CN101389764A - 担子菌类真菌的糖组合物作为抗病原体的杀虫剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了通过培养真菌培养物所产生的，为了应用至少部分纯化的包含寡糖的生物活性组合物。本发明的组合物具有抗细菌、抗真菌和杀线虫活性，因此可用来减轻这类病原体对生长中的植物的影响，减少植物表面和内部的这类病原体，和治疗这类病原体引起的动物和人感染。本发明还提供了从某些真菌培养物中产生这类组合物的方法。
Description
相关申请
本申请要求2005年8月1日提交的美国临时申请号60/704,824的优先权，以其全文纳入本文作参考。
技术领域
本发明涉及具有抗微生物和其它病原体活性的新型组合物；所述组合物产自担子菌类真菌的某些种。本发明提供了具有抗各种病原体生物，包括线虫、真菌和细菌的抗微生物活性的含糖组合物。本发明还提供了能使担子菌类真菌增量产生生物活性物质的培养条件，以及利用这些组合物保护植物免受植物病原体损害的方法之一。
背景技术
已知有些菌类具有毒性或致幻性。据报道，有些菌类产生的代谢产物具有抗线虫、或抗其它真菌种的抗微生物活性，以及抗某些人致病菌的抗细菌活性。例如，Coletto等人报道了某些担子菌类，包括硫磺菌培养物的滤出液兼具抗革兰氏阳性和革兰氏阴性人致病菌的活性。M.A.B.Coletto等人，“Basidiomiceti in relazioneall’antibiosi.Nota XI。Attivita antibatterica e antifungina di 25 nuova ceppi”，Allionia，第35卷，95-101(1997)(英文摘要)。Coletto还检测到一些真菌菌株具有抗植物致病真菌的活性。(同上)各种真菌产生的一些生物活性化合物的总结可参见Doctoral Thesis of Loreto Robles 
中所述，爱达荷州立大学，2005年3月。其中大部分化合物经特征鉴定是肽或萜类化合物：尚未报道过真菌生物活性糖。尽管美国专利号6,517,851和美国专利号6,048,714报道了含油培养基上培养的真菌产生的某些组合物具有杀线虫活性，还至少有一个报道表明硫磺菌能够产生已知具有抗某些昆虫和损害植物的疾病的杀虫活性的肉桂醛，然而对有关具有抗植物病原体活性的真菌代谢产物还是知之甚少。S.Rapior等人，“Volatile composition of Polyporus sulphureus”，Cryptogamie Mycologie，第21卷，67-72(2000)：英文摘要；和杀螨药样品标签上公开了其具有抗螨虫、蚜虫和白粉菌的活性。除了这些报道以外的各项研究揭示了某些担子菌类的结构可产生味道和气味挥发物，和已特征鉴定到这些真菌产生的一些多糖。参见例如S.Wu等人，“Characteristic Volatiles from Young andAged Fruiting Bodies of Wild Polyporus sulfurous”，J.Agricultural and Food Chem.2005，53，4524-28；和G.Alquini等人，“Polysaccharides from the fruit bodiesof Laetiporus sulphureus(Bull.：Fr.)Murr”，FEMS Microbiology Lett.230，47-52(2004)。由于各种真菌能产生多种生物活性化合物，它们应该是抗植物病原体活性天然产物的丰富来源。
担子菌类是极具多样性的真菌大家族，包括食用菌、有毒菌、尘菌，甚至微生物；许多都至少表现出一些生物活性。灵芝是一种担子菌，中医认为它能产生起免疫调节作用的物质。Bao、Wang、Dong、Fang& Li，“Structural features ofimmunologically active polysaccharides from Ganoderma lucidum”，Phytochemistry，59，175-81(2002)；Su等人，“Fungal mycelia as the source of chitin and polysaccharides andtheir applications as skin substitutes”，Biomaterials，18，1169-74(1997)。除了免疫调节化合物外，一些灵芝类还具有杀菌活性。灵芝类(灵芝(G.lucidum)、G.pfeifferi和G.resinaceum)的粗提物还能抑制枯草芽孢杆菌的生长。Suay等人，“Screening ofbasidiomycetes for antimicrobial activities”，Antonie van Leeuwenhoek，78，129-39(2000)。然而，尚未报道过这些真菌来源的寡糖具有抗微生物活性。
据报道，担子菌类代谢产物具有有限的抗真菌活性。蚝蘑(Pleurotus ostreatus)能抑制黑曲霉菌(Aspergillus niger)的生长。Gerasimenya等人，“Antimicrobial andantitoxical action of edible和medicinal mushroom Pleurotus ostreatus(Jacq.:Fr.)Kumm.extracts”，Int.J.Med.Mushrooms，4，106(2002)。泊瑞斯(Poriales)成员之一的Gloeophyllum sepiarium具有抗酿酒酵母(S.cerevisiae)和烟曲霉(Aspergillusfumigatus)的拮抗活性(Suay等人，2000)。据报道，树舌灵芝(Ganoderma applanatum)能抑制Armillaria luteobubalina的菌索生长。Perch，M.，“In vitro interactions betweenArmillaria luteobubalina and other wood decay fungi”，Mycol.Res.94，753-61(1990)。因此，据许多报道称，担子菌类的代谢产物能抑制异源真菌的生长，但几乎未报道过其实际具有的杀真菌活性，或利用它来保护培育的植物或真菌免受其它真菌的损害。
由于菌类常常是寄生性的，因此很少报道其代谢产物的杀线虫活性。然而，最近，美国专利号6,517,851和美国专利号6,048,714报道了某些真菌培养物的杀线虫活性。此外，据说，一种称为“Maui LCF”(LCF代表“液体混合肥因子(Liquid compostfactor)”)的商品肥料产品能使一些植物对线虫产生耐受性。Maui LCF是在含有植物衍生物质包括菠萝、木瓜和甘蔗的培养基上生长的硫磺菌(L.sulphureus)所产生的肥料。它能使植物更健康，和减少植物对农药的依赖。Economic Development of Hawaii， “Activities Underway in 2003”，于http://www.epa.gov/oppbppd1/PESP/publications/vol6se/IIIF-edah.htm在线提供。将植物物质在水中混合，对得到的液体进行加热使蛋白质变性，然后过滤掉固体，售卖未经进一步纯化的该褐色溶液。将MauiLCF施用到植物或种子需要加入肥料或肥料添加剂的土地上；它能提供营养物质和调节植物生长所需的化合物，但不归类为杀虫剂。一些报道称，Maui LCF具有显著的杀真菌活性：尽管有加热会破坏Maui LCF的杀真菌活性的实验证据，但所观察到的杀真菌活性应该归因于对各批Maui LCF的“烧煮不足(undercooking)”。
因此，担子菌类真菌能产生多种具有有用生物学活性的分子，但尚未被广泛研究过能否作为植物保护剂的来源。而且，几乎不知真菌具有抗植物病原体的生物活性，尤其是抗植物细菌活性。尽管昆虫和真菌疾病对农业和观赏植物的破坏性影响大得多，但植物的细菌性疾病每年也会造成数十亿美元的损失，几乎没有很好的针对性治疗手段。抗植物细菌的抗菌剂，尤其是衍生自天然产物的抗菌剂将极具价值。
本发明提供了新型的具有抗菌性能可用于保护植物的担子菌类真菌产生的糖或寡糖化合物和组合物。还提供了由担子菌类真菌培养液制成的混合肥汤：该组合物汤的特征尚未完全鉴定，但能保护植物和它们的果实或蔬菜产品不受植物病原体的伤害，能使它们从病原体所致伤害中更快恢复。这些化合物和组合物具有抗植物病原体，包括细菌、真菌和线虫的抗微生物活性，由于它们可以作为抗菌剂而抑制或杀死导致植物疾病的细菌，因此极具价值。这些抗菌组合物还具有木材防腐活性，能防止白蚁和/或真菌对木材造成的伤害。
发明内容
本发明提供了某种担子菌类真菌产生的新型抗微生物性含寡糖或糖的抗菌组合物。具体说，它提供了某些担子菌类包括灵芝和硫磺菌类产生的含有糖质的新型组合物，和利用它们保护栽培植物和植物产物的方法。它还提供了通过种植担子菌类真菌培养物来生产这类组合物的方法，包括大规模制备中增加生物活性物质产量的方法。
本发明还提供了由担子菌类培养物所产生的混合肥汤。所述汤可以含有多种具有植物保护活性和其它有用的抗病原体微生物活性的活性因子，可以采用如灭菌或过滤除去细胞物质这类方法，或采用其它浓缩方法如反向渗透法进行部分纯化。本发明还提供了生产产品活性更高的本文所述组合物的方法，包括优选的培养液和生长条件。
尽管已经生产和利用了被称为Maui LCF的硫磺菌类衍生物质(LCF表示液体混合肥因子，以收集自硫磺菌(L.sulphureus)培养液的褐色粗溶液形式出售)的植物生长调节和植物营养(肥料)作用，但目前发现采用改良的方法培养和加工相同和其它担子菌类真菌的培养液，生产的产品能出人意料地控制植物病原体和其它病原体，同时避免过度刺激对植物生长的不利影响。本发明组合物保留了这些活性而不会像现有技术的粗制组合物那样使植物/植物产品褪色。本发明新型组合物的副作用降低，当用于抗植物病原体时对植物或植物产品造成的伤害少，可提高产量和作物的质量，可加速受病原体包括真菌、细菌和线虫伤害的植物或果实的恢复。可以将所述组合物直接施用于待处理的叶子和/或植物产品和/或果实或蔬菜，或施用于例如毗邻植物或植物根部的泥土。
