CN101381742A - 晚期启动子靶向性调控溶瘤腺病毒pCN305载体及其构建方法与应用 - Google Patents
晚期启动子靶向性调控溶瘤腺病毒pCN305载体及其构建方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种晚期启动子靶向性调控溶瘤腺病毒pCN305载体及其构建方法与应用；该载体是在具有靶向性的pCN103载体的基础上加以构建，通过引入内部核糖体进入位点IRES和多克隆位点，利用病毒自身的晚期启动子来调控表达所有具有杀伤和抑制各类癌症的外源基因如IL－24、TRAIL、SOCS3、cpp－SOCS3、SOCS1、cpp－SOCS1，且通过在体内外实验均显现出很好的抗癌效果。应用本发明构建的所有双靶向复制型溶瘤腺病毒如AdCN305－IL－24、AdCN305－TRAIL、AdCN305－SOCS3、AdCN305－cpp－SOCS3、AdCN305－SOCS1和AdCN305－cpp－SOCS1都可用于治疗各类肿瘤，并可以开发出有效的治疗肿瘤的病毒-基因抗癌新药。
Description
技术领域
本发明属于基因治疗领域，特别涉及一种可利用自身晚期启动子高效表达外源基因的双靶向(肿瘤靶向)溶瘤腺病毒载体的构建方法及携带所有具有杀伤、抑制癌症的外源基因如IL-24、TRAIL、SOCS3、cpp-SOCS3、SOCS1和cpp-SOCS1的应用。
背景技术
恶性肿瘤严重危害人类健康，目前临床上对绝大多数晚期肿瘤患者仍然缺乏有效的治疗手段，而常规治疗除了具有一定的毒副作用和耐药性外，还存有在杀伤肿瘤细胞的同时，使正常组织和细胞受到损害的难题，尤其是对造血组织和细胞的损害尤为严重。因此，医务工作人员和患者都期望能有一种治疗肿瘤的新的有效治疗方法出现。
当细胞生物学和分子生物学理论与技术得到飞速发展，基因治疗肿瘤策略应运而生。而随着病毒学和肿瘤学快速发展，人们又尝试将改造后的病毒用于肿瘤治疗的研究工作。
癌症的靶向基因—病毒治疗策略是利用溶瘤病毒在肿瘤细胞内特异性裂解、增殖来提高抗癌基因对癌细胞的强烈杀伤作用或抑制作用。这与传统肿瘤基因治疗的病毒载体有本质上的不同，后者是一种非复制性病毒，仅仅作为运载工具将抗癌基因运输到组织或细胞内，而载体本身无靶向性和复制能力也无治疗作用。靶向基因—病毒治疗充分利用病毒体积小、能复制和扩散能力强的优点，可在肿瘤原发病灶和转移灶局部形成高浓度病毒，并激发免疫系统应答来增强杀瘤效应；同时还可以将抗癌基因靶向地运至肿瘤细胞内，抗癌基因能随着病毒的复制而增加拷贝数，提高抗癌基因的表达量，两者协同作用从而进一步提高抗肿瘤的疗
目前作为基因治疗的载体分为病毒型和非病毒型两大类。病毒载体包括：腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、和疱疹病毒等。病毒载体转染率高，表达时间长，但免疫原性强，有一定危险性。非病毒载体包括：裸露DNA、脂质体和其它物质包裹的DNA。非病毒载体则免疫原性小及安全性好，但转染率低，基因稳定性差，表达时间短。目前使用最多还是病毒载体。而在众多病毒载体中腺病毒以其宿主范围广，致病性低，包装容量大，产生滴度高等优点成为应用最广的基因治疗载体。根据http://www.wiley.co.uk/genmed的最新统计，全球共有1145个基因治疗方案进入临床，其中67％用于癌症的治疗，而以腺病毒为载体的研究最为广泛且高达25％。
但是大多数载体系统还是存在不能使治疗基因特异地在肿瘤细胞内高效表达，因而不能彻底杀灭肿瘤细胞而严重阻碍着肿瘤基因治疗的临床疗效。在肿瘤患者体内，如果只能杀灭部分肿瘤细胞，残留的少部分细胞将很快生长，导致肿瘤复发。因此研制高效、靶向转染肿瘤细胞的载体系统对目前肿瘤的基因治疗至关重要。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种晚期启动子靶向性调控溶瘤腺病毒pCN305载体的构建及其应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种晚期启动子靶向性调控溶瘤腺病毒pCN305载体，它具有SEQ ID No.1的基因序列。
