CN101384728B - 意识障碍患者的病态检测方法和检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了意识障碍患者的病态的检测方法，该方法对意识障碍患者，分析冯维勒布兰德因子切割酶的量和/或活性；还公开了意识障碍患者的病态的检测试剂盒，该试剂盒含有与冯维勒布兰德因子切割酶特异性结合的抗体或其片段、或冯维勒布兰德因子或其片段。病态的检测例如包含脑血管障碍的检测、动脉硬化性血管障碍的检测或严重度的检测或严重度的预测。

Description

意识障碍患者的病态检测方法和检测试剂盒

技术领域

本发明涉及意识障碍患者(特别是昏迷或昏睡等意识不清患者)的病态的检测方法(把握方法)。根据本发明，通过分析(优选定量)受试者生物试样(例如血液)中的冯维勒布兰德因子(von Willebrand factor，以下称为vWF)切割酶的量(浓度)和/或该酶的活性，可以判定现阶段的严重程度，或者预测将来的严重度。

背景技术

在日本，在1980年以前，最多的死亡原因是脑卒中，但随着治疗技术的进步和急救医疗的发展，在这20年间减少至大约四分之一。但是，随着急速进展的老年化社会，目前患者数再次有增加的倾向。为了预防，日常的健康管理是很重要的，同时，在脑卒中等导致昏迷、昏睡状态的初期阶段，正确的把握该意识障碍的原因、采取适当的处置(治疗、预后观察)，这与患者生命的延续密切相关。

脑卒中是由于血管异常引发的脑的障碍(脑血管由于某些原因破裂、堵塞的发作性障碍)，会残留生命危险性、麻痹或语言障碍等后遗症，因此，早期的适当治疗颇为重要。

脑卒中大致分为脑血管破裂引起的出血性病变的脑卒中、以及脑血管堵塞而引起的缺血性病变的脑卒中。出血性病变有蛛网膜下出血和脑出血，而缺血性病变分为脑梗塞和一时性脑缺血发作。

脑梗塞是由于血栓导致脑动脉闭塞而发生的疾病，在日本是排在死亡原因第三位的脑卒中主要病型，是死亡率高的疾病。脑梗塞是指脑动脉由于某些原因而堵塞，血液不流过或者是难以流过其之后的组织的状态。死因的约20％是脑血管疾病，其中约50％是脑梗塞。脑梗塞分为脑栓塞和脑血栓两种。脑栓塞中，脑动脉不是直接原因，而是由于发生心脏病而导致在心脏内形成的血液、蛋白质、脂肪等凝固物流入脑动脉，堵塞脑动脉而引起。与此相对，脑血栓是以脑动脉本身的动脉硬化作为成因的发病。发病频率是脑血栓比脑栓塞多。

昏迷、昏睡的原因不仅是脑卒中，还有脑部外伤等导致的脑干损伤、酒精中毒或镇静药等药物的过量摄取、心脏停止、动脉瘤、重症肺病、一氧化碳吸入、癫痫发作、甲状腺功能低下、肝功能衰竭或肾功能衰竭、糖尿病导致的低血糖等。因此，为了作准确的判断而必须进行很多检查。例如，需要调查血糖、钠、酒精、氧、二氧化碳等的浓度，红细胞数和白细胞数，尿液中的糖或有害物质。另外，通过测定肌钙蛋白或来自心脏的脂肪酸结合蛋白(H-FABP)，可以把握患者的昏迷、昏睡是否由心肌梗塞引起，可以选择适当的治疗。但是，诊断作为脑血栓原因的动脉硬化的方法目前是根据眼底检查、X射线CT、MRI、脉波速度法、超声波的血流测量等非手术性诊断方法；以及血管造影、血管内窥镜、血管回声检查等手术性检查等，它们在监测动脉硬化性血管障碍的程度或症状的发展方面并不充分。

另一方面，冯维勒布兰德因子(以下称为vWF)切割酶[以下称为ADAMTS13(vWF切割酶的别称)]以往显示与非常重度、-致死率高的血栓形成性血小板减少性紫癜(thrombptic thrombocytopenic purpura，以下称为“TTP”)的发病有关，从血浆中纯化vWF切割酶(非专利文献1)，通过cDNA克隆确定了该基因。实际上已经明确了ADAMTS13的基因突变使vWF分解活性显著降低(非专利文献2)。近年来，人们开发了应用针对ADAMTS13的单克隆抗体或多克隆抗体的酶联免疫测定法(专利文献1)，建立了与血小板凝聚有关的血栓症的原因和血栓症的血栓形成趋势的检测方法。使用它们，可以发现各种血栓病患者的血浆中的ADAMTS13的浓度比健康人显著降低。

