CN101381712A

CN101381712A - 淀粉酶变体

Info

Publication number: CN101381712A
Application number: CNA2008100885476A
Authority: CN
Inventors: H·比斯加德-佛兰茨; A·斯文森; T·V·伯切尔特
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1995-02-03
Filing date: 1996-02-05
Publication date: 2009-03-11
Also published as: CN101117629B; CN101117629A; CN101363017A

Abstract

本发明公开了亲本α－淀粉酶变体，其(i)具有选自SEQ ID No.1－3和SEQID No.7所示氨基酸序列的氨基酸序列；或(ii)与这些氨基酸序列中的一种或多种显示出至少80％同源性；和/或显示与抗体的免疫交叉反应性，所述抗体针对具有这些氨基酸序列之一的α－淀粉酶产生；和/或由与探针杂交的DNA序列编码，所述探针与编码具有这些氨基酸序列之一的α－淀粉酶之DNA序列相同；在该变体中亲本α－淀粉酶的至少一个氨基酸残基已被缺失和/或取代；和/或相对亲本α－淀粉酶插入至少一个氨基酸残基；该变体具有α－淀粉酶活性且相对于亲本α－淀粉酶显示至少一种下列性质：热稳定性增加；氧化稳定性增加；Ca²⁺依赖性降低；其条件是该变体的氨基酸序列不与SEQ ID No.1－3和SEQ ID No.7中所示的任一序列相同。

Description

淀粉酶变体

本申请是申请日为1996年2月5日、申请号为:96191711.3、题目为:“淀粉酶变体”的分案申请。

发明所属技术领域

本发明涉及相对于亲本酶而言具有改良的性质(如，改良的热和/或氧化稳定性和/或降低的钙离子依赖性)并由此改良了洗涤和/或餐具洗涤(和/或纺织品去浆)性能的α-淀粉酶变体。本发明也涉及编码所说的变体的DNA构建体以及携带DNA构建体的载体和细胞。本发明还涉及产生淀粉酶变体的方法以及包含淀粉酶变体的去垢剂添加剂和去垢组合物。本发明还涉及淀粉酶变体在纺织品去浆上的用途。

发明背景

α-淀粉酶在工业上使用了很多年，用途很广，其中最重要的是淀粉液化、纺织品去浆、在造纸和纸浆工业方面淀粉改性以及用于酿酒和烘烤。另一个日益重要的α-淀粉酶的用途是在洗涤或餐具洗涤期间除去含淀粉的污垢。

近年来试图构建具有对特定用途(如淀粉液化和纺织品去浆)的改良的性质的α-淀粉酶变体。

例如，美国5,093,257公开了包含嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶N-末端部分和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶C-末端部分的嵌合α-淀粉酶。据记载，嵌合α-淀粉酶具有独特的性质，如与其亲本α-淀粉酶相比不同的热稳定性。然而，所有具体描述的嵌合α-淀粉酶与其亲本α-淀粉酶相比表现出降低的酶促活性。

EP252 666描述了通式为Q-R-L的杂种淀粉酶，其中Q是55至60个氨基酸残基的N-末端多肽残基，它与已说明的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶的57个N-末端氨基酸残基至少75％是同源的，R是已说明的多肽，L是包含390至400个氨基酸残基的C-末端多肽，它与已说明的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的395个C-末端氨基酸残基至少75％是同源的。

Suzuki等(1989)公开了嵌合α-淀粉酶，其中地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的指定区域已被解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶的相应区域替代。为了鉴别对热稳定性起作用的区域，构建了嵌合α-淀粉酶。发现这样的区域包括解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸残基第177-186和氨基酸残基255-270。在嵌合α-淀粉酶中氨基酸残基的改变似乎不影响酶除其热稳定性以外的性质。

WO 91/00353公开了至少一个氨基酸残基与其亲本α-淀粉酶不同的α-淀粉酶突变体。在所说的专利申请中公开的α-淀粉酶突变体由于其氨基酸取代应用于淀粉降解和/或纺织品去浆表现出改良的性质。一些突变体表现出稳定性提高，但是没有报道或指出酶促活性的改进。仅作为例子说明的突变体从亲本地衣芽孢杆菌α-淀粉酶制备，它携带下列突变之一:H133Y或H133Y+T1491。已推荐的另一个突变是A111T。

FR 2,676,456公开了地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的突变体，其中在组氨酸133附近的一个氨基酸残基和/或丙氨酸209附近的一个氨基酸残基已被一种更疏水的氨基酸残基取代。据记载，产生的α-淀粉酶突变体具有改良的热稳定性，在纺织品、造纸、酿酒和淀粉液化工业中是有用的。

EP 285 123公开了进行核苷酸序列随机诱变的方法。作为这样的序列的一个例子提到了编码嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的核苷酸序列。当突变时，获得了在低pH值下具有改良的活性的α-淀粉酶变体。

在上述参考中没有一个提到甚至暗示可以构建对去垢剂工业来说有改良的性质的α-淀粉酶突变体。

EP 525 610涉及具有对离子表面活性剂(表面活性剂)改良的稳定性的突变体酶。突变体酶通过亲本酶的表面部分的一个氨基酸残基已被另一种氨基酸残基取代产生。在EP 525 610中具体描述的唯一突变体酶是蛋白酶。淀粉酶作为可获得对离子表面活性剂改良的稳定性的酶的例子被提到，但是淀粉酶的类型、起源或具体突变都没指明。

WO 94/02597公开了在氧化剂存在下表现出改良的稳定性和活性的α-淀粉酶突变体。在突变体α-淀粉酶中，一个或多个甲硫氨酸残基已被不同于半胱氨酸和甲硫氨酸的氨基酸残基取代。据记载，α-淀粉酶突变体可用于去垢剂和/或餐具洗涤添加剂以及纺织品去浆。

WO 94 18314公开了对氧化稳定的α-淀粉酶突变体，包括在地衣芽孢杆菌α-淀粉酶M197位置的突变。

EP 368 341描述了与/不与用于洗涤和餐具洗涤的α-淀粉酶组合的支链淀粉酶和其它淀粉分解酶。

本发明的一个目的是提供α-淀粉酶变体，该变体相对于其亲本α-淀粉酶具有改良的重要性质，特别是有关所说的变体的洗涤和/或餐具洗涤性能，例如，增加的热稳定性、增加的氧化稳定性、降低的对Ca²⁺离子的依赖性和/或在适当的pH值区域中(例如，洗衣或餐具洗涤)改良的稳定性或活性。这样的变体α-淀粉酶有优势，其中，它们可以在比其亲本α-淀粉酶更低的剂量下使用。而且，α-淀粉酶变体可以除去含淀粉的污垢，而此污垢不能(或有困难)用目前已知的α-淀粉酶去垢剂酶除去。

发明的简要说明

作为本发明基础的工作的目的在于改良(如果可能的话)α-淀粉酶(特别是，具体来说可从芽孢杆菌菌株获得的α-淀粉酶)的稳定性，这些α-淀粉酶以其在碱性介质(如在洗衣或餐具洗涤中典型使用的去垢剂溶液)中除去淀粉的性能为基础相对于目前市售的α-淀粉酶选择。在这方面，本发明的发明人令人惊奇地发现:事实上有可能通过亲本α-淀粉酶的氨基酸序列的不同区域的一个或多个氨基酸残基的合理修饰来改良这样的亲本α-淀粉酶的上述类型(见上)的性质。本发明以此发现为基础。

因此，本发明的第一个方面涉及亲本α-淀粉酶的变体，所说的亲本α-淀粉酶是一种:

i)具有分别在本文的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQID No.7中所示的氨基酸序列之一；或

ii)与在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示的一种或多种氨基酸序列表现出至少80％的同源性；和/或显示出与由抗具有分别在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列之一的α-淀粉酶产生的抗体的免疫交叉反应性；和/或由与编码具有分别在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列之一的α-淀粉酶之DNA序列相同的探针杂交的DNA序列编码。

本发明的α-淀粉酶变体所符合的条件为:该变体是氨基酸序列不与在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列相同的变体。

编码所述的前三个α-淀粉酶氨基酸序列的DNA序列在SEQ ID No.4(编码在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列)、SEQ ID No.5(编码在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列)和SEQ ID No.6(编码在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列)中显示。

