CN101397367B - 胶原分子片段接枝脂肪族聚酯二元或三元共聚物及制法和应用 - Google Patents
胶原分子片段接枝脂肪族聚酯二元或三元共聚物及制法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及胶原分子片段接枝脂肪族聚酯二元或三元共聚物及制法和应用。该二元共聚物中胶原分子片段的分子量为100～7000，脂肪族聚酯分子量为5000～80000。该三元共聚物是聚乙二醇-脂肪族聚酯-胶原分子片段的共聚物；其中，聚乙二醇的分子量为750～5000，胶原分子片段、脂肪族聚酯分子量与二元共聚物同。共聚物的分子结构根据胶原分子片段上面氨基的数量从线形到梳型过渡。分子链上的胶原分子片断可以保证材料在生物体内不断降解的过程中保持良好生物相容性；同时，具有梳型结构的共聚物中心链上有大量的羧基，使材料具备pH敏感的特性，在药物缓释领域用于制备组织工程支架或用于制备胶束作为药物控制释放载体。
Description
技术领域
本发明涉及胶原分子片段接枝脂肪族聚酯二元或三元共聚物及制法和应用。
技术背景
天然生物高分子—胶原作为生物医用材料，具有低抗原性、低毒性，体内可降解吸收，且降解产物无毒(参考文献：[1，2])。胶原与细胞相容性好，对细胞有较高的诱导性，可以为细胞的粘附生长提供结合位点。因此，胶原广泛的应用在组织工程和药物控制释放领域中(参考文献：[3，4])。
脂肪族聚酯是近来常用的合成生物医用材料，可生物降解并且降解产物容易吸收或代谢，这一特点使得其在组织工程和药物控制释放领域有良好的应用前景(参考文献：[5])。但是，脂肪族聚酯类材料和胶原相比，其细胞粘附和诱导性能差，组织相容性差，不能够提供细胞进行生长、分化的结合位点。因此，关于胶原对合成类脂肪族聚酯材料的改性研究越来越多。但是胶原分子量过大，对合成材料进行改性只能采取表面处理或者共混(参考文献：[6-8])。为了使脂肪族聚酯能充分和胶原结合，同时不丧失脂肪族聚酯和胶原的优点，将胶原降解获得胶原分子片段，采用化学方法将两者接枝共聚，这样获得的新材料在不影响脂肪族聚酯各项优越性能的同时，改善其生物相容性，扩大材料在组织工程和药物控制释放领域中的应用。
聚乙二醇具有显著的生物相容性，抗凝血性，无毒和低免疫性，因此被广泛应用于生物医药领域(参考文献：[9，10])。用聚乙二醇对脂肪族聚酯进行改性，可增加脂肪族聚酯的溶解性，改善其作为药物载体的稳定性。
脂肪族聚酯能在生物体内被酶降解，具有很好的可生物降解性和生物相容性，广泛用于组织工程和药物释放。同时具有细胞结合位点的胶原分子片段能在组织工程和药物释放体系中引进功能基团，两者的结合具有重大的应用价值。目前合成脂肪族聚酯通常由羟基引发乙交酯、丙交酯以及己内酯等单体开环聚合得到(参考文献：[11-14])。
发明内容
本发明所合成的脂肪族聚酯—胶原分子片段共聚物和聚乙二醇—脂肪族聚酯—胶原分子片段，综合利用了脂肪族聚酯和胶原分子片段的性质。调节二嵌段或三嵌段胶原分子片段的比例，当胶原分子片段上面氨基的摩尔数和聚酯分子的摩尔数比例小于等于1的时候，可以得到梳型结构分子；当胶原片段的摩尔数和聚酯分子的摩尔数比例大于等于1的时候，可以得到线性结构分子。共聚物的亲水/亲油性，生物相容性，生物降解性等性能也可以通过调节各嵌段间的比例获得。同时本发明所采用接枝共聚的方法，可应用在一端具有可反应功能基团为羧基的脂肪族聚酯分子和任何一个具有氨基基团的两性聚电解质，包括蛋白质、聚氨基酸和多肽的接枝共聚。
脂肪族聚酯与胶原分子片段成功的结合后，材料的生物相容性得到提高，用作组织工程材料时可以提高材料与组织间的相容性，有利于诱导细胞在材料支架上面的粘附、生长和增殖。这种材料可以综合利用脂肪族聚酯和胶原的优良性能，在生理条件下可自行降解、崩溃和代谢，进而被生物体吸收或排出体外，对人体无毒副作用。当被用作药物载体时，可以通过控制合成材料各部分的比例来控制降解速率，进而来调节药物释放速率。因此，本发明所合成的高分子材料在医学上有很高的使用价值，有广泛的应用前景。
