CN101396373A - 一种华蟾素提取物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种华蟾素提取物及其制备方法，该提取物中的主要有效成分华蟾酥毒基含量在0.15％以上，脂蟾毒配基含量在0.10％以上。该提取物是由干蟾皮经过水煮、过柱、洗脱、浓缩、干燥等工艺制备而成，本发明有效去除提取物中的无效物质(杂质)，富集有效成分，达到了提高疗效降低毒副作用的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取物及其制备方法，特别涉及一种华蟾素提取物及其制备方法。
背景技术
华蟾素提取物为蟾蜍科(Bufonidae)动物中华大蟾蜍Bufo bufogargarizans Cantor的干燥皮经提取纯化制得的棕黄色浸膏；华蟾素具解毒、消肿、止痛功效，用于中、晚期肿瘤、慢性乙型肝炎等症，其生理活性物质主要是蟾蜍毒素类(bufotoxins)及其水解产物蟾毒配基类(bufageins)、蟾毒色胺类(bufoteinines)，还含胆甾醇等其它化合物。
目前华蟾素注射剂、口服液、片剂已应用于临床，但在临床应用中发现由于提取物中无效物质(杂质)含量高、有效成分含量低，导致产品有一定的毒副作用，并且疗效降低。
发明内容
本发明的一个目的在于公开一种提取物；本发明的另一个目的在于公开一种华蟾素提取物；本发明还有一个目的在于公开该提取物的制备工艺。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
本发明所述华蟾素提取物中华蟾酥毒基含量为0.15％以上，脂蟾毒配基含量为0.10％以上。
本发明所述华蟾素提取物的制备方法为：
取干蟾皮1重量份，煎煮1-3次，每次加4-12体积份的水煎煮20分钟-2小时，合并煎煮液，滤过，滤液冷却至40℃以下，上大孔吸附树脂柱吸附，先用3-9倍柱体积水洗脱，再加2-8倍柱体积的50％-95％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后，浓缩，干燥，即得华蟾素提取物。
本发明所述华蟾素提取物的制备方法优选为：
取干蟾皮1重量份，煎煮2-3次，每次加5-10体积份的水煎煮0.5-1.5小时，合并煎煮液，滤过，滤液冷却至40℃以下，上大孔吸附树脂柱吸附，先用5-7倍柱体积水洗脱，再加3-6倍柱体积的60％-85％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后，浓缩，干燥，即得华蟾素提取物。
本发明所述华蟾素提取物的制备方法优选为：
取干蟾皮1重量份，加10体积份的水，煎煮45分钟，即一煎；一煎后药渣加入5体积份的水，煎煮30分钟，即二煎；合并两次煎煮液，滤过，滤液冷却至40℃以下，上大孔吸附树脂柱吸附，先用6倍柱体积水洗脱，再加5倍柱体积的70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后，浓缩，干燥，即得华蟾素提取物。
本发明所述华蟾素提取物的制备方法优选为：
取干蟾皮1重量份，加7体积份的水，煎煮45分钟，即一煎；一煎后药渣加入5体积份的水，煎煮45分钟，即二煎；合并两次煎煮液，滤过，滤液冷却至40℃以下，上大孔吸附树脂柱吸附，先用7倍柱体积水洗脱，再加6倍柱体积的60％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后，浓缩，干燥，即得华蟾素提取物。
本发明所述华蟾素提取物的制备方法优选为：
取干蟾皮1重量份，加10体积份的水，煎煮30分钟，即一煎；一煎后药渣加入8体积份的水，煎煮30分钟，即二煎；合并两次煎煮液，滤过，滤液冷却至40℃以下，上大孔吸附树脂柱吸附，先用5倍柱体积水洗脱，再加4倍柱体积的80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后，浓缩，干燥，即得华蟾素提取物。
上述制备方法中大孔吸附树脂型号优选为D101、AB-8或NKA-9等中性或低极性吸附树脂。
本发明所述重量份/体积份的关系是：克/毫升
取本发明所述华蟾素提取物，加入辅料，按照制剂工艺，制成临床接受的剂型，包括但不限于注射剂、胶囊、滴丸、软胶囊、片剂、分散片、口服液、含片、软膏剂、滴鼻剂、颗粒剂等药物剂型。
本发明所述技术方案制备所得的华蟾素提取物中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基含量较现有大孔树脂纯化技术(申请号200410083994.4)所述方法制得的提取物高5倍以上，说明本发明蟾蜍毒素类有效成分保留完全；且通过与提取物[按专利(申请号200510005277.4)“华蟾素(蟾皮)提取物生产工艺”制备而得]的药效学对比试验，证明本发明所得提取物药效提高且毒性减小。本发明有效去除了提取物中的无效物质(杂质)，富集了有效成分，达到了提高疗效降低毒副作用的目的。