本发明的某些组合物能提供抵抗可引起高等动物疾病的微生物的抗菌活性，因此可用所述组合物来杀死或阻止这类非植物病原体的生长。为了用于抗非植物病原体，可采用本领域已知方法将所述组合物给予待治疗的哺乳动物，或者将它们施涂于待处理的表面。它们可以，例如，通过给予待治疗或需要保护以免受病原体伤害的动物有效量的本发明组合物而进行体内施用。或者，可以将所述组合物施用于怀疑受到这类非植物病原体污染的表面，或施用或混合进可能成为病原体的生长介质的液体如静水中。同样，还可以将它们用于可能成为病原体载体的昆虫或其它运载体上，或这类昆虫或其它运载体的活动范围内。后一方式能通过减少动物无论是通过直接接触病原体或通过载体递送病原体而接触到的病原体的数量和/或活力，来降低动物受感染的可能性。
本发明的组合物可以包括多种活性物质，因此可以通过多种机制进行作用。因此，本发明提供了衍生自担子菌类培养液的自新型抗菌组合物，能够积极地抑制各种不同的植物寄生菌和其它病原体的生长，或者诱发植物对一种或多种病原体的全身抗性，或诱发植物对病原体造成的伤害的耐受性。可以使用所述培养液的粗制物，或通过运用已知的纯化方法从所述培养液中提炼活性组合物。所述组合物的抗植物寄生菌活性具有新颖性，含有抗菌化合物的部分纯化组合物也具有新颖性。
对大多数真菌进行检测的观察得到，灵芝(G.lucidum)和硫磺菌(L.sulphureus)的培养液液还具有杀真菌活性。所述活性在常态下稳定(bench stable)(当接触空气时在室温下稳定)，但不耐热，表明该活性与杀菌活性的性质不同。一些报道揭示了有些菌类对多种植物致病性真菌具有杀真菌活性。然而，之前尚未报道过灵芝(G.lucidum)或硫磺菌(L.sulphureus)的杀真菌活性能够抵抗本次研究所采用的病原体。
此外，本发明组合物的杀菌作用可用于木材防腐。当将所述组合物用于遭白蚁损坏的木材时，它可以阻止木材被白蚁消耗(拒食素活性)或使消耗木材的白蚁受伤或死亡(杀白蚁活性)。不受操作理论的束缚，可能是由于所述组合物对白蚁消化纤维素所需的共生菌具有毒性而产生该作用。因此，所述组合物能为木材提供天然的保护，使之免遭白蚁还有腐木真菌的破坏。所述组合物可生物降解，是常用于保护木材的具有潜在危害性的砷、铜和铬化合物的一种安全替代，比许多商品化杀白蚁药毒性更小。
本发明组合物还可以控制影响高等动物的病原体，包括真菌和微生物，如锥虫和其它原生动物或细菌。可以用所述组合物杀死或控制供养和传染这类微生物的宿主或载体内感染器官中，和怀疑受此类微生物感染的物体内部或表面上的微生物的生长。可以用常规方法施用或递送所述组合物。为了向对象如人施用，可以采用本文所述方法由硫磺菌(L.sulphureus)或灵芝(G.lucidum)培养物中制备浓度约为30白利糖度(brix)的组合物。通常，可以将它稀释成10-100倍，然后经口服或胃肠道外途径向对象施用；给药途径取决于待处理病原体的类型，对这类方法的选择属于本领域普通技术。可能单剂就有效，但通常需要给予对象至少两次剂量，和待处理对象常常需要每天1剂，给予2-7天。
为了施用于需要控制病原体的物体表面或物质内部，可以制备如上所述的组合物，然后以1:100-1:2,000的比例稀释，之后采用常规方法直接用于待处理的表面或内部。
还可以将所述组合物用来治疗或控制真菌和寄生虫，如癣、绦虫等的感染。对病原体如癣、皮肤感染、趾甲真菌、脚癣等可以采取皮肤给药来完成这些治疗：可以将所述组合物直接施用到感染区域，或者与运载体如DMSO共同施用来促进不然会缓慢透过皮肤的化合物的透皮递送。为了这些应用，有时需要将本发明的组合物进行浓缩，如将硫磺菌(L.sulphureus)或灵芝(G.lucidum)的培养物制成的组合物干燥或使之接近干燥，然后将样品溶解或悬浮于可用于皮肤施用的溶剂或溶剂混合物中，如乙醇或异丙醇和水的溶液，或DMSO。可以重复施用直到见到疗效。
由于这些组合物成本低和毒性小，它们适用于治疗无遮盖的表面；水，包括饮用水供应、地表水和井；和其它可能会受到污染的表面或区域。施用所述组合物可以减少动物或人接触这类表面上或这些物质内的感染性病原体的机会。
所述组合物的抗致病性活性还可用来延缓能使哺乳动物，包括人生病的细菌、线虫和原生动物等的生长或将其杀死。已经知道，所述组合物具有抗能引起人类疾病，包括疟原虫的活性。因此，可以通过杀死或使宿主体外的病原体停止生长，或者通过将所述组合物施用于能帮助病原体传播的宿主或载体器官来将所述组合物用于治疗动物和人的这类疾病，防止此类疾病传播。可以用该组合物的部分纯化形式来治疗或预防此类疾病，可以通过常规方法进行施用。
用于治疗动物和/或人的组合物的制备可以包括另外的纯化步骤，如超滤来保证无菌，可以包含添加成分，如稳定剂和/或防腐剂来使它们维持适用于医疗。
本发明的另一个方面是选择能使本发明生物活性组合物的产生增加的生长介质。例如，灵芝(G.lucidum)和硫磺菌(L.sulphureus)培养液具有杀线虫活性。可以通过在适当的培养液中进行栽培而使该活性增强。例如，当使用PDB(一种常规生长培养液，马铃薯右旋糖肉汤(培养液))来产生具有生物活性的培养液时，其杀线虫活性显著低于在特殊的富含肉汤的培养液(RBM)中生长的培养液中所观察到的活性。用RBM作为生长培养液能增强生物活性的现象在灵芝(G.lucidum)和硫磺菌(L.sulphureus)产生的培养液中均能观察到。RBM是一种含有包括玉米面筋、糖蜜、燕麦片、酿酒酵母、植物油、蔗糖等不同碳源的富营养的培养液。而PDB只含有马铃薯淀粉作为主要碳源。
本发明提供了抗微生物寡糖或包含它们的组合物的制备方法，所述方法包括使担子菌类真菌在基本是液体的培养液中生长。所采用的培养液对生物活性寡糖的产量具有显著影响；因此，本发明的另一个方面是所述生长培养液的组成，可以仔细选择生长培养液来改变代谢产物内容，从而改变组合物的生物学活性。还提供了浓缩和/或部分纯化本发明的活性形式的组合物的方法，包括不过度加热以保持生物活性的浓缩活性物质的方法。本发明的所述组合物可施用于活的植物或施用于这类植物生长地点，以减少植物病原体的生长。还可以例如通过将它们与基本上没有土的栽培植物的水培培养液混合，而将它们用于处理或补充进待保护植物所生长的培养液中。即使所述组合物不能消除病原体，还可以利用它们减轻病原体对受感染植物和植物产物的不良影响；看起来它们是通过全身性活化植物的天然防御机制来增强其病原体抗性或损伤耐受性来实现该目的。因此，本发明的另一个方面包括利用这些化合物和组合物减轻病原体对植物和植物产品的不良影响的方法。
附图简要说明
图1显示了用于分析的灵芝(G.lucidum)培养液中的活性成分的GC-质谱描图。
图2显示了图1的GC-质谱中的一个峰的质谱。
图3显示了图1的GC-质谱中的一个峰的质谱。
图4显示了图1的GC-质谱中的一个峰的质谱。
图5显示了灵芝(G.lucidum)和硫磺菌(L.sulphureus)的pH依赖性生长速率。
图6显示了灵芝(G.lucidum)和硫磺菌(L.sulphureus)的温度依赖性生长速率。
具体实施方式
本文采用术语“糖”和“寡糖”是单糖或单糖衍生物至少占50重量％的任何化合物。“寡糖”包含至少5个单糖的直链或支链糖或其衍生物，而糖包括单糖和二糖和较短链单糖及其衍生物，和寡糖。
单糖之间的连接键类型不重要，只要各连接键都含有一个醚基团。单糖衍生物包括氨基糖、O-酰基糖、脱氧-糖等。除了单糖链或其衍生物外，“糖”或“寡糖”还可以包括其它化学结构特征。本文采用的“糖”主要包括单糖，即，所述化合物分子量中的单糖基团至少占50％；糖中所述单糖基团或其衍生物可以却不必须是直链或支链。
所述抗菌组合物至少包含一种具有稳定的蛋白酶活性和寡糖结构，总分子量约为2,000-5,000的生物活性化合物。所述组合物是通过栽培担子菌类真菌所得到的至少部分纯化的产物，采用此组合物是因为其具有抗细菌、真菌和线虫植物病原体类型中的至少一种，或者抗能感染高等动物的病原体，包括细菌、真菌、线虫和各种寄生虫中的至少一种抗微生物活性。
如果本发明的化合物和组合物能使感兴趣的具体菌种的生长减缓至少50％，或者如果它们对至少一种栽培植物或植物产物具有统计学上显著的保护作用，则认为它们具有“活性”。因此，例如，如果所述组合物具有抗至少一种植物病原体细菌的活性，则它们作为植物杀菌剂具有活性。
如果化合物和组合物具有抗至少一种植物病原体细菌、真菌或线虫的活性，则它们具有本文所采用的“抗微生物性”。
在一个方面，本发明提供了某些可用来保护植物、植物产物和真菌免受各种植物病原体的不良影响的化合物和组合物。本发明的所述组合物包括担子菌类真菌产生的抗微生物性寡糖。所述寡糖化合物以其结构为特征，以它们的物理特性、稳定性和生物活性，尤其是它们的抗植物致病性细菌、真菌和线虫的抗微生物活性，和以其制备方法进行更完整的限定。
在另一方面，本发明提供了利用至少一种担子菌类真菌制备某些生物活性化合物和组合物的方法。所述方法包括使真菌在基本上是液体的含有碳源和其它营养物质来维持真菌生长的培养液中生长。所述真菌往真菌所生长的培养液中排出至少一种生物活性化合物。因此，本发明提供了使担子菌类真菌生长而在培养液中积累至少一种抗微生物性代谢产物的方法，由此来制备本发明的组合物。
在另一方面，本发明提供了利用这些生物活性化合物和组合物来减少各种病原体对植物、植物产物或真菌如栽培作物、观赏植物、树木和攀爬植物和菌类的有害作用。所述方法包括使待保护的植物、植物产物或真菌或其所在地或其生长培养液接触如本文所更完整描述的化合物或组合物。
本发明还提供了对培养液进行加工处理以产生具有本文所述可用浓度生物活性物质的汤料或其它精制组合物的方法。这些方法包括使所述真菌在本文所述的培养基上生长，在一些实施方式中，所述培养基含有至少约10％的果汁，采用浸入或与生长培养基接触的生长小室来提供除容器本身表面外的另外的支持菌丝体生长的表面。这些表面能使菌丝体更多更快地生长，从而使所述组合物的活性成分增产；因此有可能在一定的培养体积中更快地生长出真菌培养物，从而产生质量更高的活性组合物。通常，包括容器在内的总生长表面面积至少为约50cm2/L培养液，优选至少100cm2/L培养液，或至少约200cm2/L培养液，通常每个容器的体积至少为约100L。理想的是，额外表面面积使每升培养液所提供的表面面积相比只有容器增加了至少50％。采用这些方法，所述培养能产生更多的活性寡糖组合物，因此，给定体积的培养液产生的组合物的活性更高。一些这类方法中，在生长期间要在基本上不搅到菌丝丛的情况下混合或搅拌该肉汤培养液。尽管通常情况下该生产方法并不复杂，该改进的方法却能增加产量和更好地利用产生本文所述组合物所需的空间和时间。
