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CN101405603A - 用于诊断和治疗应用的不同类型的血型抗原 - Google Patents

用于诊断和治疗应用的不同类型的血型抗原 Download PDF

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CN101405603A CNA2007800103345A CN200780010334A CN101405603A CN 101405603 A CN101405603 A CN 101405603A CN A2007800103345 A CNA2007800103345 A CN A2007800103345A CN 200780010334 A CN200780010334 A CN 200780010334A CN 101405603 A CN101405603 A CN 101405603A
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little magnetic
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CNA2007800103345A
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J·刘
L·布乔恩斯特罗姆
P·格鲁夫曼
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Abstract

本发明提供了用于治疗或预防抗体介导的移植排异和血液类型的组合物和方法。

Description

用于诊断和治疗应用的不同类型的血型抗原
技术领域
本发明一般涉及用于治疗或预防抗体-调节的移植排斥的组合物和方法，更具体地，涉及包括血型决定簇的组合物，所述血型决定簇能够有效的除去抗血型抗原的抗体。
背景技术
早在移植的前期就发现穿过ABO血型屏障的肾移植会导致大范围的不发生作用的移植，因此，遵守传统的用于输血的兰斯坦纳法则被认为是异体移植的先决条件。受赠者预先形成的抗A/B同种凝集素造成针对ABO血型-不相容移植物超急性排斥反应。这种超急性排斥反应与在带有供体者反应性人体白细胞抗原-抗体同种免疫病人体内观察到的反应相似。第一个跨越ABO血型屏障的移植手术在二十世纪七十年代开始，是将A2血型的尸体肾脏移植到O型血的受赠者体内1。在二十世纪八十年代，使用A1和B型血捐献者进行第一组的ABO血型不相容的活体捐赠者(LD)肾移植，且存活下来的移植受赠者与ABO血型相容的情况相似。这种免疫抑制草案包括前期进行血浆除去法除去抗A/B抗体、捐赠者血小板输血、脾切除术和用抗淋巴细胞/胸腺细胞球蛋白进行的诱导治疗、注射从猪胃中萃取出的A或B血型的物质和环孢霉素-硝基咪唑硫嘌呤-强的松。从那以后，在世界范围内报道了超过500个ABO血型不相容活体捐赠者肾移植手术，主要是日本报道(参见1)，有很多文件证明了移植之前减少受赠者抗A/B抗体水平从而避免排异性的重要性。2-3这一组移植手术幸存者情况比较好(大约85％的A1和B型捐赠者的移植存活期是1年)但是由于单个案例发生严重的抗A/B抗体调节的排异作用4，5，因此这一情况略逊于ABO血型相容的移植术。
使用抗CD20抗体(Rituximab)与除去抗体相结合进行ABO血型不相容的肾移植，在这方面最近的数据显示了更好的移植存活情况6，7。
在器官严重不足的情况下，增加使用来自ABO血型不相容的捐赠者中的移植物能够进行更多的活体捐献者肾移植。另外，在此方面获得的经验还可以用在人体白细胞抗原-致敏病人的预处理和后移植处理8。
发明内容
本发明部分地以用于从血浆中除去血型抗原抗体的改进的组合物和方法，以及血型鉴定方法为基础。
在本发明的一个方面，本发明提供了一种组合物，这种组合物包含至少两种血型抗原，每种血型抗原在不同核心糖化物链式上表达。优选的组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多的血型A/B抗原。
在另一个方面，通过提供不同子类型的微磁珠确定(例如血型测定)来自主体的样品中血型抗体的存在，其中每个子类型都包覆有不同的血型抗原，并将来自主体的样品加入到微磁珠中。将样品和微磁珠培养足够长的时间使样品中抗血型抗体与血型抗原在微磁珠上相结合，形成一种抗血型抗体-微磁珠复合物。培养这种复合物，例如，与至少一种标记物标记过的更具体地说能够结合所述抗血型抗体的配位体相接触培养，所述抗血型抗体能够与血型抗原相结合，检测是否存在这种结合抗血型抗体的标记过的配位体可以确定所述反应性抗体的存在。这种配位体可以是，例如，一种抗体或其片段。这种抗体是一种单价抗体片段，例如Fab或Fab′片段。例如，Fab或Fab′片段可以是一种抗Fc抗体片段、一种抗kappa轻链抗体片段、一种抗λ轻链抗体片段、和单链抗体片段。所述标记物例如一种荧光标记物。通过本领域移植的方法，例如流式细胞计或luminex液态芯片(蛋白分析系统)可以测定标记的配位体。
通过提供大量不同子类型的微磁珠除去样品中的血型反应性抗体，其中，所述不同子类型的微磁珠上包覆有不同的血型抗原。将样品和这些微磁珠相接触并培养足够长的时间，使样品中的抗血型抗体与血型抗原相结合。微磁珠与样品分离，从而从样品中除去血型反应性抗体。
血型抗原包括A型抗原、B型抗原和H型抗原。核心糖化物链类型包括1型、2型、3型和4型。血型抗原不含有糖化物(在这里是指ABO血型低聚糖或任选的，血型抗原在粘蛋白多肽上表达。这里的粘蛋白多肽是粘蛋白免疫球融合蛋白质(在这里是指ABO融合蛋白质或多肽)的一部分。
任选的，ABO低聚糖或ABO融合蛋白质与一种固体支持物，例如微磁珠相连，例如共价相连或非共价相连。例如，微磁珠可以是橡胶的。通过不同的子类型的微磁珠是指微磁珠的大小、颜色不同，或者大小及颜色都不同。微磁珠的直径在大约2微米到大约15微米的范围内。优选的，所述微磁珠直径大约为5微米。最优选的，所述微磁珠直径大约为5微米。
所述样品可以是，例如，全血、血清或血浆。
在一些方面，该组合物被配制成吸收剂用于从全血或血浆中除去血型抗体。本发明还提供了许多不同子类型的微磁珠，其中每个子类型上都包覆有不同的血型抗原。例如，所述微磁珠包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25、30、40、50或更多种不同子类型的微磁珠。
除非另有定义，这里使用的所有技术与科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义相同。尽管与这里描述的相似或等同的方法和材料也可以被用于实现或检验本发明，但是适当的方法和材料在下面进行了描述。在这里提到的所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献通过引证在此全部并入本文。如果有矛盾的话，以本申请的说明书，包括定义的解释为准。另外，这里的材料、方法和实施例只起到实例性作用，并不起到限制的目的。
通过下面的详细介绍和所付权利要求书，本发明其他的特点和优势会变得显而易见。
附图说明
图1是一种用于生产传送血型抗原的载体的示意图。
图2是一种显示PSGL-1/mIgG 2b细胞定位的照片，所述PSGL-1/mIgG 2b细胞定位通过间接免疫荧光法测定。使用FITC-结合的山羊抗老鼠免疫免疫球蛋白G Fc抗体(Sigma公司购得)在封闭缓冲液中按1∶200稀释后的溶液测定PSGL-1/mIgG2b蛋白质。使用4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核染色。
图3是蛋白质印记试验的照片，显示了各种外核链传送的血型A决定簇。
图4是在不同聚糖前体上产生ABO融合肽的ABH转染方案的示意图。
图5是图表，显示了5种不同大小、不同颜色强度的磁珠所产生的流式细胞计计数，该图表清楚的显示了可以使用许多大小-颜色结合的磁珠。使用上述大小和颜色的结合，可以制成最多25中不同的磁珠，每个都代表一种独特的血型抗原。
图6是一种血型抗原外核结构的示意图。
图7是血型ABH抗原的示意图。
图8是识别血清中抗血型抗体的流式细胞计结果的图解表示。
图9是一系列散布图，显示了在来源于A型、B型和O型个体血清中免疫免疫球蛋白G和免疫免疫球蛋白M血型A抗体。
具体实施方式
本发明部分地以一种发现为基础，该发现是血型抗原决定簇可以在高密度条件下通过不同的核心糖化物链(例如1型、2型、3型或4型核心糖化物链)上专一的表达，所述核心糖化物链或者是游离糖化物或者在粘蛋白型蛋白质骨架上的糖化物。已经发现，在移植之前，使用不同的核心糖化物链携带的血型抗原相结合，能够更有效的从血液中除去抗血型抗体。另外，本发明的组合物在诊断和预兆疾病方面是有效的，可以测定主体体内血型反应性抗体的存在。