一种上述晚期启动子靶向性调控溶瘤腺病毒pCN305载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)设计如下引物：
Ad66:5’CCAGAATATTGGAACTTTAG 3’
BstXI
Ad67:5’GGATCCATCGAGGATCCTCATTCTTGGGCAATGTATGAA 3’
BamHI
Ad68:5’GGATCCGTCGACTCGCGAGAATCGTTTGTGTTATGTT 3’
BamHI
Ad69:5’CTTAAGTGAGCTGCCCGGGGA 3’
AflII；
(2)构建转移载体pCZ301：
用HindIII酶切质粒pTG1801，酶切完全后跑电泳回收2937bp大小的片段，将此片段与同样用HindIII酶切消化并去磷的载体pGEM-11Zf(+)连接、转化，取正确的阳性克隆，命名为pCZ301；
(3)构建转移载体pCZ302：
以质粒pTG3602为模板，分别用引物Ad66、Ad67和Ad68、Ad69进行PCR，电泳回收产物并分别命名为A8和A9，A8为341bp，A9为339bp；将用BstXI和BamHI酶切消化的A8以及载体pGEM-Teasy进行连接、转化，取正确的克隆并命名为pGEM-T/A8。同样地，将用BamHI和AflII酶切消化的A9以及载体pGEM-Teasy进行连接、转化，取正确的克隆并命名为pGEM-T/A9。然后用BstXI和BamHI酶切消化质粒pGEM-T/A8，跑电泳回收片段A8，将其与同样用BstXI和BamHI酶切消化过的质粒pGEM-T/A9进行连接、转化，取正确的阳性克隆命名为pGEM/A8-A9。用BstXI和AflII酶切得到的质粒pGEM/A8-A9，电泳回收650bp的片段A8-A9，将其与同样用BstXI和AflII酶切消化过的质粒pCZ301进行连接、转化，取正确的阳性克隆命名为pCZ302；
(4)构建转移载体pCZ303：
将SphI酶切质粒pTG1801，酶切完全后跑电泳回收10248bp的片段，并使其自连、转化，取正确的阳性克隆命名为pCZ303。
(5)构建转移载体pCZ304：
HindIII酶切pCZ302，电泳回收2937bp大小的片段。将其与同样用HindIII酶切并去磷的质粒pCZ303连接、转化，取正确的阳性克隆命名为pCZ304。
(6)构建转移载体pCZ305：
SphI单酶切pTG3602，电泳回收6126bp的片段。将其与同样用SphI酶切并去磷的载体pCZ304连接、转化，取正确的阳性克隆命名为pCZ305，pCZ305具有SEQ ID No.1的基因序列。
一种应用上述的晚期启动子靶向性调控溶瘤腺病毒pCN305载体获得双靶向复制型溶瘤腺病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将内部核糖体进入位点IRES以及终止信号polyA克隆到载体pBluescript-sk上，形成含有IRES、MCS和polyA表达框的转移载体pBC/polyA。
(2)通过电转法在细菌内使双靶向的腺病毒骨架质粒pCN103和含有抑癌基因IL-24、TRAIL、SOCS3、cpp-SOCS3、SOCS1、cpp-SOCS1的重组质粒pCZ305-IL-24、pCZ305-TRAIL、pCZ305-SOCS3、pCZ305-cpp-SOCS3、pCZ305-SOCS1、pCZ305-cpp-SOCS1进行同源重组，获得重组质粒pCN305-IL-24、pCN305-TRAIL、pCN305-SOCS3、pCN305-cpp-SOCS3、pCN305-SOCS1、pCN305-cpp-SOCS1。