能产生本发明的化合物和组合物的优选真菌为担子菌类，一类与植物共存和依赖植物进行生长的真菌。担子菌类具有许多不同的形式：包括靠死亡植物物质存活的种类，包括尘菌和一些“典型”的菌类，其中有些是可食用的，而有些则具有相当的毒性；还包括微型真菌，尤指锈菌或黑粉菌，它们对各种农作物和植物产物造成严重的经济损害。本发明的一些实施方式中优选采用硫磺菌类种的担子菌类，它们尤其适用于产生具有抗菌活性，包括具有抗引发疟疾、利什曼病和其它疾病的原生动物；能引发查加斯病的锥虫、能引发丝虫病、象皮病的线虫和犬恶丝虫等；和其它能影响人和家畜的病原体活性的组合物。有时优选硫磺菌(L.sulphureus)，因为它具有帮助生长的习性。一些实施方式中优选灵芝种，有时优选灵芝(G.lucidum)。
尽管有些担子菌类真菌生长于死亡植物的腐烂残渣上，目前发现担子菌类真菌，尤其是那些基本上生长于培养液中的担子菌类真菌，能产生对保护植物生长，使其免受许多病原体，包括细菌、真菌和线虫的有害影响有用的化合物。
能产生本发明化合物和组合物的优选担子菌类是灵芝类。具体说，灵芝，生长于腐烂的树木残渣上的种类，当在富含有机物质的水培液中培养时，显示能产生显著数量的本发明的生物活性物质。而且，可以从灵芝(G.lucidum)所生长的培养液中制备活性组合物，可以通过采用本文所述合适的生长条件来提高培养液中活性组分的滴度。
另一种可用于本发明的优选担子菌类是硫磺菌类，具体是硫磺菌类。“磺化支架”或“琢食木材”硫磺菌类，是一种硬木树的伤口寄生菌。通常可以在夏威夷的大叶桉(Eucalyptus robusta)树上找到。通常，它也可以在培养液中生长来产生本发明的组合物。
担子菌类家族的其它属的成员也可用来根据本发明产生生物活性寡糖，它们包括：
伞菌目(Agaricales)
蘑菇科(Agaricaceae)
牛肝菌科(Bolbitiaceae)
珊瑚菌科(Clavariaceae)
鬼伞科(Coprinaceae)
丝膜菌科(Cortinariaceae)
粉褶菌科(Entolomataceae)
牛舌菌科(Fistulinaceae)
轴腹菌科(Hydnangiaceae)
马勃科(Lycoperdaceae)
小皮伞科(Marasmiaceae)
鸟巢菌科(Nidulariaceae)
侧耳科(Pleurotaceae)
光柄菇科(Pluteaceae)
球盖菇科ophariaceae)
口蘑科(Tricholomataceae)
牛肝菌目(Boletales)
牛肝菌科(Boletaceae)
圆孢牛肝菌科(Gyroporaceae)
网褶菌科(Paxillaceae)
硬皮马勃科(Sclerodermataceae)
乳牛肝菌科(Suillaceae)
鸡油菌目(Cantharellales)
鸡油菌科(Cantharellaceae)
锁瑚菌科(Clavulinaceae)
齿菌科(Hydnaceae)
花耳目(Dacrymycetales)
花耳科(Dacrymycetaceae)
外担菌目(Exobasidiales)
外担菌科(Exobasidiaceae)
刺革菌目(Hymenochaetales)
锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)
Schizoporacea
鬼笔目(Phallales)
钉菇科(Gomphaceae)
鬼笔科(Phallaceae)
丛枝瑚菌科(Ramariaceae)
多孔菌目(Polyporales)
拟层孔菌科(Fomitopsidaceae)
灵芝科(Ganodermataceae)
褐褶菌科(Gloeophyllaceae)
彩孔菌科(Hapalopilaceae)
Meripilaceae
皱孔菌科(Meruliaceae)
Phanerochaetaceae
柄杯菌科(Podoscyphaceae)
多孔菌科(Polyporaceae)
齿耳菌科(Steccherinaceae)
红菇目(Russulales)
耳匙菌科(Auriscalpiaceae)
刺孢多孔菌科(Bondarzewiaceae)
猴头菇菌科(Hericiaceae)
Lachnocladiaceae
红菇科(Russulaceae)
韧革菌科(Stereaceae)
目革菌目(Thelephorales)
Bankeraceae
革菌科(Thelephoraceae)
银耳目(Tremellales)
黑耳科(Exidiaceae)
银耳科(Tremellaceae)
可以通过使至少一种担子菌类真菌在各种培养条件中的任何一种下生长来产生本发明的生物活性化合物和组合物。本领域已知一些合适生长担子菌类的条件，而本文则描述了至少适用于某些物种的优选条件。具体物种的生长条件和生物活性进行优化的方法属于本领域普通技术，采用如本文所述的试验方法来筛选具有对感兴趣的具体活性而言合适的属性的培养液。
所述组合物可以在任何能使所述真菌以合理速率生长的条件下产生。然而，已经显示有些培养液成分和生长条件能使生物活性寡糖和其它生物活性物质增产。确定灵芝(G.lucidum)和硫磺菌(L.sulphureus)在静止条件下产生菌丝体的优化的生长条件。据观察，2000ml Erlenmeyer烧瓶、pH值3.0和温度30℃时产生的菌丝体浓度最高。这些结果与Yang等，(1998)所报道的结果不同，他们发现在摇动条件下培养灵芝(G.lucidum)的优化条件是pH4.0和温度35℃。Yang和Liau，“Effect of cultivatingconditions on mycelial growth of Ganoderma lucidum in submerged flask cultures”，Bio.Eng.19，233-36(1998)。本文所提出的使这些真菌生长的培养条件对产生抗微生物化合物非常有效。
还观察到灵芝(G.lucidum)和硫磺菌(L.sulphureus)的培养液也具有能抵抗所检测的大多数植物致病性真菌的杀真菌活性。该活性在室温下的水溶液中很稳定，却不耐热，表明这种活性与杀细菌活性具有不同的性质，这有可能是由粗制培养液中的化学种类不同所造成的。据一些报道称，有些种类的菌类对多种植物致病性真菌具有杀真菌活性。然而，尚未有报道提到过灵芝(G.lucidum)具有抗本文用到的病原体的杀真菌活性，可以认为这是对硫磺菌(L.sulphureus)的这类活性的首次报道。
灵芝(G.lucidum)和硫磺菌(L.sulphureu)的培养液还具有杀线虫活性。可以在营养丰富的培养液中进行培养而增加该活性。例如，当利用PDB来产生具有生物活性的培养液时，其杀线虫活性显著低于用RBM产生的培养液。RBM是一种营养丰富的培养液，含有各种碳源，包括玉米面筋、糖蜜、燕麦片、酿酒酵母、植物油、蔗糖等。而PDB只含有马铃薯淀粉作为主要碳源。
本发明组合物还具有抵抗感染动物，包括人的抗病原体活性，包括具有抗引发疟疾、利什曼病和其它疾病的原生动物；能引发查加斯病的锥虫、能引发丝虫病、象皮病的线虫和犬恶丝虫等；和其它能影响人和家畜的病原体，包括炭疽、黄热病、登格热、日本脑炎、天花、霍乱、利什曼病和结核病活性的组合物。例如，已经发现，用硫磺菌类培养液的30白利糖度糖浆进行1:2000稀释可以杀死约一半与其接触的疟原虫。可以用“短时煮沸”进行加工产生30白利糖度的糖浆，即除去不溶性物质后，将组合物仅加热煮沸数秒，然后在约170℉时小火徐沸直到浓度达到30白利糖度。施用这些组合物来将抗病原体性活性物质进行体内递送的方法为本领域已知，包括常规方法，如口服递送液体或固体形式的本发明组合物、如通过IV进行静脉内递送，和胃肠道外或肌肉内注射浓缩溶液。针对这类组合物的合适的制剂方法为本领域已知，例子如《雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)》，第18版中所述。
在一个方面，本发明提供了能使本发明生物活性化合物增产的生长条件和液体培养液。在一些实施方式中，所述生长培养液包括衍生自植物的糖，包括经加工的植物物质，如燕麦片、糖、马铃薯、琼脂等的水悬液。在一些实施方式中，所述培养液中还补充添加了植物油，如玉米油、芸苔油、或类似的植物油。对易于获得的便宜的物质进行特殊组合即能使抗微生物活性组合物增产；本文中指富含肉汤的培养液(RBM)。RBM通常是将以下材料在与水混合制得：燕麦片、酿酒酵母、玉米面筋、糖蜜、柠檬酸和芸苔油。优选的RBM混合物是通过将15g磨碎的燕麦片、15g酿酒酵母、15g玉米面筋、1茶匙糖蜜，2g柠檬酸和2ml芸苔油与1升水混合制得，然后经高压锅灭菌，再接种真菌。生长培养液所需的其它组分包括蔗糖、麦芽提取液、酵母提取液、马铃薯浸液、琼脂等。还可以采用果汁和经生长和加工的水果残渣来提供真菌的另外生长材料，改变水果成分的含量可以优化所述组合物的活性。
因此，在一个实施方式中，本发明包括担子菌类真菌在RBM或基本上相似的培养液中生长所产生的本文所述的组合物。优选采用的担子菌类品种包括灵芝(G.lucidum)和硫磺菌(L.sulphureus)。一些实施方式中，优选除硫磺菌类品种以外的担子菌类。
在另一实施方式中，使担子菌类真菌品种在马铃薯右旋糖肉汤，或基本上相似的培养液中生长产生含寡糖组合物。该培养液含有马铃薯浸液和右旋糖和pH值可以是约5.1或是针对具体申请进行优化的pH，这些为本领域所公知。
技术人员可以从本文所述的生长方法中明显知道培养液组分的组合，加入后可以为具体的真菌种类提供有助于其平衡生长的培养液的另外的物质，和其它类似的营养来源，将含有上述那些物质的培养液用来产生本文所述的生物活性组合物也属于本发明的范围之内。