在一个方面，本发明提供了一种包含至少两种不同的血型抗原(即，低聚糖)的组合物，其中，每种血型抗原在不同的核心糖化物链(即，聚糖前体)上表达。这些低聚糖在这里被称为″ABO血型低聚糖″。所述血型抗原是游离糖化物。做为选择，所述血型抗原在粘蛋白多肽上表达。例如，所述血型抗原在粘蛋白免疫球蛋白融合蛋白质(在这里被称作″ABO血型融合蛋白质″)中表达。所述ABO血型融合蛋白质携带对血型决定簇具有专一性的抗原决定簇。例如，ABO血型融合蛋白质携带A型抗原决定簇、B型抗原决定簇或H型抗原决定簇。做为选择，ABO血型融合蛋白质携带用于血型抗原的两种抗原决定簇。例如，ABO血型融合蛋白质携带A型和B型抗原决定簇。在一些方面，ABO血型融合蛋白质携带所有的三种抗原决定簇(即，A型抗原决定簇、B型抗原决定簇和H型抗原决定簇)。本发明的ABO血型融合蛋白质在不同的聚糖前体上表达A型抗原决定簇、B型抗原决定簇或H型抗原决定簇，所述不同的聚糖前体例如1型前体链、2型前体链或者3型前体链。
任选的，ABO血型低聚糖或者ABO血型融合蛋白质与一种固体支持物相连，从而使血型抗原从血液中分离出来。
因此，在例如，ABO血型不相容的器官移植、骨髓移植之前或者为了产生万能供血者血浆时，ABO血型低聚糖和ABO血型融合蛋白质在从受赠者血液或者血浆中除去抗血型ABO抗体方面是有效的。ABO血型低聚糖或者ABO血型融合蛋白质从受赠者血液或者血浆中吸收50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或者100％的抗τ血液基团ABO抗体。
与在单一核心糖化物链上表达的血型低聚糖相比，ABO血型低聚糖在碳水化合物摩尔分子量基础上在除去或结合抗血型抗体方面是更有效的。与“等量的在单一核心糖化物链上表达的游离糖化物″相比，ABO血型低聚糖结合2、4、10、20、50、80、100或更多倍的大量抗血型抗体。
相似地，与野生型AB决定簇的游离糖化物相比，ABO血型融合肽在碳水化合物摩尔分子量基础上在除去或者结合抗血型抗体方面更为有效。与相等数量的野生型AB决定簇的游离糖化物相比，ABO血型融合肽结合2、4、10、20、50、80、100或更多倍的大量抗血型抗体。
ABO血型低聚糖和ABO血型融合蛋白质还可以有效的用于血型测定的方法中。本发明的方法与现有的血型测定方法相比更优越的地方在于本发明方法能够定量评价不同的种类和亚种类的血型抗体。特别是，本发明方法还考虑到链式特异性抗体的检测。这具有临床相关性，因为免疫系统可以特异性的应答在不同核心链上的血型抗原。此外，血型抗原不同的核心链上以一种细胞和组织特异性方式被表达。因此，通过检测链特异性抗体可以在ABO血型不相容的器官异源移植中更好的完成捐赠者-受赠者交叉配血，从而减少过急性排异作用。
ABH组织血型抗原
在ABH抗原在几乎所有的人体细胞中都有发现，但是如果他们起到一些作用的话，他们的生理作用还存在一些未确定的问题。他们具有碳水化合物的性质，且通过不同的糖基转移酶建成，所述糖基转移酶即以连续的方式在生长的低聚糖链的非还原末端加入单糖单元的酶。低聚糖可以通过蛋白质或者脂类携带，或者可以在体液(例如人类乳汁)中游离存在9。
根据线性核心糖基链，ABH抗原可以被分为不同的亚基团。作为一种实施例，A、B和H抗原在1型链(Galβ1，3GIcNAc)、2型链(Galβ1，4GlcNAc)、3型链(Galβ1，3GaIN Acα)和4型链(Galβ1，3GalNAcβ)上表达。4型链ABH抗原只被发现结合脂类。通过在加入海藻糖可以制备H型抗原，所述海藻糖通过α1，2连接体与不同的包含末端半乳糖的核心链相连。A型抗原和B型抗原都是从H型子类型中通过加入N-乙酰半乳糖胺(A型)或半乳糖(B型)产生的，所述N-乙酰半乳糖胺或半乳糖与末端半乳糖以α1，3连接体形式相连。负责A型和B型抗原生物合成的糖基转移酶需要α1，2-海藻糖的存在，从而分别加入末端N-乙酰半乳糖胺和半乳糖。
两种在结构上有差别的α1，2-海藻糖基转移酶能够使H型抗原的生物合成按照Oriol.10所述的方法开始进行。其中一个通过H位点(FUT-I)编码，另一个通过分泌器官(Se)位点(FUT-II)编码。FUT-I基因产物导致红血细胞H型抗原表达并在2型链上起到突出的作用，同时也显示了相对1型链的活性。相反，FUT-II基因产物通过唾液腺腺泡细胞以及排列在胃肠道、繁殖系统和肺部区域的分泌薄壁细胞表达，主要作用与1型链，可能也作用于3和4型链。
负责A型抗原和B型抗原表达的基因产物已经表明具有公共的来源。与B型编码的基因产物相比，导致A型四个氨基酸残基替换的突变作用造成捐赠者糖核苷酸的变化，优选的该变化是从二磷酸尿嘧啶-N-乙酰半乳糖胺转变为二磷酸尿嘧啶-半乳糖。由于原始A型等位基因中框架位移的突变作用，血清学命名的O表现型缺少的东西这两个基因产物的表达，由此也不表达A型或B型决定簇。11A型血型已经根据血清学被分成不同的群，最常见的子群是A1和A2。12通过两种不同的α1，3-N-乙酰氨基半乳糖转移酶生产这些A型子类型，一种优选H型3和4抗原(A1)，另一种优选H型1和2(A2)抗原。
多化合价的重要性
蛋白质-碳水化合物的相互作用通常以低的结合亲合力为特征。尽管这看起来是不合理的，但是这为快速开/关速率提供了基础，而快速开/关速度在生理情况下是必须的，从而能够允许快速、高度可变的、在细胞受体、抗体及其他碳水化合物结合蛋白和他们的糖基化的配体之间产生的相互作用。必要时，通过利用多化合价自然可以实现较高的亲合力。在一个生物体上的几个受体与在另一个生物体上的几个碳水化合物配位体的结合可以使亲和力增加10-10000倍。多价相互作用的实施例包括微生物(病毒、细菌或者细菌毒素)与细胞表面的结合、细胞-细胞结合和多价分子，例如抗体与细胞表面的结合。13多价抑制剂与单价抑制剂相互作用的抑制通常是无效的，及时所述抑制剂的结合活性已经在结构上被最优化。因此；许多不同的分子(例如聚丙烯酰胺、肽、牛血清白蛋白、树枝状聚合物和环糊精)已经被用作主要成分，用于试图使相应受体产生多价结合作用的单糖和低聚糖的多目标显示。13一种选择性的方法包括配位体与脂质体、薄膜或者其他表面头部基团非共价的结合。13这种糖连接物的成果是变化的，但亲合力与单价相互作用相比，通常能够增加10到1000倍。在一些情况下，通过最优化配位体外观(即配位体结构、化合价程度、主链结构和内部/内配位体距离)，也就是说，通过尽可能详细的模仿碳水化合物呈递的天然线路，已经实现了纳摩活性最常见的特征生理蛋白质-碳水化合物相互作用。
带有适当聚糖-取代作用的重组细胞粘蛋白作为抗碳水化合物抗体有效的吸收体。
粘蛋白型蛋白质通常发现在粘膜表面，它的特点在于其具有大量的O-聚糖取代作用(每两到三个氨基酸)。超过50％的分子量是由于所述碳水化合物取代作用。通过将各式各样的糖基转移酶互补DNA与所述粘蛋白-免疫球蛋白的共同表达，可以测定其O聚糖的结构，从而携带几个生物学上重要的碳水化合物决定簇的拷贝。这样，可以制得粘蛋白传送的血型A型决定簇，这种血型A型决定簇表现出高效率的抗血型A型吸收体结合活性。1事实上，抗血型A型抗体以粘蛋白为基础的吸收体与血型A型三糖通过间隔物直接与琼脂糖磁珠()相连所得的吸收体相比其结合抗A型抗体效力提高了大约100倍(通过计算血型A型决定簇的数目)。这可以通过一种现象来解释，即A型决定簇的几个拷贝在粘蛋白型载体蛋白1上以Ab-结合最佳的间隔被表达。同样；重组细胞粘蛋白传送的碳水化合物抗原决定簇，Galα1，3Gal(α-GaI)已经被证明是一种非常有效的抗Gal抗体的吸收体，也是组织猪-向人异种移植的主要障碍15-17。因此，粘蛋白是非常有效的支架用于具有生理活性的碳水化合物的最佳显示。
血型抗原子类型的重要性
如上所述，血型ABH决定簇可以被不同的核心糖化物链携带。他们在人体中具有细胞-特异性和组织-特异性的分布状态，且个体ABH抗原作为靶向分子用于抗血型ABH抗体的重要性是未知的。相似地，所述抗血型ABH抗体的全部技能是否是异质的也是未知的，那就是说这些抗体的亚群是否可以区别不同的ABH抗原子类型以及是否实际上比末端三糖需要更多的链用于结合是未知的。一些数据表明，只使用A或B三糖来吸附所有对血型A或B抗原分别具有特异性的抗体是足够的，表明这对检测抗体也是正确的19-20。然而，本发明的数据显示使用ABH血型抗原不同的子类型(即不同的核心糖化物链携带的子类型)来获得更有效的抗体吸附和检测是可能的。
具有合适的核心糖化物链的低聚糖可以作为有效的抗碳水化合物抗体吸收体。
从以上的讨论得出，粘蛋白型融合蛋白质或者低聚糖在不同的核心糖化物链上传送的ABH决定簇(从而获得结构多相性)的混合物能够吸附更宽范围的抗A型/B型抗体。使用不同的糖基转移酶基因的结合，可以设计粘蛋白-免疫球蛋白融合蛋白质用规定的内部和外部核心糖化物链来传送几个拷贝的O-连接的聚糖。这可以被ABH决定簇进一步地拉长。因此，重组细胞技术可被用来产生结构多变的血型A或B粘蛋白，这种粘蛋白可用于吸附更大范围的抗A型或者B型抗体。
血型抗原低聚糖
在多种方面，本发明提供了血型抗原低聚糖。血型抗原包括A型、B型以及O(H)型。所述血型抗原对所有的血型子类型都具有特异性。血型抗原子类型是指所述血型抗原在不同的核心糖化物链型上表达。核心糖化物链类型包括1型、2型、3型以及4型聚糖前体。
示范性的血型抗原低聚糖包括如下所示：
1-4型的血型A抗原
1型GalNAcα1，3(Fucα1，2)Galβ1，3GlcNAcβ1-R
2型GalNAcα1，3(Fucα1，2)Galβ1，4GlcNAcβ1-R
3型GalNAcα1，3(Fucα1，2)Galβ1，3GalNAcα1-R
4型GalNAcα1，3(Fucα1，2)Galβ1，3GalNAcβ1-R
1-4型的血型B抗原
B1型Galcd，3(Fucα1，2)Galβ1，3GlcNAcβ1-R