(3)将酶切消化后暴露出包装信号的重组腺病毒质粒pCN305-IL-24、pCN305-TRAIL、pCN305-SOCS3、pCN305-cpp-SOCS3pCN305-SOCS1、pCN305-cpp-SOCS1分别转染到293细胞中，使其包装成双靶向复制型溶瘤腺病毒AdCN305-IL-24、AdCN305-TRAIL、AdCN305-SOCS3、AdCN305-cpp-SOCS3、AdCN305-SOCS1和AdCN305-cpp-SOCS1；使其高效表达IL-24、TRAIL、SOCS3、cpp-SOCS3、SOCS1和cpp-SOCS1蛋白分子。
一种应用上述的方法获得双靶向复制型溶瘤腺病毒用于制备治疗肿瘤的药物的用途。
本发明的有益效果是：
1.本发明将肿瘤的病毒疗法和基因治疗有效地结合了起来，可高效表达外源基因，相对于单纯的病毒疗法增强了对肿瘤的杀伤能力。
2.本发明采用了一种双重靶向肿瘤的策略，大大增强了腺病毒基因治疗载体的安全性。
3.本发明利用病毒晚身启动子来调控表达外源基因，保证了外源基因只有在病毒复制的情况下才表达，相对于外源性启动子，增加了基因表达的特异性。
4.本发明通过构建的新型腺病毒基因治疗载体使所有杀伤抑制癌症的基因如IL-24、TRAIL、SOCS3、cpp-SOCS3、SOCS1和cpp-SOCS1发挥了较好的肿瘤杀伤效果。
附图说明
图1为穿梭质粒pCZ305构建流程图；
图2为穿梭质粒pBC/polyA的构建流程图；
图3为双靶向复制型溶瘤腺病毒PCN305载体携带抑癌基因IL-24的构建流程图；
图4为采用Western-blot方法所得到的病毒感染后的SOCS3和cpp-SOCS3细胞中的表达能力图；
图5为抗癌因子SOCS3和cpp-SOCS3诱导肿瘤细胞凋亡示意图；
图6为病毒AdCN305-SOCS3和cpp-SOCS3在正常细胞和在肿瘤细胞中的复制能力示意图；
图7的(a)～(e)分别为MTT法检测病毒AdCN305-SOCS3和AdCN305-cpp-SOCS3在正常细胞和肿瘤细胞经10MOI(multiplicity of infection)的不同病毒处理后5天的存活率示意图；
图8的(a)和(b)分别为AdCN305-SOCS3和AdCN305-cpp-SOCS3在裸鼠体内治疗肿瘤细胞移植瘤的结果示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种可利用自身晚期启动子调控表达所有杀伤抑制癌症的外源基因如SOCS1、cpp-SOCS1、SOCS3、cpp-SOCS3、TRAIL和IL-24的双靶向复制型溶瘤腺病毒基因治疗载体PCN305的构建方法和应用。
该发明提供载体例如pCN305-IL-24、pCN305-TRAIL、pCN305-SOCS3、pCN305-cpp-SOCS3、pCN305-SOCS1和pCN305-cpp-SOCS1的构建方法.其步骤包括：
一、通过删除腺病毒Fiber基因下游的终止信号，构建成与pCN103含有同源臂的转移载体质粒pCZ305。
构建转移载体质粒pCZ305的方法具体如下：
1.首先设计如下引物：
Ad66:5’CCAGAATATTGGAACTTTAG 3’
BstXI
Ad67:5’GGATCCATCGAGGATCCTCATTCTTGGGCAATGTATGAA 3’
BamHI
Ad68:5’GGATCCGTCGACTCGCGAGAATCGTTTGTGTTATGTT 3’
BamHI
Ad69:5’CTTAAGTGAGCTGCCCGGGGA 3’
AflII
2.构建转移载体pCZ301：
用HindIII酶切质粒pTG1801，酶切完全后跑电泳回收2937bp大小的片段。将此片段与同样用HindIII酶切消化并去磷的载体pGEM-11Zf(+)连接、转化，取正确的阳性克隆，命名为pCZ301。
3.构建转移载体pCZ302：