在WO 95/26397中也公开了SEQ ID No.1和SEQ ID No.2亲本α-淀粉酶的氨基酸序列和相应的DNA序列(分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)(和本专利申请的SEQ ID NOs.相同)。

本发明的变体是这样的变体，其中:(a)所说的亲本α-淀粉酶的至少一个氨基酸残基已被缺失；和/或(b)所说的亲本α-淀粉酶的至少一个氨基酸残基已被不同的氨基酸残基取代；和/或(c)相对亲本α-淀粉酶而言至少有一个氨基酸残基已被插入；所说的变体具有α-淀粉酶活性并且相对于亲本α-淀粉酶表现出至少一种下列性质:

增加的热稳定性，即在比使用亲本酶适合的温度更高的温度下令人满意地保持酶促活性；

增加的氧化稳定性，即对氧化剂(如氧，氧化的漂白剂等等)降解的抗性提高；

降低的Ca²⁺依赖性，即在比亲本α-淀粉酶更低浓度的Ca²⁺存在时令人满意地起作用的能力。有这种降低的Ca²⁺依赖性的α-淀粉酶在用于去垢组合物中时是十分合乎需要的，因为这样组合物典型地包含较大量的强烈结合钙离子的物质(如磷酸盐，EDTA等等)。

其它可用按照本发明的变体达到的合乎需要的性质改良或修饰(与所说的亲本α-淀粉酶相比)的例子有:

在中性或比较高的pH值(例如，pH值在7-10.5的范围内(如8.5-10.5的范围))下稳定性和/或α-淀粉分解活性提高；

在比较高的温度下(例如，在40-70℃范围内的温度)α-淀粉分解活性提高；

提高或降低等电点(pI)以使所说的α-淀粉酶变体与变体在其中使用的介质(例如，洗衣介质、餐具洗涤介质或纺织品-去浆介质)(见下)的pH值更好地匹配；

改良的对特定类型的底物的结合，改良的对底物的特异性，和/或改良的对底物裂解(水解)的特异性。

如果通过已知算法(如Lipman和Pearson，科学，227(1985)，1435所述)进行的某氨基酸序列与亲本α-淀粉酶各自氨基酸序列的比较揭示出X％的同一性，就可认为该氨基酸序列与亲本α-淀粉酶X％同源。使用缺省的GAP惩罚值，可适当地使用7.3版的GCG软件包(1993，6)的GAP计算机程序[遗传学计算机组(1991)，GCG软件包程序手册，第7版，575 Science Drive，Madison，威斯康辛州，美国53711]。

在本发明中，如上所述，和洗涤与餐具洗涤一起使用的“改良的性能”意思是分别在洗涤或餐具洗涤期间改良的含淀粉的污垢(即包含淀粉的污垢)的去除。可以在常规洗涤的和餐具洗涤实验中确定性能，通过与所说的亲本α-淀粉酶的比较来评价改良。在下面的实验部分中描述了可用于餐具洗涤性能指示的一个小规模的“小型餐具洗涤测试”的例子。

可以理解，α-淀粉酶变体的许多不同特征单独或组合起来可以促成其改良的性能，这些特征包括:比活、底物特异性、K_m(所谓的在Michaelis-Menten方程中的“米氏常数”)、V_max[给定底物在Michaelis-Menten方程基础上测定的最大转化速率(平台值(plateau))、pI、最适pH值、最适温度、热激活、对氧化剂或表面活性剂(例如，在除垢剂中的)的稳定性，等等。技术人员清楚:变体的性能不能在上述特征的基础上单独预测，而必须伴随着洗涤和/或餐具洗涤性能测试。

本发明的另一个方面涉及包含编码本发明的α-淀粉酶变体的DNA序列的DNA构建体、携带该DNA构建体的重组表达载体、用此DNA构建体或载体转化的细胞以及通过在有益于α-淀粉酶变体产生的条件下培养这样的细胞然后从培养物中回收α-淀粉酶变体以产生α-淀粉酶变体的方法。

本发明的另一个方面涉及制备亲本α-淀粉酶变体的方法，该变体由于如上所述的改良的性质和亲本α-淀粉酶比较表现出改良洗涤和/或餐具洗涤性能。这种方法包括:

a)构建包含编码所说的亲本α-淀粉酶变体的基因的细胞群，

b)在模拟至少一种洗涤和/或餐具洗涤的条件下筛选该细胞群的α-淀粉酶活性，

c)从包含编码所说的亲本α-淀粉酶变体基因的细胞群中分离出细胞，其中的变体在步骤b)选择的条件下和亲本α-淀粉酶相比具有改良的活性，

d)在适合条件下的适当培养基上培养步骤c)中分离的细胞，

e)从在步骤d)中获得的培养物中回收α-淀粉酶变体。

本发明也涉及通过后一种方法制备的变体(该变体是按照本发明的变体)。

在本发明中，术语“模拟至少一种洗涤和/或餐具洗涤条件”意思是指这样的模拟，例如，在洗涤或餐具洗涤期间最普通的温度或pH值，或在洗涤或餐具洗涤处理中所用的去垢组合物中的化学组合物。术语“化学组合物”是指包括所说的去垢组合物的一种成分，或两种或多种的成分的组合。许多不同的去垢组合物的成分列于下面。

步骤a)所指的细胞群可通过克隆编码亲本α-淀粉酶的DNA序列并使DNA进行本文下述的定点或随机诱变适当地构建。

在本发明中，术语“变体”与术语“突变体”可互换使用。术语“变体”意思是包括杂种α-淀粉酶，即包含至少两种不同α-淀粉分解酶的部分的α-淀粉酶。这样，这样一种杂种可以从，例如，从以上定义的变体衍生的一部分或多部分；或从以上定义的变体衍生的一部分或多部分以及从一种未改良的亲本α-淀粉酶衍生的一部分或多部分构建。在这方面，本发明也涉及一种产生这样的杂种α-淀粉酶的方法，其中的α-淀粉酶于与它的成分酶任一相比(即与组成杂种的一部分的任何一种酶相比)具有改良的洗涤和/或餐具洗涤性能，该方法包括:

a)使一种组分α-淀粉酶的α-淀粉酶基因或相应cDNA的N-末端编码区与另一种组分α-淀粉酶的α-淀粉酶基因或相应cDNA的C-末端编码区体内或体外重组以形成重组体，

b)选择产生与其组分α-淀粉酶相比具有改良的洗涤和/或餐具洗涤性能的杂种α-淀粉酶的重组体，

c)在适合条件下的适当培养基上培养步骤b)中选择的重组体，

d)从在步骤c)中获得的培养物中回收杂种α-淀粉酶。

本发明的另一个方面涉及本发明的α-淀粉酶变体[包括通过上述方法之一制备的任何变体或杂种]作为去垢剂酶(具体来说是用于洗涤或餐具洗涤)的用途，本发明也涉及包含α-淀粉酶变体的去垢剂添加剂和去垢剂组合物以及本发明的α-淀粉酶变体在纺织品去浆上的用途。

按照本发明的变体可通过随机诱变产生，本发明进一步涉及一种制备亲本α-淀粉酶变体的方法，该方法包括:

(a)随机诱变编码亲本α-淀粉酶的DNA序列，

(b)在宿主细胞中表达在步骤(a)中获得突变的DNA序列，

(c)筛选表达突变的淀粉分解酶的宿主细胞，该淀粉分解酶和亲本α-淀粉酶相比具有如上所述的改良性质(例如，性质如降低的Ca²⁺依赖性、增加的氧化稳定性、增加的热稳定性和/或在较高的pH值下改良的活性)。

发明详述

表示法

在本发明的描述和权利要求中，使用了常规的核苷酸单字母码和常规的氨基酸残基的单字母和三字母代码。为易于参考，本发明的α-淀粉酶变体通过使用下列表示法描述:

原来的氨基酸:位置:取代的氨基酸

按照该表示法的例子是，天冬酰胺在位置30取代丙氨酸可表示为:

Ala 30 Asn 或 A30N

相同位置的丙氨酸缺失表示为:

Ala 30^* 或 A30^*

一种附加的氨基酸残基(如赖氨酸)的插入可表示为:

Ala 30 AlaLys 或 A30AK

一段连续的氨基酸残基的缺失，以氨基酸残基30-33为例可表示为(30-33)^*。

特定α-淀粉酶包含与其它α-淀粉酶相比的“缺失”(即缺少一个氨基酸残基)和在这一位置上产生插入，这可表示为:

^*36 Asp 或 ^*36D

表示在位置36中插入一个天冬氨酸

多重突变通过加号分开，即:

Ala30Asp+Glu34Ser 或 A30N+E34S

代表在位置30和34的突变(其中丙氨酸和谷氨酸分别被天冬酰胺和丝氨酸取代)。

当一种或多种择一的氨基酸残基可以插入到给定的位置时，可以表示为:

A30N、E或

A30N 或 A30E

而且，本文中当适于修饰的位置被指明，而没有任何特定的修饰被建议时，可理解为任何其它的氨基酸残基都可取代那个位置上存在的氨基酸残基(即选自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V的任何氨基酸残基-而非在所说的位置正常存在的氨基酸残基)。这样，例如，当在位置202的甲硫氨酸的修饰(取代)被提到、但没有指定时，可以理解为任何其它的氨基酸，即任何选自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y和V中的其它氨基酸可用于取代甲硫氨酸。

亲本α-淀粉酶

已经提到，本发明的α-淀粉酶变体非常适于在具有分别在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列之一的亲本α-淀粉酶的基础上制备。

具有分别在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶可从亲碱的(alkaliphilic)芽孢杆菌属菌株(分别为菌株NCIB12512和菌株NCIB 12513)获得，它们在EP 0 277 216 B1中详尽描述。这两种亲本α-淀粉酶的制备、纯化和测序在WO 95/26397中详细描述[参见本文的实验部分(见下)]。

具有SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶可从嗜热脂肪芽孢杆菌获得并在(特别是)细菌学杂志，166(1986)，635-643中描述。

具有SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶(它和在图1中的第4个序列相同)可从“芽孢杆菌属一个种#707”中获得并由Tsukamoto等在生物化学和生物物理学研究通讯，151(1988)，25-31页描述。

除了上述的具有分别在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQID No.7中所示的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶的变体之外，按照本发明的其它感兴趣的变体包括具有表现出和后面的四种氨基酸序列至少一种之高度同源性的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶的变体，如至少70％同源，优选的(如上所述的)至少80％同源，希望至少85％同源，更优选的至少90％同源，例如，≥95％同源。

如上所述，鉴别适当的亲本α-淀粉酶的进一步标准是:a)α-淀粉酶显示出与如下抗体的免疫交叉反应性，所述抗体针对具有分别在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示氨基酸序列之一的α-淀粉酶产生，和/或b)α-淀粉酶由如下DNA序列编码，所述DNA与编码具有分别在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7所示氨基酸序列之一的α-淀粉酶的DNA序列与相同的探针杂交。

已经提到，对于多肽(如酶)同源程度的测定，可以使用已知算法进行(如Lipman和Pearson所描述的(1985))氨基酸序列比较。

可以使用抗体进行免疫交叉反应性测定，所述抗体是抗具有SEQ IDNo.1中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的、或具有在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的、或具有在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的、或具有在SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的至少一种表位所产生的或与之反应的。

抗体可是单克隆或多克隆的，可通过本领域已知的方法(例如，象由Hudson等所描述的(1989))产生。在本领域中熟知的适当测定技术的例子包括Western印迹法和径向免疫扩散测定，例如，由Hudson等所描述的(1989)。

以探针杂交[上述标准b)]为基础用于鉴别适当的亲本α-淀粉酶的寡核苷酸探针可以，例如，适当地在这样的α-淀粉酶的全部或部分氨基酸序列的基础上制备(该α-淀粉酶具有分别在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3和SEQ ID No.7中所示的序列之一)，或者在此α-淀粉酶相应的核苷酸序列的全部或部分的基础上制备。

用以测试杂交的适当条件包括在5×SSC中预浸渍，在～40℃的pH6.8的20％甲酰胺、5×Denhardt’s溶液、50mM磷酸钠以及50μg变性的超声处理小牛胸腺DNA的溶液中预杂交1小时，接着在～40℃下和补充了100μMATP的相同溶液中杂交18小时，或者使用其它由，例如，Sambrook等(1989)描述的方法。

突变对特定性质的影响

从本发明发明人获得的结果可以看出，相对于所说的亲本α-淀粉酶，变体表现出的特定性质(例如，热稳定性或氧化稳定性)的变化在相当大的程度上与变体中突变(氨基酸的取代、缺失与插入)的类型和位置有关。然而，可以理解，特定的突变或突变方式导致给定性质的变化的观察结果决不排除所说的突变也能影响其它性质的可能性。

氧化稳定性:对于提高相对于其亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶变体的氧化稳定性，看来特别需要亲本的至少一个(优选的是多个)可氧化的氨基酸残基被缺失或被一种比原来的可氧化的氨基酸残基对氧化敏感性低的不同的氨基酸残基取代。

具体来说，在这一点上有关的可氧化的氨基酸残基是半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和酪氨酸。这样，例如，在包含半胱氨酸的亲本α-淀粉酶的情况下，可预期半胱氨酸残基的缺失或被可氧化性低的氨基酸残基的取代在获得相对于亲本α-淀粉酶具有改良的氧化稳定性的变体中是重要的。

在上述具有分别在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶的情况下(所有这些亲本α-淀粉酶不包含半胱氨酸残基但具有较多的甲硫氨酸含量)，甲硫氨酸残基的缺失或取代对于达到产生的变体的改良的氧化稳定性是尤其有关的。这样，在SEQ ID No.1、SEQID No.2和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的M9、M10、M105、M202、M208、M261、M309、M382、M430和M440位置和/或在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的M323位置的一个或多个甲硫氨酸残基的缺失或取代[例如，被苏氨酸(T)或已被以上所列其它氨基酸之一取代](或符合上述亲本α-淀粉酶的其它标准之一的另一种α-淀粉酶序列的相当的(equivalent)位置的甲硫氨酸残基的缺失或取代)对于提高氧化稳定性看来是尤其有效的。

在具有在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶的情况下，对于以改良氧化稳定性为目的而缺失或取代的有关氨基酸残基包括单一的半胱氨酸残基(C363)以及-通过和在SEQ ID No.1和SEQ ID No.3中所示的序列类比-定位在位置M8、M9、M96、M200、M206、M284、M307、M311、M316和M438的甲硫氨酸残基。

在这方面，术语“相当的位置”指的是这样的位置，在以所说的亲本α-淀粉酶氨基酸序列和所说的“参比”α-淀粉酶的氨基酸序列(如在SEQ ID No.1中所示的序列)的序列对比为基础使二者共同的氨基酸残基/区域对合时，该位置最接近地对应于所说参比序列中的特定位置(例如，被相同的氨基酸残基占据)。

与具有分别在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的氧化稳定性的改良(提高)有关的特定的目的突变是一种或多种下列的甲硫氨酸取代(或其在符合本发明的亲本α-淀粉酶要求的其它α-淀粉酶的氨基酸序列中的相当的取代):M202A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y、V。

在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列中的其它有关甲硫氨酸取代是:M323A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y、V。

与具有在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的氧化稳定性的改良(提高)有关的特定的目的突变是一种或多种下列的甲硫氨酸取代:M200A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y、V；M311A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y、V；以及M316A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y、V。

热稳定性:就相对于其亲本α-淀粉酶提高α-淀粉酶变体的热稳定性而言，缺失在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列中的至少一个，优选的是两个或甚至三个下列氨基酸残基(或其相当物)显得特别合乎需要:F180、R181、G182、T183、G184和K185。相应地，分别在SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列中的相应的特别相关的(和相当的)氨基酸残基是:F180、R181、G182、D183、G184和K185(SEQ ID No.2)；F178、R179、G180、I181、G182和K183(SEQ ID No.3)；以及F180、R181、G182、H183、G184和K185(SEQ ID No.7)。

这种类型的特别感兴趣的成对(pairwise)缺失如下:

R181^*+G182^*；以及T183^*+G184^*(SEQ ID No.1)；

R181^*+G182^*；以及D183^*+G184^*(SEQ ID No.2)；

R179^*+G180^*；以及I181^*+G182^*(SEQ ID No.3)；和

R181^*+G182^*；以及H183^*+G184＂(SEQ ID No.7)。

(或在另一种符合本发明的亲本α-淀粉酶的要求的α-淀粉酶中这些成对缺失的相当的缺失)。

其它显得重要的与热稳定性有关的突变是:在SEQ ID No.1中所示的序列中的P260至I275的氨基酸残基中的一个或多个取代(或其在本发明的另一个亲本α-淀粉酶中的相当的取代)，如在位置269赖氨酸残基的取代。

与相对于所说的亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶变体的热稳定性有关的显得重要的具体突变的例子是在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的一个或多个下列取代(或其在本发明的另一个亲本α-淀粉酶中的相当的取代):K269R；P260E；R124P；M105F、I、L、V；M208F、W、Y；L217I；V206I、L、F。

对于具有SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶，重要的进一步(相当的)突变是相应的一个或多个下列取代:M1O5F、I、L、V；M208F、W、Y；L217I；V206I、L、F；K269R。

对于具有SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶，重要的进一步(相当的)突变是相应的一个或两个下列取代:M206F、W、Y；L215I。

对于具有SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶，重要的进一步(相当的)突变是相应的一个或多个下列取代:M105F、I、L、V；M208F、W、Y；L217I；K269R。

显得重要的(特别是与所说的亲本α-淀粉酶相比达到改良的热稳定性的α-淀粉酶变体)突变的其它例子是:在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ IDNo.7中所示的氨基酸序列中的一个或多个下列取代(或其在本发明的另一个亲本α-淀粉酶中的相当的取代):A354C+V479C；L351C+M430C；N457D，E+K385R；L355D，E+M430R，K；L355D，E+I411R，K；N457D，E。

Ca²⁺依赖性:就达到α-淀粉酶变体相对于其亲本α-淀粉酶降低的Ca²⁺依赖性[即就获得一种变体而言，该变体在外部介质中的钙离子浓度比亲本酶所必需的更低时表现出令人满意的淀粉分解活性，因此，该变体，例如，比亲本对消减钙离子的条件(如在包含钙络合剂(如某些增强去垢剂去污能力的物质)的介质中获得的条件)的敏感性低]而言，在SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列中掺入一个或多个下列取代(或在本发明的另一个亲本α-淀粉酶中的相当的取代)显得尤其合乎需要:Y243F、K108R、K179R、K239R、K242R、K269R、D163N、D188N、D192N、D199N、D205N、D207N、D209N、E190Q、E194Q和N106D。

在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列的情况下，特别合乎需要的取代相应地(相当地)表现为下列的一个或多个:K107R、K177R、K237R、K240R、D162N、D186N、D190N、D197N、D203N、D205N、D207N、E188Q和E192Q。

另外，上述的用N残基取代D残基以及用Q残基取代E残基，其它在降低的Ca²⁺依赖性中的有关的取代是所说的D和/或E残基用任何其它的氨基酸残基取代。

在达到降低的Ca²⁺依赖性中显得重要的其它取代是存在于下列位置的氨基酸残基的成对取代:在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的位置113和151以及位置351和430；以及在SEQ IDNo.3中所示的氨基酸序列的位置112和150以及位置349和428(或在本发明中另一个亲本α-淀粉酶中的相当的成对取代)，即下列氨基酸残基的成对取代:

G113+N151(涉及SEQ ID No.1)；A113+T151(涉及SEQ ID No.2和SEQ IDNo.7)；G112+T150(涉及SEQ ID No.3)；L351+M430(涉及SEQ ID No.1，SEQID No.2和SEQ ID No.7)；L349+I428(涉及SEQ ID No.3)。

关于达到降低的Ca²⁺依赖性，这类特别感兴趣的成对取代如下:

G113T+N151I(涉及SEQ ID No.1)；A113T+T151I(涉及SEQ ID No.2和SEQ ID No.7)；G112T+T150I(涉及SEQ ID No.3)；以及

L351C+M430C(涉及SEQ ID No.1，SEQ ID No.2和SEQ ID No.7)；L349C+I428C(涉及SEQ ID No.3)。

就Ca²⁺依赖性的适当取代而言，一些其它取代(这些取代在稳定酶构象中是重要的，而且可以考虑通过，例如，提高钙离子在α-淀粉分解酶之内的钙结合位点之上或之内结合或保持的能力，达到这种结果)是:在SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列中的一个或多个下列取代(或在本发明中另一个亲本α-淀粉酶中的相当的取代):G304W、F、Y、R、I、L、V、Q、N、G305A、S、N、D、Q、E、R、K；H408Q、E。

在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列中的相应的(相当的)取代是:G302W、F、Y、R、I、L、V、Q、N；G303A、S、N、D、Q、E、R、K。

在达到降低的Ca²⁺依赖性中显得重要的其它突变是选自下列位置的氨基酸的成对缺失(即两个氨基酸的缺失):在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列中的R181、G182、T183和G184(或在本发明中符合亲本α-淀粉酶要求的另一种α-淀粉酶的氨基酸序列中的相当位置)。这样的成对缺失如下:

R181^*+G182^*；T183^*+G184^*；R181^*+T183^*；G182^*+T183^*；

G182^*+G184^*；R181^*+G184^*(SEQ ID No.1)；

R181^*+G182^*；D183^*+G184^*；R181^*+D183^*；G182^*+D183^*；

G182^*+G184^*；R181^*+G184^*(SEQ ID No.2)；

R179^*+G180^*；I181^*+G182^*；R179^*+I181^*；G180^*+I181^*；

G180^*+G182^*；R179^*+G182^*(SEQ ID No.3)；

R181^*+G182^*；H183^*+G184^*；R181^*+H183^*；G182^*+H183^*；

G182^*+G184^*；R181^*+G184^*(SEQ ID No.7)；

(或这些成对缺失在另一种符合本发明的亲本α-淀粉酶要求的另一种α-淀粉酶中相当的缺失)。

等电点(pI):初步结果表明:α-淀粉酶的洗涤性能，例如，洗衣洗涤性能在洗涤液(洗涤介质)的pH值接近所说的α-淀粉酶的pI值时是最优的。这样，适当时产生具有和介质(如洗涤介质)(在其中使用所说的酶)的pH值更好匹配(与所说的亲本α-淀粉酶的等电点相比)的等电点(pI值)的α-淀粉酶变体时是合乎需要的。

关于降低等电点，在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列中的优选的突变包括下列取代中的一个或多个:Q86E、R124P、S154D、T183D、V222E、P260E、R310A、Q346E、Q391E、N437E、K444Q和R452H。这些降低等电点的取代的适当组合包括:Q391E+K444Q；Q391E+K444Q+S154D。

相应地，有关降低等电点的在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列的优选的突变包括下列取代中的一个或多个:L85E、S153D、I181D、K220E、P258E、R308A、P344E、Q358E和S435E。

就提高等电点而言，在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列中的优选的突变包括下列取代中的一个或多个:E86Q、L；D154S；D183T、I；E222V、K；E260P；A310R；E346Q、P；E437N、S；和H452R。

在下面的实验部分中描述了按照本发明的许多变体的构建。

本发明的α-淀粉酶变体，除了具有一种或多种上述的改良的性质之外，优选地是这样的变体，该变体在低的底物浓度下具有比亲本α-淀粉酶更高的淀粉水解速度。或者，本发明的α-淀粉酶变体优选地是这样的变体，该变体在相同条件下测试时比亲本α-淀粉酶具有更高的V_max和/或更低的K_m。在杂种α-淀粉酶的情况下，用于进行比较的“亲本α-淀粉酶”应该是具有最好性能的组份酶之一。