例如专利文献2中公开了血栓形成倾向的程度或血栓病的检测方法，其特征在于：对ADAMTS13进行定量，上述血栓病有：急性或慢性骨髓性白血病、急性前骨髓细胞性白血病、全身性红斑狼疮、肺栓塞、脑梗塞、肝中心静脉闭塞症、急性淋巴细胞性白血病、血栓形成性微血管障碍、血栓形成性血小板减少性紫癜、溶血性尿毒症综合征或深部静脉血栓。专利文献3中还公开了弥散性血管内凝血综合征(DisseminatedIntravascular Coagulation，DIC)或全身性炎症反应综合征(systemicinflammatory response syndrome，SIRS)患者中血小板血栓症或器官障碍的检测方法，该方法是对ADAMTS13和/或其分解因子(例如弹性蛋白酶、纤维蛋白溶酶、或凝血酶)进行分析。

ADAMTS13的活性测定方法以往是采用将SDS-琼脂糖电泳与放射显影或蛋白质印迹法组合的vWF大分子多聚体的检测方法(非专利文献3)。近年来，开发了使用ADAMTS13的特异性分解vWF的部位——A2结构域的73个残基、再向其周边部位导入荧光基团和消光基团所得的FRETS-VWF73，ADAMTS13活性的测定变得简便(非专利文献4)。

专利文献1：国际公开第2004/029242号小册子

专利文献2：国际公开第2005/062054号小册子

专利文献3：国际公开第2006/049300号小册子

非专利文献1：K.Fujikawa等人，“Blood”，(美国)，2001年，第98卷，1662-6页

非专利文献2：G.G.Levy等人，“Nature”，(英国)，2001年，第413卷，488-494页

非专利文献3：M.Furlan等人，“Blood”，(美国)，1996年，第87卷，4223-4234页

非专利文献4：Kokame K等人，“ブリテイツシユジヤ一ナルオブヘマトロジ一”，(英国)，2005年，第129卷，93-100页

发明内容

如上所述，昏迷、昏睡的原因有多种，尽早把握其由来是很重要的。特别是对于脑血管障碍患者，存在诊断作为脑血栓原因的动脉硬化的各种检查方法，但是，在监测动脉硬化性血管障碍的程度或症状的进展方面尚有不足。另外，进展至伴随意识障碍和/或多器官衰竭发丙的病态的机理或成为其成因的物质尚未完全解明，发展至生命预后不良的患者仍有很多。在脑血管障碍患者中，尽早发现可能陷入上述严重度症状的可能性的患者、尽快进行适当的治疗，由此可能可以防御包括多器官衰竭的严重度发展的病态。

本发明人进行深入的研究，结果发现，通过分析脑卒中等昏迷或昏睡状态患者的ADAMTS13，可以由该测定结果把握病态、或预测严重度症状的发展。更具体地说，测定脑血管障碍患者血浆中的ADAMTS13浓度和/或其活性，发现随着动脉硬化性血管障碍的程度而ADAMTS13的浓度降低。并且，本发明中新发现，在具有重度肝障碍的病例中，如果ADAMTS13的浓度和活性显著降低，则会陷入伴有意识障碍和多器官衰竭的严重度症状，了解到：这些测定对于严重度的预测和预后管理有用，从而完成了本发明。