1)本发明的目之一是提供胶原分子片段接枝脂肪族聚酯二元或三元共聚物，所述的胶原分子片段接枝脂肪族聚酯二元共聚物，胶原分子片段的分子量为100～7000，脂肪族聚酯分子量为5000～80000；
所述的胶原分子片段接枝脂肪族聚酯三元共聚物，是甲氧基聚乙二醇-脂肪族聚酯-胶原分子片段的共聚物；其中，甲氧基聚乙二醇的分子量为750～5000，胶原分子片段的分子量为100～7000，脂肪族聚酯分子量为5000～80000。
2)本发明的另一目的是给出脂肪族聚酯—胶原分子片段二元共聚物(简写为Polyester-DCol)的制备方法，其步骤如下：
(1)胶原分子片段的制备方法
取胶原冻干海绵溶解在浓度为0.5～2M的柠檬酸水溶液中，反应温度为80～100℃，磁力搅拌，进行胶原的降解，胶原和0.5～2M的柠檬酸水溶液的质量比为0.02～0.2；经过12～36h后，降解液用分子量100的透析袋进行透析，除掉分子量小于100的胶原分子片段后，再用分子量7000的透析袋继续透析，取透析出来的透析液冷冻干燥，得到分子量100～7000胶原分子片段；
(2)脂肪族聚酯—胶原分子片段二元共聚物(Polyester-DCol)的制备
本发明采用异丙醇(IPA)引发乙交酯(GA)、L-丙交酯(L-LA)或者ε-己内酯(ε-CL)开环聚合成一端带有羟基的聚酯，实验条件参照参考文献[11，14和15]。按脂肪族聚酯：异丙醇质量比为1:1～100:1投料，先把异丙醇溶于甲苯中得到重量百分数浓度为5％的甲苯溶液，在无水无氧条件下加入L-LA、GA或者ε-CL单体，再加入占单体摩尔数1‰的催化剂辛酸亚锡，甲苯的质量是反应物质量的2～3倍，反应温度为120±20℃，反应48±10h后，反应液旋转蒸发除掉过量的甲苯，之后倒入10～20℃的乙醚中，不断搅拌，沉降，得到产物，得到的产物用乙醚再沉降三次，最后真空干燥，得到纯净的一端带有羟基的脂肪族聚酯；
然后将聚酯的羟基用琥珀酸酐进行羧化，得到一端带有羧基的聚酯，条件参照参考文献[16，17]。首先将聚酯与琥珀酸酐按1：1.1的摩尔比投料，同时分别加入与聚酯等摩尔的吡啶和三乙胺，用1，4—二氧六环做溶剂，溶剂的量为聚酯质量的6～7倍，室温反应24±5h，磁力搅拌，产物用乙醚沉降，抽干，得到端基为羧基的脂肪族聚酯；
将等摩尔量的端羧基活化后的聚酯和胶原分子片段在15～30℃分别溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，端羧基活化后的聚酯和胶原分子片段溶液浓度相等，均为0.01～0.04mmol/mL，溶解后，把端羧基活化后的聚酯溶液逐滴加入到胶原分子片段溶液中，30～40℃油浴中反应3～12h接枝，反应结束后，用二甲基亚砜和水作为透析液对反应产物进行逐级透析，然后用蒸馏水透析48～72h后，冻干得脂肪族聚酯—胶原分子片段二元共聚物。
3)本发明的第三个目的是给出甲氧基聚乙二醇—脂肪族聚酯—胶原分子片段三元共聚物的制备方法，其步骤如下：
首先制备甲氧基聚乙二醇—脂肪族聚酯(mPEG-Polyester)共聚物，聚合物的合成遵循经典的脂肪族聚酯的合成方法，实验过程按照参考文献[12和19]的方法进行，首先是将mPEG加入到甲苯中，在140℃的条件下共沸，除去mPEG中残留的水分，使剩余的甲苯的体积是溶液中溶质质量的2～3倍，之后降低温度至120℃，加入L-LA、GA或者ε-CL单体，再加入单体摩尔数1‰的辛酸亚锡作为催化剂，反应24h；反应的后处理如下：将反应液旋转蒸发除掉过量的甲苯，之后倒入10～20℃乙醚中，不断搅拌沉降，得到的产物用乙醚再沉降三次，最后真空干燥，得到纯净的甲氧基聚乙二醇—脂肪族聚酯二元共聚物；
然后将甲氧基聚乙二醇—脂肪族聚酯的端羟基用琥珀酸酐进行羧化条件参照参考文献[16，17]。首先将甲氧基聚乙二醇—脂肪族聚酯与琥珀酸酐按1：1.1的摩尔比投料，同时分别加入与甲氧基聚乙二醇—脂肪族聚酯等摩尔的吡啶和三乙胺，用1，4—二氧六环做溶剂，溶剂的量为甲氧基聚乙二醇—脂肪族聚酯质量的6～7倍，室温反应24±5h，磁力搅拌，产物用乙醚沉降，抽干，得到端基为羧基的甲氧基聚乙二醇—脂肪族聚酯；