V_max和K_m(Michaelis-Menten方程的参数)可通过众所周知的方法测定。

制备α-淀粉酶变体的方法

在本领域中已知几种用于把突变导入基因的方法。在简要地讨论编码α-淀粉酶的DNA序列的克隆之后，将讨论在编码α-淀粉酶的序列之内的特定位点产生突变的方法。

克隆编码α-淀粉酶的DNA序列

使用本领域各种熟知的方法可从产生所说的α-淀粉酶的任何细胞或微生物中分离编码亲本α-淀粉酶的DNA序列。第一，使用得自产生所研究的α-淀粉酶的有机体的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。然后，如果α-淀粉酶的氨基酸序列是已知的，就可以合成并使用同源、标记的寡核苷酸探针以从所说的从有机体制备的基因组文库中鉴别编码α-淀粉酶的克隆。或者，包含和已知α-淀粉酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针可用作在较不严格的杂交和洗涤条件下鉴别编码α-淀粉酶的克隆的探针。

另一个用于鉴别编码α-淀粉酶的克隆的方法包括:把基因组DNA片段插入到表达载体(如质粒)中以产生的基因组DNA文库转化α-淀粉酶阴性细菌，然后把转化的细菌平板接种到包含α-淀粉酶底物的琼脂上，由此使得可以鉴别表达α-淀粉酶的克隆。

或者，编码酶的DNA序列可以通过已知的标准方法合成制备，例如，由S.L Beaucage和M.H.Caruthers(1981)描述的phosphoamidite方法或Matthes等(1984)描述的方法。在phosphoamidite方法中，寡核苷酸，例如，在一台自动化DNA合成仪上合成、纯化、退火、连接和克隆到适当的载体中。

最后，DNA序列可以是混合的基因组和合成的起源，混合的合成和cDNA起源或混合的基因组和cDNA起源，可按照标准技术通过连接合成的、基因组的或cDNA起源的片段(适当时，对应于整个DNA序列不同部分的片段)来制备。DNA序列也可以使用特异性的引物通过聚合酶链式反应(PCR)制备，例如在美国4,683,202中或R.K.Saiki等(1988)描述的方法。

定点诱变

一旦分离到编码α-淀粉酶的DNA序列以及鉴别到所需的突变位点后，就可以使用合成的寡核苷酸导入突变。这些寡核苷酸包含在所需的突变位点侧翼的核苷酸序列；在寡核苷酸合成期间插入突变体核苷酸。在特异性的方法中，在携带α-淀粉酶基因的载体中产生桥连接编码α-淀粉酶的序列的DNA单链缺口。然后，使携带所需突变的合成核苷酸与单链DNA的同源部分退火。以DNA聚合酶I(Klenow片段)填充剩余的缺口，然后使用T4连接酶连接构建体。Morinaga等(1984)描述了这种方法的具体例子。美国4,760,025公开了通过进行微小盒式改变而导入编码多种突变的寡核苷酸。然而，通过Morinaga的方法在任何一次都可以导入甚至更多种类的突变，因为可以导入很多各种长度的寡核苷酸。

Nelson和Long(1989)描述了另一种把突变导入编码α-淀粉酶的DNA序列的方法。它包括包含所需的突变(通过使用化学合成的DNA链作为PCR反应中的引物之一导入)的PCR片段的3步生成。可以通过用限制性核酸内切酶裂解从PCR生成的片段中分离携带突变的DNA片段，然后再插入到表达质粒中。

随机诱变

随机诱变适合在翻译成所说的氨基酸序列的基因中的至少三个部分或在整个基因之内以定位或区域特异性随机诱变进行。

对于以提高热稳定性为目的的区域特异性随机诱变，具体来说，下列的密码子位置可适当地作为目标(使用单字母氨基酸缩写和氨基酸残基在所说的序列中的编号):

在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列中:

120-140＝VEVNRSNRNQETSGEYAIEAW

178-187＝YKFRGTGKAW

264-277＝VAEFWKNDLGAIEN

在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列中:

120-140＝VEVNPNNRNQEISGDYTIEAW

178-187＝YKFRGDGKAW

264-277＝VAEFWKNDLGALEN

在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列中:

119-139＝VEVNPSDRNQEISGTYQIQAW

176-185＝YKFRGIGKAW

262-275＝VGEYWSYDINKLHN

在SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列中:

120-140＝VEVNPNRNQEVTGEYTIEAW

178-187＝YKFRGHGKAW

264-277＝VAEFWKNDLGAIEN

以达到降低的Ca²⁺依赖性为目的时，具体来说，下列密码子位置可适当地作为目标:

在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列中:

178-209＝YKFRGTGKAWDWEVDTENGNYDYLMYADVDMD

237-246＝AVKHIKYSFT

在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列中:

178-209＝YKFRGDGKAWDWEVDSENGNYDYLMYADVDMD

237-246＝AVKHIKYSFT

在SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列中:

178-209＝YKFRGHGKAWDWEVDTENGNYDYLMYADIDMD

237-246＝AVKHIKYSFT

以达到α-淀粉酶变体增加的底物结合(即增加的碳水化物类-如直链淀粉或支链淀粉这些α-淀粉分解酶的底物的结合)、改良的(例如，更高的)底物特异性和/或改良的(例如，更高的)对底物裂解(水解)的特异性为目的时，在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的下列密码子位置(或在本发明中另一个亲本α-淀粉酶的相当的密码子位置)显得尤其适合作为目标:

在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列中:

15-20＝WYLPND

52-58＝SQNDVGY

72-78＝KGTVRTK

104-111＝VMNHKGGA

165-174＝TDWDQSRQLQ

194-204＝ENGNYDYLMYA

234-240＝RIDAVKH

332-340＝HDSQPGEAL

按照本发明的上述方法的步骤a)进行的编码亲本α-淀粉酶的DNA序列的随机诱变可以使用本领域任何已知的方法方便地进行。例如，可以通过使用适当的物理或化学诱变剂、使用适当的寡核苷酸或使DNA序列经受PCR产生的诱变进行随机诱变。而且，可以通过使用这些诱变剂的任何组合进行随机诱变。

诱变剂可以是一种，例如，诱导转换、颠换、倒位、乱序(scrambling)、缺失和/或插入的诱变剂。

适于此目的的物理或化学诱变剂的例子包括:紫外(UV)照射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸以及核苷酸类似物。

当使用这样的试剂时，诱变典型地通过在选择的诱变剂存在时，于适合诱变产生的条件下，温育需诱变的编码亲本酶的DNA序列并选择具有所需性质的突变DNA进行。

当诱变通过使用寡核苷酸进行时，在寡核苷酸合成期间，在要改变的位置，寡核苷酸可以以三个非亲本的核苷酸掺入或掺加。进行掺入或掺加以避免不合需要的氨基酸的密码子。掺入或掺加的寡核苷酸可以通过任何已发表的技术使用，例如，PCR、LCR或任何DNA聚合酶和连接酶掺入到编码淀粉分解酶的DNA中。

使用PCR产生的诱变时，在增加核苷酸的错误掺入的条件下使化学处理的或非处理的编码亲本α-淀粉酶的基因经受PCR(Deshler，1992；Leung等，技术，第1卷，1989，11-15)。

大肠杆菌(Fowler等，分子基因遗传学，133，1974，179-191)、酿酒酵母或任何其它微生物的增变菌株(可通过，例如，把包含亲本酶的质粒转化进增变菌株，培养含质粒的增变菌株并从增变菌株中分离突变的质粒)用于编码淀粉分解酶的DNA的随机诱变。其后，突变的质粒可以转化进表达有机体。

要诱变的DNA序列可以方便地存在于从表达亲本淀粉分解酶的有机体中制备的基因组或cDNA文库中。或者，DNA序列可以存在于合适的载体如质粒或噬菌体中，这些载体可以和诱变剂温育或以其它方式暴露于诱变剂。需诱变的DNA也可以通过整合进所说的细胞的基因组或存在于细胞所含载体中而存在于宿主细胞中。最后，需诱变的DNA可以以隔离形式存在。可以理解，要经受随机诱变的DNA序列优选地是cDNA或基因组DNA序列。

在某些情况下，在进行表达步骤(b)或筛选步骤(c)之前可以方便地扩增突变的DNA序列。这种扩增可以按照本领域已知的方法进行，目前优选的方法是使用在亲本酶的DNA或氨基酸序列的基础上制备的寡核苷酸引物进行PCR产生的扩增。