以质粒pTG3602为模板，分别用引物Ad66、Ad67和Ad68、Ad69进行PCR(详见Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd ed.，Joseph Sambrookand David W.Russell)，电泳回收产物并分别命名为A8(341bp)和A9(339bp)。将用BstXI和BamHI酶切消化的A8以及载体pGEM-Teasy进行连接、转化，取正确的克隆并命名为pGEM-T/A8。同样地，将用BamHI和AflII酶切消化的A9以及载体pGEM-Teasy进行连接、转化，取正确的克隆并命名为pGEM-T/A9。然后用BstXI和BamHI酶切消化质粒pGEM-T/A8，跑电泳回收片段A8，将其与同样用BstXI和BamHI酶切消化过的质粒pGEM-T/A9进行连接、转化，取正确的阳性克隆命名为pGEM/A8-A9。用BstXI和AflII酶切得到的质粒pGEM/A8-A9，电泳回收650bp的片段A8-A9，将其与同样用BstXI和AflII酶切消化过的质粒pCZ301进行连接、转化，取正确的阳性克隆命名为pCZ302。
4.构建转移载体pCZ303：
将SphI酶切质粒pTG1801，酶切完全后跑电泳回收10248bp的片段，并使其自连、转化，取正确的阳性克隆命名为pCZ303。
5.构建转移载体pCZ304：
HindIII酶切pCZ302，电泳回收2937bp大小的片段。将其与同样用HindIII酶切并去磷的质粒pCZ303连接、转化，取正确的阳性克隆命名为pCZ304。
6.构建转移载体pCZ305：
SphI单酶切pTG3602，电泳回收6126bp的片段。将其与同样用SphI酶切并去磷的载体pCZ304连接、转化，取正确的阳性克隆命名为pCZ305，pCZ305具有SEQ ID No.1的基因序列。
二、将内部核糖体进入位点(IRES)以及终止信号polyA克隆到载体pBluescript-sk上，形成含有IRES、MCS和polyA表达框的转移载体pBC/polyA。
三、通过电转法在细菌内使双靶向的腺病毒骨架质粒pCN103和含有抑癌基因如IL-24、TRAIL、SOCS3、cpp-SOCS3、SOCS1和cpp-SOCS1(上述各种基因在基因库中均可查到)重组质粒pCZ305-IL-24、pCZ305-TRAIL、pCZ305-SOCS3、pCZ305-cpp-SOCS3、pCZ305-SOCS1和pCZ305-cpp-SOCS1进行同源重组，获得重组质粒pCN305-IL-24、pCN305-TRAIL、pCN305-SOCS3、pCN305-cpp-SOCS3、pCN305-SOCS1和pCN305-cpp-SOCS1。
四、将酶切消化后暴露出包装信号的重组腺病毒质粒如pCN305-IL-24、pCN305-TRAIL、pCN305-SOCS3、pCN305-cpp-SOCS3pCN305-SOCS1和pCN305-cpp-SOCS1分别转染到293细胞中，使其包装成病毒如AdCN305-IL-24、AdCN305-TRAIL、AdCN305-SOCS3、AdCN305-cpp-SOCS3、AdCN305-SOCS1和AdCN305-cpp-SOCS1使其高效表达如IL-24、TRAIL、SOCS3、cpp-SOCS3、SOCS1和cpp-SOCS1蛋白分子。
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，应理解以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。
下面根据附图和具体实施例详细说明本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。
下面以抑癌基因IL-24和SOCS3为例，说明双靶向复制型溶瘤腺病毒PCN305载体的构建方法及其用于制备治疗肿瘤的药物的构建流程和治疗效果。
实施例1：
可携带外源基因的肿瘤靶向的腺病毒载体载体PCN305的构建和病毒如AdCN305-IL-24、AdCN305-SOCS3和AdCN305-cpp-SOCS3等获得。A、转移质粒pCZ305的构建：
首先设计如下引物：
Ad66:5’CCAGAATATTGGAACTTTAG 3’