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1 提取物收率及吲哚类总生物碱含量
1.1 仪器及试药：UV-2401紫外可见分光光度计(日本岛津)；提取物I(实施例1所述本发明提取物)；提取物II[按专利(申请号200510005277.4)“华蟾素(蟾皮)提取物生产工艺”制备而得]；5-羟色胺对照品(中国药品生物制品检定所)。
1.2 实验方法：吲哚类总生物碱含量测定参照华蟾素注射液(WS3-Bb-0027-95)“含量测定”项下方法进行，结果见表1。
表1 提取物收率及吲哚类总生物碱含量
结果证明，本发明提取物收率降低但吲哚类总生物碱含量明显提高，有效成分吲哚类总生物碱得到富集，并丢弃大量无效物质(杂质)。
实验例2 提取物中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基含量分析
2.1 仪器与试药：HP-1100高效液相色谱仪及检测器(美国惠普)，实施例1所述本发明提取物；华蟾酥毒基对照品和脂蟾毒配基对照品(中国药品生物制品检定所)；
2.2 实验方法：参照《中国药典》2005年版一部265页(2000年版一部316页)蟾酥项下含量测定方法进行，结果见表2。
表2 各提取物华蟾酥毒基、脂蟾毒配基含量
*专利提取物数据引用专利(申请号200410083994.4)“一种华蟾毒冻干粉针及其制备方法”说明书“三、华蟾素醇提物含量分析”中提取物的华蟾酥毒基、脂蟾毒配基含量。
结果证明，本发明提取物中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量大大提高，蟾蜍毒素类有效成分得到较大程度富集。
实验例3 提取物药效学比较研究试验
3.1 试验材料及试剂
3.1.1 提取物I：实施例1所述本发明提取物；每g浸膏相当于60.61g原生药。临用前用蒸馏水配成所需浓度的溶液备用。本实验剂量按原生药g/kg计算。
提取物II：按专利(申请号200510005277.4)“华蟾素(蟾皮)提取物生产工艺”制备而得；每g浸膏相当于27.78g原生药。临用前用蒸馏水配成所需浓度的溶液备用。本实验剂量按原生药g/kg计算。
环磷酰胺：注射用，江苏恒瑞医药股份有限公司，规格0.2g/瓶，批号：06071721，临用前用蒸馏水新鲜配制。
3.1.2 瘤株
S180瘤株：购自四川大学华西医院肿瘤研究所。
H22瘤株：购自四川大学华西医院肿瘤研究所。
3.1.3 实验动物
昆明种小鼠：SPF级，雌性，体重24～26g，四川省中医药科学院实验动物中心提供。
3.2 实验方法
3.2.1 口服各提取物对S180小鼠肿瘤生长的影响
复苏小鼠S180瘤株，加入适量的灭菌生理盐水，充分混匀，配制成瘤细胞悬液(细胞数>1×107～2×107/ml)接种于5只同种异体小鼠腹腔内(一代种鼠)。7天后抽取腹水，再次接种于5只同种异体小鼠腹腔内(二代种鼠)。选取生长7天后的二代种鼠抽取腹水，混匀，稀释10倍，计数细胞浓度。调整细胞浓度至2×107/ml，接种于70只小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2ml，在接种后第2天，将动物称重并随机分为6组，分别灌胃HC I20g/kg、4.0g/kg，HC II20g/kg、4.0g/kg、环磷酰胺20mg/kg及等量溶媒，蒸馏水对照组则给予等体积的蒸馏水。每天一次，连续10天。末次给药后24小时处死动物，称重，剥取肿瘤，称湿重。结果见表3。
表3 各提取物对S180小鼠的抑制作用
与溶媒对照组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
结果证明，提取物I和提取物II各剂量组均可显著抑制小鼠S180的生长，其抑瘤率分别为74.6％、64.0％，69.7％和68.6％，与对照组比较有统计学差异。从表3还可看出提取物I各剂量组在产生抑瘤作用的同时对动物体重的增长并无明显影响，而提取物II在抑制肿瘤生长的同时也减慢动物的生长速度，提示提取物II在产生治疗作用的同时具有一定的毒性作用。
3.2.2 口服各提取物对H22肝癌小鼠生存期的影响