即，本发明的课题在于提供意识障碍患者的病态的检测方法和检测用试剂盒。

上述课题可通过本发明的上述意识障碍患者的病态的检测方法解决，其特征在于：对意识障碍患者，对冯维勒布兰德因子切割酶的量和/或活性进行分析。

根据本发明的检测方法的优选方案，上述病态的检测是脑血管障碍的检测、动脉硬化性血管障碍的检测、或者严重度的检测或严重度的预测。

根据本发明的检测方法的另一优选方案，按照使用与冯维勒布兰德因子切割酶特异性结合的抗体或其片段的免疫学方法，进行冯维勒布兰德因子切割酶的量的分析。

根据本发明的检测方法的又一优选方案，通过使用冯维勒布兰德因子或其片段进行冯维勒布兰德因子切割酶活性的分析。

本发明还涉及意识障碍患者的病态的检测试剂盒，该试剂盒包含与冯维勒布兰德因子切割酶特异性结合的抗体或其片段、或者冯维勒布兰德因子或其片段。

根据本发明的检测试剂盒的优选方案，上述病态的检测是脑血管障碍的检测、动脉硬化性血管障碍的检测、或者严重度的检测或严重度的预测。

本说明书中的术语“分析”包含判定是否有分析对象(例如ADAMTS13)存在的“检测”、和对分析对象物质的量(浓度)或活性进行定量或半定量确定的“测定”。

本说明书中的术语“病态的检测(把握)”例如包含：脑血管障碍的有无或者程度的检测或预测、各种症状[例如脑血管障碍和/或其它并发症(例如意识障碍、多器官衰竭、肝功能障碍)]的严重度的检测或预测、各种症状[例如脑血管障碍和/或其它并发症(例如意识障碍、多器官衰竭、肝功能障碍)]的发病的预测(即发病危险性评价)、各种症状[例如脑血管障碍和/或其它并发症(例如意识障碍、多器官衰竭、肝功能障碍)]的预后预测、监控、治疗方法的确定等。

根据本发明，可以对意识障碍患者进行当前严重度的判定、或者将来严重度的预测。

例如，本发明可以在意识障碍患者(例如脑血管障碍患者)中尽早发现可能陷入伴随有意识障碍和/或多器官衰竭发病的重度症状的可能性的患者，其临床价值非常高。根据本发明，可以进行简便性、迅速性和特异性优异的意识障碍和/或多器官衰竭的检测。另外，由后述的实施例显示，意识障碍或多器官衰竭发病的新的成因是“ADAMTS13显著减少”，因此，可以认为：如果进行使以往从未对相应得患者发行处方的ADAMTS13增加或不减少的治疗方法[新鲜冷冻血浆(FFP)的输注、血浆更换等]，则可以阻止病状的恶化。这显示，ADAMTS13的监控可直接用于判定脑梗塞患者的上述治疗效果是否良好。

附图简述

图1是表示用含有ADAMTS13的正常人血库血浆及其稀释系列处理的vWF的SDS-琼脂糖凝胶电泳的结果的、代替附图的照片。

图2是由图1所示的电泳图像制作的标准曲线。

图3是对动脉粥样硬化性血栓形成性脑梗塞病例中的ADAMTS13抗原量进行统计处理的结果的图表。

图4是表示对腔隙性(ラクナ型)脑梗塞病例中ADAMTS13抗原量进行统计处理的结果的图表。

图5是表示实施例3的病例1的临床过程的图表。

具体实施方式

本发明的检测方法

本发明的方法中，对ADAMTS13的量(浓度)或其酶活性的至少一方进行分析(优选测定或定量)，与健康人的ADAMTS13的量(浓度)或其酶活性进行比较，或者经时地测定或定量其量(浓度)和活性，由此可以进行意识障碍患者的病态的检测。本发明方法可包含以下步骤：

(1)对被检试样中的ADAMTS13的量(浓度)或酶活性进行分析的步骤；以及

(2)将上述分析值与健康人的值进行比较的步骤。

或者本发明的方法可包含以下步骤：

(1)在不同的时间对被检试样中的ADAMTS13的量(浓度)或酶活性进行分析的步骤；以及

(2)对上述分析值随时间变化的倾向进行分析的步骤。

本说明书中，“冯维勒布兰德因子切割酶(vWF切割酶)”是特异性的切断存在于冯维勒布兰德因子(vWF)的A2结构域中的酪氨酸(842)和蛋氨酸(843)，被称为ADAMTS13的金属蛋白酶。

本发明的方法中，与健康人比较，可以以ADAMTS13的量(浓度)和/或其酶活性的降低作为指标。本发明的方法中，还可以经时地测定ADAMTS13的量(浓度)和/或酶活性，以其减少倾向作为指标。例如，如后述实施例所示，伴随有意识障碍和/或多器官衰竭的发病的病态发展的患者中，在上述病态发展之前已经与健康人进行比较，体液试样中所含的ADAMTS13的浓度和酶活性显著降低。