在另一方面，本发明通过增加生长表面面积与培养液体积的比率为产生能加快培养液中的真菌生长速率和活性物质产生速率的真菌培养液提供了改进的方法。由于所述改进的方法将生物活性物质的产量最大化而减少所需的生长空间和缩短生产周期，因此它尤其适用于大规模生产。所述方法尤其适用于某种担子菌类菌种，包括硫磺菌类培养物。
一般来讲，为了产生大量的本发明组合物，需要在桶、筒、瓮或类似的容器中生长约30天形成培养物，然后培养液中会产生大量的具有生物活性的物质；需要继续培养30-60天才能获得最多的生物活性物质。目前已经发现，在给定的培养液体积中，另外增加生长表面面积能加快真菌的生长速率和生物活性物质的产生速率。它还能缩短采用本文所述的培养方法生产一批液体培养液所需的循环周期。
生长表面面积是指可以支持菌丝体生长或使菌丝体附着的任何表面。提供添加生长表面是指提供除与容器本身有关的天然表面以外的任何表面，只要所述额外的表面能与培养液接触或靠近培养液，而使菌丝体可以在加入的表面上轻易生长。
用于产生大量本发明组合物的真菌培养物生长容器通常是以适于容纳含有真菌生长必需物质的水培液的材料制成的桶或瓮或类似容器。各种塑料、玻璃、PLEXIGLASTM、玻璃纤维和某些金属均为此类容器的合适材料。然而，通常当培养液深度超过数英寸时，这些容器的表面面积与体积的比值较小，已经发现当表面面积与体积的比值增加时，本发明的生物活性物质的生长和产生速率也增加。在大规模生产时，优选尽可能增加培养液的深度来最大程度地利用生长空间和光线，从而每批生产出尽可能多的培养液。许多适于产生本发明组合物的真菌培养物可以在深度超过数英寸的培养液中有效生长，当然，通常表面面积与体积的比值随培养液深度增加而减小。通常提供一些空间更有利于菌丝体簇伸展，而增加可用表面面积则有助于菌丝体簇的生长。因此，目前已经证明，在提供添加生长表面的情况下，当培养液深度超过数英寸，则培养物的生长速率和本发明生物活性物质的产率均增加。
因此，在某些实施方式中，本发明提供了通常为基本上垂直的，从生长培养液表面或其上方穿过生长培养液表面向下延伸进入培养液，至少一部分延伸至所述真菌培养物所生长的容器底部的额外生长表面。在一些实施方式中，通过将这些部件悬挂在培养液表面上方，使其下垂浸入培养液中来提供所述额外的表面面积；或者，由悬浮于培养液表面或由悬浮于培养液表面的材料所支撑的表面来提供额外的表面面积。在其它实施方式中，所述结构提供了从容器侧面或底部延伸进培养液的添加生长表面，它们通常会延伸穿过培养液表面向上延伸到培养液上方来提供培养液上方的但与培养液相接触的添加生长表面。最有利的结构是从培养液表面向上延伸，从而所述添加生长表面能与培养液相接触来直接保留培养液或保留延伸进培养液中的菌丝体，同时还能接触空气。
通常，添加生长表面的形状是棒状、平板状、条状、管状或柱状；它们还可以是延伸自容器侧面和/或底部的片状突起。在一个实施方式中，所述添加生长表面是悬挂于用来盖住生长真菌培养物的筒或桶或其它容器的盖子上的多个例如PLEXIGLASTM平板。或者，可以使所述平板例如以纵横交错的方式相互连接，至少有一种相应的结构可以延伸自容器的底部或侧面，当如此悬挂时，能稳定所述添加生长表面结构，改进其稳定性。由于一旦建立了所述生长支持物后移动它会损伤真菌，因此使所述添加生长表面保持相对静止有利于真菌的生长。尽管本改进方法的有些优点无需知道，但使所述添加生长表面在大部分生长期间均保持相对静止在通常情况下都是有益的。然而，所述添加生长表面的形状，和它是如何支持或固定的并不重要，只要它能为菌丝体的生长提供可供粘附的表面面积即可。
所述添加生长表面由适于支持真菌在培养液表面以上和/或以下生长的材料制成。它可以包括一种或多种这类材料，可以采用与容器相同的材料或者不同的可兼容的材料。或者，用于所述添加生长表面的材料可以经过砂磨、刮擦、刮削或其它方法而使其粗糙，使真菌能够粘附上和“爬上”所述添加生长表面。在一些实施方式中，所述表面是相对平滑的固体，如玻璃或PLEXIGLASTM，它便于进行垂直刻蚀、开槽或刮擦：这些方式能帮助真菌向培养液上方生长，可以提供一定程度的毛细管作用使水份往培养液上方流动，进一步促进真菌的生长。除了固体表面外，所述添加生长表面还可以包括可以是由例如塑料或玻璃纤维制成的多孔或吸附材料，例如布、海绵或垫子；或者可以是打孔平板或网格或筛网。
添加生长表面的优选材料需要适于长期接触用来维持真菌生长的生长水培液；通常包括与用来构建培养物生长容器的材料相同的材料。例如不锈钢、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龙、聚氯乙烯、玻璃纤维、聚氨酯和TEFLONTM均可以被采用。不锈钢网或筛网效果良好，聚丙烯垫、经处理的聚氨酯泡沫塑料如声学材料和TEFLONTM也同样。这些材料中的每一种在有些时候都可以成为优选材料。可以采用这些材料和它们的性状和质地的组合，还可以与不同的固定方法组合。
本发明另一方面提供提供了一种由真菌消化植物来源有机物产生的混合肥汤。所述混合肥汤通过使植物物质的水悬液与担子菌类真菌混合通常数周或更长时间，部分纯化该产物所得到的基本上不含细胞物质的活性化合物溶液。重要的是，为了从将该组合物应用到叶片或果实中获得某些益处，制备组合物的处理过程中不能将这些材料加热到高于约50℃或高于70℃或高于90℃，原因是这样加热会减少或破坏一些能提供抗真菌和/或杀线虫伤害保护的生物活性物质。这些植物保护性组合物可以用于植物叶片，也可以直接用于某些农作物，包括例如洋葱和木瓜，来减少真菌对瓜果或蔬菜消费品的伤害，因而能改善产品外观和质量。
因此，在一个实施方式中，使含有菠萝、木瓜和甘蔗的生产和处理中获得的副产品的植物产品混合物与经处理的植物物质如延麦片、小麦面筋和面包酵母组合，在如本文所述那些条件下在水悬液/浆体中煮解2-5周。制备出的混合肥汤无需加热即可使用，否则会破坏一些所需的生物活性。用常规方法分离出固体，或者用常规方法如超滤法除去高分子量的细胞衍生物质而进一步纯化该汤料。产生出的液体或者可以被进一步纯化，或可直接用于植物，如番茄植物的叶子或用于植物产物，如生长中的木瓜，来减少真菌对植物或植物产物的伤害。
本发明的其它方面提供了使真菌生长来产生富含所需生物活性组分的培养液。通常在产生本发明化合物和组合物的过程中，可以有利地使担子菌类在pH小于7，优选小于5的基本上是液体的培养液中生长从而增加生物杀灭性寡糖的产量。在一些实施方式中，使所述液体培养液的pH在大多数时间内或优选全部时间内均保持在4以下继续培养直到收集培养液。在其它实施方式中，使它的pH保持在3.5以下；在优选实施方式中，使培养液的pH在大部分培养生长期均保持在约等于3。可以采用任何生物相容性碱如氢氧化钠或钾来建立所述pH，根据需要选用合适的缓冲液来保持该pH。或者，可以采用能保持pH的pH计和自动化系统来防止显著偏离所需pH的发生。
培养温度也应该恒定才能使担子菌类真菌的生长最佳和获得最多的所需生物活性组分。尽管最佳温度取决于所生长的担子菌类品种和所采用的确切的培养液，大多数实施方式中优选的生长温度约为20-40℃。在一些实施方式中，在大部分培养生长期内，使所述温度保持在25-35℃，优选是约30℃或约30-35℃。尽管在这个范围内温度发生一些或高或低的偏差并不必然会破坏培养液或生长中的真菌，却可能会是培养液中所需的生物活性组分的产量减少，或者会使生长期延长。可以利用本领域熟知的恒温箱和加热和冷却系统使培养温度保持恒定。
可以通过例如搅拌或通入气体而使所述培养液不断翻滚。然而，在具体实施方式中，所述培养液并不翻滚。相反，使它保持非常浅的悬液状态，其中培养物不超过约1-6英寸深，或约2英寸，或约3英寸，或约4-5英寸深：当使用更深的悬液，和培养物深度显著高于6英寸时，可能需要一些搅动或通气。
为了大规模生产，往往优选搅拌培养液。当采用适当搅拌使生长培养液混匀和使培养液与菌丝体间的接触增加却不过分打扰菌丝体簇时，往往会在大规模生产中显著改善其生长。因为静止培养会使一些培养液离真菌太远而不能与之接触，因此不在菌丝体附近的培养液既不能为真菌提供营养也不能接受到含有感兴趣的生物活性化学物质的渗出物，因此此时进行搅拌培养较为有利。可以通过轻柔地搅动真菌生长的培养液或通过用生长培养液在培养液上方冲洗真菌长成物而实现所述混匀。在一些实施方式中，通过将生长容器底部或至少是处于特定生长期的大多数真菌生长物下方某处的的培养液带上在生长中的真菌上方将其散发的提升泵系统来实现。所述培养液可以被喷洒、滴落或喷射到生长中的真菌垫上，或从生长中的真菌上方足够轻柔地流下以免破坏其生长。还可以简单地以能够促进混匀的方式将它再次注入容器中，例如，可以将它从离泵系统所抽取位点足够远的位点处重新注入容器，从而净结果是在培养液内进行轻柔地流通。或者，可以使用液面下泵系统或混匀设备如搅拌机从下方轻柔地指导液体流动而不会碰到菌丝体簇内部或表面的菌丝体，就不会过度打搅垫结构。用这种方式，相对较小规模的生长培养就能产生巨大体积的含有本发明组合物的培养液。
额外生长表面的量并不关键：任何额外生长表面都能有些帮助。然而，通常需要增加至少约50％或100％或更多的可用表面面积。在一些实施方式中，例如，用208升的装有约113升培养液的圆桶来容纳培养物。垂直方向上，即直立站立时，其表面面积/体积比约为22cm2/L。当横放时，比例增加到约42cm2/L。然而，加入少许本文所述的额外生长表面材料的平板能容易地使可用表面面积翻倍或增至三倍；和使用多孔材料甚至可以增加更多表面面积。在一些实施方式中，优选提供额外生长表面使表面面积/体积比大于50cm2/L，或大于约100cm2/L。
根据具体所用真菌、生长条件和培养液，和培养液深度，可以优选不同材料和形状的这类额外支持表面和不同的液体混匀或重分配安排，当具体培养物的产量按比例增加时，有必要选择这些特征的恰当组合。本文所提供的进行生物检定的方法可用来确定哪种条件能提供最多数量的所需生物活性物质。因此采用本文所提供的生物检定所指导的常规实验，可以针对具体的培养物和/或生长环境优化这些参数。