B2型Galα1，3(Fucα1，2)Galβ1，4GlcNAcβ1-R
B3型Galα1，3(Fucα1，2)Galβ1，3GalNAcα1-R
B4型Galα1，3(Fucα1，2)Galβ1，3GalNAcβ1-R
其中当血型抗原被携带在融合蛋白质上时，R代表粘蛋白；当低聚糖与固体支持物相连时，R代表连结点，或者当低聚糖是游离糖化物时，R什么也不代表。
融合多肽
在各种方面，本发明提供了包括第一多肽的融合蛋白质，所述第一多肽包含至少一部分糖蛋白，例如，可操作的与第二多肽连接的粘蛋白多肽。如在这里使用的，″融合蛋白质″或者″嵌合蛋白质″包括至少一部分粘蛋白多肽，该可操作的与非粘蛋白多肽连接。″粘蛋白多肽″涉及一种具有粘蛋白区域结构的多肽。所述粘蛋白多肽具有一个、两个、三个、五个、十个、二十或更多的粘蛋白区域结构。所述粘蛋白多肽可以是任意一种糖蛋白，其特征在于其氨基酸序列被O-聚糖所取代。例如，粘蛋白多肽每两个或三个氨基酸是丝氨酸或者苏氨酸。粘蛋白多肽是一种分泌蛋白质。做为选择，粘蛋白多肽是细胞表面蛋白。
粘蛋白区域结构富含苏氨酸、丝氨酸和脯氨酸，其中，低聚糖通过N-乙酰半乳糖胺与羟基氨基酸相连(O-聚糖)。粘蛋白区域结构包括O-连接的糖基化作用位点，或者作为选择，粘蛋白区域结构由O-连接的糖基化作用位点组成。粘蛋白区域结构具有1、2、3、5、10、20、50、100或更多的O-连接的糖基化作用位点。做为选择，粘蛋白区域结构包括N连接的糖基化作用位点，或者做为选择粘蛋白区域结构由N-连接的糖基化作用位点组成。粘蛋白多肽重量的50％、60％、80％、90％、95％或者100％是由聚糖产生的。粘蛋白多肽可以是任何一种MUC基因(例如，MUC1、MUC2、MUC3等等)编码的多肽。做为选择，粘蛋白多肽是P-选凝素糖蛋白配位体1(PSGL-I)、CD34、CD43、CD45、CD96、GlyCAM-1、MAdCAM或者红血球血型糖蛋白。优选的，所述粘蛋白是P-选凝素糖蛋白配位体1。然而″非粘蛋白多肽″涉及一种多肽，该多肽中少于40％的质量是由于聚糖引起的。
在本发明ABO血型融合蛋白质内部，粘蛋白多肽可以相当于所有的粘蛋白蛋白质或者粘蛋白蛋白质的一部分。在一个实施方案中，ABO血型融合蛋白质包括至少一部分粘蛋白蛋白质。″至少一部分″是指粘蛋白多肽包含至少一个粘蛋白区域结构(例如，O-连接的糖基化作用位点)。在一个实施方案中，粘蛋白蛋白质包括所述多肽的细胞外部分。例如，所述粘蛋白多肽包括PSGL-I的细胞外部分。
第一多肽通过一个或一个以上血型转移酶糖基化。第一多肽通过2个、3个、5个或更多的血型转移酶糖基化。糖基化作用是连续的或者联贯的。做为选择，糖基化作用是同时发生的或者随机发生的，例如，以不特定的方式进行。例如第一多肽通过α1，2海藻糖基转移酶糖基化，所述α1，2海藻糖基转移酶例如H-或者Se-基因编码的α1，2海藻糖基转移酶。实例性的α1，2海藻糖基转移酶是FUT1(基因库编号：Q10984；O10983；010981；AT455028和NM00148)和FUT2(基因库编号：P19526；BAA11638；D82933和A56098)。做为选择，第一多肽通过1，3N-乙酰半乳糖胺基转移酶或者α1，3氨基半乳糖基转移酶被糖基化。在一些方面，第一多肽通过α1，2海藻糖基转移酶和1，3N-乙酰半乳糖胺基转移酶或者α1，3氨基半乳糖基转移酶被糖基化。
在所述融合蛋白中，术语″可操作的连接″是用来说明，第一和第二多肽是化学连接的(最具代表性的，通过一种共价键，例如肽键连接)，其连接方式允许第一多肽的O-连接的糖基化作用。当应用涉及核酸编码的融合多肽时，术语″可操作的连接″是指编码核酸编码的粘蛋白多肽和非粘蛋白多肽在框架结构中彼此融合。所述非粘蛋白多肽可以在粘蛋白多肽的N-末端或者C-末端融合。
在进一步的实施方案中，所述ABO血型融合蛋白质可以与一个或一个以上其他的基团相连，例如，ABO血型融合蛋白质可能另外与GST融合蛋白质相连，其中，ABO血型融合蛋白质与GST(例如，谷胱甘肽S-转移酶)序列的C-末端融合。这种融合蛋白质可以促进ABO血型融合蛋白质的纯化。做为选择，ABO血型融合蛋白质可以另外与一种固体支持物相连。本领域普通技术人员已知多种不同的固体支持物。这种组合物可以促进抗血型抗体的除去。例如，ABO血型融合蛋白质与一种颗粒相连，所述颗粒由例如金属化合物、硅、橡胶、聚合材料、微量滴定板、硝化纤维或者聚酰胺纤维或者其结合组成。与固体支持物相连的ABO血型融合蛋白质可以被用作一种吸收体，从生物样品中除去抗血型抗体，所述生物样品例如血液或者血浆。
在另一个实施方案中，所述融合蛋白质在它的N-末端包括一种异源信号顺序(即，一种在粘蛋白核酸编码的多肽中不应该存在的多肽序列)。例如，天然粘蛋白信号序列可以被删除或被来自另外一种蛋白质的信号序列所取代。在某些寄主细胞(例如，哺乳动物寄主细胞)中，可以通过使用异源信号序列增加多肽的表达和/或分泌。
本发明的嵌合蛋白质或者融合蛋白质可以通过标准重组DNA技术生产。例如，使用传统方法，例如，使用粗糙末端或者交错末端捆绑、限制酶消化提供适当的末端、适合的粘性末端填充、碱性磷酸酶处理避免不需要的连接、和酶催化捆绑等方法，被编码用于不同多肽序列的DNA片段在框架中捆绑在一起。在另一个实施方案中，所述融合基因可以通过传统方法合成，所述传统方法包括自动化的DNA合成。做为选择，可以使用固定引物进行基因片段的PCR扩增，所述引物能够在两个连续的基因片段之间产生互补的凸起，随后，这两个连续的基因片段被退火并再扩增产生一种嵌合基因序列(参见，例如，Ausubel等人的文献(编辑)，分子生物学方面的现有方案，John Wiley & Sons，1992)。此外，许多编码融合基团(例如，免疫球蛋白重链Fc区域)的表达载体是可以商业购得的。糖蛋白Ibα编码的核酸可以被克隆进入这种表达载体中，从而使该融合基团在框架内与免疫球蛋白蛋白质连接。
ABO血型融合多肽可以作为低聚物存在，例如，作为二聚物、三聚物或者五聚物存在。优选的，所述ABO血型融合多肽被一种二聚物。
可以使用本领域内已知的粘蛋白编码序列构建第一多肽和/或核酸编码的第一多肽。粘蛋白多肽和核酸编码的粘蛋白多肽的适当的来源包括基因银行登记号分别为：NP663625和NM145650，CAD10625和AJ417815，XP140694和XM140694，XP006867和XM006867和NP00331777和NM009151，他们在这里通过引证全部并入本文。
在一些实施方案中，粘蛋白多肽基团作为一种粘蛋白多肽变体被提供，所述粘蛋白多肽变体在天然存在的粘蛋白序列(野生型)中具有一种突变，导致碳水化合物含量的增加(相对于未突变的序列)。例如，与野生型粘蛋白相比，所述粘蛋白多肽变体包括另外的O-连接的糖基化作用位点。做为选择，粘蛋白多肽变体与野生型粘蛋白多肽相比，包括能够导致丝氨酸、苏氨酸或者脯氨酸残基数量增加的氨基酸顺序突变。这些增加的碳水化合物含量可以使用本领域普通技术人员已知的方法通过测定蛋白质比粘蛋白的碳水化合物比率来估价。
在一些实施方案中，粘蛋白多肽基团作为一种粘蛋白多肽变体被提供，所述粘蛋白多肽变体在天然存在的粘蛋白序列(野生型)中具有一种突变，这种突变会使粘蛋白序列对蛋白水解作用具有更强的抵抗力(相对于未突变序列)。
在一些实施方案中，第一多肽包括全长的PSGL-I。做为选择，第一多肽包括小于全长的PSGL-I多肽，例如PSGL-I的细胞外部分。例如第一多肽的长度小于400个氨基酸，例如，长度小于或等于300个氨基酸、250个氨基酸、150个氨基酸、100个氨基酸、50个氨基酸或者25个氨基酸。示范性的PSGL-I多肽和核酸序列包括基因银行登记号：XP006867；XM006867；XP140694和XM140694的序列。
第二多肽优选是可溶的。在一些实施方案中，第二多肽包括能够促进ABO血型融合多肽与第二粘蛋白多肽结合的序列。在优选的实施方案中，第二多肽包括至少一种免疫球蛋白多肽区域。″至少一种区域″是指包括免疫球蛋白分子的任何部分，例如轻链区域、重链区域、FC区域、Fab区域、Fv区域或者其任一片段。免疫球蛋白融合多肽在本领域内是已知的，在例如美国专利第5,516,964号；第5,225,538号；第5,428,130号；第5,514,582号和第5,455,165号中有所描述。
在一些实施方案中，第二多肽包括全长免疫球蛋白多肽。做为选择，第二多肽包括小于全长的免疫球蛋白多肽，例如重链、轻链、Fab、Fab2、Fv、或者Fc区域。优选的，第二多肽包括一种免疫球蛋白多肽的重链。更优选的第二多肽包括一种免疫球蛋白多肽的Fc区域。
在本发明的另一个方面，第二多肽与野生型免疫球蛋白重链Fc区域的效应子作用相比具有较少的效应子作用。Fc效应子作用包括例如，Fc受体结合作用、补体固定作用和T细胞消耗活性，(参见美国专利第6,136,310号的实施例)。测定T细胞消耗活性、Fc效应子作用、和抗体稳定性的方法在本领域内是已知的。在一个实施方案中，第二多肽对Fc受体具有较低的亲合力或完全没有亲合力。在一种选择性的实施方案中，第二多肽对互补蛋白质CIq具有较低的亲合力或完全没有亲合力。
