CN101421620B - 通过内源校准物对待分析物进行偶联的酶免疫化学测定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过分析元件对生物样品和其它液体样品中的多种待分析物(例如代谢物和抗原)进行测定的方法，所述分析元件特别是侧向流动测试带、流通膜体系(流通测试)、微量滴定板或试管的孔/洞，本发明的方法以偶联的酶和亲和反应为基础，并借助于内源校准物(即内源生产的物质)完成，借助于所述内源校准物(例如肌酸酐、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸盐、乳酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐、胆固醇、丙酮酸盐、尿素和甘油三酯)能够校正样品基质的稀释度。本发明的应用领域主要是医学诊断学、制药工业和环境保护。优选地，本发明涉及对抗原和代谢物的同时或先后测定。在本发明的含义中，它们主要是高分子抗原(如蛋白质)或低分子半抗原，例如杀虫剂、新蝶呤、污染物或激素，以及，在代谢物的情况下例如为葡萄糖或肌酸酐。结果可借助于计算图、比色器(参考带)、读数器的帮助从测定法直接确定，或通过用肉眼比较来确定。

Description

通过内源校准物对待分析物进行偶联的酶免疫化学测定的方法

本发明涉及通过分析元件对生物样品和其它液体样品中的多种待分析物(例如代谢物和抗原)进行测定的方法，所述分析元件特别是侧向流动测试带(lateral-flow test strip)、流通膜体系(流通测试)、微量滴定板或试管的孔/洞。本发明的应用领域主要是医学诊断学、制药工业和环境保护。

用于测定生物学液体中的多种待分析物或用于测定环境样品中的污染物的分析元件(例如免疫-色谱测试体系)已经已知数年，在实践中其被证明是非常成功的。它们主要根据夹层原理或竞争原理(在小分析物的情况下)工作。亲和测定法(例如免疫测定法、受体和DNA测定法)的使用对于临床和大量其它应用来说正越来越重要。在该情况下，非常不同的待分析物在不同的样品基质(例如尿、唾液、泪液、汗、液体(liquor)或血)中被测定。但目前仍存在下述问题，至少一部分所述基质(例如尿)的稀释度不是恒定的；因此，在一天的过程中发生明确的浓度改变，这影响相应的待分析物的测量值。然而，内源形成的物质是针对个体身体基质来描述的，在它的帮助下可以校正相应的稀释度；因此，体系可以被校准(Federal health sheet-health research-health protection52005；Norpoth K，Heger M(1984)，Creatinine as a reference variable for indicating substanceconcentrations in the urea.In：Hentschler D，Lehnert G(Hrsg)Biological AgentTolerance Values(BAT values)，occupational medical toxicological grounds，Vol.1，Commission for the testing of health-hazardous biological agents of theDFG)。样品基质尿中的肌酸酐是作为内源校准物(calibrator)作用的这些物质的一个例子。在健康测试受试者自发产生的尿样的情况下，每升尿4到28mmol之间的肌酸酐浓度波动是非常正常的(Fundamentals of LaboratoryTesting：Urine，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)。如果将这些值与24小时尿的平均值(15mmol/l)相比，那么很清楚：因数为3.5的稀释度是正常范围，但是尿也可以以因数2被浓缩。以样品基质尿中待测定的待分析物为基础，这表示：测定的测量值必须相应地被校正，因此双重测定(内源校准物和分析物)之后必须进行计算。在实践中，这表示进行两个独立的测试。在尿的情况下，首先通过酶级联放大测定肌酸酐浓度，然后在第二阶段(通常免疫化学地)测定待分析物的体积。该方法是既耗时又费力的。

因此，本发明的目的是发现用于下述测试体系的新溶液，所述测试体系测定样品基质中的多种待分析物，所述样品基质具有不恒定的浓度。

本发明根据权利要求完成。其涉及通过分析元件来测定生物样品或其它液体样品中的多种待分析物(例如代谢物和抗原)的方法，所述分析元件特别是侧向流动测试带、流通膜体系(流通测试)、微量滴定板或试管的孔/洞，本发明的方法以偶联的酶和亲和反应为基础，并借助于内源校准物实现。