本发明的方法中，测定或定量ADAMTS13浓度和/或其酶活性、显示比健康人的正常值范围低时(例如超过阀值时)、或者经时地测定或定量ADAMTS13的浓度和/或酶活性、该测定值显示减少倾向时，可以判定或预测受试者有脑血管障碍发病(或障碍程度高)，或者其发病的危险性高。另外，可以判定各种症状[例如脑血管障碍和/或其它并发症(例如意识障碍、多器官衰竭、肝功能障碍)]的严重度高，可以预测各种症状[例如脑血管障碍和/或其它并发症(例如意识障碍、多器官衰竭、肝功能障碍)]的发病危险性高，可以预测各种症状[例如脑血管障碍和/或其它并发症(例如意识障碍、多器官衰竭、肝功能障碍)]的预后状态不良。

另一方面，ADAMTS13浓度和/或其酶活性在正常值范围之内时，或者经时地测定或定量ADAMTS13的浓度和/或酶活性、其测定值有增加倾向时，可以判定或预测受试者没有脑血管障碍发病(或障碍程度低)，或者其发病的危险性低。还可以判定各种症状[例如脑血管障碍和/或其它并发症(例如意识障碍、多器官衰竭、肝功能障碍)]的严重度低，可以预测各种症状[例如脑血管障碍和/或其它并发症(例如意识障碍、多器官衰竭、肝功能障碍)]的发病危险性低，可以预测各种症状[例如脑血管障碍和/或其它并发症(例如意识障碍、多器官衰竭、肝功能障碍)]的预后状态良好。

可以适用本发明方法的对象(受试者)是意识障碍患者，特别是昏迷或昏睡等意识不清患者，优选为脑血管障碍患者(脑卒中患者)。

脑血管障碍例如有：一时性脑缺血发作、粥样动脉硬化性血栓形成性脑梗塞、心源性脑栓塞症、腔隙性脑梗塞、脑出血、蛛网膜下出血、颅内出血、脑血管性痴呆、或高血压性脑病等。肝功能障碍例如有急性病毒性肝炎、慢性病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、酒精性肝病、肝硬化、原发性胆汁性肝硬化、肝细胞癌或药物性肝病等。动脉硬化性血管障碍是大多发生于主动脉、冠状动脉、脑动脉或颈动脉、成为心肌梗塞或脑梗塞等的主因的病态。动脉硬化灶由血管内皮细胞障碍引发，由于障碍部位的血小板凝聚和吸附、血管平滑肌向内膜的游走·增殖，吞噬细胞向凝聚的血小板的游走、由于平滑肌细胞或吞噬细胞而生成泡沫细胞等而形成粥样动脉硬化灶(粥样动脉硬化)，并由于胶原性的变性吸附等导致硬化，形成了动脉硬化灶。这些动脉硬化灶显示结构脆弱性，血液动力学的力成为诱因，引起破裂，由于组织因子与血液凝固系统因子的反应而急速形成血栓。动脉硬化性血管障碍的危险因子有：高血压、高血脂、吸烟、肥胖、痛风、应激、运动不足、A型行为模式、或HDL胆固醇低的状态等很多。近年来，在脑血管障碍中，随着这些生活方式病的增加，粥样动脉硬化性血栓形成性脑栓塞或心源性脑栓塞病有增加倾向。脑血管障碍中，起因于这些动脉硬化性血管障碍的是缺血性的脑梗塞，其例子例如有：粥样动脉硬化性血栓形成性脑梗塞，其起因于动脉狭窄·堵塞，该动脉狭窄·堵塞由颈内动脉起始段或大脑中动脉水平段的粥样动脉硬化的形成导致；或者动脉源性栓塞，其由大多由于位于颈部的颈总动脉的动脉硬化而产生的较大的血管的动脉硬化导致；以及心源性脑栓塞，该病是起因于冠状动脉疾病的心脏的心率不齐等为原因，由于在心腔内形成的纤维蛋白血栓的游走而使颈内动脉或脑动脉突然堵塞，与剧烈的脑循环障碍同时发病；还有腔隙性脑梗塞，该病是穿通动脉的细动脉硬化为主要原因，高血压是危险因子。

本发明的方法中，分别由健康者和受试者采样，测定各自的ADAMTS13浓度和/或其酶活性，然后比较测定值，由此可进行上述检测和/或预测，但通常优选使用由健康人采集的检体预先确定ADAMTS13浓度和/或酶活性的正常值范围或判定阀值。正常值范围或判定阀值预先确定时，对于作为预测对象的受试者只进行ADAMTS13的分析即可进行上述受试者的上述检测和/或预测。可以预想，上述正常值范围或判定阀值根据各种条件例如基础疾病、性别、年龄等而变化，本领域技术人员可以适当选择与受试者对应的适当的母集团，通过对由该母集团所获得的数据进行统计学处理，可确定正常值范围或判定阀值。