本发明的另一个方面与载体有关，优选的与表达载体有关，所述载体包含核酸编码的粘蛋白多肽、或者其衍生物、片段、类似物或者同源物质。在许多方面，所述载体包含核酸编码的粘蛋白多肽，该粘蛋白多肽可操作的与一种核酸编码的免疫球蛋白多肽或者其衍生物、片段类似物或者同源物质连接。另外，该载体包括一种核酸编码的血型转移酶，例如α1，2海藻糖基转移酶、α1，3N-乙酰半乳糖氨基转移酶、α1，3半乳糖基转移酶或者其任意结合。所述血型转移酶能够促进血型决定簇在ABO血型融合蛋白质粘蛋白部分肽骨架上的加入。如这里使用的术语″载体″是指能够运输它所连接的其他核酸的核酸分子。载体的一个类型是″质粒″，质粒是指一种环状双链脱氧核糖核酸环，其中可以捆绑另外的DNA片段。载体的另一种类型是病毒载体，其中，额外的DNA部分可以被捆绑进入病毒基因组中。载体能够在他们被引入的寄主细胞中自动复制(例如，来源于细菌的细菌载体的复制和附加型哺乳动物载体)。其他的载体(例如，非附加型哺乳动物载体)通过引入寄主细胞被整合入宿主细胞基因组中，并因此随着宿主基因组的复制而复制。此外，某些载体能够指导与他们可操作的连接着的基因表达。这种载体在这里被称为″表达载体″。通常，在重组DNA技术中使用的表达载体经常以质粒形式存在。在本说明书中，″质粒″和″载体″能可交换地被使用，因为质粒通常以载体的形式被使用。然而，也可用来包括其他形式的表达载体，例如起到相同作用的病毒载体(例如，有复制缺陷的反向病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒)。
本发明的重组细胞表达载体包括本发明的核酸，本发明的核酸以一种适合于核酸在宿主细胞中表达的形式存在，这意味着所述重组细胞表达载体包括一个或一个以上调节序列，这些调节序列根据用来表达的宿主细胞选择，可操作的与被表达的核酸序列连接。在重组细胞表达载体内部，″可操作的连接″是指所关心的核苷酸序列与所述调节序列以允许核苷酸序列表达的方式连接(例如，当载体被引入所述宿主细胞时，在一种体外转录/翻译系统中或在宿主细胞中)。
术语″调节序列″是指包括促进剂、增强剂及其他表达控制元素(例如，聚腺甘酸化信号)。这种调节序列被描述在例如Goeddel等人的文献GENE EXPRESSION TECHNOLOGY：METHODS INENZYMOLOGY(基因表达技术：酶学方法)185，Academic Press(学术出版社)，San Diego(圣地亚哥)，Calif.(加利福尼亚)(1990)中。调节序列包括能够指导核苷酸序列在许多类型的寄主细胞中表达的序列和能够指导核苷酸序列只在确定的宿主细胞中表达的序列(例如，组织-特异性调节序列)。本领域技术人员可以理解表达载体的设计可以依赖与一些因素，例如被转化的寄主细胞的选择，期望的蛋白质的表达水平，等等。本发明的表达载体被引入宿主细胞从而生产蛋白质或者肽，所述蛋白质或者肽包括这里所述的通过核酸编码的融合蛋白质或者肽(例如，ABO血型融合多肽、由ABO血型融合多肽形成的突变体，等等)。
本发明的重组细胞表达载体可以被设计用于ABO血型融合多肽在原核生物细胞或者真核生物细胞中表达。例如，ABO血型融合多肽可以在细菌细胞，例如大肠杆菌中表达，可以在昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)酵母细胞或者哺乳动物细胞中表达。适当的宿主细胞进一步的描述在Goeddel等人的文献GENEEXPRESSION TECHNOLOGY：METHODS IN ENZYMOLOGY(基因表达技术：酶学方法)185，Academic Press(学术出版社)，San Diego(圣地亚哥)，Calif.(加利福尼亚)(1990)中。做为选择，重组细胞表达载体可以被体外转录和翻译，例如使用T7促进剂调节序列和T7聚合酶进行体外转录和翻译。
蛋白质在原核细胞中的表达经常在带有载体的大肠杆菌中进行，所述载体包含固有促进剂或诱导促进剂，指导融合蛋白质或非融合蛋白质的表达。融合载体向其编码的蛋白质中，通常向重组细胞蛋白质的氨基末端加入很多氨基酸。这种融合载体一般起到三个目的：(i)增加重组蛋白质的表达；(ii)增加重组蛋白质的溶解度；和(iii)通过在亲合纯化中起到配位体的作用帮助重组蛋白质纯化。通常在融合表达载体中，在融合基团和重组蛋白质接合点引入一种蛋白水解分裂位点，从而使重组蛋白质在融合蛋白质纯化之后从融合基团上分裂。这种酶和他们的同源的识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia生物技术公司；Smith和Johnson，1988.基因67：31-40)、pMAL(新英格兰生物实验室，Beverly，Mass)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)这些载体分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、或者蛋白质A融合到靶向重组蛋白质中。
适当的诱导的未融合大肠杆菌表达载体的实施例包括pTrc(Amrann等人，(1988)基因69：301-315)和pET Hd(Studier等人，GENE EXPRESSION TECHNOLOGY：METHODS INENZYMOLOGY(基因表达技术：酶学方法)185，Academic Press(学术出版社)，San Diego(圣地亚哥)，Calif.(加利福尼亚)(1990)60-89)。
在大肠杆菌中最大化重组蛋白质表达的一个策略是将蛋白质在具有减少容量的细菌宿主中表达，从而蛋白水解所述重组蛋白质。参见，例如Gottesman等人的文献GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY：METHODS IN ENZYMOLOGY(基因表达技术：酶学方法)185，Academic Press(学术出版社)，San Diego(圣地亚哥)，Calif.(加利福尼亚)(1990)119-128。另一个策略是改变被插入表达载体中的核酸序列以至于不同氨基酸各自的密码子分别优选的在大肠杆菌中被使用(参见，例如，Wada，et al.，1992.Nucl.Acids Res.20：2111-2118)。可以通过标准DNA合成技术进行本发明核酸序列的改变。
在另一个实施方案中，ABO血型融合多肽表达载体是一种酵母表达载体。用于在酿酒酵母中表达的载体的实施例包括pYepSecl(Baldari，et al.，1987.EMBO J.6：229-234)、pMFa(Kurjan and Herskowitz，1982.Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz et al.，1987.Gene 54：113-123)、pYES2(Invitrogen公司，圣地亚哥，加利福尼亚)和picZ(InVitrogen公司，圣地亚哥，加利福尼亚)。
做为选择，ABO血型融合多肽可以使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达。能够在培养的昆虫细胞(例如，SF9细胞)中有效的表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith，et al.，1983.MoI.Cell.Biol 3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers，1989.Virology 170：31-39)。
在依旧另一个实施方案中，本发明的核酸使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实施例包括pCDM8(参见，1987.Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman，et al，1987.EMBO J.6：187-195)。当被用于哺乳动物细胞时，经常通过病毒调节因素提供表达载体的控制功能。例如，通常使用的促进剂衍生自多形瘤、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。其他对于原核细胞和真核细胞都适用的适当的表达系统参见参见，例如，Sambrook等人编辑的《分子克隆：一种实验手册》第二版的第16、17章，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Laboratory出版社出版，Cold Spring Harbor，N.Y.，19。
本发明的另一个方面与宿主细胞有关，在此宿主细胞中已经引入本发明的一种重组表达载体。术语″宿主细胞″和″重组宿主细胞″在这里是可交换使用的。应当理解，这种术语不只涉及特定的主体细胞而且涉及这种细胞的后代或者潜在的后代。由于突变作用或环境影响，在随后的繁殖过程中可能发生某些修饰，因此，事实上，这些后代可能与母代细胞不相同，但是尽管如此，这些后代也被包括在这里所使用的术语所包括的范围内。
宿主细胞可以是任何一种原核细胞或者真核细胞。例如糖蛋白Ibα融合多肽可以在例如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞或者哺乳动物细胞(例如人、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或者COS细胞)中表达。其他适当的宿主细胞是本领域内已知的。
