基酚聚氧乙烯醚(Polyoxyethylene phenyl ether)，

ii、至少一种烷基醇聚氧乙烯醚(polyoxyethylene glycol ether)，

iii、用于调节pH的缓冲剂。

所述烷基酚聚氧乙烯醚优选具有如下结构：

R₁-C₆H₄-(C₂H₄O)_m-OH

其中，R₁表示碳原子数为8～9的烷基，m为8～10的正整数；

和/或

所述烷基醇聚氧乙烯醚具有如下结构：

R₂-(C₂H₄O)_n-OH

其中，R₂表示碳原子数为8～18的烷基，n为2～23的正整数。

在本发明的具体实施方式中，所述烷基酚聚氧乙烯醚优选结构式为C₈H₁₇-C₆H₄-(C₂H₄O)_x-OH，x＝9或10的辛基酚聚氧乙烯醚，如Triton X-100，或者优选结构式为C₉H₁₉-C₆H₄-(C₂H₄O)₈-OH的壬基酚聚氧乙烯醚，如Nonidet P 40(NP 40)。所述烷基醇聚氧乙烯醚优选为十二烷基醇聚氧乙烯醚，如Brij 35，其结构式为C₁₂H₂₅-(C₂H₄O)₂₃-OH，或者优选为十六烷基醇聚氧乙烯醚，如Brij 56，其结构式为C₁₆H₃₃-(C₂H₄O)₁₀-OH。

所述试剂中，烷基酚聚氧乙烯醚的浓度为100～8000mg/L，优选为400～4000mg/L，烷基醇聚氧乙烯醚的浓度为100～10000mg/L，优选为500～4000mg/L。

本发明的试剂中，所述缓冲剂调节试剂的pH为1.8～3.5，优选为2.0～3.0。

本发明还公开了一种嗜碱性粒细胞的测定方法，所述方法包括，将上述的试剂与血液样本按10～100:1的比例混合，于15～42℃温度下孵育5～60秒后对细胞进行分析。

所述对细胞进行分析是指，通过测定反映细胞大小和内部结构的光信号(如前向和侧向散射光信号)对嗜碱性粒细胞进行分类和计数。

由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：

本发明的试剂可以裂解红细胞和血小板，并破坏除嗜碱性粒细胞以外的其它白细胞的胞膜，使其胞浆外流、细胞结构消失，但保留嗜碱性粒细胞的结构完整，从而可通过测定反映细胞大小和内部结构的光信号即可对嗜碱性粒细胞进行分类和计数。本发明的试剂成分溶解性好，不易析出，不会对仪器的部件造成损害。本发明的试剂成分简单，且利用本发明的试剂进行嗜碱性粒细胞分析时，仅需配合使用简单的分析装置就可对嗜碱性粒细胞进行分类计数。此外，试剂中使用的烷基酚聚氧乙烯醚不仅是一种高效的溶血剂，而且还是一种被广泛应用的、强力的增溶剂，可以快速裂解细胞并消除细胞裂解所产生的碎片，它的使用可以减少其它增溶剂(如烷基醇聚氧乙烯醚)的用量，达到节约试剂成本的目的。附图说明

图1是本发明的一种嗜碱性粒细胞分析试剂进行嗜碱性粒细胞测定所生成的散点图；

图2是利用本发明的嗜碱性粒细胞分析试剂与用sysmex XE-2100血液细胞分析仪进行血液测定的相关性分析结果图；

图3是对照例中用阳离子表面活性剂(十六烷基三甲基氯化铵)替代本发明试剂中的烷基酚聚氧乙烯醚，进行嗜碱性粒细胞测定所生成的散点图；

图4是本发明的另一种嗜碱性粒细胞分析试剂进行嗜碱性粒细胞测定所生成的散点图；

图5是本发明的又一种嗜碱性粒细胞分析试剂进行嗜碱性粒细胞测定所生成的散点图；

图6是本发明的再一种嗜碱性粒细胞分析试剂进行嗜碱性粒细胞测定所生成的散点图。

具体实施方式

本发明的试剂可用于嗜碱性粒细胞的分类和计数。此试剂可以裂解红细胞，并将除嗜碱性粒细胞以外的其它类白细胞裸核化，仅保留嗜碱性粒细胞的结构完整，再通过测定反映细胞大小和内部结构的光散射信号即可对嗜碱性粒细胞进行分类和计数。

本发明细胞分析试剂的组分主要包括：

1)至少一种烷基酚聚氧乙烯醚(Polyoxyethylene phenyl ether)，其具有如下结构

R₁-C₆H₄-(C₂H₄O)_m-OH

其中，R₁表示碳原子数为8～9的烷基，m为8～10的正整数。具体例子如辛基酚聚氧乙烯醚Triton X-100，其结构式为C₈H₁₇-C₆H₄-(C₂H₄O)_x-OH，x＝9～10，以及壬基酚聚氧乙烯醚Nonidet P 40(NP 40)，其结构式为C₉H₁₉-C₆H₄-(C₂H₄O)₈-OH。