然后将端基为羧基的甲氧基聚乙二醇—脂肪族聚酯的端羧基活化，活化的过程参照参考文献[18]，先将带有端羧基的甲氧基聚乙二醇—脂肪族聚酯和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在二氯甲烷(DCM)中搅拌，冰浴中加入N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)进行活化，0℃搅拌1h后，室温反应24h；反应过程中有沉淀1，3-二环己基脲(dicyclohexylurea，DCU)析出，说明活化成功；反应结束后过滤除去DCU沉淀后，端羧基活化后的甲氧基聚乙二醇—脂肪族聚酯用乙醚沉降；
将等摩尔量的端羧基活化后的甲氧基聚乙二醇—脂肪族聚酯和胶原分子片段在15～30℃分别溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，端羧基活化后的甲氧基聚乙二醇—脂肪族聚酯和胶原分子片段溶液浓度相等，均为0.01～0.04mmol/mL，溶解后，把端羧基活化后的甲氧基聚乙二醇—脂肪族聚酯溶液逐滴加入到胶原分子片段溶液中，30～40℃油浴中反应3～12h接枝，反应结束后，用二甲基亚砜和水作为透析液对反应产物进行逐级透析，然后用蒸馏水透析48～72h后，冻干得甲氧基聚乙二醇—脂肪族聚酯—胶原分子片段三元共聚物。
本发明的第四目的是脂肪族聚酯—胶原分子片段二元共聚物的用途，将其用于制备组织工程支架。
一种制法是用电纺丝制备支架：将脂肪族聚酯—胶原分子片段二元共聚物溶解在氯仿和二甲基亚酰胺的体积比9：1的混合溶液里面，溶液里面加入质量为脂肪族聚酯—胶原分子片段二元共聚物质量两倍的分子量为100k的聚乳酸，最终溶液浓度为10wt％；为了增加电纺射流表面的电荷密度，防止珠状物的形成，相对于聚合物质量的3～5wt％的苄基三乙基溴化铵盐加入到上述溶液中成均一的纺丝溶液，将得到的纺丝溶液在高压电场下面进行纺丝，可得到电纺纤维毡。
第二种制法是热塑成型：将脂肪族聚酯—胶原分子片段二元共聚物溶在二甲基亚砜(DMSO)中，溶液里面加入质量为脂肪族聚酯—胶原分子片段二元共聚物质量两倍的分子量为80000～200000的聚乳酸，混溶，溶解均匀后，用乙醚沉降，真空干燥后用热压的方法成型。
本发明的第五个目的是甲氧基聚乙二醇—脂肪族聚酯—胶原分子片段三元共聚物的用途，将其用于制备胶束作为药物控制释放载体。
制法是：在锥形瓶中，将甲氧基聚乙二醇—脂肪族聚酯—胶原分子片段三元共聚物溶解于DMSO中，浓度为1～10mg/ml。然后逐滴匀速加入和DMSO等体积的二次蒸馏水，可形成胶束。胶束形成后，用分子量7000的透析袋对胶束水溶液进行透析，除去DMSO，定容后可得到聚合物胶束的母液，根据实验需要对母液进行稀释。
本发明的有益效果：本发明所进行的合成脂肪族聚酯—胶原分子片段二元共聚物，以及合成甲氧基聚乙二醇—脂肪族聚酯—胶原分子片段三元共聚物，脂肪族聚酯的分子量为5000～80000，胶原分子片段的分子量为100～7500，甲氧基聚乙二醇单分支的分子量为750～5000。共聚物的分子结构根据胶原分子片段上面氨基的数量从线形到梳型过渡。和表面固定和共混胶原的脂肪族聚酯相比，分子链上的胶原分子片断可以保证材料在生物体内不断降解的过程中保持良好生物相容性；同时，具有梳型结构的共聚物中心链上有大量的羧基，使这种材料具备了pH敏感的特性，在药物缓释领域的应用具有优势。
附图说明
图1是聚乙丙交酯(IPA-PLGA)端羟基羧化活化产物核磁图，a峰的出现说明IPA-PLGA端羟基已经被羧化，b峰的出现说明羧基被NHS活化。
图2是IPA-PLGA、DCol和IPA-PLGA-DCol共聚物红外谱图，和IPA-PLGA谱图相比，IPA-PLGA-DCol谱图上1549cm-1和1662cm-1附近新增了两个峰，3336cm-1附近的峰有了明显的迁移和增强。分别对应的是DCol中酰胺II带CN伸缩、NH弯曲振动，酰胺I带C＝O伸缩振动，和NH伸缩与酰胺II第一倍频共振吸收，说明DCol和IPA-PLGA成功进行了接枝共聚反应。(坐标用中文！)
图3是经过1h培养后Hela细胞在聚合物表面粘附及生长形态。图3的(a)是IPA-PLGA；图3的(b)是IPA-PLGA-DCol。