复苏小鼠H22瘤株，加入适量的灭菌生理盐水，充分混匀，配制成瘤细胞悬液(细胞数>1×107～2×107/ml)接种于5只同种异体小鼠腹腔内(一代种鼠)。7天后抽取腹水，再次接种于5只同种异体小鼠腹腔内(二代种鼠)。选取生长7天后的二代种鼠抽取腹水，混匀，稀释10倍，计数细胞浓度。调整细胞浓度至2×107/ml，接种于67只小鼠腹腔，每只小鼠注射0.2ml，在接种后第2天，将动物称重并随机分为6组，分别灌胃提取物I 20g/kg、4.0g/kg，提取物II 20g/kg、4.0g/kg，环磷酰胺20mg/kg，蒸馏水对照组则给予等体积的蒸馏水。每天一次，连续10天。末次给药后继续观察并记录动物在接种肿瘤后的死亡时间，结果进行t检验，结果见表4。
表4 口服各提取物对H22肝癌小鼠生存期的影响
与溶媒对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。
从表4可见，提取物I 20g/kg、4.0g/kg和提取物II 20g/kg、4.0g/kg均可显著延长H22小鼠的生存期，与溶媒对照比较有统计学差异。其延长率分别为43.8％、28.5％，21.5％和11.1％。可见提取物I延长荷瘤小鼠生存期的作用明显优于提取物II。
3.3 小结
以上结果证明，两种提取物均有抗肿瘤作用，但以提取物I(本发明制备方法所得提取物)的作用较好，毒性较低。
下述实施例均能实现上述实验例的效果。
具体实施方式
实施例1：
取干蟾皮1kg，加10L水煎煮45分钟，即一煎；一煎后药渣加入5L水煎煮30分钟，即二煎；合并两次煎煮液，滤过，滤液冷却至30℃，上D101大孔吸附树脂柱吸附，先用6L水洗脱，再加5L70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后，浓缩，干燥，得华蟾素提取物16.5g，经测定提取物中华蟾酥毒基总量为31.2mg，脂蟾毒配基总量为20.8mg。
实施例2：
取干蟾皮1kg，加7L水煎煮45分钟，即一煎；一煎后药渣加入5L水再煎煮45分钟，即二煎；合并两次煎煮液，滤过，滤液冷却至25℃，上AB-8大孔吸附树脂柱吸附，先用7L水洗脱，再加6L 60％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后，浓缩，干燥，得华蟾素提取物15.3g，经测定提取物中华蟾酥毒基总量为22.9mg，脂蟾毒配基总量为15.6mg。
实施例3：
取干蟾皮1kg，加10L水，煎煮30分钟，即一煎；一煎后药渣加入8L水煎煮30分钟，即二煎；合并两次煎煮液，滤过，滤液冷却至35℃，上NKA-9大孔吸附树脂柱吸附，先用5L水洗脱，再加4L80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后，浓缩，干燥，得华蟾素提取物18.4g，经测定提取物中华蟾酥毒基总量为36.5mg，脂蟾毒配基总量为24.2mg。
实施例4：
取干蟾皮1kg，加5L水，煎煮1小时，即一煎；一煎后药渣加入4L水再煎半小时，煎煮液滤过，滤液冷却至32℃，上D101大孔吸附树脂柱吸附，先用8L水洗脱，再加7L 55％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后，浓缩，干燥，得华蟾素提取物13.8g，经测定提取物中华蟾酥毒基总量为20.8mg，脂蟾毒配基总量为13.9mg。
实施例5：
取干蟾皮1kg，加22L水，煎煮45分，煎煮液滤过，滤液冷却至38℃，上AB-8大孔吸附树脂柱吸附，先用4L水洗脱，再加3L 90％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后，浓缩，干燥，得华蟾素提取物17.1g，经测定提取物中华蟾酥毒基总量为30.6mg，脂蟾毒配基总量为24.3mg。
实施例6：
取干蟾皮1kg，每次加4L水煎煮25分钟，煎煮3次；合并三次煎煮液，滤过，滤液冷却至28℃，上NKA-9大孔吸附树脂柱吸附，先用8L水洗脱，再加2L 95％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后，浓缩，干燥，得华蟾素提取物15.8g，经测定提取物中华蟾酥毒基总量为24.0mg，脂蟾毒配基总量为16.5mg。
Claims (13)
1、一种华蟾素提取物，其特征在于该提取物中华蟾酥毒基含量为0.15％以上，脂蟾毒配基含量为0.10％以上。
2、如权利要求1所述的华蟾素提取物，其特征在于该提取物是由如下方法制备的：取干蟾皮1重量份，煎煮1-3次，每次加4-12体积份的水煎煮20分钟-2小时，合并煎煮液，滤过，滤液冷却至40℃以下，上大孔吸附树脂柱吸附，先用3-9倍柱体积水洗脱，再加2-8倍柱体积的50％-95％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后，浓缩，干燥，即得华蟾素提取物。