BstXI
Ad67:5’GGATCCATCGAGGATCCTCATTCTTGGGCAATGTATGAA 3’
BamHI
Ad68:5’GGATCCGTCGACTCGCGAGAATCGTTTGTGTTATGTT 3’
BamHI
Ad69:5’CTTAAGTGAGCTGCCCGGGGA 3’
AflII
①构建转移载体pCZ301：
用HindIII酶切质粒pTG1801，酶切完全后跑电泳回收2937bp大小的片段。将此片段与同样用HindI II酶切消化并去磷的载体pGEM-11Zf(+)连接、转化，取正确的阳性克隆，命名为pCZ301。
②构建转移载体pCZ302：
以质粒pTG3602为模板，分别用引物Ad66、Ad67和Ad68、Ad69进行PCR(详见Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd ed.，Joseph Sambrookand David W.Russell)，电泳回收产物并分别命名为A8(341bp)和A9(339bp)。将用BstXI和BamHI酶切消化的A8以及载体pGEM-Teasy进行连接、转化，取正确的克隆并命名为pGEM-T/A8。同样地，将用BamHI和AflII酶切消化的A9以及载体pGEM-Teasy进行连接、转化，取正确的克隆并命名为pGEM-T/A9。然后用BstXI和BamHI酶切消化质粒pGEM-T/A8，跑电泳回收片段A8，将其与同样用BstXI和BamHI酶切消化过的质粒pGEM-T/A9进行连接、转化，取正确的阳性克隆命名为pGEM/A8-A9。用BstXI和AflII酶切得到的质粒pGEM/A8-A9，电泳回收650bp的片段A8-A9，将其与同样用BstXI和AflII酶切消化过的质粒pCZ301进行连接、转化，取正确的阳性克隆命名为pCZ302。
③构建转移载体pCZ303：
将SphI酶切质粒pTG1801，酶切完全后跑电泳回收10248bp的片段，并使其自连、转化，取正确的阳性克隆命名为pCZ303。
④构建转移载体pCZ304：
HindIII酶切pCZ302，电泳回收2937bp大小的片段。将其与同样用HindIII酶切并去磷的质粒pCZ303连接、转化，取正确的阳性克隆命名为pCZ304。⑤构建转移载体pCZ305：
SphI单酶切pTG3602，电泳回收6126bp的片段。将其与同样用SphI酶切并去磷的载体pCZ304连接、转化，取正确的阳性克隆命名为pCZ305。
B、转移质粒pBC/polyA的构建：
设计一段含有酶切位点NcoI，SacI的polyA的Linker：
5’-CATGGTTGCGGCCGCGGATCCTCTAGAAATAAAAGATCTTAAGTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGGTCGACGAGCT-3’
将EcoRI和XbaI酶切载体pCITE-1(含有IRES序列)，酶切完全后电泳回收1752bp片段。将此片段与用EcoRI和XbaI酶切消化过的载体pBluescript-Sk连接、转化，取正确的阳性克隆，命名为pBC。用NcoI和SacI酶切质粒pBC，电泳回收3495bp的片段，并将其与Linker进行连接转化，取正确的阳性克隆即为转移质粒pBC/polyA。
C、pCN305-IL-24、pCN305-SOCS3、pCN305-cpp-SOCS3构建：
①转移载体pCZ305-IL-24、pCZ305-SOCS3和pCZ305-cpp-SOCS3构建：
使用NcoI和NotI分别酶切质粒pMD/IL-24、pMD/SOCS3、pMD/-cpp-SOCS3、pMD/SOCS1和pMD/-cpp-SOCS1，酶切完全后电泳分别回收691bp、680bp和720bp条带。将其与同样用NcoI和NotI酶切消化过的质粒pBC/polyA进行连接、转化，取正确的阳性克隆分别被命名为pBC/polyA-IL-24pBC/polyA-SOCS3和pBC/polyA-cpp-SOCS3。用SalI酶切此得到的质粒pBC/polyA-IL-24，酶切完全后电泳回收的片段。将其与同样用SalI酶切并去磷的PCZ305进行连接连接、转化，取正确的阳性克隆即为重组质粒pCZ305-IL-24、pCZ305-SOCS3和pCN305-cpp-SOCS3。