载体DNA可以通过常规转化或者转染技术被引入原核细胞或真核细胞中。如这里使用的，术语″转化″和″转染″是指用于将外源核酸(例如，DNA)引入宿主细胞的各种本领域已知的技术，包括磷酸钙或者氯化钙共同沉淀、二乙基氨基乙醇-右旋糖酐-调节的转染、脂质转染法、或者电穿孔。用于转化或者转染宿主细胞的适当的方法可以发现在Sambrook等人的文献(MOLECULAR CLONING(分子克隆)：ALABORATORYMANUAL.(实验手册)第二版，Cold Spring Cold Spring Harbor实验室Cold Spring Harbor实验室出版社，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)及其他实验手册中。
众所周知，为了稳定的转染哺乳动物细胞，根据使用的不同的表达载体和转染技术，只有一小部分的细胞可以整合外源DNA进入他们的基因组。为了识别和选择这些成分，通常在引入所关心的基因的同时，向宿主细胞中引入一种能够编辑可选择的标记物(例如，对抗生素的抵抗性)的基因。各种可选择的标记物包括能够赋予药物抗药性的标记物，例如G418、匀潮霉素和氨甲蝶呤。编码可选择的标记物的核酸可以被引入宿主细胞，在此过程中使用的载体可以与编码糖蛋白Ibα融合多肽的核酸时使用的载体是相同的载体，或者可以被引入单独的载体中。通过药物筛选可以识别出能够稳定的转染带有引入核酸的细胞(例如，已经整合入可选择的标志基因的细胞将会继续存在，而其他的细胞会死亡)。
一种本发明的宿主细胞，例如在培养基中的原核宿主细胞或者真核宿主细胞可以被用于产生(即，表达表达)ABO血型融合多肽。因此，本发明进一步提供了使用本发明宿主细胞生产ABO血型融合多肽的方法。在一个实施方案中，该方法包括在适当的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中已经引入能够编码ABO血型融合多肽的重组表达载体)，从而生产ABO血型融合多肽。在另一个实施方案中，该方法进一步包括从所述培养基或者宿主细胞中分离ABO血型多肽。
所述ABO血型融合多肽可以根据常规技术进行分离和纯化，例如，提取、沉淀、色谱法、亲和色谱法、电泳等等。例如，通过将溶液穿过包含固定化蛋白质A或者蛋白质G的色谱柱，固定化蛋白质A或者蛋白质G有选择地结合融合蛋白质的Fc部分，从而将所述免疫球蛋白融合蛋白质纯化。参见，例如Reis，K.J.etal.，J.Immunol.132：3098-3102(1984)；PCT申请，公开号WO87/00329。通过用带有离液序列高的盐处理洗提融合多肽或者通过含水乙酸(1M)洗提所述融合多肽。
做为选择，本发明的ABO血型融合多肽可以通过本领域已知的方法化学合成。例如，多肽的化学合成已经被描述，例如，各种蛋白质合成方法是本领域常用的方法，包括使用肽合成器进行合成。参见，例如，肽化学作用，一种实用教科书，Bodasnsky版本，Springer-Verlag，1988；Merrifield，Science 232：241-247(1986)；Barany，et al，Intl.J.Peptide Protein Res.30：705-739(1987)；Kent，Ann.Rev.Biochem.57：957-989(1988)，和Kaiser，et al，Science 243：187-198(1989)。使用标准肽纯化技术将所述多肽进行纯化使他们基本上不含有化学前体或者其他的化学试剂。术语″基本上不含化学前体或者其他的化学试剂″包括肽的制备，其中肽从其合成过程使用的到的化学前体或者其他的化学试剂中分离。在一个实施方案中，术语″基本上不含有化学前体或者其他的化学试剂″包括制备具有小于大约30％(干重)的化学前体或者非肽化学试剂的肽，更优选的制备具有小于大约20％化学前体或者非肽化学试剂的肽，更优选制备具有小于大约10％化学前体或者非肽化学试剂的肽，和制备具有最优选小于大约5％化学前体或者非肽化学试剂的肽。
多肽的化学合成促进修饰或者非自然氨基酸的整合，所述修饰的或非自然氨基酸包括D-氨基酸及其他小有机分子。用相应的D-氨基酸同种型置换一种或一种以上肽中的L-氨基酸，这种置换可以被用来增加肽对酶催化水解的抵抗力，且可以用于增加生物学活性肽一个或一个以上性质，即，受体结合、官能效力或者作用持续时间。参见，例如，Doherty，et al，1993.J.Med.Chem.36：2585-2594；Kirby，et al，1993.J.Med.Chem.36：3802-3808；Morita，et al，1994.FEBS Lett.353：84-88；Wang，et al，1993.Int.J.Pept.Protein Res.42：392-399；Fauchere and Thiunieau，1992.Adv.Drug Res.23：127-159。
向一种肽序列中引入共价交联键可以从构象上和地形上束缚多肽骨架。这一方法可以被用来发展带有增加的效力、增加的选择性和稳定性的融合多肽的肽类似物。由于环状肽的构象熵比它直线型对应物的构象熵要低，因此使用一种特定构象可能使环状类似物的熵比非环形类似物的熵下降的程度小，从而得到用于更好结合的自由能。往往通过在肽N-和C-末端之间形成一种酰胺键、在侧链和N-或者C-末端(例如，在pH值为8.5时带有K3Fe(CN)O)(Samson et al.，Endocrinology，137：5182-5185(1996))之间形成一种酰胺键、或者在两个氨基酸侧链之间形成一种酰胺键来完成大环化作用。参见，例如，DeGrado，Adv ProteinChem，39：51-124(1988)。同时，将二硫键引入线性序列来减少他们的灵活性。参见，例如，Rose，et al.，Adv Protein Chem，37：1-109(1985)；Mosberg et al，Biochem Biophys Res Commun，106：505-512(1982)。此外，带有青霉胺(Pen，3-巯基-(D)缬氨酸)的半胱氨酸剩余物的取代已经被用于增加某些鸦片样物质-受体相互作用的选择性。Lipkowski和Carr的《肽：合成、结构和应用》，Gutte版本，学术出版社出版，第287-320(1995)。
组合物和试剂盒
本发明还包括一种组合物，这种组合物包含至少两种血型抗原(例如，ABO血型低聚糖)，且其中每种血型抗原在不同的核心糖化物链类型上表达。所述血型抗原是一种A型抗原、一种B型抗原或者一种H型抗原。所述核心糖化物链类型可以是1型、2型、3型或者4型。所述组合物包含2、3、4、5、6、7、8或更多不同的血型抗原。
示范性的血型抗原包括上面所描述的。
任选的，ABO血型低聚糖或者ABO血型融合蛋白质与一种固体支持物相连。所述连接键是共价的。做为选择，所述连接键是非共价的。
所述固体支持物可以是，例如，磁珠、树脂、薄膜或者平圆形物、或者任何一种适合于本发明方法的固体支持物材料。优选的，该固体支持物是磁珠，例如，微磁珠。所述磁珠的尺寸不重要。通常，所述磁珠的直径至少为1到50微米，颗粒大小为1到10微米是优选的。最优选的所述磁珠具有大约4-10微米的直径。例如，具有2，3，4，5，10，15，20，25，30，40或50微米的直径。
所述磁珠可以由金属化合物、硅、橡胶、聚合材料或者涂有金属金属化合物的硅、橡胶或者聚合物核。
所述固体支持物可以传送官能团，例如羟基基团、羧基基团醛基团或者氨基基团。所述支持物可以带有正电荷、带有负电荷或者是疏水性的。本发明使用的功能化的被涂布的支持物可以通过支持物的修饰作用来制备。例如用带有一个或者更多这种官能团的聚合物处理未涂布的支持物，例如聚氨基甲酸酯和聚二醇一起提供羟基或者通过纤维素衍生物提供羟基，丙烯酸或者甲基丙烯酸的聚合物或者共聚物能够提供羧基，或者氨烷基化的聚合物能够提供氨基基团。美国专利第4,654,267号描述了许多表面涂层的引入。
优选的每种不同的ABO血型低聚糖或者ABO血型融合蛋白质位于不同子类型的微磁珠上。子类型是指每种微磁珠是有显著区别的，例如，具有不同的大小或者具有可区别的标记。不同大小的微磁珠或者带有例如荧光团标记的微磁珠使这些不同的磁珠能够被识别和/或分离，例如通过流式细胞计进行识别和/或分离。
本发明进一步提供了一种试剂盒，使用本发明所述的方法，该试剂盒用于从样品中分离或鉴定血液基团反应性抗体。所述试剂盒包含许多各种子类型的微磁珠，每种子类型都涂布有不同的ABO血型低聚糖或者ABO血型融合蛋白质。任选的，所述试剂盒至少包含一种打开的带有标记的配位体，所述配位体能够特异性的结合抗血型抗原抗体。例如，所述配位体是一种抗体或其片段，例如，Fab、Fab-和F(ab-)2片段。″特异性结合″或者″与...发生免疫反应″是指所述抗体与一个或一个以上期望抗原的抗原决定簇反应，且不与其他多肽反应(即，结合)或者与其他的多肽以很低的亲合力(Kd＞10～6)结合。
所述抗体是单价抗体。