优化感兴趣的生物活性物质的产量所需的担子菌类在液体培养液上的生长时间长度取决于各种因素，包括培养液、pH、温度和采用的真菌菌种。精确时间对成功产生生物活性组分而言并不关键，因为它们一旦产生，在培养条件下就基本稳定了。通常，生长期将持续至少数天到1周；在一些实施方式中，约是2周；和在有些情况下，最好可以持续培养约3周或约4周或长达约60天。在一些实施方式中，持续培养至少5周，在一些实施方式中，持续6周或更长。一旦生长期结束后，可以收集培养液，但是否马上收集液体并不是关键。
因此，在一个实施方式中，担子菌类真菌可以在温度约为30℃和pH约为3，不进行搅动和通气的条件下在RBM中，优选在小于约6英寸深的浅混合物中生长。在另一实施方式中，担子菌类真菌可以在温度约为30℃，pH约为3的含RBM或类似培养液的，具有根据本文所述提供的额外生长表面的桶、筒或瓮中生长，或者还可以采用搅动方法如上述那些方法。
使用前，通过从生长中的菌丝体簇上引流或倾析，或通过机械分离方法如过滤或离心除去大部分真菌生长物来收集所述培养液。通常来讲，使用前至少要对所收获的培养液进行部分纯化。在一些实施方式中，通过如沉积、过滤或离心或这些方法组合使用来除去固体。或者，还可以用已知方法如加热和/或过滤或超滤对所述溶液进行灭菌得到可能无菌的含有至少一种本发明的生物活性寡糖化合物的水溶液。优选地，通过在高达约100℃的温度下加热水溶液，或通过用膜如0.22微米膜进行过滤，或通过UV或γ照射进行灭菌。
还可以通过冻干或通过反渗透方法实现有效的灭菌。还可以联用分离和纯化方法来提供相对于粗发酵液至少是部分纯化的其它组合物。根据需要还可以采用本领域已知方法基于本文所提供的有关所述化合物结构和稳定性的信息进一步纯化培养液或其中的生物活性化合物。这样，提供了一种新型的具有有用的生物学活性能够保护植物免遭病原体损伤的部分纯化的组合物。
可以采用本领域已知的浓缩、调节密度、表面张力、粘性和其它机械特性方法来调节所述组合物液态时的浓度和处理特性。通常，对培养物发酵液的处理包括至少一次基于加热的浓缩步骤来减少组合物的体积和增加活性物质的浓度。在一些这类实施方式中，将所述组合物加热至沸腾并在一段时间内持续，优选不超过约4小时，和在一些实施方式中，将它煮沸1小时或更短以保留所述组合物的生物学活性。可以通过在较低的温度进行加热或通过其它常规方法而实现进一步浓缩。为了一些应用，将所述组合物加热到不高于90℃持续不多于1小时将其浓缩成浓度至少是10白利糖度，或至少20白利糖度，或至少约30白利糖度的浓浆。
本发明所述含有寡糖的组合物可以包含许多不同的化学物质，所述活性组分尚不完全由其化学结构所定义。所述抗菌化合物可溶于水或甲醇，但不显著可溶于二氯甲烷或乙酸乙酯。通过HPLC，利用ACPI检测器(化学电离)，所述化合物显示表观分子量为3000-4500。所述可溶于甲醇的物质包含多种组分，但所述抗菌活性物质是快速洗脱的高极化馏份。对所述活性组分进行质谱分析显示出寡糖的特征性片段模式：观察到各片段的分子量依次损失18个单位，对应于H2O的损失。
根据凝胶过滤柱确定的所述抗菌化合物的分子量为约4000-4500。因此，基本上可以用所述化合物的分子量和结构中存在构成大部分结构的某些单糖组分，以及它们的溶解性、稳定性和生物活性特征来限定其结构。
尽管不能排除还可能存在其它结构特征，本发明所述抗菌化合物主要是由少数普通单糖组成的寡糖结构。对经氯化三甲基硅烷进行硅烷化的所述活性化合物样品进行质谱分析也证明了这点。由于母体化合物的挥发性不够而无法显示，因此GC-MS只显示出单体；它提供了4个峰中每一个的质谱。将它们与质谱数据库中的数据进行比较，表明所述寡糖中还存在核糖、呋喃半乳糖和葡萄糖。如图1-4所示。核糖和葡萄糖均呈现出两个分离的峰，这可以由它们都是端基异构体混合物来解释。呋喃半乳糖是一种不天然存在于动物体内却广泛分布于病原性微生物中的糖(参见Beverley等人，《Eukaryotic Cell(真核细胞)》，1147-54(June 2005))；因此，本发明不受任何操作理论的限制，认为它存在于病原性组合物中与它们的作用模式有关。
存在的所述抗菌活性物质看起来不含有对它们的活性而言必需的肽键：当用已知的蛋白酶，蛋白酶K处理时，它们未表现出丧失了抗菌活性。在水培液中加热时，所述抗菌活性仍然稳定：将样品在水中在100℃煮沸1小时，或在室温下保存至少90天，基本上都不会削弱它的抗菌活性。然而，如上所述在水中加热确实会显著削弱所述组合物的抗真菌和杀线虫活性。因此，看起来所述组合物含有至少两种不同的活性化合物；而且，可以轻易地通过加热所述组合物的水溶液消除其杀线虫和杀真菌活性而将所述组合物的抗菌活性与其杀线虫和杀真菌活性分开。
认为本发明所述抗菌化合物含有普通单糖的寡聚体。尽管GC-MS数据无法确认其绝对的立体化学结构，也可以推定出这些都是D型异构体。无法从GC数据中精确地确定它们的比例，但数据表明活性寡糖含有一种或可能两种核糖单位，多种半乳糖单位，大部分还是葡萄糖。因此，认为所述活性抗菌物质是主要含有这些普通单糖部分的寡糖。
通常要对本发明组合物进行充分纯化，使之至少能够基本上不含细胞组分。这意味着采用本文所述的纯化方法基本上除去了水性培养液中的任何真菌衍生的不溶物质。在一些实施方式中，使用经过了过滤或其它处理(如，通过沉积、离心、透析等)基本上除去了所有存在的悬浮固体，包括真菌衍生的不溶物质和除去了尺寸大于约5微米的细胞和细胞碎屑的所述培养液，得到富含本发明生物活性化合物的水溶液。在一些实施方式中，对所述组合物进行处理除去尺寸大于约1微米的组分。
或者，通过超滤或通过凝胶层析、透析或其它常规方法对溶液进行处理，基本上除去超出某一尺寸，如细胞尺寸或如近似分子量为约100,000，或约60,000，或约40,000，或约20,000，或约10,000的所有物质。这些方法除去了感兴趣的所述生物活性化合物中的杂质，提供了新型和具有生物活性的可以进一步纯化或浓缩或可以配制用作杀虫组合物的部分纯化组合物。除去高分子量物质能减少对植物或果实应用不佳的或不需要的物质的数量以改进用于叶片应用中的水溶液。
这些组合物可以被进一步纯化，例如，通过用水不溶混有机溶剂抽提除去亲脂性和/或有色物质，或通过标准层析方法包括凝胶、正相和反相层析来减少将被用来处理植物的水溶液中的非活性或不良物质的量。还可以用其它常规方法如用木炭或其它吸附剂进行脱色除去杂质却不会大量地除去所需要的生物活性化合物来对它们进行部分纯化。本文采用的“脱色”，是指充分除去水溶液或悬液中的可溶性或不溶性有色物质，使水溶液的颜色显著变淡或改变其颜色。因为脱色能减少或消除对处理叶片或果实的染色现象，而改善叶片的光吸收和改善果实的外观和质量，因而为更好地叶片应用提供了材料。
本文采用的术语“亲脂性物质”是指能优先分散进水不溶混剂中的物质，可以通过用例如水不溶混溶剂将它们从水溶液中抽提出来部分或基本上全部除去。亲脂性物质的例子是在待纯化水溶液的pH时不带电的化合物，在该pH时，其log P大于约2或大于约3。“Log P”是指分子的辛醇/水分配系数的负对数，是评价亲脂性的熟知参数。本领域技术人员熟知测量或计算log P值的方法，同样熟知从水溶液中除去亲脂性物质的这类水/有机抽提方法。除去亲脂性物质在应用于植物或果实时能减少不佳的或不需要物质的量从而改善该用于叶片的水溶液。
本发明所述抗菌化合物的化学和生物特性与担子菌类真菌产生的其它产物不同。看起来，它们的分子量和溶解性和稳定性无法与担子菌类产生的任何已知生物活性物质相对应。首先，它们优先溶于水，在除醇以外的有机溶剂中的溶解性非常小：当将1克冻干培养液样品在2mL乙腈、氯仿或乙酸乙酯中摇晃2小时时，有机溶剂中的可溶性物质未显示出抗菌活性。因此，看来所述活性化合物不是萜类或其它基本上是有机类的代谢产物。第二，据显示在能消化肽的条件下用蛋白酶K处理对它们的活性没有影响。因此，看来所述生物活性化合物不含受蛋白酶影响的化学键—它们基本上不是蛋白质或简单的多肽。第三，据显示它们的分子量约为2000-5000。这使它们与一些真菌产生的具有免疫调节活性的分子量远远超过5000的β葡聚糖相区别。
看来，本发明所述抗菌化合物主要由寡糖组成，根据分子筛析色谱知道其分子量约为4000-4500。然而，当将灵芝(G.lucidum)的所述活性组合物样品置于分子量截取值约为3500的透析袋中时，所述活性物质能从袋中透析出来，在外部溶液中找到。这表明其近似分子量至多约为3500。利用质谱检测和化学电离将断裂发生减到最小的HPLC方法表明所述活性物质的分子量为3000-4500。如上所述，看来组合物中至少存在两种生物活性化合物，所述抗菌活性至少与一种或多种分子量为2000-5000，可能是3000-4500的糖类化学物质相关。
在另一方面，本发明提供了通过使真菌在支持其生长的培养液中生长，然后分离出含有培养液的水溶液或悬液形式的组合物的方法产生的组合物。本发明所述组合物含有至少一种具有上述结构和稳定性的活性化合物，可以通过各种步骤进行至少部分纯化，如过滤除去一些或基本上所有颗粒；抽提除去一些或基本上所有能显著溶于有机溶剂的物质；透析、分子筛析色谱或类似的方法除去基本上具有不同分子量的物质；离子交换树脂处理除去酸性和/或碱性组分；和用化学试剂如氧化剂、还原剂、螯合剂除去其它不需要的组分。或者，如果只需要抗菌活性的话，可以加热发酵液而消除其抗真菌和/或杀线虫活性，和然后可以通过常规方法包括本文所提到的那些进行部分纯化。