②细菌内同源重组：
分别使用SnaBI酶切消化质粒pCZ305-IL-24、pCZ305-SOCS3和pCZ305-cpp-SOCS3，酶切完全后用无水乙醇醋酸钠沉淀回收大片段。将质粒pCN103(由本实验室构建，用hTERT替换了E1A的启动子并缺失E1A上可与Rb相互作用的CR2区)与回收得到的片段通过电转的方法在感受态细胞BJ5183内进行同源重组，取正确的阳性克隆即为重组质粒pCN305-IL-24、pCN305-SOCS3和pCN305-cpp-SOCS3。
D、病毒AdCN305-IL-24、AdCN305-SOCS3和AdCN305-cpp-SOCS3包装：
分别使用pacI酶切质粒pJN103/IL-24、pJN103/SOCS3和pJN103/cpp-SOCS3(暴露出腺病毒的包装信号)，酶切完全后用无水乙醇醋酸钠沉淀回收大片段，通过转染使其可以在293细胞(含E1A区)中进行包装形成病毒。此种方法包装病毒不会产生野生型病毒的污染。将病毒在293细胞进行大量的繁殖，应用氯化铯梯度离心纯化病毒。
实施例2：病毒感染后SOCS3细胞中的表达能力。
将病毒AdCN305-SOCS3分别按5MOI感染MRC5、BEL7404、Hep3B、H460和Bcap37五种细胞，48hr后，提取细胞的总蛋白，通过Western-blot对SOCS3蛋白的表达进行分析。如图4所示，从左至右分别表示AdCN305-SOCS3在人胚肺细胞MRC5、人肝癌细胞株BEL7404、人肝癌细胞株Hep3B、人肺癌细胞株H460中表达SOCS3、人乳腺癌细胞株Bcap37中表达SOCS3蛋白水平。在正常细胞MRC5中，SOCS3蛋白表达水平较低，说明病毒复制率低。而在四种肿瘤细胞中，SOCS3蛋白表达水平较高，说明病毒复制率较高。
实施例3：SOCS3诱导肿瘤细胞凋亡。
将病毒Ad-wt、AdCN305-SOCS3和AdCN305-cpp-SOCS3按5MOI感染人肺癌细胞H460，作用48hr后，通过Hochest染色法检测SOCS3诱导肿瘤细胞凋亡的能力。如图5所示，其中，a表示PBS空白对照组Hochest染色，b表示Ad-wt作用于H460细胞后Hochest染色，c表示AdCN305-SOCS3作用于H460细胞后Hochest染色，d表示AdCN305-cpp-SOCS3作用于H460细胞后Hochest染色。可见，病毒AdCN305-SOCS3和AdCN305-cpp-SOCS3可以诱导肿瘤细胞产生凋亡，而PBS和Ad-wt却没有诱导肿瘤细胞凋亡。(箭头所指为凋亡细胞)
实施例4：AdCN305-SOCS3和AdCN305-cpp-SOCS3重组腺病毒在正常细胞和肿瘤细胞中复制能力分析。
将3×105的正常细胞或肿瘤细胞铺于6孔板，24h后，加入5MOI的病毒将Ad-wt、AdCN305-HcRed、AdCN305-SOCS3和AdCN305-cpp-SOCS3四种病毒按5MOI感染MRC5、BEL7404、Hep3B、H460和Bcap37五种细胞。48小时后，收集细胞上清与细胞，在-20℃与37℃反复冻融3次以释放病毒。将病毒稀释，检测病毒滴度。293细胞铺于60mm dish，24小时后细胞接近长满，加入含不同稀释度(10-1～10-8)的病毒，37℃感染2小时后，铺8ml低熔点胶(5％FBS，1.25％Agarose)。9天左右记数。计算每PFU病毒产生的病毒数目。
由图6结果可见，在正常细胞MRC5中，野生型病毒Ad-wt有较高的复制能力，而7我们改造后的靶向型病毒却呈现出很低的复制水平。在四种肿瘤细胞中，我们的重组病毒与野生型病毒都有着较高的复制能力，相差无几。这些说明了重组病毒的安全性以及在肿瘤细胞中特异性复制的能力。并且外源基因的插入也未对病毒自身在肿瘤细胞中的复制能力造成的影响。用上述实验方法AdCN305-TRAIL和AdCN305-IL-24也可得到相同的实验结果。