在和诱变剂温育或暴露于诱变剂之后，突变的DNA通过使得可以产生表达的条件下培养携带DNA序列的适当宿主细胞表达。用于这个目的的宿主细胞可以是用在或不在载体中的突变的DNA序列转化的细胞，或在诱变处理期间携带编码亲本酶的DNA序列的细胞。适合的宿主细胞的例子如下:革兰氏阳性细菌如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌；以及革兰氏阴性细菌如大肠杆菌。

突变的DNA序列还包括编码允许突变DNA序列表达的功能的DNA序列。

定位随机诱变:随机诱变有利地是定位在所说的亲本α-淀粉酶的一部分。这在，例如，当鉴别出酶的某些区域对于酶的给定性质特别重要以及当期望改良可产生具有改良性质的变体时可能是有利的。当对亲本酶的三级结构阐明并与酶的功能有关时，通常可以鉴别这样的区域。

通过使用上述的PCR产生的诱变技术或任何其它在本领域中已知的合适技术可以方便地进行定位随机诱变。

或者，可以通过，例如，插入到合适的载体中以分离编码要改良的DNA序列部分的DNA序列，其后，所说的部分通过使用上述的任何诱变方法经受诱变。

关于在本发明的上述的方法中的筛选步骤，可以使用通过基于下列原理的滤膜测定方便地进行:

能表达突变的目的淀粉分解酶的微生物在适于酶分泌的条件下在适当的培养基上培养，培养基具有包括第一层结合蛋白质的滤膜和其上表现出低的蛋白质结合能力的第二层滤膜的双层滤膜。微生物位于第二层滤膜上。尔后进行培养时，把包含微生物分泌的酶的第一层滤膜从包含微生物的第二层滤膜上分离下来。第一层滤膜进行所需的酶促活性筛选，同时鉴别存在于第二层滤膜上的相应微生物菌落。

用于结合酶促活性的滤膜可以是任何结合蛋白质的滤膜，例如，尼龙或硝化纤维膜。携带表达有机体的菌落的上层滤膜可以是对结合蛋白质没有亲和力或亲和力低的任何滤膜，例如，乙酸纤维素或Durapore^TM。滤膜可用用于筛选的任何条件预处理或在酶促活性检测期间处理。

酶促活性可以通过染料、荧光、沉淀、pH指示剂、IR-吸收率或任何其它已知的用于检测酶促活性的技术来检测。

检测化合物可以通过任何固定剂固定，例如，琼脂糖、琼脂、明胶、聚丙烯酰胺、淀粉、滤纸、布；或固定剂的任何组合。

α-淀粉酶活性可通过在琼脂糖上固定的Cibacron Red标记的支链淀粉检测。为了筛选具有增加的热和高pH值稳定性的变体，结合有α-淀粉酶变体的滤膜在pH为10.5以及60℃或65℃下的缓冲液中温育指定的时间，在去离子水中简短漂洗并置于支链淀粉-琼脂糖基质上进行活性检测。剩余的活性通过支链淀粉降解导致的Cibacron Red裂解可以看出来。选择这样的条件是因为具有在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的活性几乎不能检测出来。由于Cibacron Red的释放增加，稳定变体在相同的条件下表现出较高的颜色强度。

为了筛选在更低的温度下和/或更宽的温度范围内活性最优的变体，把结合有变体的滤膜直接放置在支链淀粉-Cibacron Red的底物平板上并在所需的温度下(例如，4℃，10℃或30℃)温育指定的时间。在这个时间之后由于具有在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的活性几乎不能检测出来，而在更低的温度下有最优活性的变体显示出提高了支链淀粉的裂解。为了筛选所说的变体对所述添加剂改变的依赖性或反应性，在支链淀粉基质上温育之前可以在所有种类所需的培养基-例如，包含Ca²⁺、除垢剂、EDTA或其它有关添加剂的溶液-中温育。

制备杂种α-淀粉酶的方法

作为位点特异性诱变的替代性方法，可以通过结合所说的各个的基因的有关部分制备是至少两种成分α-淀粉酶的杂种的α-淀粉酶变体。

天然产生的酶可通过上述的随机或定点诱变遗传改良。或者，一种酶的一部分可以已被另一种的一部分取代以获得嵌合酶。这种取代可以通过常规的体外基因剪接技术或体内重组或这两种技术的组合达到。使用常规的体外基因剪接技术时，α-淀粉酶基因的编码序列的所需部分使用适当的位点特异性限制酶缺失；然后编码序列缺失的部分可以通过不同α-淀粉酶的编码序列的所需部分的插入取代，这样就产生了编码新的α-淀粉酶的嵌合核苷酸序列。或者，可以通过，例如，使用由Higuchi等(1988)描述的PCR重叠延伸方法融合α-淀粉酶基因。

体内重组技术取决于下列事实:具有高度同源区(DNA序列相同)的不同DNA片断可以重组，即切断和交换DNA，然后在同源区建立新键。因此，当两种不同但同源的淀粉酶的编码序列用于转化宿主细胞时，在体内同源序列的重组就导致嵌合基因序列的产生。这些编码序列通过宿主细胞的翻译将导致嵌合淀粉酶基因产物的产生。特异性体内重组技术在美国5,093,257和EP 252 666中描述。

或者，可以通过本领域已知的标准化学方法合成杂种酶。例如，参见Hunkapiller等(1984)。因此，具有适当的氨基酸序列的肽可全部或部分合成并连接以形成本发明的杂种酶(变体)。

α-淀粉酶变体的表达

按照本发明，通过上述方法或本领域已知的任何替代方法产生的编码突变的α-淀粉酶的DNA序列可以使用表达载体以酶的形式表达，该表达载体典型地包括编码启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号的控制序列以及可有可无的阻遏物基因或各种激活基因。

携带编码本发明的α-淀粉酶变体的DNA序列的重组表达载体可以是任何可方便地经受重组DNA过程的载体，载体的选择常取决于它要导入的宿主细胞。这样，载体可以是自主复制载体(即作为染色体外实体存在的载体，它的复制独立于染色体的复制)，例如，质粒、噬菌体或染色体外成分、微型染色体或人工染色体。或者，载体可以是当导入宿主细胞时整合进宿主细胞基因组并与它所整合的染色体一道复制的载体。

在载体中，DNA序列应可操作地连接到合适的启动子序列上。启动子可以是任何在选择的宿主细胞中所示出转录活性并可衍生自编码对宿主细胞来说是同源的或异源的蛋白质的基因的DNA序列。指导编码本发明的α-淀粉酶变体的DNA序列的转录的适合的启动子的例子(尤其是在细菌宿主中)是大肠杆菌乳糖操纵子的启动子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因的dagA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因的启动子(amyM)、解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的启动子(amyQ)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。对于真菌宿主中的转录，有用的启动子的例子是那些衍生自编码下列酶的基因的启动子:米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶。

本发明的表达载体也可以包含适当的转录终止子，在真核生物中还包含可操作地连接到编码本发明的α-淀粉酶变体的DNA序列上的聚腺苷酸化序列。终止和聚腺苷酸化序列可以适当地从与启动子相同的来源衍生。

载体还可以包括使载体能够在所说的宿主细胞中复制的DNA序列。这样的序列的例子是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和plJ702的复制起点。

载体也可以包含选择标记，例如，其产物补充了宿主细胞中的缺陷的基因，如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因或赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。进而，载体可包括曲霉属的选择标记如amdS、argB、niaD和引起潮霉素抗性的标记sC，选择也可以通过，例如，在WO 91/17243中描述的共转化完成。

尽管在某些方面胞内表达有优势，例如，当使用某些细菌作为宿主细胞时，通常优选的表达是胞外表达。

适于构建本发明的编码α-淀粉酶变体并分别包含启动子、终止子以及其它成分的载体的方法是本领域技术人员熟知的[参见，例如，Sambrook等(1989)]。

包含上述本发明的DNA构建体或表达载体的本发明的细胞在本发明α-淀粉酶变体的重组产生中用作宿主细胞是有优势的。细胞可以方便地通过把DNA构建体(一个或多个拷贝)整合进宿主染色体中以用本发明的编码变体的DNA构建体转化。由于DNA序列在细胞中更可能稳定保持，这种整合通常已被认为是一个优点。DNA构建体整合进宿主染色体可按照常规方法(例如，通过同源或异源重组)进行。或者，细胞可以用上述与不同类型的宿主细胞联系的表达载体转化。