借助于所述内源校准物(例如肌酸酐、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸盐、乳酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐、胆固醇、丙酮酸盐、尿素和甘油三酯)能够校正样品基质的稀释度。

主要的构想由偶联酶和免疫化学方法组成，其包括由获得的体系自动校正总结果中相应样品基质的内源校准物浓度、分析物浓度。使用该组合的酶/免疫学测试体系，将体液与酶混合物孵育(反应1)，此时通过内源校准物转化孵育产生的过氧化氢(H₂O₂)被部分或完全地用于用相同体液进行的第二轮的免疫反应(反应2)中，以通过标记物酶形成信号。获得该信号，将其与第一反应中产生的H₂O₂信号比较或抵消。

该方法的两个反应可以同时或先后进行，也可以在一个区室或两个独立的区室中进行。优选地，使用侧向流动测试带、流通膜体系(流通测试)、微量滴定板或试管的孔/洞作为区室。根据本发明，通过视觉(裸眼)、比色法、通过荧光或电化学获得信号。

评价借助于计算图、比色器(参考带)、读数器或使用肉眼的比较进行，在后者的情况下，由校准物经酶促产生的信号数(例如测试线或测试点)被设定为针对由待分析物经免疫学产生的信号数(例如测试线或测试点)的比例。

使用该新方法，可以研究体液，包括尿、唾液、泪液、汗、液体或血。肌酸酐、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸盐、乳酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐、胆固醇、丙酮酸盐、尿素和甘油三酯被尤其用作内源校准物。标记物酶优选是过氧化物酶和氧化酶。优选地，使用酶混合物，所述酶混合物与体液中存在的涉及H₂O₂形成的内源校准物反应。例如，在体液尿的情况下，当使用肌酸酐作为内源校准物时，使用肌酸酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶的混合物。然而，如果在相同的样品基质中使用葡萄糖作为内源校准物，则使用葡萄糖氧化酶产生H₂O₂。

令人惊奇的是，我们发现，在具有非恒定浓度的样品基质中使用这样的组合体系，能够以可靠的方式(即用相应的稀释度校正)直接测定非常大范围的待分析物。接着借助图解在下文中更详细地解释本发明。

实施例

实施例1用侧向流动测试体系在样品基质尿中测定心脏特异脂肪酸结合 蛋白(FABP)同时借助于内源校准物(肌酸酐)进行校正(见图1、3、4和 6)

将尿样(200μl)分为2等份(A和B)。将A部分引入试管中(见图3)，所述试管含有冻干形式的以下酶混合物(每20μl)：肌酸酐酶(18.8U/ml)、肌酸酶(7.5U/ml)和肌氨酸氧化酶(11.3U/ml)。摇动试管并在室温(20-25℃)下孵育20分钟。存在于尿中的内源肌酸酐被以此种方式重建的酶混合物转化为过氧化氢(H₂O₂)和其它物质(见图1)。B部分首先被商业蛋白质稳定剂进行1∶4稀释，然后取50μl应用于测试带上(图4：样品开口1)。在样品开口1下固定的抗-FABP/辣根过氧化物酶缀合物从其基质中被溶解出来，与分析物形成络合物(FABP-抗-FABP/辣根过氧化物酶)，并以此种形式流过测试区域，另一种抗-FABP抗体被固定在所述测试区域上作为接收器(catcher)。存在FABP时，后者与所提到的络合物结合，作为分析物浓度的函数。应用B部分后20分钟，向样品开口2中引入100μl预孵育的A部分。因此，测试带上被固定的无H₂O₂并且局部严格受限制沉淀的过氧化物酶底物被溶解，并与H₂O₂(得自肌酸酐的转化)一起流过测试区域。如果达到接收器线的位置，则液体的、无色的底物立刻被转化为蓝色/紫色沉淀物。沉淀物(即产生的信号)的体积是分析物浓度和内源校准物体积的函数，所述内源校准物被用于产生反应必需的H₂O₂。高度内源的校准物(浓缩的晨尿)产生比具有平均校准物浓度和相同分析物浓度的样品(日间尿)更强的信号。所述的测试体系通过其作用的方式校正了该效应，并且在该情况下，允许借助于比色卡记录真正的分析物浓度(见图6)。