部分纯化过程中有需要的话，可以采用本领域已知的生物测定技术追踪感兴趣的所述生物学活性物质的存在位置来定位本发明所述生物活性化合物。因此，例如，可以联用各种常规纯化方法制备本发明的抗菌组合物，而通过分析抗至少一种植物寄生菌如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciuns)、发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)、燕麦嗜酸菌(Acidovorax avenae)、瓜类果斑病菌(Brenneria quercina)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、草生泛生氏菌(Pantoea herbicola)、皱纹假单胞菌(Psudomonas corrugate)、丁香假单胞菌(Psudomonas syringae)、小麦拉氏杆菌(Rathayibacter tritici)、地毯草黄单胞菌(Xanghomonas axonopodis)或野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)的抗菌活性追踪该活性化合物的效果。本发明的某些组合物能有效对抗这些病原体。可以进行纯化来获得任何所需的纯度水平，一直到和包括分离出基本上纯形式的所述活性化合物的。本领域技术人员熟知进行这类分离过程的方法，本文还概括了检测过程以便使用者能定位抗菌、抗真菌和杀线虫活性物质。除了简单的加热和过滤之外，采用这类纯化方法能得到部分纯化的新型的可用于植物或植物产物的抗菌治疗，或减少细菌和(如果不加热)其它植物病原体所造成的伤害的组合物。
用上述方法产生的部分纯化的物质可直接用于治疗生长中的植物或将要生长植物的培养液或地点或将要播种入种子的地点。或者，在纯化的任何截断，可以采用已知方法如蒸馏、蒸发或透析来浓缩化合物，产生浓缩的溶液、乳液、悬液、浆液或固体。然后，可以采用常规方法应用足以减少植物病原体，如细菌、真菌或线虫所造成的有害影响，或减慢或阻止这类病原体的生长或这类病原体所造成的伤害的数量的所述部分纯化的物质或其浓缩形式。
本发明组合物可以减少后者表面病原体所造成的有害作用，因而可用于培养植物和菌类。可以施用它们通过杀死或减缓微生物、真菌或线虫的生长而减少这类病原体的有害作用。可以采用常规方法运用所述化合物和组合物而将抗菌、抗真菌或其它杀虫物质用于生长中的植物，如行栽作物、树、藤本植物和观赏植物，或用来培育真菌如蘑菇。还可以将它们用于植物叶片或根部或者通过递送到植物或种子或它附近，如到它的生长培养液中，将其施用到生长中的植物或种子或新生幼苗。还可以将它们直接用于生长中的果实或蔬菜以减轻植物病原体对这些作物的伤害。运用组合物的方法，如本领域所熟知的这些，可以轻易地适用来应用本组合物。
通过常规方法如喷雾、撒粉或与递送到植物的灌溉或水培溶液混合而将本发明所述化合物或组合物应用于植物或其地点或生长中的果实或蔬菜。通过对施用到一种或多种植物上的组合物进行试验来确定要实现所需的作用所需要多少量来轻易地确定所述组合物的有效量。
许多目的下，单次应用可能就足够了。一些情况下，可能需要多次应用才能恰如其分地保护感兴趣的植物或植物产物。评估作物植物或植物产物状态和确定是否需要继续处理的实地考察方法是种植每种具体作物的农民所熟知的。
本发明的组合物可以与植物的生长培养液混合，如与植物生长所使用的混合肥或肥料或其它泥土改良剂混合。它还可以与水混合，采用高空或地面喷雾方法，通过滴落、喷雾或灌溉方法，或通过水培法递送而进行植物应用。这些方法是培育植物和真菌中熟知的方法，将这些方法适用于本发明组合物属于本领域的普通技术。
所述组合物往往无需纯化即可使用：基本上将培养液与生长真菌和细胞衍生的物质分离后的粗产物形式即可使用，或者当组合物将用于例如蘑菇时，可以加热使残留的真菌物质灭活和/或破坏其抗真菌和/或杀线虫活性。利用粗培养物发酵液或除去大部分真菌物质后的培养液的方法还属于本发明范围内。根据应用方法的不同，可以使用基本上除去了细胞衍生物质，或者浓缩后的或者经合适的物质如水或固体稀释的担子菌类所生长的粗培养液。
或者，可以在使用前或使用时往本发明组合物中加入佐剂，如表面活性剂、去污剂、肥料、植物生长调节剂、UV阻滞物等。在一些实施方式中，在用于生长中的植物前往所述混合物中加入铵盐如硝酸铵或硝酸脲铵。
使用前可以使本发明所述组合物基本上干燥，然后可以应用其再水合溶液或悬液，或应用它们的固体如粉尘，或与其它固体如粘土、砂粒、蛭石、混合肥或土壤或待保护植物或菌类的生长培养基。所述培养液还可以未经干燥即与固体混合，然后可以以浆液或悬液形式施用，或者可以通过蒸发使所述组合干燥，将生成的固体用于生长中的植物或菌类或它们所处位置附近来产生有益的作用。
或者，本发明所述组合物可以与含有一种或多种其它生物灭杀行或杀虫性物质如商品化除草剂、杀虫剂或杀真菌剂组合物的混合物一起或混合进其中进行应用。它们还可以与含有一种或多种植物生长调节剂或生长刺激剂的混合物一起或混合进其中进行应用。它们还可以与含有一种或多种肥料，尤其是能为耕种植物提供生物可利用的氮、磷、钾、微量营养素或铁的肥料的混合物一起或混合进其中进行应用。
本发明还提供了可能与已知的组合物(US 6,048,714；US 6,517,851)类似的杀线虫组合物；然而，由于改良了培养条件，本发明提供的组合物活性增强，还通过增强植物对线虫生长或线虫造成的伤害的抗性而具有了抑制植物上的线虫的生长，或抑制线虫造成植物或植物产物损害的能力。这些组合物能明显活化植物的天然防御机制以抵御线虫的生长或修改其防御反应而减少线虫的有害作用，即使当线虫数量很多时亦如此。与之前报道的专用于土壤的组合物不同，这些组合物适合应用于待保护的暴露的植物叶片或果实。
而且，因为该作用是植物介导性的，所需线虫抑制作用无需通过与线虫直接接触来获得。由于线虫通常位于土壤，影响植物的根系，施用现有技术化合物需要与线虫间发生有效的直接接触，这就需要直接将化合物递送进土壤。本发明组合物至少可以施用一部分到植物叶片上来提供保护，以抵抗线虫感染的某些有害作用。因此，可以将本发明组合物适用于未观察到线虫感染症状或证据的植物，作为抑制线虫的“免疫增强剂”在伤害性感染发作前保护植物免受伤害，它们还可以通过叶片应用方式进行施用，而必需直接接触目标线虫的化合物采用这种方式不会有效。
实施例
微生物菌株和培养条件
使真菌隔离群在马铃薯右旋糖琼脂(PDA，迪克实验室(Difco Laboratories)，密歇根州底特律市)上生长。细菌菌株，如根癌农杆菌(Agro6acterium tumefaciuns)、发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)、燕麦嗜酸菌(Acidovorax avenae)、Brenneriaquercina、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(Erwinia carotovora subsp.carotovora)、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、草生泛生氏菌(Pantoea herbicola)、皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugate)菌株0782-6、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv.syringae)、小麦拉氏杆菌(Rathayibacter tritici)、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestrispv.campestris B-24)菌株B-24或野油菜黄单胞菌小麦致病变种(Xanthomonascampestris pv.translucens)也在营养琼脂(NA，迪克实验室，密歇根州底特律)上生长。
在每升水含有3g酵母提取物、200g马铃薯浸出液、20g细菌培养用麦芽糖提取物、1g细菌培养用蛋白胨、60g蔗糖、15g细菌培养用琼脂、1茶匙糖蜜和3.75g磨碎的燕麦片的丰富固体培养基(RSM)中培养灵芝和硫磺菌(L.sulphureus)培养物。将该培养物接种到液体培养液(肉汤)中进行培养。进行肉汤培养时，使真菌在PDB中，或富含肉汤的培养液(RBM)中生长。本文采用的RBM每升水中含有15g磨碎的燕麦片、15g酿酒酵母、15g玉米面筋、1茶匙糖蜜、2g柠檬酸和2ml低芥酸菜子油。或者往往可以往培养液中加入另一种植物油。使用前通过高压灭菌法对所有培养液进行灭菌。
灵芝和硫磺菌类的优化培养条件
对表面通气、pH和温度条件进行评估建立灵芝(G.lucidum)和硫磺菌(L.sulphureus)的最优化液体生长条件。就表面通气而言，在含有100ml RBM的250ml、500ml、1000ml和2000ml埃伦迈尔烧瓶中进行固定烧瓶实验。然后在装有100ml RBM的2000ml烧瓶中进行温度和pH实验。就pH实验而言，通过加入1N HCl或1N NaOH将pH调节到3、4、5或6。为了确定最优化的生长温度，使培养物在含有100ml RBM的2000ml埃伦迈尔烧瓶中生长，在20℃、25℃、30℃和35℃培养成静态培养物。所有实验中，均将培养液在121℃灭菌20分钟和用5个1厘米的塞子(8号木塞穿孔器)接种25℃培养14天的旧RSM培养物。将进行表面通气和pH实验的烧瓶在25℃培育21天。
产生生物活性培养液
对灵芝(G.lucidum)和硫磺菌(L.sulphureus)生长的培养条件进行优化后，采用以下条件产生生物活性培养液。所述实验在含有200ml培养液的2000ml埃伦迈尔烧瓶中进行，因此限制了培养液的深度要小于约2-4英寸。在121℃对培养液进行20分钟的高压灭菌。冷却到约50℃后，用来自14天RSM培养物中的积极生长的5片菌丝体(用直径1cm的8号木塞穿孔器切割)接种烧瓶。将所述烧瓶在30℃下培育21天。培育后，通过4℃下14,000转离心15分钟收集培养液和用0.22mm滤膜(滤膜，伊索(
)，爱尔兰)进行过滤灭菌。检测培养液的抗各种细菌、真菌和线虫的抗菌活性。
菌丝体生长的最优化条件
培养介质的表面面积、pH和温度这些生长条件能影响灵芝(G.lucidum)和硫磺菌(L.sulphureus)菌丝体的生长。采用更大容器容纳给定体积的培养液来增加培养液/空气界面的表面面积致使两种真菌的生物量均增加。在2000ml埃伦迈尔烧瓶中25℃培养两种真菌(灵芝(G.lucidum)为1005mg/100ml和硫磺菌(L.sulphureus)为1090mg/100ml)21天后发生最大量的菌丝体生长。在250ml烧瓶中观察到最低浓度的菌丝体(灵芝(G.lucidum)为260mg/100ml和硫磺菌(L.sulphureus)为270mg/100ml)。500ml和1000ml埃伦迈尔烧瓶之间没有显著差异，呈现出类似的结果，其培养物均显著少于2000ml烧瓶。这些证明了浅生长培养液更为有利，通常该培养液不超过约6英寸深，优选其深度小于5英寸或小于4英寸。在一些实施方式中，所述培养液的深度不超过3英寸。