图4是经过6h培养后Hela细胞在聚合物表面粘附及生长形态。图4的(a)是IPA-PLGA；图4的(b)是IPA-PLGA-DCol。
图5是经过12h培养后Hela细胞在聚合物表面粘附及生长形态。图5的(a)是IPA-PLGA；图5的(b)是IPA-PLGA-DCol。
图6是经过24h培养后Hela细胞在聚合物表面粘附及生长形态。图6的(a)是IPA-PLGA；图6的(b)是IPA-PLGA-DCol。
图7的(a)和(b)是IPA-PLGA-DCol的电纺丝扫描电镜照片。
具体实施方式
实施例1
用柠檬酸降解，可以选择不同分子量范围的透析袋透析来制备分子量为500～7000的胶原分子片段。
取1g胶原冻干海绵溶解在装有20mL1M柠檬酸水溶液的支管反应器中，油浴加热使反应温度升高到100℃，磁力搅拌，使胶原发生降解反应。24h后，降解液用分子量3500的透析袋进行透析，除掉分子量小于3500的胶原分子片断和柠檬酸后，用分子量7000的透析袋继续透析。取透析出来的透析液冷冻干燥，得到分子量3500～7000的胶原分子片断(DCol)。DCol的收率为10％。
制备操作相同的条件下，用分子量3500和1000的透析袋，得到分子量1000～3500的胶原分子片段，收率为5％。用分子量500和1000的透析袋，得到分子量500～1000的收率为5％。
设定分子量为3500～7000的DCol的凝胶色谱测试结果见表1。
表1
| DCol设定分子量分布 | Mw | Mn | PDI |
| 3500～7000 | 6240 | 5710 | 1.09 |
实施例2
用异丙醇(IPA)引发丙交酯(LA)开环聚合成不同分子量的聚乳酸(PLA)，PLA分子量的大小与引发剂IPA的用量直接相关。
首先，根据要合成PLA的分子量计算所需丙交酯和引发剂的比例，然后将重结晶过的丙交酯装入200mL安瓶中，氩气保护下加入引发剂，催化剂辛酸亚锡(SnOct)和蒸馏提纯的甲苯，SnOct占LA摩尔数的千分之一。实验中使用的是SnOct甲苯溶液，浓度根据配备的时候SnOct和甲苯的用量进行计算。反应物与催化剂加好后，将安瓶放入120℃油浴中并磁力搅拌，氩气保护下反应48h。产物用乙醚沉降3次，抽真空干燥。产物的分子量用核磁进行计算
若要合成20g PLA，设计分子量分别为5000，10000，15000，那么所需甲苯40mL，IPA、LA用量及产物分子量列于表2中。
表2
| 设计PLA分子量 | LA(g) | IPA(g) | H1NMR计算产物分子量 |
| 5000 | 19.756 | 0.244 | 4584 |
| 10000 | 19.878 | 0.122 | 9184 |
| 20000 | 19.939 | 0.061 | 20400 |
实施例3
用IPA引发LA和GA开环聚合成乙丙交酯共聚物(PLGA)，PLGA分子量的大小与引发剂异丙醇的用量直接相关。根据经验，用作生物材料的PLGA，LA：GA的比例为8：2材料性能最佳，因此，选择此比例进行以下的实验操作。
试验装置和操作步骤同实施例2相同。首先，根据要合成PLGA的分子量计算所需LA、GA和引发剂的比例，然后将重结晶过的LA和GA装入200mL安瓶中，氩气保护下加入引发剂，催化剂辛酸亚锡(SnOct)和蒸馏提纯的甲苯，SnOct占LA和GA总摩尔数的千分之一。安瓶放入120℃油浴中并磁力搅拌，氩气保护下反应48h。产物用乙醚沉降3次，抽真空干燥。产物的分子量用核磁进行计算
若要合成20g PLGA，设计分子量分别为5000，10000，15000，那么实验所需甲苯40mL、LA、GA的用量及产物分子量列于表3中。
表3
| 设计PLGA分子量 | LA(g) | GA(g) | IPA(g) | H1NMR计算产物分子量 |
| 5000 | 15.805 | 3.951 | 0.244 | 6783 |
| 10000 | 15.902 | 3.976 | 0.122 | 8946 |
| 20000 | 15.951 | 3.988 | 0.061 | 18463 |
实施例4