实施例5：病毒AdCN305-SOCS3和AdCN305-cpp-SOCS3在体外对正常细胞和肿瘤细胞的杀伤能力检测。
细胞经病毒处理后的存活率由MTT法检测。步骤如下：将肝癌癌细胞株BEL7404、SMMCC7721及正常人胚肺细胞NHLF和正常人肺细胞MRC-5以5000每孔的量铺入96孔板，培养24小时后分别加入10MOI的病毒，作用1天，然后每天一次，连续四天将含病毒的培养液移去，换成含5mg/mlMTT的正常培养液，培养4小时后将含MTT的培养液移去，以DMSO裂解，摇匀，然后以655nm处吸光度为参比测定595nm处吸光度。
细胞存活率(％)＝A595(样品)/A595(对照)×100％。
结果如图7所示，AdCN305-SOCS3和AdCN305-cpp-SOCS3对肿瘤细胞有很强的杀伤作用，而对正常细胞毒性很小，具有肿瘤选择性。用同样的方法对病毒AdCN305-IL-24和AdCN305-TRAIL也能产生相同的治疗效果。
实施例6：病毒AdCN305-SOCS3和AdCN305-cpp-SOCS3在裸鼠体内治疗肿瘤细胞移植瘤。
将4～5周龄的裸鼠皮下接种肝癌细胞株BEL7404，12天后进行动物分组。治疗组给予1×109pfu的AdCN305-SOCS3进行治疗，试验结果如图8-1所示，单纯的野生型病毒Ad-wt或者空载体病毒AdCN305-HcRed可以表现出一定的溶瘤效果，但是携带治疗基因的AdCN305-SOCS3和AdCN305-cpp-SOCS3可以显著的抑制肿瘤的生长，并且融合了穿膜肽的SOCS3的病毒抑制效果更好。用同样的方法对AdCN305-IL-24和AdCN305-TRAIL裸鼠体内治疗肿瘤细胞移植瘤疗效相同。
实施例7：病毒AdCN305-SOCS3和AdCN305-cpp-SOCS3移植瘤及肝脏的病理学和免疫组化分析
取注射病毒7天后的裸鼠肿瘤组织，按常规H&E染色方法进行，分别进行脱水和石蜡包埋，石蜡切片厚4um，常规脱蜡、梯度酒精水化后，苏木素染10min，盐酸酒精分化数秒，水洗，伊红染3min，水洗，脱水，透明，中性树胶封固。实验结果如图8-2所示：单纯的野生型病毒Ad-wt或者空载体病毒AdCN305-HcRed可以表现出一定的溶瘤效果，但是携带治疗基因的AdCN305-SOCS3和AdCN305-cpp-SOCS3可以显著的抑制肿瘤的生长，并且融合了穿膜肽的SOCS3的病毒抑制效果更好。通过病理学和免疫组织化学对注射肿瘤及小鼠的肝脏进行了分析，AdCN305-SOCS3和AdCN305-cpp-SOCS3抑制了肿瘤内phospho-Stat3的表达水平并且使肿瘤出现了大量的坏死。野生型病毒Ad-wt的病毒颗粒可以在肝脏中被检测到，而AdCN305-SOCS3和AdCN305-cpp-SOCS3却没有表现出对肝脏的毒性，进一步的说明了重组病毒的安全性。
序列表
<110>浙江理工大学
<120>晚期启动子靶向性调控溶瘤腺病毒pCN305载体及其构建方法与应用
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1357
<212>DNA
<400>1
Claims (4)
1.一种晚期启动子靶向性调控溶瘤腺病毒pCN305载体，其特征在于，它具有SEQ ID No.1的基因序列。
2.一种权利要求1所述晚期启动子靶向性调控溶瘤腺病毒pCN305载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计如下引物：
Ad66:5’CCAGAATATTGGAACTTTAG 3’
BstXI
Ad67:5’GGATCCATCGAGGATCCTCATTCTTGGGCAATGTATGAA 3’
BamHI
Ad68:5’GGATCCGTCGACTCGCGAGAATCGTTTGTGTTATGTT 3’