实施例2用基于微量滴定板的大点测定法在样品基质尿中测定FABP同 时借助于内源校准物(葡萄糖)进行校正(见图2和5)

用商业膜包裹的微量滴定板(96孔)进行大点测定法(图5/1)。优选地，膜材料由PVDF或硝酸纤维素组成。使用的点模型取决于涉及的应用；例子在图5/2中阐述。优选地，使用5个点(图5/3)，一般中央的点作为对照点作用。外部的点可以被用于测定不同的分析物和用于个体分析物浓度的稀释度校正。要被描述的例子涉及对个体分析物(FABP)的测定和使用的样品基质(尿)稀释度的同时校正。使用含有不同浓度抗-FABP抗体(接收器)的4个点(见图5，中央部分)。将尿样(400μl)分为2等份(A和B)。将A部分引入试管中，所述试管含有6.5U葡萄糖氧化酶和0.5mM葡萄糖。必须单独地添加小的、固定量的葡萄糖，以产生基底水平的H₂O₂。摇动试管并在室温(20-25℃)下孵育60分钟。存在于尿中的内源葡萄糖被转化为过氧化氢(H₂O₂)和其它物质(见图2)。首先用商业的蛋白质稳定剂以1∶10稀释B部分。制造以下的反应混合物：

	1	2
			μl稀释液(B部分)	199	194
μl抗-FABP抗体辣根过氧化物酶缀合物	1	1
			来自4,000ng/ml溶液的μl FABP	0	5
对应于以下以ng/ml为单位的FABP终浓度	0	100
			μl终体积	200	200

向每孔中添加100μl反应混合物，在室温(20-25℃)下孵育60分钟。添加FABP使得作用能够更清楚地被描述。只有存在FABP时才能在接收器抗体上形成以下络合物：接收器抗体/FABP/抗FABP抗体辣根过氧化物酶缀合物。然后将平板洗涤4次(0.1M Na-P缓冲液，pH7.2)，并向每孔中添加50μl的以下混合物：

1部分A部分

1部分不含H₂O₂的、局部严格受限制沉淀的过氧化物酶底物。

然后在室温下孵育至少5分钟。在该情况下，在结合辣根过氧化物酶的位置处，液体、无色的底物被转化为蓝色的沉淀物，沉淀物的体积(即产生的信号)取决于分析物浓度和内源校准物(葡萄糖)的体积，所述内源校准物被用于产生反应必需的H₂O₂。然后将平板再洗涤4次(如上)。干燥后使用例如成像工艺进行评价。图5显示了无FABP添加(4)和有FABP添加(5)的RGB图，还显示了无FABP添加(6)和有FABP添加(7)的灰色比例图用于评价。定量发生于后图的基础上，所述后图的数据在表1中给出。该自我校准测定法的作用通过向两种尿样中添加100ng/ml FABP而变得清楚。从最后一行看出使用的晨尿与日间尿相比被浓缩了1.74倍。参照它们的动力学，来评价通过使用的模型与接收器抗体(1；2；4和8ng/ml)产生的信号。在1ng/ml接收器抗体的强信号后，从2ng/ml接收器抗体开始，发生了连续的信号上升至饱和。在日间尿中相同的分析物浓度下，饱和更容易达到，因为该非浓缩的样品含有更少的内源校准物(在该情况下为葡萄糖)，并因此进能够形成更小量的H₂O₂。因此，可以针对特征性相对浓度范围数学地描述饱和曲线，并在评价软件中完成。然后通过比较饱和曲线进行样品中分析物的校正浓度测定。

表1：图5中所示结果的定量

测量的值对应于被选择用于评价的范围的像素(pixel)平均值

日间尿	2,830	3,113	1,582	2,958	5,623	3,472	4,042	4,062
									晨尿	3,897	2,278	1,950	3,215	8,970	5,117	6,808	9,011

晨尿-日间尿	1,067	-835	368	257	3,347	1,645	2,766	4,949
									晨尿：日间尿	1.38	0.73	1.23	1.09	1.60	1.47	1.68	2.22