用甲氧基聚乙二醇(mPEG)引发丙交酯开环聚合成不同分子量的mPEG-PLA两嵌段共聚物，mPEG-PLA分子量的大小与引发剂的分子量和用量直接相关。
首先，根据要合成PLA的分子量计算所需丙交酯(LA)和引发剂mPEG的比例，然后将mPEG装入安瓶中，与甲苯共沸除水(140℃)5个小时后，将重结晶过的丙交酯装入安瓶中，氩气保护下加入催化剂SnOct，补加蒸馏提纯的甲苯，SnOct占LA摩尔数的千分之一。反应物与催化剂加好后，将反应温度降低到120℃并磁力搅拌，氩气保护下反应48h。产物用乙醚沉降3次，抽真空干燥。产物的分子量用核磁进行计算
若要合成20g mPEG-PLA，mPEG的分子量为2000，设计分子量分别为5000，10000，20000，80000，那么实验所需甲苯40mL。mPEG、LA用量及产物分子量列于表4。
表4
| 设计PLA分子量 | mPEG(g) | LA(g) | H1NMR计算产物分子量 |
| 5000 | 8 | 12 | 5620 |
| 10000 | 4 | 16 | 10567 |
| 20000 | 2 | 18 | 21348 |
| 80000 | 0.5 | 19.5 | 78837 |
实施例5
用甲氧基聚乙二醇(mPEG)引发乙丙交酯开环聚合成不同分子量的mPEG-PLGA两嵌段共聚物，mPEG-PLGA分子量的大小与mPEG的分子量和用量直接相关。
首先，根据要合成PLGA的分子量计算所需LA和引发剂mPEG的比例，然后将mPEG装入安瓶中，与甲苯共沸除水(140℃)5个小时后，将重结晶过的LA和GA装入安瓶中，氩气保护下加入催化剂SnOct，补加蒸馏提纯的甲苯，SnOct占LA和GA总摩尔数的千分之一。反应物与催化剂加好后，将反应温度降低到120℃并磁力搅拌，氩气保护下反应48h。产物用乙醚沉降3次，抽真空干燥。产物的分子量用核磁进行计算
若要合成20g mPEG-PLGA，mPEG的分子量为分别为750，2000，5000，设计分子量分别为10000，那么实验所需甲苯40mL。mPEG、LA和GA用量及产物分子量列于表5。
表5
| 聚合物 | mPEG(g) | GA(g) | LA(g) | H1NMR计算的分子量 |
| mPEG750-PLGA | 1.5 | 3.7 | 14.8 | 10625 |
| mPEG2k-PLGA | 4 | 3.2 | 12.8 | 9750 |
| mPEG5k-PLGA | 10 | 2 | 8 | 10830 |
实施例6
实验所涉及到的聚酯类材料的端羟基必须羧化后才能与DCol的氨基偶联。首先通过核磁计算出脂肪族聚酯的分子量。选择琥珀酸酐在接枝到聚酯的羟基端，步骤是首先将聚酯与琥珀酸酐按1：1.1的摩尔比投料，同时加入等摩尔的4，4-二甲氨基吡啶(DMAP)和三乙胺，用1，4—二氧六环做溶剂，溶剂的量大约脂肪族聚酯质量的7倍。实验过程中保持无水无氧，室温反应24小时后，产物用乙醇沉降三次，洗净未反应的琥珀酸酐，真空干燥3天，用核磁和红外表征接枝反应进行的情况。
设计合成分子量为10k的几种聚酯的羧化过程中所用聚酯、琥珀酸酐、DMAP和三乙胺的用量列于表6。
表6
| 样品号 | Mn | 用量(g) | 琥珀酸酐(g) | DMAP(g) | 三乙胺(g) |
| IPA-PLA10k | 9100 | 5.460 | 0.066 | 0.081 | 0.067 |
| IPA-PLGA10k | 8946 | 5.368 | 0.066 | 0.081 | 0.067 |
| mPEG2k-PLA8k | 10567 | 5.283 | 0.055 | 0.067 | 0.056 |
| mPEG750-PLGA10k | 10625 | 5.312 | 0.055 | 0.067 | 0.056 |
| mPEG2k-PLGA8k | 9750 | 4.875 | 0.055 | 0.067 | 0.056 |
| mPEG5k-PLGA5k | 9866 | 4.933 | 0.055 | 0.067 | 0.056 |
实施例7