就较大规模生产而言，通常往大桶，如55加仑桶中填入约1/4-1/2的培养液，与待生长的真菌培养物一起培养。所述培养液和生长条件如上所述。通过将平板例如PLEXIGLASTM从上方悬挂进培养液来加快菌丝体的生长速率。
降低培养液的pH能有助于两种真菌的菌丝体生长(图5)。pH是3时在两种真菌(灵芝(G.lucidum)是680mg/100ml和硫磺菌(L.sulphureus)是770mg/100ml)中均可观察到最大量的菌丝体生长。在pH是4、5和6的培养液中，菌丝体生长超过30％，不如在pH是3时在两种真菌中所观察到的生长情况。在不同的温度下生长时，在30℃观察到对两种真菌均最优化的生长(图6)。
确定杀菌活性
检测培养液的如下抗菌代谢产物：将灵芝(G.lucidum)和硫磺菌(L.sulphureus)在马铃薯右旋糖肉汤(PDB)中产生的培养液经离心和过滤灭菌后与2X营养琼脂1:1(v:v)混合后装入90mm x 15mm皮氏细菌培养皿(Petri plate)。使病原性细菌在NA平板中于28℃生长24小时，在0.85％的盐水溶液中制成107CFU/ml(O.D.600＝0.5)的细菌悬液。待琼脂冷却后，将15μl的细菌悬液点于所述培养物过滤液平板上。28℃培养48小时后记录下生长，如下：
+＝全部生长抑制；
±＝轻度生长抑制；
-＝不生长。
确定杀真菌活性
检测生长于富含肉汤的培养液(RBM)中的灵芝(G.lucidum)和硫磺菌(L.sulphureus)的经离心、过滤灭菌的培养液的抗各种植物病原体的杀真菌活性。在所有实验中均将非接种RBM用作对照。将培养液和对照与熔化的2X PDA以1:1(v:v)混合后倒入50 x 9mm一次性塑料皮氏培养皿(Falcon，美国)。待琼脂冷却后，将单片(5mm2)新的活性生长中的菌丝体置于琼脂平板中心。在25℃培养平板5天。培养后，测量菌丝体克隆的直径(cm)，确定对真菌生长的抑制作用。报道结果以培养5后真菌菌丝体生长减少的平均百分比表示。
确定杀线虫活性
评估灵芝(G.lucidum)和硫磺菌(L.sulphureus)在补充有低芥酸菜子油或玉米油的PDB、RBM或RBM(RBMCO或RBMVO)中产生的培养液的杀线虫活性。所有情况下，均将非接种PDB或RBM(NI-PDB或NI-RBM)用作对照。用PDB或RBM中产生的培养液来确定产生生物活性杀线虫化合物的最佳培养时间，同时评估营养培养液对杀线虫活性的作用。利用补充有任一种油的改良RBM中产生的培养液评估油对产生杀线虫活性的作用。
通过将15条哥伦比亚根结线虫(Meloidogyne chitwoodi)线虫的J2幼虫置于直径为3cm的浅玻盘中的无菌双馏水液滴中以评估杀线虫活性。将线虫置于盘中后，在800μl体积中进行处理。将盘进行室温培养，培养6小时、12小时、24小时和36小时后记录结果。所述杀线虫活性的报道结果以36小时后死亡线虫的平均百分比表示。将线虫转移进含有新鲜无菌水的盘中并培养24小时来评估线虫的死亡率。将没有恢复活动的线虫报道为死亡。
观察杀细菌活性
在PDB和RBM中的灵芝(G.lucidum)和硫磺菌(L.sulphureus)的培养液中观察杀细菌活性。然而，RBM的渗透条件还会产生抑制区带，因此接下来的所有抗菌试验只采用PDB培养。灵芝(G.lucidum)和硫磺菌(L.sulphureus)均能产生强烈的抗发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)、根癌农杆菌(A.tumefaciens)、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚类(Erwinia carotovora subsp.carotovora)和丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv.syringae)的抑制区带。没有观察到抗洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和油菜单胞菌小麦致病变种(Xanthomonas campestrispv.translucens)的活性。可以观察到对Brennaria quercina和小麦拉氏杆菌(Rathayibactertritici)的轻度抑制。新鲜收集培养液，在室温下储存90天后具有相同的活性量。当将培养液煮沸1小时后仍可观察到类似的结果，只是煮沸培养液后在B.quercina和小麦拉氏杆菌(Rathayibacter tritici)(表1)中观察不到生长抑制。
表1.经长期储存(90天)或煮沸1小时的灵芝(G1)和硫磺菌(Ls)的过滤灭菌营养肉汤培养液的抗菌活性与新鲜收集的培养液相比不受影响。非接种营养肉汤用作对照。
*细菌生长抑制等级评定：观察含有涂布有200μl培养液的无菌滤纸盘的PDA平板上的检测菌苔，+＝全部生长抑制；±＝轻度生长抑制；-＝无生长。
观察杀真菌活性
根据所检测的真菌菌种，检测真菌的菌丝体生长抑制为0-71％，看起来在室温下储存90天以上仍然稳定(表2)。只有RBM不会抑制检测真菌。豌豆基腐病菌(Phomamedicaginis)是所有检测真菌中受影响最深的，而在根霉菌(Rhizopus sp.)中未观察到抑制。相比对照，在终极腐霉菌(Pythium ultimum)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)中观察到轻度抑制，其它真菌隔离群的生长被中度抑制(减少了23-54％的生长)。煮沸1小时能显著削弱灵芝(G.lucidum)和硫磺菌(L.sulphureus)的培养液的抗大多数真菌的杀菌活性。然而，相比新鲜或储存的培养液，镰刀菌(Fusarium sp.)的生长抑制被灵芝(G.lucidum)(54％)的煮沸培养液适度增加，而对于硫磺菌(L.sulphureus)(48％)则不变。同样，还观察到煮沸的培养液对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的生长抑制增加了。
表2.经长期储存(90天)的灵芝(G1)和硫磺菌(Ls)的过滤灭菌营养肉汤培养基(RBM)的培养液的抗真菌活性(与新鲜收集的培养液类似)不变，但经煮沸1小时后活性降低。非接种营养肉汤用作对照。
+结果以在无细胞RBM培养液：PDA(1:1，v:v)的试验培养基上培养5天后真菌菌丝体生长减少(与对照相比)的3次实验的平均百分比表示。
*NI-RBM中的数值表示培养5天后真菌生长的实际数量平均值(第2和第5栏)。
观察杀线虫活性
灵芝和硫磺菌类的PDB和RBM无细胞培养液均呈现抗哥伦比亚根结线虫(Meloidogyne chitwoodi)的杀线虫活性。约50％的线虫在接触培养液1小时内出现颤动，但接触非接种培养基则不会。认为停止运动和僵直的线虫已死亡。将线虫转移到新鲜水中2-4小时后仍然不动则能确认该线虫死亡。
早在灵芝(G.lucidum)和硫磺菌(L.sulphureus)培养第7天，培养物中即能检测到杀线虫活性(表3)。灵芝(G.lucidum)和硫磺菌(L.sulphureus)在PDB中培养第28、21和14天时可以在培养液中观察到最高水平的杀线虫活性，第35天培养物中该水平略微下降。该两种真菌在RBM中也呈现类似的趋势。然而，在RBM中的活性水平比在PDB中高得多。
表3.在马铃薯右旋糖肉汤(PDB)和富含肉汤培养液(RBM)中生长的灵芝和硫磺菌产生的培养液的杀线虫活性。以7天间隔收集培养液直到第35天，筛选出能够抗哥伦比亚根结线虫(Meloidogyne chitwoodi)J2幼虫的培养液。
+每栏内后跟相同字母的平均值间的差异在p<0.05时不显著(LSD)。数字是36小时候死亡线虫的平均百分比。
在补充有低芥酸菜子油或玉米油的改良RBM中产生的杀线虫活性
在PDB和RBM培养液中，可以在灵芝(G.lucidum)和硫磺菌(L.sulphureus)培养物中观察到小油滴。在PDB培养物中，小油滴维持到每次实验结束，但在RBM中，第30天时可见小油滴即消失。为了检验油可以作为这些真菌的营养源的假设，用1％低芥酸菜子油或1％玉米油对RBM进行改良(分别为RBMCO和RBMVO)。灵芝(G.lucidum)和硫磺菌(L.sulphureus)在RBM、RBMCO和RBMVO中产生的所有培养液中均观察到杀线虫活性，但在RBM对照中未观察到。然而，两种真菌在补充有两种油的培养液中产生的培养液的杀线虫活性比未补充的培养液低。
实施例2
制备用于植物的组合物
可以通过过滤除去固体接着用水稀释来制备施用于植物的本发明所述组合物。通常，另外采用纯化方法基本上除去所有的细胞衍生物质。可以通过离心、沉积、凝胶过滤或透析例如，除去细胞碎屑来实现。利用这些或其它常规方法，可以采用分子量大于约100,000的物质。另外的处理和纯化步骤如，例如，可以采用活性碳或炭处理除去亲脂性物质和/或有色物质。类似地，可以用水不婚溶有机溶剂对所述水溶液进行抽提除去亲脂性物质。
或者，可以加入表面活性剂增加对叶片或果实的效力。还可以加入其它营养物和佐剂如已知能增强植物保护剂效力的硝酸脲铵(UAN)。
或者，可以检测每批产品(例如部分纯化溶液、“混合肥汤”或浓缩剂)的所需生物活性或活性，或具体化合物或与所需活性有关的化合物的存在。然后可以对每批进行按需浓缩或稀释，使生物活性水平标准化后分配给用户。
实施例3
用于植物
然后通过常规用法和设备将上述部分纯化的组合物直接用于待保护植物或植物部分以减少可能损害植物或植物产品的植物病原体感染。例如，可以将所述组合物稀释成合适体积进行喷洒，和可以对植物、土壤或两者进行喷洒。确定所需用量的常规方法已知，可用于指导用户确定适于控制靶害虫而不会伤害植物或农作物的稀释度。