总日间尿	10,483	17,199
			总晨尿	11,340	29,906

总晨尿-总日间尿

857

12,707

总晨尿：总日间尿

1.08

1.74

实施例3用于测定分析物同时借助于针对多种样品基质的内源校准物进 行校正的流通大点测定法(图7)

实施例3描述了用于测定分析物同时借助于针对多种样品基质的内源校准物进行校正的流通大点测定法的应用。在该情况下，首先将7个点用于流通膜体系(比较图7)。点‘1’到‘4’含有对照点，并且，优选地含有抗小鼠免疫球蛋白G或蛋白A。点‘EK’被用于测定相应的内源校准物，并因此优选地由个体酶或酶混合物以及过氧化物酶组成。点

是任选的，并且被使用时含有最适合该应用的浓度的相应校准物(例如肌酸酐或葡萄糖)，还含有将校准物转化为H₂O₂必需的组分。向所有的点中添加局部严格受限沉淀的过氧化物酶底物。

使用该测试体系时，首先在试管中预孵育样品，所述试管含有转化涉及的内源校准物必需的酶混合物，或相应的个体酶，以及辣根过氧化物酶偶联的抗-分析物抗体。然后将该反应混合物应用于流通膜体系的测试区域。如果分析物存在于样品中，则分析物-辣根过氧化物酶偶联的抗分析物抗体与相应的接收器抗体(点‘1’到‘4’)结合。因为不同的接收器抗体浓度，饱和发生在点‘4’的方向。通过反应混合物中内源校准物的转化形成的产物(优选H₂O₂)立刻启始无H₂O₂的、局部严格受限沉淀的过氧化物酶底物从其无色的初级阶段到蓝色/紫色沉淀物的转化，所述过氧化物酶底物预先被固定在每个点中。在该情况下，沉淀物体积取决于例如局部存在的过氧化物酶和H₂O₂浓度。

Claims (11)

1.组合的酶和免疫学测试方法，其特征在于，包括：

(A)第一反应，其为酶孵育反应，在其中用酶混合物孵育体液，并且所述酶混合物与存在于体液中涉及H₂O₂形成的内源校准物反应，从而产生H₂O₂；

(B)第二反应，其为采用相同体液的免疫反应，以通过标记物酶形成信号，其中所述第一反应中产生的H₂O₂被部分地用于所述第二反应中；以及

(C)获得在第二反应中形成的信号，并将其与第一反应中产生的H₂O₂的信号比较或抵消。

2.根据权利要求1的测试方法，其特征在于，所述两个反应先后进行。

3.根据权利要求1的测试方法，其特征在于，所述两个反应在一个区室中或在2个独立的区室中进行。

4.根据权利要求3的测试方法，其特征在于，所述区室选自侧向流动测试带、流通膜体系、微量滴定板或试管的孔/洞。

5.根据权利要求1-3中任一项的测试方法，其特征在于，通过视觉、比色法、通过荧光或电化学获得信号。

6.根据权利要求5的测试方法，其特征在于，所述比较借助于计算图、比色器、读数器或使用肉眼的比较进行，在后者的情况下，由校准物经酶产生的信号数被设定为针对由分析物经免疫学产生的信号数的比例。

7.根据权利要求1-3中任一项的测试方法，其特征在于，所述体液选自尿、唾液、泪液、汗、血清、血浆或血。

8.根据权利要求1-3中任一项的测试方法，其特征在于，所述内源校准物选自肌酸酐、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸盐、乳酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐、胆固醇、丙酮酸盐、尿素和甘油三酯、酶和离子。

9.根据权利要求1-3中任一项的测试方法，其特征在于，使用过氧化物酶和氧化酶作为标记物酶。

10.根据权利要求1-3中任一项的测试方法，其特征在于，使用的内源校准物以恒定的、最适的浓度被添加进所述反应混合物中用于所涉及的应用。

11.根据权利要求10的测试方法，其特征在于，在体液尿的情况下，当使用肌酸酐作为内源校准物时使用肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶的混合物，当使用葡萄糖作为内源校准物时使用葡萄糖氧化酶。

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