由于DCol分子链上不但有氨基，而且有羧基，如果直接加入偶联剂对端羟基羧化的聚酯与DCol进行偶联的话，在聚酯的端羧基与DCol接枝的同时，-DCol分子间也会发生反应，而使大量的氨基丧失，有可能导致接枝反应失败。因此，在进行偶联以前，必须先使聚酯的端羧基活化。活化的过程是先将聚合物和偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在二氯甲烷(DCM)中搅拌，冰浴中加入N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)，0℃搅拌1h后，室温反应24h；DCC和NHS等量加入，为聚酯摩尔量的5倍。反应过程中有沉淀1，3-二环己基脲(dicyclohexylurea，DCU)析出，说明接枝成功；反应结束后过滤除去DCU沉淀后，产物用乙醚沉降。
设计合成分子量为10k的几种聚酯的端羧基活化过程中所用聚酯、NHS、DCC和DCM的用量列于表7。
表7
| 样品号 | 用量(g) | NHS(g) | DCC(g) | DCM(mL) |
| IPA-PLA10k | 2.755 | 0.173 | 0.310 | 20 |
| IPA-PLGA10k | 2.709 | 0.173 | 0.310 | 20 |
| mPEG2k-PLA8k | 2.642 | 0.144 | 0.240 | 15 |
| mPEG750-PLGA10k | 2.677 | 0.144 | 0.240 | 15 |
| mPEG2k-PLGA8k | 2.600 | 0.153 | 0.256 | 16 |
| mPEG5k-PLGA5k | 2.467 | 0.1438 | 0.240 | 15 |
实施例8
脂肪族聚酯的端羟基经过羧化活化后可以直接与DCol偶联。首先，计算DCol上面氨基的平均数量，然后按照一个氨基和一个羧基发生缩聚反应，计算聚合物和DCol的摩尔比，在室温分别溶解在DMSO中，溶解后，聚合物的溶液逐滴加入到DCol溶液中，40℃油裕中反应3h接枝。反应结束后，首先用DMSO透析24小时后，用DMSO和水的混合溶液作为透析液对反应产物进行逐级透析72小时，中间更换透析液，直至然后用蒸馏水透析48h后，冻干得PLGA/D-Col。
设计合成分子量为10k的几种聚酯和分子量分布为3500～7000的DCol缩聚过程中所用聚酯、DCol和DMSO的用量见表8。
表8
| 样品号 | 用量(g) | DCol(g) | DMSO(mL) | 产率，％ |
| IPA-PLA10k | 1.017 | 0.1 | 6 | 70 |
| IPA-PLGA10k | 0.911 | 0.1 | 6 | 68 |
| mPEG2k-PLA8k | 1.085 | 0.20 | 8 | 75 |
| mPEG750-PLGA10k | 1.593 | 0.25 | 10 | 72 |
| mPEG2k-PLGA8k | 1.462 | 0.25 | 10 | 69 |
| mPEG5k-PLGA5k | 1.810 | 0.3 | 10 | 78 |
实施例9
将异丙醇引发聚合的聚酯系列接枝胶原分子片段后，用作组织工程支架材料。由于胶原分子片段的接枝使得材料在有机溶剂中的溶解性能变差，但是材料对细胞的相容性得到了显著的提高。因此可以将此系列材料与高分子量的PLA或者PCL混溶后，重新沉降，获得的材料用热塑成型，来制备组织工程用材料。
细胞在分子量为10k的IPA-PLGA和IPA-PLGA-DCol膜表面生长的结果见图3，统计结果列于表9。
表9
实施例10
将0.5g分子量为10k的IPA-PLGA-DCol溶解在2mL二甲基甲酰胺(DMF)中，材料溶解完全后加氯仿(CHCl3)18mL，得到IPA-PLGA-DCol的CHCl3和DMF混合溶液。称取0.25g分子量为100k的PLA，加入5mL上述的混合溶液溶解后，进行电纺丝。电纺过程中所涉及到的操作参数如下：喷丝口的直径为0.4mm，所施加的静电场的强度为1.46kV/cm，喷丝口和收集屏之间的距离为24cm，溶液流速为2-2.5ml/h。最终在收集屏上得到了干燥IPA-PLGA-DCol～PLA的电纺纤维毡。IPA-PLGA-DCol～PLA电纺丝的电镜照片见附图7。