或者，可以将所述组合物用作土壤灌溉或喷洒，或者可以通过浓缩将它们制备成固体配剂，然后混合进新植种子、抽生秧苗或成形植物周围的土壤中。还可以在种植过程中用它们对植物种子或移植种子附近的环状带进行处理，使组合物混合进紧贴敏感种子的周围土壤中。
或者，可以在播种前将用它们处理种子，此时种子可以是被干燥的所述组合物所包裹，或者浸在含有可以从本发明组合物中获得的组分的溶液，如浓缩的培养液中。
实施例4
用于保护木材
可以将本发明所述组合物用来保护木材，减少白蚁、真菌或两者造成的损害。本发明组合物的制备浓度可以高达约30白利糖度，可以直接用于木材进行保护。或者，可以采用本领域熟知的对其它类型的木材防腐剂常采用的压力处理方法来增加待处理木材对所述组合物的吸收。
实施例5
用来控制非植物病原体
用2000:1稀释的制备自硫磺菌(L.sulphureus)的采用“短时煮沸”方法将其浓度浓缩成30白利糖度的本发明组合物处理皮氏培养皿中的原质团培养物(疟原虫)。该稀释度下，在数小时内杀死约50％的疟原虫。更高剂量对原虫群具有更强的毒性。
实施例6
改进的真菌培养物生长方法
使硫磺菌(L.sulphureus)培养物在有和没有加入提供额外生长表面的聚氨酯泡沫片的容器中生长。据估计所述泡沫能使生长表面变为单用容器的3倍。通过周期性检测培养液的白利糖度来追踪所述生长培养液中的糖浓度2个月。白利糖度是用来监测生长曲线(growing grapes)中的糖含量的参数，表明水性混合物中溶解的固体的近似浓度。加入聚氨酯泡沫的培养消耗糖的速率是不加入聚氨酯泡沫的培养的速率的约3倍，表明由于聚氨酯泡沫提供了额外的生长表面致使其生长快了大致3倍。
本文所提供的详细描述和实施例的作用是说明本发明，而非限制它。普通从业者可以根据所提供的描述明显看出本发明特征的变体和组合，而这些变体和组合也属于本发明的范围内。
Claims (49)
1.一种含有由担子菌类真菌产生的，具有抗至少一种细菌活性的分子量约为2000-5000的热稳定寡糖的杀菌组合物，
其中已对所述组合物进行了处理基本上除去了真菌来源的细胞组分。
2.如权利要求1所述的杀菌组合物，其特征在于，可通过除去有色物质和/或除去亲脂性物质和/或除去分子量大于约100,000的物质进一步纯化所述组合物。
3.如权利要求1所述的杀菌组合物，其特征在于，所述担子菌类是灵芝类或硫磺菌类。
4.如权利要求1所述的杀菌组合物，其特征在于，所述担子菌类是灵芝或硫磺菌。
5.如权利要求1-4中任一项所述的杀菌组合物，其特征在于，所述寡糖含有D-葡萄糖、D-核糖和D-呋喃半乳糖。
6.如权利要求5所述的杀菌组合物，其特征在于，已对所述组合物进行了灭菌处理。
7.如权利要求5所述的杀菌组合物，其特征在于，所述寡糖的分子量约为3000-4500。
8.如权利要求1-7中任一项所述的杀菌组合物，其特征在于，所述组合物具有抗植物病原菌，包括选自农杆菌、嗜酸菌、斑病菌、欧文氏菌、泛菌、假单胞菌和黄色杆菌至少一种的活性。
9.如权利要求8所述的杀菌组合物，其特征在于，所述植物细菌至少包括根癌农杆菌、发根农杆菌、燕麦嗜酸菌、Brenneria quercina、胡萝卜软腐欧文氏菌、草生泛生氏菌、皱纹假单胞菌，丁香假单胞菌和野油菜黄单胞菌中的一种。
10.如权利要求1-7中任一项所述的杀菌组合物，其特征在于，所述组合物具有抗感染人的病原体的活性。
11.一种分子量约为2000-5000的杀菌性糖，所述糖由担子菌类真菌所产生，具有抗至少一种植物病原性微生物的活性，且基本上不含细胞组分。
12.如权利要求11所述的杀菌性糖，其特征在于，所述糖由担子菌类真菌的灵芝类所产生。
13.如权利要求11所述的杀菌性糖，其特征在于，所述糖由担子菌类真菌的硫磺菌类所产生。
14.如权利要求11-13中任一项所述的杀菌性糖，其特征在于，所述糖的分子量约为3000-4500。
15.如权利要求14所述的杀菌性糖，其特征在于，其经过处理除去了分子量大于约60,000的组分。
16.如权利要求15所述的杀菌性糖，其特征在于，所述植物病原菌是：农杆菌、嗜酸菌、斑病菌、欧文氏菌、泛菌、假单胞菌和黄色杆菌。
17.如权利要求16所述的杀菌性糖，其特征在于，所述细菌选自：根癌农杆菌、发根农杆菌、燕麦嗜酸菌、Brenneria quercina、胡萝卜软腐欧文氏菌、草生泛生氏菌、皱纹假单胞菌，丁香假单胞菌和野油菜黄单胞菌。
18.一种产生具有抗病原体的生物灭杀活性的组合物的方法，所述方法包括在基本上为液体的生长培养液中培养担子菌类真菌，
收集培养液，
和除去基本上所有的细胞组分。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，可通过除去有色物质和/或除去亲脂性物质和/或除去分子量大于约100,000的物质进一步纯化所述组合物。
20.如权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述担子菌类真菌在pH是4以下生长。
21.如权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述担子菌类真菌在pH约为3下生长。
22.如权利要求18-21中任一项所述的方法，其特征在于，所述液体培养液含有富含肉汤培养液或马铃薯右旋糖肉汤，其中除了用于容纳培养物的容器所提供的表面外还提供了额外的生长表面，或者其中担子菌类真菌是灵芝类，将所述担子菌类真菌培养于深度小于6英寸的培养液中，或培养于搅拌或通气的培养液中。
23.如权利要求18-22中任一项所述的方法，其特征在于，所述担子菌类真菌在约30℃温度培养2-5周。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述病原体是细菌、真菌或线虫，它们是感染植物的病原体。
25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述病原体是细菌、真菌或线虫，它们是感染人的病原体。
26.一种真菌来源的含有分子量约为2000-5000的糖、对蛋白酶处理稳定但在水溶液中煮沸时变性的杀线虫组合物，
其中已通过除去基本上所有的细胞组分部分纯化了所述组合物。
27.如权利要求26所述的组合物，其特征在于，可通过除去有色物质和/或除去亲脂性物质和/或除去分子量大于约100,000的物质进一步纯化所述组合物。
28.如权利要求26或27所述的组合物，其特征在于，所述组合物是通过培养担子菌类真菌菌种所产生的。
29.如权利要求28所述的组合物，其特征在于，所述组合物是通过培养担子菌类真菌的灵芝或硫磺菌类所产生的。
30.如权利要求28所述的组合物，其特征在于，在RMB或基本上相似的培养液上至少约30℃的温度培养所述真菌。
31.一种含有分子量约2000-5000的糖、对蛋白酶处理稳定但在水溶液中煮沸时变性的真菌来源的抗真菌组合物，其中通过除去基本上全部的细胞组分部分纯化了所述组合物。
32.如权利要求31所述的组合物，其特征在于，可通过除去有色物质和/或除去亲脂性物质和/或除去分子量大于约100,000的物质进一步纯化所述组合物。
33.如权利要求31或32所述的组合物，其特征在于，所述组合物是由担子菌类真菌所产生的。
34.如权利要求33所述的组合物，其特征在于，所述组合物是由担子菌类真菌类在富含肉汤培养液或与RBM基本上类似的培养液中生长所产生的。
35.如权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述组合物由灵芝或硫磺菌所产生。
36.一种减轻病原体对植物、植物产品或真菌有害作用的方法，所述方法包括将有效量的权利要求1、26或31所述的组合物应用于待保护的植物或植物产品或真菌，
或将有效量的权利要求1、26或31所述的组合物应用于待保护的植物或真菌的生长地点或生长培养液中。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述病原体是细菌。
38.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述病原体是真菌。
39.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述病原体是线虫，和在观察到线虫存在证据之前将所述组合物应用于植物、植物产品或真菌。
40.如权利要求36-39中任一项所述的方法，其特征在于，将所述组合物应用于植物叶子，或将其直接应用于生长中的植物产品。
41.一种通过在大型容器中的水培液培养真菌产生其培养液的改进方法，其中所述改进包括：
除容器表面外提供适合支持菌丝体生长的额外生长表面，
其中培养液浸湿的容器表面加上额外生长表面的总表面面积/体积的比率至少是约50cm2/L培养液，
和/或其中所述额外生长表面所提供的生长表面面积至少约为培养液浸湿的容器表面所提供的生长表面面积的50％。
42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，还包括在基本上不破坏菌丝体垫而使培养物生长下搅拌或混合培养液。
43.如权利要求41或42所述的方法，其特征在于，所述真菌是担子菌类。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述真菌是硫磺菌。
45.一种木材防腐方法，包括将权利要求1-7或权利要求31-35中任一项所述的组合物应用于木材的至少一部分表面。
46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，通过减少白蚁和/或真菌对木材的破坏来保护木材。
47.一种减少表面上或物体内部感染性病原体水平的方法，所述方法包括将权利要求1-7中任一项所述的组合物应用于怀疑受到病原体污染的表面或物体。
48.一种减少或防止表面或物体受病原体污染的方法，所述方法包括将权利要求1-7中任一项所述的组合物应用于所述表面或物体。
49.一种治疗或预防动物受病原体感染的方法，所述方法包括：
给予动物有效量的权利要求1-7中任一项所述的组合物。
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