本发明的试剂中，烷基酚聚氧乙烯醚的使用浓度通常为100～8000mg/L，优选为400～4000mg/L。浓度过低，则可能引起红细胞、血小板甚至嗜碱性粒细胞以外的白细胞裂解不完全；浓度过高，则会破坏包括嗜碱性粒细胞在内的所有白细胞的细胞结构。因此浓度过高和过低都会导致嗜碱性粒细胞分类和计数的错误。

2)至少一种烷基醇聚氧乙烯醚(polyoxyethylene glycol ether)，其具有如下结构

R₂-(C₂H₄O)_n-OH；

其中，R₂表示碳原子数为8～18的烷基，n为2～23的正整数。具体例子如十二烷基醇聚氧乙烯醚Brij 35，其结构式C₁₂H₂₅-(C₂H₄O)₂₃-OH，以及十六烷基醇聚氧乙烯醚Brij 56，其结构式C₁₆H₃₃-(C₂H₄O)₁₀-OH。

在本发明的试剂中，烷基酚聚氧乙烯醚的使用浓度通常为100～10000mg/L，优选为500～4000mg/L。浓度过低，则可能引起包括嗜碱性粒细胞在内的所有白细胞都被裂解，导致嗜碱性粒细胞不能与其它白细胞正确区分；浓度过高，则可能会使红细胞、血小板和嗜碱性粒细胞以外的白细胞裂解不完全，也会导致嗜碱性粒细胞分类和计数的错误。

3)用于调节pH值的缓冲剂

本发明的试剂中，缓冲剂的主要作用是为了将试剂的pH稳定在1.8～3.5之间，优选在2.0～3.0范围内。合理的pH值有利于嗜碱性粒细胞以外的其它白细胞的破坏，同时选择性地保护嗜碱性粒细胞结构的完整性。pH过低(<1.8)时，会造成包括嗜碱性粒细胞在内的所有白细胞都被破坏；而pH过高(>3.5)则会导致嗜碱性粒细胞以外的白细胞裂解不完全。而这两种情况都会影响嗜碱性粒细胞的正确分类和计数。

可用于本发明的试剂的此类缓冲剂没有特别的限定，可以为有机酸(盐)、无机酸(盐)或多种成分的混合物。具体的例子如乙酸、柠檬酸、邻苯二甲酸、草酸、甘氨酸-盐酸缓冲液和邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液等。缓冲液的合适浓度通常在2～500mM范围内。

采用本发明的方法对嗜碱性粒细胞进行测定时，使用本发明提供的试剂与一定比例的血液样本混合，两者的比例通常为10～100:1，孵育时间通常控制在5～60秒，孵育温度通常控制在15～42℃。使用较高孵育温度时可适当缩短孵育时间，而使用较低温度时可适当延长孵育时间。

试剂与血液孵育一定时间后，在可以检测前向和侧向散射光信号的细胞分析装置上对细胞进行分析，然后通过细胞的前向和侧向散射光二维散点图，可将嗜碱性粒细胞与其它白细胞进行区分。其中，检测前向和侧向散射光信号的方法以及在二维散点图上对细胞进行区分的方法是本领域技术人员所熟知的内容。

下面通过具体的实施例对本发明做进一步详细的描述。

实施例1

按如下成分配制嗜碱性粒细胞分析试剂：

NP 40           800mg/L

Brij 35         2g/L

柠檬酸          10mM

H₂O             加至1L

上述试剂pH值约为2.8。取上述嗜碱性粒细胞分析试剂1mL与20μL血液样本混匀，40℃孵育10秒。然后在迈瑞BC-5500血液细胞分析仪上测定细胞的前向和侧向散射光信号，生成的散点图如图1。如图所示，使用前向和侧向散射光信号可将嗜碱性粒细胞与其它白细胞进行区分。

另取155份新鲜的临床血液标本，使用上述嗜碱性粒细胞分析试剂按上述方法在迈瑞BC-5500血液细胞分析仪上对嗜碱性粒细胞(％)进行测定，并将结果与同样血液标本按本领域常规方法在sysmex XE-2100血液细胞分析仪上的测定值进行相关分析。如图2所示，两组测定值的相关性良好，其相关系数达到0.84808。

对照例

对照例采用类似实施例1中的嗜碱性粒细胞分析试剂的成分，只是NP40由相同浓度的十六烷基三甲基氯化铵替代，其组成如下：

十六烷基三甲基氯化铵      800mg/L

Brij 35                   2g/L

柠檬酸                    10mM

H₂O                       加至1L

上述试剂pH值约为2.8。取上述试剂1mL与20μL血液样本混匀，40℃孵育10秒。然后在迈瑞BC-5500血液细胞分析仪上测定细胞的前向和侧向散射光信号，生成的散点图如图3。如图所示，使用与NP 40相同浓度的阳离子表面活性剂(十六烷基三甲基氯化铵)时，有嗜碱性粒细胞以外的白细胞和细胞碎片溶解破坏不完全，导致嗜碱性粒细胞和其它白细胞不能明显区分。