所述标记物可以是任何一种用于促进靶分子识别和/或定量的物质。标记物既可以被直接观察或测量，又可以被间接地观察或测量。标记物包括但不仅限于，可以使用放射计数装置测量的放射性同位素；颜料、染料或者其他可以视觉观察到或用分光光度计测定的生色团；可以通过自旋标记物分析器测定的自旋标记物；和荧光基团，其中适当的分子加合物的激发作用能够产生输出信号，且可以通过被染料吸收的灯的激发作用显象，或者可以使用例如标准荧光测定计或成像系统测定。所述标记物可以是一种发光物质，例如，是磷光体或荧光团；一种生物发光物质；一种化学发光物质，其中，通过信号化合物的化学修饰产生输出信号；一种包含金属的物质；或者一种酶，其中，这里存在一种酶依赖型的第二代信号，例如从无色的底物中形成的带有颜色的产品。所述标记物还可以采取化学试剂或生化试剂的形式，或者是一种惰性颗粒，包括但不仅限于胶体金、微球体、量子点、或无机晶体，所述无机晶体例如纳米晶体或磷光体(参见，例如，Beverloo，et ah，Anal.Biochem.203，326-34(1992))。术语″标记物″还可以被称作″标记″或可以有选择地结合标记分子的半抗原，从而随后加入的标记分子可以被用于产生可检测信号。举例来说，一方面可以使用生物素、亚氨生物素或脱硫生物素作为标记，随后使用一种抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素与辣根过氧化酶(HRP)的结合物与标记相连，随后，使用一种显色底物(例如，四甲基对二氨基联苯)或一种荧光底物来检测辣根过氧化酶(HRP)的存在，其中，荧光底物例如Amplex红或Amplex金黄(Molecular Probes公司)。相似地，所述标记可以是一种半抗原或抗原(例如，异羟洋地黄毒苷配基)，且一种酶催化的、荧光的或放射性标记的抗体可用于与标记物结合。许多标记物对本领域普通技术人员是已知的，这些标记物包括，但不仅限于，颗粒、荧光染料、半抗原、酶及其产色底物、荧光底物和化学发光底物，其他的标记物描述在Richard P.Haugland编辑的《荧光探针的分子探针手册和化学试剂研究》第6版(1996)中，和随后的分别在1999年十一月和2001年五月出版CD版的第7和第8版本，其内容和其他的出版物通过引证在此全部并入本文。
荧光团可以是任何一种能够在280纳米之上显示出最大吸收的化学基团，且当共价附着于标记试剂上时，能够保持其光谱性质。荧光团包括，但不仅限于一种嵌二萘(包括美国专利第5,132,432号公开的任何一种相应的衍生化合物)、一种蒽、一种萘、一种吖啶、1-2-二苯乙烯、吲哚或者苯并吲哚、恶唑或者苯并恶唑、噻唑或者苯并噻唑、4-氨基-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑(NBD)、一种花青素甙(包括美国系列号09/968,401和09/969,853所公开的任何一种相应化合物)、一种羰花青(包括美国系列号09/557,275；09/969,853和09/968,401；美国专利第4,981,977号；第5,268,486号；第5,569,587号；第5,569,766号；第5,486,616号；第5,627,027号；第5,808,044号；第5,877,310号；第6,002,003号；第6,004,536号；第6,008,373号；第6,043,025号；第6,127,134号；第6,130,094号；第6,133,445号；和公开号WO 02/26891、WO 97/40104、WO 99/51702、WO 01/21624；EP 1 065 250 A1中所描述的任何一种相应化合物)、一种carboslyryl、一种卟啉、一种邻羟基苯甲酸盐、一种氨基苯甲酸盐、一种甘菊环烃、一种二萘嵌苯、一种吡啶、一种喹啉、一种硼化聚氮杂吲丹烯(包括美国专利第4,774,339号；第5,187,288号；第5,248,782号；第5,274,113号；和第5,433,896号中公开的任何一种相应化合物)、一种夹氧杂蒽(包括在美国专利第6,162,931号；第6,130,101号；第6,229,055号；第6,339,392号；第5,451,343号和美国系列号09/922,333中公开的任何一种相应化合物)、一种噁嗪(包括在美国专利第4,714,763号中公开的任何一种相应化合物)或者一种苯并恶嗪、一种卡巴嗪包括在美国专利第4,810,636号中公开的任何一种相应化合物)、一种次联苯甲酮、一种香豆素(包括在美国专利第5,696,157号；第5,459,276号；第5,501,980号和第5,830,912号中公开的相应化合物)、一种苯并呋喃包括在美国专利第4,603,209号和第4,849,362号中公开的相应化合物)和苯并次联苯甲酮(包括在美国专利第4,812,409号中公开的任何一种相应化合物)及其衍生物。如这里使用的，噁嗪包括9-羟基-3-异吩恶唑酮(包括在专利5,242,805号中公开的任何相应化合物)、氨基嗪酮、二氨基嗪及其与苯有关的取代的类似物。
任选的，所述试剂盒包含阳性参照或阴性参照或者两种都包括、用于使用该试剂盒的说明书(例如，书面记载的、磁带录制的、VCR形式、CD-ROM形式等等)、样品收集途径。样品收集途径对本领域技术人员来将是已知的。例如，样品收集途径是一种CPT真空采样管。
所述试剂被包装在单独的容器中，例如，ABO血型低聚糖或者ABO血型融合蛋白质(或者与固体基质结合或者分别与用于将他们结合在基质上的试剂包装在一起)、一种对照试剂(阳性和/或阴性的对照试剂)、和/或一种标记的配位体。
治疗或预防抗体调节的移植排异的方法
治疗或者预防抗体调节的移植排异(AMR)，例如，器官移植的方法同样包括在本发明的范围内。这种移植包括但不仅限于肾移植、肝移植、皮肤移植、胰腺移植、角膜移植或者心脏移植。抗体调节的移植排异AMR包括受赠者产生的任何一种抗体调节的移植排斥。所述方法包括将来自主体的生物样品与本发明的ABO血型低聚糖或者ABO血型融合肽相接触。所述生物样品是，例如血液，即，全血或者血浆。该样品已知包括一种抗体，或者怀疑包括一种抗体，例如，一种抗血型抗体。在某些方面，所述生物样品在与ABO血型低聚糖或者ABO血型融合多肽接触之前从主体体内取出。在允许ABO血型低聚糖或者ABO血型融合肽-抗血型抗体复合物形成的条件下将ABO血型低聚糖或者ABO血型融合肽与生物样品相接触。如果存在的话，所述ABO血型低聚糖或者ABO血型融合肽-复合物从生物样品中分离出来，从而除去抗血型抗体并将生物样品重新融入主体体内。
抗体调节的移植排异(AMR)还可以通过向主体给药本发明的ABO血型融合多肽进行治疗或预防。
所述主体可以是例如，任何一种哺乳动物，例如，人、灵长类动物、老鼠、鼠、狗、猫、母牛、马、猪。所述治疗在患者接受ABO血型不相容的移植之前给药。做为选择，述治疗在患者接受ABO血型不相容的移植之后给药。
将所述生物样品和ABO血型低聚糖或者ABO血型融合蛋白质通过本领域内已知的方法相接触。例如，血浆除去法或者体外免疫吸收法。
基本上，任何一种病因上与抗体调节的反应有关的病症都可以被预防或者治疗。器官移植的存活率大于未通过本发明方法治疗的器官移植的存活率时，抗体调节的移植排异(AMR)被有效的治疗或预防了。移植的存活率是指移植被受赠者排斥之前的时间。例如，当移植存活至少1星期、2星期、4星期或者8星期之后进行抗体调节的移植排异(AMR)的治疗或者预防。优选的，移植存活时间为3个月、6个月、13个月。更优选的，移植存活2年、3年、5年或更多年。
从样品中除去抗血型抗体的方法
本发明还包括从样品中除去或者减少抗血型抗体的方法。所述样品是一种生物液体，例如，血液或者血浆。样品是一种生物组织，例如心脏组织、肝组织、皮肤、或者肾组织。本方法包括将样品与本发明的ABO血型低聚糖或者ABO血型融合肽相接触。在允许ABO血型低聚糖或者ABO血型融合肽-抗血型抗体复合物形成的条件下将ABO血型低聚糖或者ABO血型融合肽与生物样品相接触。所述ABO血型融合肽抗体复合物如果存在的话，则从生物样品中分离，从而除去或者减少抗血型抗体。
本方法可以有效地用于生产万能供血者血浆。
血型鉴定方法
本发明还包括主体血型测定的方法。通过将取自主体的样品，例如，血浆或者全血与不同子类型的微磁珠相接触。每种子类型包含不同的血型抗原。所述血型抗原在不同的核心糖化物链类型上表达。所述微磁珠和样品相互接触，例如，一起培养足够长的时间，从而允许存在于样品中的抗血型抗体结合，例如，形成一种血型抗原抗体复合物，从而将血型抗原捆绑在微磁珠上。
在复合物形成之后，任选地将样品洗涤一次或一次以上从而除去非结合的血浆成分。做为选择，非结合的血浆成分通过进行分离步骤从微磁珠上除去，在分离步骤中，微磁珠从样品中除去。使用本领域普通技术人员已知的方法进行分离，所属本领域普通技术人员已知的方法例如，离心作用。所述微磁珠进一步地与一种标记试剂相接触，该标记试剂能够特异性结合与微磁珠相连的抗血型抗体。任选地将微磁珠洗涤一次或一次以上从而除去非结合的标记试剂。随后通过测定标记试剂确定样品中是否存在抗血型抗体。使用本领域普通技术人员已知的方法进行检测，例如，通过流式细胞计或者luminex液态芯片方法。
本发明还提供了用于检测样品中多倍抗血型抗体的方法。多倍抗血型抗体不只意味着对每种血型(即，ABH)具有特异性的抗体，还指对不同的低聚糖核心链型的血型抗原具有特异性的抗体。通过将生物样品与额外的检测试剂相接触来识别不同的靶分子，随后使用如上所述的方法，将生物样品与额外的标记试剂相接触，所述额外的标记试剂对额外的检测试剂具有特异性。例如，用不同的血型抗原制备微磁珠的子集，例如，使用具有不同核心低聚糖链类型的血型抗原。然后将所述微磁珠子集加入到包含控制比例的生物样品中。