实施例11
将mPEG引发聚合的系列材料(包括接和未接胶原分子片段的系列材料)制备成2.5mg/mL的DMSO溶液，然后缓慢逐滴滴加和DMSO等量的水，制备胶束溶液。透析除去DMSO，过程中观察材料成胶束的情况。通过实验观察发现，材料成胶束的能力和mPEG的长度有直接的关系，胶原分子片段的接枝在一定程度上可以影响材料的成胶束能力，但是不是决定因素。不同材料能胶束能力的情况列于表11。
表11
| 样品号 | 滴加水溶液情况 | 透析中溶液情况 | 成胶束情况 |
| mPEG750-PLGA10k | 沉淀 | — | 不成胶束 |
| mPEG750-PLGA10k-DCol | 大量气泡 | 沉淀 | 不成胶束 |
| mPEG2k-PLGA8k | 变青色，半透明 | 浑浊，有沉淀 | 成胶束，不稳定 |
| mPEG750-PLGA10k-DCol | 变青白色，半透明 | 青白色，半透明 | 成胶束 |
| mPEG5k-PLGA5k | 变青色，半透明 | 青白色，半透明 | 成胶束 |
| 变青白色，半透明 | 青白色， | 成胶束 |
| mPEG750-PLGA10k-DCol | 半透明 |
实施例12
将10mg mPEG5k-PLGA5k和10mg mPEG750-PLGA10k-DCol
分别溶解在4mL DMSO中，搅拌使材料充分溶解。然后在磁力搅拌过程中逐滴缓慢加水至8mL，对水进行透析3天左后，去除DMSO。两种材料均可成胶束mPEG750-PLGA10k-Dcol。
胶束的荧光实验结果确定当聚合物浓度增大到一定值的时候，芘的最大激发波长会由333nm增大到335.2nm，最大激发波长发生了2.2nm的红移，说明mPEG750-PLGA10k-DCol可以形成胶束。mPEG5k-PLGA5k胶束的荧光实验结果是芘的最大激发波长由333nm增大到335nm，最大激发波长发生了2nm的红移，也可形成胶束。
通过荧光实验得到mPEG750-PLGA10k-DCol和mPEG5k-PLGA5k胶束的临界胶束浓度(CMC)，可知mPEG750-PLGA10k-DCol在较低的浓度下就可以形成胶束。测试结果见表12。其中mPEG750-PLGA10k-DCol胶束由于在D-Col分子上有大量的羧基存在，因此mPEG750-PLGA10k-DCol胶束具备pH敏感性。
表12
| 样品号 | 临界胶束浓度(mg/mL) | 平均粒径(nm) |
| mPEG5k-PLGA5k | 0.00353mg/ml | 132 |
| mPEG750-PLGA10k-DCol | 0.00669mg/ml | 60.7 |
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Claims (6)
1.胶原分子片段接枝脂肪族聚酯二元共聚物，其特征在于，该二元共聚物中胶原分子片段的分子量为100～7000，脂肪族聚酯分子量为5000～80000；所述的脂肪族聚酯为聚乳酸、聚乙交酯、聚乙交酯丙交酯或聚ε-己内酯。
2.胶原分子片段接枝脂肪族聚酯三元共聚物，其特征在于，该三元共聚物是甲氧基聚乙二醇-脂肪族聚酯-胶原分子片段的共聚物；其中，甲氧基聚乙二醇的分子量为750～5000，胶原分子片段的分子量为100～7000脂肪族聚酯分子量为5000～80000；所述的脂肪族聚酯为聚乳酸、聚乙交酯、聚乙交酯丙交酯或聚ε-己内酯。
3.权利要求1所述的胶原分子片段接枝脂肪族聚酯二元共聚物的制备方法，其特征在于步骤和条件如下：
(1)胶原分子片段的制备方法
取胶原冻干海绵溶解在浓度为0.5～2M的柠檬酸水溶液中，反应温度为80～100℃，磁力搅拌，进行胶原的降解，胶原和0.5～2M的柠檬酸水溶液的质量比为0.02～0.2；经过12～36h后，降解液用分子量100的透析袋进行透析，除掉分子量小于100的胶原分子片段后，再用分子量7000的透析袋继续透析，取透析出来的透析液冷冻干燥，得到分子量100～7000胶原分子片段；
(2)脂肪族聚酯-胶原分子片段二元共聚物的制备