BamHI
Ad69:5’CTTAAGTGAGCTGCCCGGGGA 3’
AflII。
(2)构建转移载体pCZ301：
用HindIII酶切质粒pTG1801，酶切完全后跑电泳回收2937bp大小的片段，将此片段与同样用HindIII酶切消化并去磷的载体pGEM-11Zf(+)连接、转化，取正确的阳性克隆，命名为pCZ301。
(3)构建转移载体pCZ302：
以质粒pTG3602为模板，分别用引物Ad66、Ad67和Ad68、Ad69进行PCR，电泳回收产物并分别命名为A8和A9，A8为341bp，A9为339bp；将用BstXI和BamHI酶切消化的A8以及载体pGEM-Teasy进行连接、转化，取正确的克隆并命名为pGEM-T/A8。同样地，将用BamHI和AflII酶切消化的A9以及载体pGEM-Teasy进行连接、转化，取正确的克隆并命名为pGEM-T/A9。然后用BstXI和BamHI酶切消化质粒pGEM-T/A8，跑电泳回收片段A8，将其与同样用BstXI和BamHI酶切消化过的质粒pGEM-T/A9进行连接、转化，取正确的阳性克隆命名为pGEM/A8-A9。用BstXI和AflII酶切得到的质粒pGEM/A8-A9，电泳回收650bp的片段A8-A9，将其与同样用BstXI和AflII酶切消化过的质粒pCZ301进行连接、转化，取正确的阳性克隆命名为pCZ302。
(4)构建转移载体pCZ303：
将SphI酶切质粒pTG1801，酶切完全后跑电泳回收10248bp的片段，并使其自连、转化，取正确的阳性克隆命名为pCZ303。
(5)构建转移载体pCZ304：
HindIII酶切pCZ302，电泳回收2937bp大小的片段。将其与同样用HindIII酶切并去磷的质粒pCZ303连接、转化，取正确的阳性克隆命名为pCZ304。(6)构建转移载体pCZ305：
SphI单酶切pTG3602，电泳回收6126bp的片段。将其与同样用SphI酶切并去磷的载体pCZ304连接、转化，取正确的阳性克隆命名为pCZ305，pCZ305具有SEQ ID No.1的基因序列。
3.一种应用权利要求1所述的晚期启动子靶向性调控溶瘤腺病毒pCN305载体获得双靶向复制型溶瘤腺病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将内部核糖体进入位点IRES以及终止信号polyA克隆到载体pBluescript-sk上，形成含有IRES、MCS和polyA表达框的转移载体pBC/polyA。
(2)通过电转法在细菌内使双靶向的腺病毒骨架质粒pCN103和含有抑癌基因IL-24、TRAIL、SOCS3、cpp-SOCS3、SOCS1、cpp-SOCS1的重组质粒pCZ305-IL-24、pCZ305-TRAIL、pCZ305-SOCS3、pCZ305-cpp-SOCS3、pCZ305-SOCS1、pCZ305-cpp-SOCS1进行同源重组，获得重组质粒pCN305-IL-24、pCN305-TRAIL、pCN305-SOCS3、pCN305-cpp-SOCS3、pCN305-SOCS1、pCN305-cpp-SOCS1。
(3)将酶切消化后暴露出包装信号的重组腺病毒质粒pCN305-IL-24、pCN305-TRAIL、pCN305-SOCS3、pCN305-cpp-SOCS3 pCN305-SOCS1、pCN305-cpp-SOCS1分别转染到293细胞中，使其包装成病毒AdCN305-IL-24、AdCN305-TRAIL、AdCN305-SOCS3、AdCN305-cpp-SOCS3、AdCN305-SOCS1和AdCN305-cpp-SOCS1；使其高效表达IL-24、TRAIL、SOCS3、cpp-SOCS3、SOCS1和cpp-SOCS1蛋白分子。
4.一种应用权利要求3所述的方法获得的双靶向复制型溶瘤腺病毒用于制备治疗肿瘤的药物的用途。
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