本发明的细胞可以是高等有机体的细胞，如哺乳动物或昆虫的细胞，但是优选的是微生物细胞，例如，细菌或真菌(包括酵母)细胞。

合适的细菌的例子如下:革兰氏阳性细菌，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌；以及革兰氏阴性细菌如大肠杆菌。细菌的转化可以通过，例如，原生质体的转化或以本来已知的方式使用感受态细胞完成。

酵母有机体有利的选自酵母属或裂殖酵母属的物种，例如，酿酒酵母。丝状真菌可有利地属于曲霉属的物种，例如，米曲霉或黑曲霉。真菌细胞转化方法包括按本来已知的方式形成和转化原生质体以及然后的细胞壁再生。用于曲霉属宿主细胞转化的适当方法在EP 238 023中描述。

在另一个方面，本发明涉及产生本发明的α-淀粉酶变体的方法，该方法包括如上所述的在有利于变体产生的条件下培养宿主细胞以及从细胞和/或培养基中回收变体。

用于培养细胞的培养基可以是任何适于培养所说的宿主细胞并获得本发明的α-淀粉酶变体表达的常规培养基。合适培养基可从商业供应者得到，或按照已发表的处方制备(例如，在美国典型培养物收集中心的目录中所描述的)。

分泌自宿主细胞的α-淀粉酶变体可通过众所周知的方法方便地从培养基中回收，该方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，通过盐(如硫酸铵)的方式沉淀培养基中的蛋白质组分然后再使用层析(如离子交换层析、亲和层析等等)。

工业应用

由于在碱性pH值下本发明的α-淀粉酶变体的活性，它们特别适合在各种工业加工中使用。具体来说，在洗涤、餐具洗涤和硬表面清洁去垢组合物(见下)中它们都有潜在的应用，但是在从淀粉中产生增甜剂和乙醇也是有用的。常规淀粉转化加工和液化和/或糖化加工的条件在，例如，美国3,912,590、EP 252,730和EP 63,909中描述。

本发明的α-淀粉酶变体的应用的某些领域概述如下。

有关纸的应用:本发明的α-淀粉酶变体具有从淀粉加固(starch-reinforced)的废纸和废纸板产生木质纤维素材料(如纸浆、纸和纸板)的有价值的性质，尤其是重新纸浆化发生在pH值高于7的地方以及淀粉酶通过加固淀粉的降解有利于废材料分解的地方。本发明的α-淀粉酶变体特别适于从淀粉包衣的或包含淀粉的废印刷纸造纸的脱墨/再利用加工。为了产生高亮度的新纸，除去印刷墨通常是合乎需要的；本发明的变体如何以这种方法使用的例子在PCT/DK94/00437中描述。

本发明的α-淀粉酶变体在改良淀粉中也是十分有用的，酶促改良的淀粉用于和碱性填料(如碳酸钙、高岭土和粘土)一起造纸。对于本发明的碱性α-淀粉酶变体，在填料存在下改良淀粉是切实可行的，这样就使得可以进行更简单、更完整的加工。

纺织品去浆(desizing):本发明的α-淀粉酶变体也特别适于纺织品去浆。在纺织品加工工业中，在去浆加工中传统地使用α-淀粉酶作为助剂来促进除去包含淀粉的浆糊(size)，这种浆糊在纺织期间作为对织物纱的保护性包衣。

在纺织后完全除去浆糊对于确保在随后加工中的最优效果是重要的，其中对所说的织物进行洗涤、漂白和染色。酶促淀粉降解是优选的，因为它不损害纺织品或织物的纤维。

为了减少加工成本并增加制造厂的生产量，去浆处理有时与洗涤和漂白步骤结合使用。在这种情况下，非酶助剂(如碱或氧化剂)典型地用于分解淀粉，因为传统的α-淀粉酶不是十分与高pH水平和漂白剂相容。淀粉浆糊的非酶促分解由于所使用的相当攻击性的(aggressive)化学药品确实导致了一些纤维的破坏。

本发明的在较高的pH水平并有氧化(漂白)剂存在下显示出增加的淀粉降解性能的α-淀粉酶变体特别适合用于上述的去浆加工，尤其是适于代替当前使用的非酶去浆剂。α-淀粉酶变体可单独使用或在去浆包含纤维素的织物或纺织品时与纤维素酶结合使用。

啤酒生产:本发明的α-淀粉酶变体在啤酒酿造过程中也已被认为是非常有用的；在这个过程中，典型地是在捣碎处理时添加变体。

在用于洗涤或餐具洗涤的去垢剂添加剂和去垢组合物中的应用:由于改良的洗涤和/或餐具洗涤性能常是上述性质改良的结果，本发明的许多α-淀粉酶变体(包括杂种)尤其适于掺入去垢组合物，例如，有意在pH值7-13的范围中，具体来说是pH值8-11的范围内使用的去垢组合物。按照本发明，α-淀粉酶变体可作为去垢组合物的组分添加。这样，它可以以去垢剂添加剂的形式包括在去垢组合物中。

这样，本发明的另一个方面涉及包含按照本发明的α-淀粉酶变体的去垢剂添加剂。酶可以通过添加包含一种或多种酶的分开的添加剂或添加包含所有这些酶的组合添加剂包括在去垢组合物中。本发明的去垢剂添加剂(即一种分离的添加剂或组合的添加剂)可以制成例如，粒状、液体、浆体等。去垢剂添加剂的优选的酶制剂是粒剂(具体来说是非粉状粒剂)、液体(具体来说是稳定的液体)、浆体或受保护酶(见下)。

去垢组合物以及去垢剂添加剂还可以包含一种或多种通常在除垢剂中使用的其它酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉分解酶、氧化酶(包括过氧化物酶)或纤维素酶。

已经发现:当α-淀粉酶与另一种淀粉分解酶(如支链淀粉酶、异淀粉酶、β-淀粉酶、淀粉葡糖甙酶以及CTG酶)结合时可以在洗涤和/或餐具洗涤性能中获得实质上的改进。适于给定目的的市售淀粉分解酶的例子是AMG^TM、Novamyl^TM和Promozyme^TM，它们都可从Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Demark得到。因此，本发明的一个特定实施方案涉及包含本发明的α-淀粉酶变体与至少一种其它的淀粉分解酶(例如，在上述的那些酶中选择)结合的去垢剂添加剂。

非粉状粒剂可以如，例如在美国4,106,991和美国4,661,452中公开的方法产生，可有可无地通过本领域已知的方法包衣；有关包衣的细节如下所述。当不同的去垢剂酶的组合使用时，酶可以在成为粒状之前或之后混合。

液态酶制剂可按照已知的技术通过，例如，添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸使其稳定。其它酶稳定剂在本领域中是已知的。受保护酶可按照EP 238 216中公开的方法制备。

如上所述，本发明的另一个方面涉及去垢组合物(例如，用于洗衣洗涤、餐具洗涤或硬表面清洁)，该组合物包含本发明的α-淀粉酶变体(包括杂种)以及表面活性剂。

本发明的去垢组合物可以是任何方便的形式，例如，粉剂，粒剂或液体。液态的去垢剂可以是含水的(典型地包含多达90％的水和0-20％的有机溶剂)或是不含水的(如在EP 120,659中所描述的)。

去垢组合物

当本发明的α-淀粉酶变体用作去垢组合物(例如，洗衣洗涤去垢组合物或餐具洗涤去垢组合物)的组分时，它可以，例如，以非粉状粒剂、稳定液体或受保护酶的形式包括在去垢组合物中。如上所述，非粉状粒剂可如，例如，美国4,106,991和4,661,452(两者都属于Novo Industri A/S)公开的方法产生，并可有可无地用本领域已知的方法包衣。蜡质包衣材料的例子是聚(环氧乙烷)的产物(聚乙二醇，PEG)，平均分子量为1000至20000；具有16至50个环氧乙烷单位的乙氧基化的壬基酚；乙氧基化的脂肪醇(其中醇包含12至20个碳原子)，其中具有15至80个环氧乙烷单位；脂肪醇；脂肪酸；脂肪酸甘油单、双、三酯。适于通过液化床技术应用的膜形成包衣材料在GB 1483591中给出。