在作为替换的方法中，用不同的标记物，例如具有不同发射光谱的荧光团制备标记试剂子集，例如，一种发出绿色光谱，另一种发出红色光谱。然后将所述标记试剂子集加入到包含控制比例的检测试剂-靶分子复合物的生物样品中，例如，每份靶分子结合抗体中包括两份一种标记试剂(例如，发出绿色光谱的)和一份另一种标记试剂(例如，发出红色光谱的)。这样，所述免疫标记的复合物可以用于检测靶分子。如果向样品中加入另一种免疫标记的复合物，则原始靶分子与随后检测出的靶分子是不同的。
任选的，在样品中检测出2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多种血型抗原。
所述样品包括任何一种能够包含血型抗原的材料。一般地，所述样品是全血、血清或者血浆。
本发明方法在现有血型测定技术的基础上提供了一种重要的优点。具体而言，该方法允许血型抗原子类型的检测。此外，本方法允许样品中不同的血型抗原子类型的检测。
所述检测试剂是一种化合物，该化合物能够特异性的结合与微磁珠相连的血型抗体。根据希望的靶分子选择所述检测试剂。该检测试剂是，例如，一种多肽，例如一种靶向特异性抗体或者其片段。如这里使用的，术语″抗体″是指免疫球蛋白分子和具有免疫活性部分的免疫球蛋白(Ig)分子，那就是说，包含抗原结合部位的分子，所述抗原结合部位特异性的结合抗原(与抗原发生免疫反应)。这种抗体包括多克隆的、单克隆的、嵌合的、单链、Fab、Fab′和F(ab′)2片段，和一种Fab表达文库。″特异性结合″或者″与。。。发生免疫反应″是指抗体与一个或一个以上期望抗原的抗原决定簇发生反应而且不与其他多肽发生反应(即，结合)或者与其他的多肽以低得多的亲合力(Kd＞10-6结合。
单克隆抗体在实现本发明所述方法过程中是有优势的。通常，单克隆抗体比多克隆抗体更敏感的且更具有特异性，多克隆抗体依赖于产生所述抗体的动物的寿命，与此不同，单克隆抗体的供应是不确定的。然而，当必须使用具有多倍同种型的抗体时，多克隆抗体是有效的，最常见的单克隆抗体是IgG亚类。
如这里使用的，术语″免疫结合″和″免疫结合性质″是指免疫球蛋白分子和与此免疫球蛋白具有特异性的抗原之间存在的非共价相互作用类型。免疫结合相互作用的强度或者亲合力可以用相互作用术语“电离常数(Kd)”表示，其中较小的电离常数(Kd)代表较大的亲合力。使用本领域内已知的方法确定所选择多肽的免疫结合性质。一种方法需要测量抗原结合簇/抗原复合物形成和分解的速率，其中所述速率取决于复合物成分的浓度，相互作用的亲合力和几何参数同样影响形成和分离速率。因此，″连接速率常数″(Kon)和″解离速率常数″(KOff)可以通过计算浓度和结合以及分离的实际速率计算确定。(参见1993年发表在Nature(《自然》)上361：186-87页的文献)。Koff/Kon的比率能够消除所有与亲合力无关的参数，因此等于电离常数IQ(通常参见Davies等人1990年发表在Annual Rev Biochem 59：439-473页的文献)。
通过下面非限制性的实施例对本发明进行进一步说明
实施例1.表达载体的构建
修饰传送P-选凝素糖蛋白配位体-1/老鼠IgG2b(PSGL-1/mIgG2b)互补DNA的表达载体使之包含一种肠激酶(EK)分裂位点。该位点在下游分离老鼠IgG2b部分时会使用到。所述人血型A基因用聚合酶连锁反应(PCR)扩增，以总RNA中制得的互补DNA为基础，所述总RNA从MKN-45细胞株中分离出来，且血型B基因进行聚合酶连锁反应(PCR)扩增，以总RNA中制得的互补DNA为基础，所述总RNA从HuTu80细胞株中分离出来。用于产生稳定转染子的表达载体是双向作用的，参见示意图。所述PSGL-1/mIgG2b表达载体具有聚合物连接剂的EF1α促进剂上游、一种拼接捐献位点和受体位点、和SV40的双向作用聚(A)附加信号。相反，在转录方向，使用相反方向的聚(A)信号，该第二转录单元由HSV TK促进剂组成，随后是编码嘌呤霉素转乙酰酶(PAC)的序列。相似地，所述β1，6GIcNAcT(核心2酶)表达载体包含EF1α促进剂和编码新链丝菌素抗性基因(Neo)的序列。所述FUT2(Se-基因)表达载体包含相同载体骨架，但是具有CMV促进剂和新链丝菌素抗性基因。GaINAcT(A-基因)和GaIT(B-基因)表达载体包含CMV促进剂和blasictidin抗性基因(Bsd)，FUT1(H-基因)和β1，3GlcNAcT6(核心3酶)包含CMV促进剂和zeocin抗性基因，GaITS表达载体包含CMV促进剂和鸟嘌呤核苷转磷酸核糖基酶基因(GPT)。
通过自动测序方法测定表达载体的DNA序列。
实施例2.使用蛋白印迹和间接免疫荧光法测定PSGL-1/ MIGG2B的表达
使用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹方法测定PSGL-1/mIgG2b在细胞培养上清液中的表达。所述样品在MES缓冲液(购于Invitrogen公司)中穿过4-12％浓度梯度的凝胶柱(购于Invitrogen公司)，且将分离的蛋白质电泳渗透在硝化纤维薄膜(购于Invitrogen公司)上。在含有3％牛血清白蛋白(BSA)、0.2％吐温20的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中结合1小时，随后，该薄膜在室温下用在封闭缓冲液按1∶4.000的比例稀释后的过氧化物酶-结合的山羊抗老鼠IgG Fc抗体(购于Sigma公司)进行探针试验。之后用包含0.2％吐温20的磷酸缓冲液洗涤薄膜三次，按照厂家的说明书，通过使用ECL试剂盒(购于Amerham生物科学公司)进行化学发光对结合的抗体显象。
通过间接免疫荧光确定PSGL-1/mIgG2b的细胞定位。按照厂家说明书用PSGL-1/mlgGib表达载体脂质体Lipofectamine2000(购于Invitrogen公司)瞬时转染接种在六孔板盖玻片上的CHO-K1细胞。转染四十八小时工作的后，用磷酸缓冲液洗涤细胞并固定在30％丙酮/甲醇中。在含有1％BSA的磷酸缓冲液中封闭30分钟之后，使用在封闭缓冲液中按1∶200的比例稀释的FITC-结合的山羊抗老鼠IgG Fc抗体(购自Sigma公司)测定PSGL-1/mIgG2b蛋白质。用4，6-二脒基2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核进行染色。用Vectashield固定介质(载体实验室)将盖玻片固定在滑片上。用DMRXA显微镜(Leica公司)检验该滑片，并用Hamamatsu C4880-40CCD摄像机(Hamamatsu Photonics NordenAB)Openlab程序包(Improvision)和Adobe Photoshop软件(参见附图)进行数字成像。
实施例3：CHO-细胞对不含血清的培养基的适应性
根据厂家说明书CHO-K1细胞株(ATCC CCL-61)适合于不含血清的培养基，Ex-细胞302(购自JHR生物科学公司)。
实施例4：DNA转染和克隆筛选
适合于不含血清的培养基的CHO-K1细胞接种到75平方厘米的烧瓶中并用脂质体Lipofectamine 200CD(购自Invitrogen公司)和一种不含有动物源物质的制剂，按照厂家的说明书使用PSGL-1/mIgG2b表达载体转染。转染之后四十八小时，细胞被培养在包含嘌呤霉素的选择培养基中(6微克/毫升)。选择的培养基每三天改变一次。大约2星期之后，按照厂家说明书，使用死亡细胞除去微磁珠(Miltenyi生物技术)除去死亡细胞。在96孔板中对活细胞进行单细胞克隆，并延伸进选择培养基中大约2周。收集细胞培养上清液，使用一种山羊抗老鼠IgG Fc抗体(Sigma公司)通过酶联免疫吸附测定(ELISA)估价hPSGL-1/mlgG2b的浓度，方案如下所示。选择具有最高hPSGL-1/mIgG2b表达的细胞克隆体进行进一步扩展。
实施例5：使用酶联免疫吸附试验(ELISA)定量评价PSGL- 1/MIGG2B在上清液中的浓度
将细胞接种到25平方厘米的烧瓶中(11x106细胞/毫升)。4天后收集细胞培养上清液。用酶联免疫吸附试验(ELISA)评定通过细胞克隆生产的PSGL-1/mIgG2b浓度。用浓度为10微克/毫升的亲合-净化的山羊抗mlgG Fc抗体(Sigma公司)涂布九十六孔酶联免疫吸附试验(ELISA)平板(Costar 3590，Corning公司)2小时。用含有1％BSA的磷酸缓冲液封闭该平板2小时。在封闭液中，包含PSGL-1/mIgG2b的上清液被逐次稀释并被培养2小时。随后洗涤，将该平板与在封闭缓冲液中按1∶4.000的比例稀释后的过氧化物酶-结合的山羊抗老鼠IgG Fc抗体(Sigma)一起培养2小时。用3，3′，5，5′-四甲基对二氨基联苯二氢氯化物(Sigma公司)对连接上的过氧化物酶-结合的抗体显象。用2M的硫酸终止反应，在自动微板阅读器(Bio-Tek仪器)中在450纳米下阅读该平板。使用经过标准稀释系列的纯净的mlgG Fc片段(Sigma公司)计算PSGL-1/mIgG2b浓度。选择具有最高产量的细胞克隆株(大约25微克/毫升)进行进一步转染，如下所述。
实施例6：用血型A/B型3型抗原取代的PSGL-1/MIGG 2B 的产生