3、如权利要求2所述的华蟾素提取物，其特征在于该提取物是由如下方法制备的：取干蟾皮1重量份，煎煮2-3次，每次加5-10体积份的水煎煮0.5-1.5小时，合并煎煮液，滤过，滤液冷却至40℃以下，上大孔吸附树脂柱吸附，先用5-7倍柱体积水洗脱，再加3-6倍柱体积的60％-85％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后，浓缩，干燥，即得华蟾素提取物。
4、如权利要求2所述的华蟾素提取物，其特征在于该提取物是由如下方法制备的：取干蟾皮1重量份，加10体积份的水，煎煮45分钟，即一煎；一煎后药渣加入5体积份的水，煎煮30分钟，即二煎；合并两次煎煮液，滤过，滤液冷却至40℃以下，上大孔吸附树脂柱吸附，先用6倍柱体积水洗脱，再加5倍柱体积的70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后，浓缩，干燥，即得华蟾素提取物。
5、如权利要求2所述的华蟾素提取物，其特征在于该提取物是由如下方法制备的：取干蟾皮1重量份，加7体积份的水，煎煮45分钟，即一煎；一煎后药渣加入5体积份的水，煎煮45分钟，即二煎；合并两次煎煮液，滤过，滤液冷却至40℃以下，上大孔吸附树脂柱吸附，先用7倍柱体积水洗脱，再加6倍柱体积的60％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后，浓缩，干燥，即得华蟾素提取物。
6、如权利要求2所述的华蟾素提取物，其特征在于该提取物是由如下方法制备的：取干蟾皮1重量份，加10体积份的水，煎煮30分钟，即一煎；一煎后药渣加入8体积份的水，煎煮30分钟，即二煎；合并两次煎煮液，滤过，滤液冷却至40℃以下，上大孔吸附树脂柱吸附，先用5倍柱体积水洗脱，再加4倍柱体积的80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后，浓缩，干燥，即得华蟾素提取物。
7、如权利要求2-6任一所述的华蟾素提取物，其特征在于该提取物的制备方法中大孔吸附树脂型号为D101、AB-8或NKA-9中性或低极性吸附树脂。
8、如权利要求1所述的华蟾素提取物的制备方法，其特征在于该方法为：取干蟾皮1重量份，煎煮1-3次，每次加4-12体积份的水煎煮20分钟-2小时，合并煎煮液，滤过，滤液冷却至40℃以下，上大孔吸附树脂柱吸附，先用3-9倍柱体积水洗脱，再加2-8倍柱体积的50％-95％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后，浓缩，干燥，即得华蟾素提取物。
9、如权利要求8所述的华蟾素提取物的制备方法，其特征在于该方法为：取干蟾皮1重量份，煎煮2-3次，每次加5-10体积份的水煎煮0.5-1.5小时，合并煎煮液，滤过，滤液冷却至40℃以下，上大孔吸附树脂柱吸附，先用5-7倍柱体积水洗脱，再加3-6倍柱体积的60％-85％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后，浓缩，干燥，即得华蟾素提取物。
10、如权利要求8所述的华蟾素提取物的制备方法，其特征在于该方法为：取干蟾皮1重量份，加10体积份的水，煎煮45分钟，即一煎；一煎后药渣加入5体积份的水，煎煮30分钟，即二煎；合并两次煎煮液，滤过，滤液冷却至40℃以下，上大孔吸附树脂柱吸附，先用6倍柱体积水洗脱，再加5倍柱体积的70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后，浓缩，干燥，即得华蟾素提取物。
11、如权利要求8所述的华蟾素提取物的制备方法，其特征在于该方法为：取干蟾皮1重量份，加7体积份的水，煎煮45分钟，即一煎；一煎后药渣加入5体积份的水，煎煮45分钟，即二煎；合并两次煎煮液，滤过，滤液冷却至40℃以下，上大孔吸附树脂柱吸附，先用7倍柱体积水洗脱，再加6倍柱体积的60％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后，浓缩，干燥，即得华蟾素提取物。
12、如权利要求8所述的华蟾素提取物的制备方法，其特征在于该方法为：取干蟾皮1重量份，加10体积份的水，煎煮30分钟，即一煎；一煎后药渣加入8体积份的水，煎煮30分钟，即二煎；合并两次煎煮液，滤过，滤液冷却至40℃以下，上大孔吸附树脂柱吸附，先用5倍柱体积水洗脱，再加4倍柱体积的80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后，浓缩，干燥，即得华蟾素提取物。
13、如权利要求8-12任一所述的华蟾素提取物的制备方法，其特征在于该方法中大孔吸附树脂型号为D101、AB-8或NKA-9中性或低极性吸附树脂。
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