例如，在后述实施例所示的母集团中，ADAMTS13浓度被视为异常的值是50％以下，ADAMTS13的酶活性被视为异常的值是40％以下。

本发明的方法中，对ADAMTS13的浓度或其酶活性进行分析的方法只要是可以定量或半定量的确定ADAMTS13的浓度或酶活性，或者可判定ADAMTS13的存在的有无即可，没有特别限定。

分析ADAMTS13浓度的方法例如有：使用抗ADAMTS13抗体或其片段的免疫学方法(例如酶联免疫测定法、胶乳凝集免疫测定法、化学发光免疫测定法、荧光抗体法、放射免疫测定法、免疫沉淀法、免疫组织染色或蛋白质印记等)、生物化学方法(例如酶学测定法)、或测定mRNA量的分子生物学方法等。

采用免疫学方法作为ADAMTS13浓度的分析方法时，抗ADAMTS13抗体或其片段可以按照公知的方法、例如国际公开第2004/029242号小册子的方法制备，各种免疫学的测定例如也可以按照国际公开第2004/029242号小册子记载的方法实施。

从灵敏度和简便性角度考虑，测定ADAMTS13浓度的方法优选免疫学方法。这里，免疫学方法是使用ADAMTS13的抗体，通过例如ELISA法、胶乳法或免疫色谱法分析ADAMTS13的方法。免疫学方法例如有：标记ADAMTS13的竞争法、标记抗体的夹层法、观察涂布有抗体的珠的聚集的胶乳珠法、或使用与胶体金等着色颗粒结合的抗体的方法等各种方法，使用ADAMTS13的抗体的方法也包含在本发明的优选方案中。抗体可以是单克隆抗体也可以是多克隆抗体。另外，抗体片段例如可以使用Fab、Fab’、F(ab’)₂或Fv。

分析ADAMTS13的酶活性的方法例如有：使用vWF或其片段的生物化学方法[例如将SDS-琼脂糖凝胶电泳与放射显影或蛋白质印迹法组合的vWF大分子多聚体的检测法(非专利文献3)、]；检测下述方法对vWF的切割活性的方法(非专利文献4)：在相当于与vWF的A2结构域中的Asp1596-Arg1668对应的73个残基的合成肽中导入荧光基团[2-(N-甲基氨基)苯甲酰，Nma]和消光基团(2，4-二硝基苯基，Dnp)；或者使用特异性识别vWF或其片段、和vWF的ADAMTS13切断部位的抗体或其片段的免疫学方法等。

对ADAMTS13的酶活性进行分析的方法有使用合成底物的测定法或免疫测定法。它们例如可按照日本特愿2005-148793号说明书的方法实施，具体可通过包含以下步骤的分析方法实施：(1)将vWF或其片段与不溶性载体结合，制成固定化底物，将可能含有ADAMTS13的被检试样与所得固定化底物在液体中接触的步骤；(2)使上述液体与不溶性载体分离的步骤；以及(3)对残留在不溶性载体上的vWF或其片段、和/或从不溶性载体中游离出的液体中的vWF片段进行分析的步骤。上述分析方法中，与不溶性载体结合的vWF或其片段是以下方式：在被ADAMTS13切割而从不溶性载体中游离出的底物片段一侧用标记物进行标记。再使用与由ADAMTS13切割产生的新抗原(包含切割面的氨基酸的部分序列)特异性结合的抗体或其片段或核酸适体(アプタマ一)等，将它们用标记物进行标记，在上述分析步骤中使用，由此可以分析酶活性。上述标记物例如有荧光物、发光物、显色物或酶，不溶性载体例如有：含有各种塑料(例如聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚酰胺或聚四氟乙烯)的胶乳颗粒、玻璃颗粒、磁性颗粒或微量滴定孔等。

本发明的方法中，被检试样例如优选为血浆或血清形式的血液，除此以外例如也可以使用细胞组织液、淋巴液、胸腺水、腹水、羊水、胃液、尿、胰液、髓液或唾液等各种体液。

本发明的检测试剂盒

本发明的检测试剂盒可以用于实施本发明的方法。本发明的检测试剂盒根据其分析对象，包含可通过分析ADAMTS13浓度来检测上述障碍的检测试剂盒(以下称为浓度分析型试剂盒)和可通过分析ADAMTS13的酶活性来检测上述障碍的检测试剂盒(以下称为酶活性分析型试剂盒)。