实施例2

按如下成分配制嗜碱性粒细胞分析试剂：

NP 40                 800mg/L

Brij 56               1g/L

甘氨酸                20mM

HCl                   将pH调至2.5的量

H₂O                   加至1L

使用上述嗜碱性粒细胞分析试剂1mL，加入20μL血液样本。40℃孵育40秒后，在迈瑞BC-5500血液细胞分析仪上测定细胞的前向和侧向散射光信号，生成如图4的散点图。如图所示，通过前向和侧向散射光信号可以对嗜碱性粒细胞进行分类和计数。

实施例3

按如下成分配制嗜碱性粒细胞分析试剂：

Triton X-100      400mg/L

Brij 35           500mg/L

乙酸              250mM

H₂O               加至1L

上述试剂pH值约为2.8。使用上述嗜碱性粒细胞分析试剂1mL，与20μL血液样本混匀，40℃孵育10秒。然后在迈瑞BC-5500血液细胞分析仪上测定细胞的前向和侧向散射光信号，其散点图结果如图5。如图所示，使用前向和侧向散射光信号可将嗜碱性粒细胞与其它白细胞区分开来。

实施列4

按如下成分配制嗜碱性粒细胞分析试剂：

Triton X-100       400mg/L

Brij 56            1g/L

邻苯二甲酸氢钾     20mM

HCl                将pH调至2.5的量

H₂O                加至1L

使用上述嗜碱性粒细胞分析试剂1mL，加入20μL血液样本。40℃孵育40秒后，在迈瑞BC-5500血液细胞分析仪上测定细胞的前向和侧向散射光信号，生成如图6的散点图。如图所示，通过前向和侧向散射光信号可以对嗜碱性粒细胞进行分类和计数。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种嗜碱性粒细胞分析试剂，其特征在于：所述试剂包括

i、至少一种烷基酚聚氧乙烯醚(Polyoxyethylene phenyl ether)，

ii、至少一种烷基醇聚氧乙烯醚(polyoxyethylene glycol ether)，

iii、用于调节pH的缓冲剂。

2、根据权利要求1所述的一种嗜碱性粒细胞分析试剂，其特征在于：所述烷基酚聚氧乙烯醚具有如下结构：

R₁-C₆H₄-(C₂H₄O)_m-OH

其中，R₁表示碳原子数为8～9的烷基，m为8～10的正整数；

和/或

所述烷基醇聚氧乙烯醚具有如下结构：

R₂-(C₂H₄O)_n-OH

其中，R₂表示碳原子数为8～18的烷基，n为2～23的正整数。

3、根据权利要求2所述的一种嗜碱性粒细胞分析试剂，其特征在于：所述烷基酚聚氧乙烯醚选自：

结构式为C₈H₁₇-C₆H₄-(C₂H₄O)_X-OH，其中x＝9或10的辛基酚聚氧乙烯醚，或，

结构式为C₉H₁₉-C₆H₄-(C₂H₄O)₈-OH的壬基酚聚氧乙烯醚。

4、根据权利要求2所述的一种嗜碱性粒细胞分析试剂，其特征在于：所述烷基醇聚氧乙烯醚为十二烷基醇聚氧乙烯醚或十六烷基醇聚氧乙烯醚。

5、根据权利要求1～4任意一项所述的一种嗜碱性粒细胞分析试剂，其特征在于：所述试剂中，烷基酚聚氧乙烯醚的浓度为100～8000mg/L，烷基醇聚氧乙烯醚的浓度为100～10000mg/L。

6、根据权利要求5所述的一种嗜碱性粒细胞分析试剂，其特征在于：所述试剂中，烷基酚聚氧乙烯醚的浓度为400～4000mg/L，烷基醇聚氧乙烯醚的浓度为500～4000mg/L。

7、根据权利要求1～4任意一项所述的一种嗜碱性粒细胞分析试剂，其特征在于：所述缓冲剂调节试剂的pH为1.8～3.5。

8、根据权利要求7所述的一种嗜碱性粒细胞分析试剂，其特征在于：所述缓冲剂调节试剂的pH为2.0～3.0。

9、一种嗜碱性粒细胞的测定方法，所述方法包括，将权利要求1～8中任意一项所述的试剂与血液样本按10～100:1的比例混合，于15～42℃温度下孵育5～60秒后对细胞进行分析。

10.根据权利要求9所述的一种嗜碱性粒细胞的测定方法，其特征在于：所述对细胞进行分析是指，通过测定反映细胞大小和内部结构的光信号对嗜碱性粒细胞进行分类和计数。

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