采用异丙醇引发乙交酯、L-丙交酯或者ε-己内酯开环聚合成一端带有羟基的聚酯，按脂肪族聚酯∶异丙醇质量比为1∶1～100∶1投料，先把异丙醇溶于甲苯中得到重量百分数浓度为5％的甲苯溶液，在无水无氧条件下加入L-丙交酯、乙交酯或者ε-己内酯单体，再加入占单体摩尔数1‰的催化剂辛酸亚锡，甲苯的质量是反应物质量的2～3倍，反应温度为120±20℃，反应48±10h后，反应液旋转蒸发除掉过量的甲苯，之后倒入10～20℃的乙醚中，不断搅拌，沉降，得到产物，得到的产物用乙醚再沉降三次，最后真空干燥，得到纯净的一端带有羟基的脂肪族聚酯；
然后将一端带有羟基的脂肪族聚酯的羟基用琥珀酸酐进行羧化，首先将聚酯与琥珀酸酐按1∶1.1的摩尔比投料，同时分别加入与聚酯等摩尔的吡啶和三乙胺，用1，4-二氧六环做溶剂，溶剂的量为聚酯质量的6～7倍，室温反应24±5h，磁力搅拌，产物用乙醚沉降，抽干，得到端基为羧基的脂 肪族聚酯；
然后将端基为羧基的脂肪族聚酯的端羧基活化，先将带有端羧基的聚酯和N-羟基琥珀酰亚胺溶解在二氯甲烷中搅拌，冰浴中加入N，N’-二环己基碳二亚胺进行活化，0℃搅拌1h后，室温反应24h；反应结束后过滤除去1，3-二环己基脲沉淀后，端羧基活化后的聚酯用乙醚沉降；
将等摩尔量的端羧基活化后的聚酯和胶原分子片段在15～30℃分别溶解在二甲基亚砜中，端羧基活化后的聚酯和胶原分子片段溶液浓度均为0.01～0.04mmol/mL，溶解后，把端羧基活化后的聚酯溶液逐滴加入到胶原分子片段溶液中，30～40℃油浴中反应3～12h接枝，反应结束后，用二甲基亚砜和水作为透析液对反应产物进行逐级透析，然后用蒸馏水透析48～72h后，冻干，得到脂肪族聚酯-胶原分子片段二元共聚物。
4.权利要求2所述的胶原分子片段接枝脂肪族聚酯三元共聚物的制备方法，其特征在于步骤和条件如下：
首先制备甲氧基聚乙二醇-脂肪族聚酯共聚物，首先是将甲氧基聚乙二醇加入到甲苯中，在140℃的条件下共沸，除去甲氧基聚乙二醇中残留的水分，使剩余的甲苯的体积是溶液中溶质质量的2～3倍，之后降低温度至120℃，加入乙交酯、L-丙交酯或者ε-己内酯单体，再加入单体摩尔数1‰的辛酸亚锡作为催化剂，反应24h；反应的后处理如下：将反应液旋转蒸发除掉过量的甲苯，之后倒入10～20℃乙醚中，不断搅拌沉降，得到的产物用乙醚再沉降三次，最后真空干燥，得到纯净的甲氧基聚乙二醇-脂肪族聚酯二元共聚物；
然后将甲氧基聚乙二醇-脂肪族聚酯的端羟基用琥珀酸酐进行羧化，首先将甲氧基聚乙二醇-脂肪族聚酯与琥珀酸酐按1∶1.1的摩尔比投料，同时分别加入与甲氧基聚乙二醇-脂肪族聚酯等摩尔的吡啶和三乙胺，用1，4-二氧六环做溶剂，溶剂的量为甲氧基聚乙二醇-脂肪族聚酯质量的6～7倍，室温反应24±5h，磁力搅拌，产物用乙醚沉降，抽干，得到端基为羧基的甲氧基聚乙二醇-脂肪族聚酯；
然后将端基为羧基的甲氧基聚乙二醇-脂肪族聚酯的端羧基活化，先将带有端羧基的甲氧基聚乙二醇-脂肪族聚酯和N-羟基琥珀酰亚胺溶解在二氯甲烷中搅拌，冰浴中加入N，N’-二环己基碳二亚胺进行活化，0℃搅拌1h后，室温反应24h；反应结束后过滤除去1，3-二环己基脲沉淀后，端羧基活化后的甲氧基聚乙二醇-脂肪族聚酯用乙醚沉降；
将等摩尔量的端羧基活化后的甲氧基聚乙二醇-脂肪族聚酯和胶原分 子片段在15～30℃分别溶解在二甲基亚砜中，端羧基活化后的甲氧基聚乙二醇-脂肪族聚酯和胶原分子片段溶液浓度均为0.01～0.04mmol/mL，溶解后，把端羧基活化后的甲氧基聚乙二醇-脂肪族聚酯溶液逐滴加入到胶原分子片段溶液中，30～40℃油浴中反应3～12h接枝，反应结束后，用二甲基亚砜和水作为透析液对反应产物进行逐级透析，然后用蒸馏水透析48～72h后，冻干得甲氧基聚乙二醇-脂肪族聚酯-胶原分子片段三元共聚物。
5.权利要求1所述的胶原分子片段接枝脂肪族聚酯二元共聚物，其特征在于，其用于制备组织工程支架。
6.权利要求2所述的胶原分子片段接枝脂肪族聚酯三元共聚物，其特征在于，其用于制备胶束作为药物控制释放载体。
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