本发明的浓度分析型试剂盒至少含有抗ADAMTS13抗体或其片段，优选含有两种以上不同的抗ADAMTS13抗体。上述抗ADAMTS13抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体的任意形式。另外，含有两种以上不同的抗ADAMTS13抗体时，可以以其中的任意一方(第2抗体)制成标记抗体，或者作为标记，将在第2抗体的抗体上结合标记的标记抗体进一步追加到试剂盒中。

本发明的酶活性分析型试剂盒至少包含vWF或其片段。还可以将标记的vWF或其片段用于试剂盒。或者将与用ADAMTS13切割而产生的新抗原(含有切割面的氨基酸的部分序列)特异性结合的抗体或其片段代替标记vWF或其片段，追加到试剂盒中。

实施例

以下，通过实施例具体说明本发明，它们并不限定本发明的范围。《实施例1：通过SDS-琼脂糖凝胶电泳测定ADAMTS13酶活性》

将含有ADAMTS13的正常人血库血浆及其稀释系列与Tris缓冲液(pH7.4；含有1.5mol/L尿素和0.1mol/L氯化钡)等量混合，再添加4-[2-氨基乙基]-苯磺酰基氟化物盐酸盐(Pefabloc；Roche制备)，使其终浓度为2.4mmol/L。将上述处理的样品溶液与含有3μg/mL vWF(按照非专利文献3的方法，由人血浆纯化)的Tris缓冲液(pH7.4，1.5mol/L尿素)以1∶5的容量比混合，在37℃下温育过夜，将重组vWF用样品溶液中的ADAMTS13分解。分解反应通过添加EDTA、使其终浓度为40mmol/L而终止。将上述制备的样品用非还原下的SDS-琼脂糖凝胶电泳(1.4％琼脂糖凝胶)分离，然后通过蛋白质印迹法转印至PVDF(聚偏氟乙烯)膜上。用市售的封闭试剂(ブロツクエ一ス；大日本制药制备)在室温下进行封闭，然后用Tris缓冲液(pH7.4)洗涤。用Tris缓冲液(pH7.4)/用10％ブロツクエ一ス稀释1/1000的HRP(辣根过氧化物酶)标记抗vWF抗体(DAKO制备)在室温下反应1小时，然后用Tris缓冲液(pH7.4)洗涤3次，然后用市售的显色试剂盒(イムノステインHRP-1000；コニカ制备)显色。

电泳结果如图1所示。图1所示的各泳道的数值(单位＝％)是以正常人血浆为100％时、在正常人血库血浆及其稀释系列中所含的血库血浆的含有比例。由样品中的ADAMTS13分解vWF，形成按照其多聚体尺寸的vWF条带的长度，可以被检测。

以vWF条带的长度(单位＝mm)为纵轴，以血库血浆的含有比例为横轴，制备图2所示的标准曲线。

《实施例2：脑血管障碍病例中的ADAMTS13抗原量的测定》

以粥样动脉硬化性血栓形成性脑梗塞病例和腔隙性脑梗塞病例患者的血浆作为被检试样，测定ADAMTS13抗原量。ADAMTS13抗原量使用市售试剂盒(vWF切割酶ELISA试剂盒；三菱化学ヤトロン制备)进行测定。

粥样动脉硬化性血栓形成性脑梗塞病例的相关结果如图3所示，腔隙性脑梗塞病例的相关结果如图4所示。图3和图4中，Y轴[ADAMTS13：Ag(％)]是在以正常人血库血浆的ADAMTS13抗原量为100％时的ADAMTS13抗原量(单位＝％)。图3所示的“P＜0.05”是指以误差率低于5％具有显著差异。图4所示的“P＜0.01”是指以误差率低于1％时具有显著差异。

在粥样动脉硬化性血栓形成性脑梗塞病例(图3)中，按照是否有其它部位(即脑以外的部位)的血管疾病[例如陈旧性心肌梗塞(OMI)和/或闭塞性动脉硬化(ASO)]的并发来比较ADAMTS13抗原量。与没有其它部位的血管疾病并发组相比，在并发组中，ADAMTS13抗原量显著降低。

在腔隙性脑梗塞病例(图4)中，通过MRI图像进行分析，筛选单发性梗塞组和多发性梗塞组，分别比较其中的ADAMTS13抗原量。与单发梗塞组相比，在多发性梗塞组中，ADAMTS13抗原量显著降低。