使用FUT2(Se-基因)表达载体转染具有最高PSGL-1/mlgG2b表达量的稳定CHO-K1细胞株，如上所述，并在包含G418的培养基(400微克/毫升)中进行选择。用GaINAcT(A-基因)或者GaIT(B-基因)表达载体转染在PSGL-1/mIgG2b上具有最高血型H型3型抗原相对数目的细胞克隆株，并在包含blasticidine的培养基中进行选择，从而产生一种细胞系，这种细胞系能够在PSGL-1/mIgG2b上分别生产血型A和B型3型抗原(参见转染方案)。
实施例7：用血型A/B型2型抗原取代的PSGLr 1/MIGG 2B 的产生
使用β1，6GlcNAcT1(核心2酶)和FUT1(H-基因)表达载体转染具有最高PSGL-1/mlgG2b表达量的稳定CHO-K1细胞株，并在包含G418(400微克/毫升)的培养基中进行选择。用α1，3GaINAcT(A-基因)或者α1，3GaIT(B-基因)表达载体转染在PSGL-1/mIgG2b上具有最高血型H型2型抗原相对数目的细胞克隆株，并在包含blasticidine的培养基中进行选择，从而产生一种细胞系，这种细胞系能够在PSGL-1/mIgG2b上分别生产血型A和B型2型抗原(参见转染方案)。
实施例8：用血型A/B型1型抗原取代的PSGL-I/MIGG 2B 的 产生
用β1，3GIcNAcT(核心3酶)和GalT5表达载体转染在PSGL-1/mIgG2b上具有最高血型H型3型抗原相对数目的细胞克隆株，并在包含zeocin的培养基中进行选择。用α1，3GaINAcT(A-基因)或者cc1，3GaIT(B-基因)表达载体转染在PSGL-1/mIgG2b上具有最高血型H型1型抗原相对数目的克隆株，并在包含blasticidine的培养基中进行选择，从而产生一种细胞系，这种细胞系能够在PSGL-1/mIgG2b上分别生产血型A和B型1型抗原(参见转染方案)。
实施例9：重组HPSGL-1/EK/M GG 2B 的纯化
通过离心作用除去细胞培养上清液，并通过包含山羊抗老鼠IgG(整体分子)琼脂糖柱(Sigma公司)。用磷酸缓冲液洗涤之后，用3M NaSCN洗提结合的hPSGL-1/EK/mIgG2b，并用蒸馏水透析。为了除去低分子量污染物，进一步通过凝胶过滤法在HiPrep 16/60 Sephacryl S-200HR柱(Amersham生物科学)上纯化hPSGL-1/EK/mIgG2b。
与琼脂糖凝胶和柱填充物的共价偶联
使用标准生物结合化学作用蒋纯化的血型A和B粘蛋白共价的与琼脂糖快速流动的磁珠连在一起。连接之后，琼脂糖凝胶被包装在塑料容器中形成实际的色谱柱。
测试原型柱的吸附效力和生物适合性
通过标准血库技术，包括血球凝集作用和间接的抗球蛋白试验评定集中控制的血型O血浆吸附之前和之后的抗血型ABO抗体滴定度。通过标准基数测定血浆蛋白，所述血浆蛋白包括免疫球蛋白(IgG、IgM和IgA)、互补因子/片段(C3、C3a、C3d、C4和sC5b-9)、免疫复合物、和凝血因子(FVIII、凝血酶原、纤维蛋白原、纤维蛋白降解产物)。使用重组粘蛋白携带的在确定的核心糖化物链上的血型A/B型抗原通过酶联免疫吸附测定(ELISA)，或者通过薄色层分离法为基础的覆盖试验测定被吸附和洗提的ABO抗体、以及未吸附的ABO抗体的专一性，其中薄色层分离法为基础的覆盖试验中使用纯化的且结构确定的血型A和B糖脂。
实施例10：用于确定抗体滴度的不同的大小和颜色的磁珠的 产生
德国罗斯托克的micromod Partikeltechnologie有限公司生产了不同大小和颜色的磁珠，并能结合不同类型的血型抗原。通过流式细胞计分析磁珠，该磁珠在大小且颜色方面都显示出良好的分辨率(参见图5)。使用这个方法，使使用多种磁珠的混合物称为可能，结合的磁珠具有不同的大小-颜色强度组合，代表其特异性核心组织上表达一种特异性血型抗原。
实施例11：血型抗体的检测
在含有0.5％人白蛋白的磷酸缓冲液中按1∶10的比例稀释血清样品，并与携带血型抗原低聚糖的橡胶微磁珠(4.6微米；18微克干重)混合。血清和微磁珠在室温下培养30分钟，并用0.5％HAS/PBS洗涤。向洗涤后的微磁珠中加入FITC标记的抗人IgM和PE标记的IgG，并用流式细胞计分析。
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其他的实施方案
尽管本发明已经连同其详细的说明书进行了介绍，但是前面的说明只起到解释的效果，并不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围定义。其他的方面、优点和改进也包括在下述权利要求书的范围内。

Claims (32)

1.一种组合物，包括至少两种血型抗原，其中，每种血型抗原表达在不同的核心糖化物链类型上。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述血型抗原是一种A型抗原、B型抗原或H型抗原。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述血型抗原与一种固体支持物相连。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述核心糖化物链类型是1型、2型、3型或者4型。
5.一种吸收剂，包括权利要求3所述的组合物。
6.一种测定主体血清中血型反应性抗体存在的方法，所述方法包括：a)提供不同子类型的微磁珠，其中每种子类型用不同的血型抗原涂布，b)向微磁珠中加入所述来自主体的血清；C)培养所述血清和微磁珠足够长的时间，使血清中的抗血型抗体与所属血型抗原相结合；d)与至少一种能够特异性结合所述抗血型抗体的标记配位体培养，所述抗血型抗体结合有所述血型抗原；和e)检测结合所属抗血型抗体的标记配位体的存在，从而确定所述反应性抗体是存在还是不存在。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述血型抗原由不同的核心糖化物链类型所携带。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述检测时通过流式细胞计或luminex液态芯片蛋白分析系统。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述微磁珠中包括8种不同的血型A/B抗原。
10.根据权利要求7所述的方法，其中微磁珠是乳胶制成的。
11.根据权利要求7所述的方法，其中由于选择了不同的直径或不同的颜色，至少一种血型抗原子类型的微磁珠与至少一种另外的血型子类型的微磁珠不同。
12.根据权利要求7所述的方法，其中由于用不同的标记物进行了标记，至少一种血型抗原子类型的微磁珠与至少一种另外的血型子类型的微磁珠不同。
13.根据权利要求11所述的方法，其中标记物是荧光标记物。
14.根据权利要求7所述的方法，其中微磁珠的直径大约是5微米。
15.根据权利要求7所述的方法，其中微磁珠的直径范围在大约2微米到大约15微米之间。
16.根据权利要求7所述的方法，进一步包括在进行步骤(d)之前除去所述血清成分的步骤，所述血清成分不特异性的结合存在于所述微磁珠上的所述血型抗体。
17.根据权利要求7所述的方法，进一步包括在进行步骤(e)之前除去标记的配位体的步骤，所述标记的配位体不结合所述抗血型抗体。
18.根据权利要求7所述的方法，其中所述配位体是一种抗体或其片段。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述抗体是一种一价抗体片段。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述一价抗体片段是Fab或者Fab’片段。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述Fab或者Fab’片段选自由一种抗Fc抗体片段、一种抗κ轻链抗体片段、一种抗λ轻链抗体片段和一种单一链抗体片段所组成的组中。
22.根据权利要求7所述的组合物，其中，所述链类型是1型前体物、2型前体物或者3型前体物。
23.不同子类型的微磁珠集合，其中每种子类型用不同的血型抗原涂布。
24.根据权利要求23所述的微磁珠集合，其中所述血型抗原由不同的核心糖基化链类型携带。
25.根据权利要求23所述的微磁珠集合，其中所述血型抗原在重组粘液素上表达。
26.根据权利要求25所述的微磁珠集合，其中所述血型抗原表达是多化合价的。
27.根据权利要求24所述的组合物，其中所述核心糖化物链类型是1型前体物、2型前体物或者3型前体物。
28.一种除去血清中血型反应性抗体的方法，所述方法包括：a)提供具有不同子类型的微磁珠集合，其中每种子类型用不同的血型抗原涂布，b)将所述微磁珠与所述血清相接触；c)将所述微磁珠与血清一起培养足够长的时间使血清中的抗血型抗体与所述血型抗原相结合；d)将所述微磁珠与所述血清相分离，因此从血清中除去所述反应性抗体。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述血型抗原在不同的核心糖化物链类型上表达。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述核心糖化物链类型是1型、2型、3型或者4型。
31.根据权利要求28所述的方法，其中所述血型抗原表达在一种重组粘液素上。
32.根据权利要求28所述的方法，其中所述血型抗原表达是多化合价的。
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