图3和图4所示的结果显示，脑血管障碍患者中，如果ADAMTS13在血液中的浓度低，则显示动脉硬化性血管障碍进一步发展，这显示了ADAMTS13作为反映脑血管障碍的程度的标记物的意义。例如，粥样动脉硬化性血栓形成性脑梗塞起因于颈内动脉起始段或大脑中动脉水平段的粥样动脉硬化的形成导致的动脉狭窄、闭塞。另外，陈旧性心肌梗塞、闭塞性动脉硬化症也被视为动脉硬化性血管障碍。并且腔隙性脑梗塞是以穿通动脉的细动脉硬化为主因，其梗塞多发时，脑动脉以外可见很多动脉硬化部位，单发与多发相比，动脉硬化性血管障碍进一步发展。《实施例3：伴随有意识障碍和/或多器官衰竭发病的病态发展的病例的临床特征和ADAMTS13值》

在133个亚急性期-慢性期的脑血管障碍病例(粥样动脉硬化性血栓形成性脑梗塞50例、心源性脑栓塞22例、腔隙性脑梗塞34例、脑出血19例、蛛网膜下出血8例)中，通过实施例1所示的SDS-琼脂糖凝胶电泳测定ADAMTS13酶活性，还通过实施例2所示的市售试剂盒(vWF切割酶ELISA试剂盒；三菱化学ヤトロン)测定ADAMTS13抗原量。其中，ADAMTS13酶活性低于30％的病例为6例，该6例全部为脑梗塞[心源性脑栓塞(CEBI)3例，腔隙性脑梗塞(LBI)3例]，伴有重度肝病(胆管癌1例、酒精性肝炎1例、慢性丙型肝炎4例)和意识障碍。上述6例的临床特征和ADAMTS13值如表1所示。

[表1]

表1所示的6例内，入院期间ADAMTS13酶活性进一步降低的5个病例(病例1-病例5)中，向多器官功能障碍综合征(MODS)发展，导致生命预后不良。病例6未达到MODS，未有生命预后不良(存活)。

病例1的临床过程如图5所示。图5中，“Ag”和“Act”分别表示ADAMTS13抗原量和ADAMTS13酶活性。病例1是于2004年6月22日(6/22’04)入院(入院时的基础疾病是胆管癌、多发性肝转移、以及复发性胆管炎发病)，同年9月10日(9/10)表现为意识障碍和多器官功能障碍综合征(MODS)的症状，逐渐恶化，同年9月28日(9/28’04)死亡。

由以上结果强烈显示，ADAMTS13在重症肝病时显著降低，成为促进发展为意识障碍、MODS的促进因子。即，可以认为，作为发展至伴随意识障碍和/或多器官衰竭发病的病态的成因，“ADAMTS13显著减少”本身在该病态形成时具有非常重要的意义。另外，上述6个病例内，虽然ADAMTS13酶活性低(21％)，但对于维持该活性值、未见更多减少的病例(病例6)，未达到MODS，免除了生命预后不良。由该结果不仅显示“ADAMTS13的显著减少”可能是形成严重度发展病态的成因，并且对于该患者，可以尝试目前尚未施行处方的ADAMTS13补充疗法的新的有效性。监测ADAMTS13抗原量和酶活性，检测其减少程度，这可以尽早预知向MODS的发展，确定早期治疗方案，继而可成为与对患者的急救措施有关的诊断方法。

产业实用性

本发明可应用于意识障碍患者的病态的检测用途。

以上，按照特定的方案说明本发明，但本领域技术人员应该了解的变形或改良也包含在本发明的范围内。

Claims (2)

1.冯维勒布兰德因子或其片段在制备意识障碍患者的病态的检测用试剂盒中的应用，其中，病态的检测是严重度的检测或严重度的预测，该严重的症状是伴随有重度肝病和意识障碍的脑梗塞，其中使用冯维勒布兰德因子或其片段来测定冯维勒布兰德因子切割酶的酶活性。

2.意识障碍患者的病态的检测用试剂盒，该试剂盒包含冯维勒布兰德因子或其片段，其中，病态的检测是严重度的检测或严重度的预测，该严重的症状是伴随有重度肝病和意识障碍的脑梗塞，其中使用冯维勒布兰德因子或其片段来测定冯维勒布兰德因子切割酶的酶活性。

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