以液态酶制剂形式添加的酶可以如上所述，按照已知的技术通过，例如，添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸稳定。其它酶稳定剂在本领域中是众所周知的。

包含在本发明的去垢组合物中的受保护酶可以如上所述按照在EP238,216中公开的方法制备。

本发明的去垢组合物可以是任何方便的形式，例如，粉剂、粒剂、糊剂或液体。液态的去垢剂可以是含水的(典型地包含多达70％的水和0-30％的有机溶剂)或是不含水的。

去垢组合物包含一种或多种表面活性剂，每种可以是阴离子的、非离子的、阳离子的或两性的(兼性离子的)。去垢剂通常包含0-50％的阴离子表面活性剂如线性烷基苯磺酸盐(LAS)、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)、醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)、仲烷烃磺酸盐(SAS)、α-磺基脂肪酸甲基酯、烷基或烯基琥珀酸或肥皂。它也可以包含0-40％的非离子表面活性剂如醇乙氧基化物(AEO或AE)、醇丙氧基化物、羧基化醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基聚糖甙、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺或聚羟基烷基脂肪酸酰胺(例如，在WO 92/06154中所描述的)。

去垢组合物还包含一种或多种其它酶，如支链淀粉酶、酯酶、脂肪酶、角质酶、蛋白酶、纤维素酶、过氧化物酶或氧化酶，例如，漆酶。

通常去垢剂包含1-65％增强去垢剂去垢作用的物质(虽然某些餐具洗涤去垢剂可包含多达90％的增强去垢剂去垢作用的物质)或络合物剂如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或分层硅酸盐(例如，得自Hoechst的SKS-6)。

增强去垢剂去垢作用的物质可细分为含磷或不含磷类型。含磷的无机碱性增强去垢剂去垢作用的物质例子包括:水溶性盐，尤其是碱金属焦磷酸盐、正磷酸盐、多磷酸盐和膦酸盐。不含磷的无机的增强去垢剂去垢作用的物质的例子包括水溶性碱金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐，以及分层二硅酸盐和各种类型的水不溶性结晶或无定形的铝硅酸盐，其中沸石是最熟知的代表。

合适的有机的增强去垢剂去垢作用的物质的例子包括琥珀酸、丙二酸、脂肪酸丙二酸、脂肪酸磺酸、羧基甲氧基琥珀酸、聚醋酸、羧酸、聚羧酸、氨基聚羧酸和聚乙酰基羧酸的碱金属、铵或取代的铵盐。

去垢剂也可以不增强去垢作用，即基本上不含增强去垢剂去垢作用的物质。

去垢剂可以包括一种或多种聚合物。例子是羧甲基纤维素(CMC；典型地以钠盐形式)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、聚马来酸酯、马来酸/丙烯酸的共聚物以及异丁烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

去垢组合物也可以包含氯/溴型或氧型的漂白剂。漂白剂可以是包衣的或胶囊化的。无机氯/溴型的漂白剂的例子是锂、钠或钙的次氯酸盐或次溴酸盐以及氯化磷酸三钠。漂白系统也可以包含H₂O₂源如过硼酸盐或过碳酸盐，它们可以与过酸形式的漂白激活剂如四乙酰乙二胺(TAED)或壬酰羟苯磺酸盐(NOBS)组合。

有机氯/溴型漂白剂的例子是杂环N-溴化和N-氯化亚胺如三氯异氰尿酸、三溴异氰尿酸、二溴异氰尿酸、二氯异氰尿酸及其与水增溶性阳离子如钾和钠的盐。乙内酰脲化合物也是合适的。漂白系统也可以包含，例如，酰胺、亚胺或砜型过氧酸(peroxyacids)。

在餐具洗涤去垢剂中，氧漂白剂是优选的，例如无机过酸盐形式，优选地是带有漂白剂前体或作为过氧酸化合物。适合的过氧漂白剂化合物的典型例子是碱金属过硼酸盐、四氢盐和单氢盐、碱金属过碳酸盐、过硅酸盐和过磷酸盐。优选的激活剂材料是TAED或NOBS。

本发明的去垢组合物的酶可以使用常规的稳定剂稳定，例如，多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如，例如，芳族硼酸盐，以及组合物可以如在WO 92/19709和WO 92/19708中所述的方法配制。本发明的酶也可通过添加可逆的酶抑制剂稳定，例如，蛋白质型(如在EP 0544 777 B1中所描述的)或硼酸型酶抑制剂。

去垢剂也可以包含其它的常规去垢剂成分如，例如，织物调节物(fabricconditioners)包括粘土、抗絮凝剂物质、泡沫激发剂/泡沫压制剂(在餐具洗涤去垢剂泡沫压制剂中)、起泡肥皂水的泡沫压制剂、抗腐蚀剂、污物悬浮剂、抗污物再沉积剂、染料、脱水剂、杀菌剂、光学增白剂、或香料。

pH值(在水溶液中以使用时的浓度测量)通常是中性或碱性，例如，在7-11之间。

本发明的范围之内的洗衣去垢组合物的特定的形式包括:

1)配制成具有至少600g/l的堆密度的粒剂的去垢组合物，其包含

线性烷基苯基磺酸盐(以酸计算)	7-12％
线性烷基苯基磺酸盐(以酸计算)	7-12％	醇乙氧基硫酸盐(例如，C_12-18醇，1-2EO)或烷基硫酸盐(例如C_16-18)	1-4％
醇乙氧基化物(例如，C_14-15醇，7EO)	5-9％	醇乙氧基硫酸盐(例如，C_12-18醇，1-2EO)或烷基硫酸盐(例如C_16-18)	1-4％
醇乙氧基化物(例如，C_14-15醇，7EO)	5-9％	碳酸钠(作为Na₂CO₃)	14-20％
可溶性硅酸盐(作为Na₂O，2SiO₂)	2-6％	碳酸钠(作为Na₂CO₃)	14-20％
可溶性硅酸盐(作为Na₂O，2SiO₂)	2-6％	沸石(作为NaAlSiO₄)	15-22％
硫酸钠(作为Na₂SO₄)	0-6％	沸石(作为NaAlSiO₄)	15-22％
硫酸钠(作为Na₂SO₄)	0-6％	柠檬酸钠/柠檬酸(作为(C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)	0-15％
过硼酸钠(作为NaBO₃.H₂O)	11-18％	柠檬酸钠/柠檬酸(作为(C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)	0-15％
过硼酸钠(作为NaBO₃.H₂O)	11-18％	TAED	2-6％
羧甲基纤维素	0-2％	TAED	2-6％
羧甲基纤维素	0-2％	聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)	0-3％

酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％
酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％	次要的组成部分(例如，起泡肥皂水的泡沫抑制剂、香料、光学增白剂、光漂白剂)	0-5％

2)配制成具有至少600g/l的堆密度的粒剂的去垢组合物，其包含

线性烷基苯基磺酸盐(以酸计算)	6-11％
线性烷基苯基磺酸盐(以酸计算)	6-11％	醇乙氧基硫酸盐(例如，C_12-18醇，1-2EO)或烷基硫酸盐(例如C_16-18)	1-3％
醇乙氧基化物(例如，C_14-15醇，7EO)	5-9％	醇乙氧基硫酸盐(例如，C_12-18醇，1-2EO)或烷基硫酸盐(例如C_16-18)	1-3％
醇乙氧基化物(例如，C_14-15醇，7EO)	5-9％	碳酸钠(作为Na₂CO₃)	15-21％
可溶性硅酸盐(作为Na₂O，2SiO₂)	1-4％	碳酸钠(作为Na₂CO₃)	15-21％
可溶性硅酸盐(作为Na₂O，2SiO₂)	1-4％	沸石(作为NaAlSiO₄)	24-34％
硫酸钠(作为Na₂SO₄)	4-10％	沸石(作为NaAlSiO₄)	24-34％
硫酸钠(作为Na₂SO₄)	4-10％	柠檬酸钠/柠檬酸(作为C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)	0-15％
羧甲基纤维素	0-2％	柠檬酸钠/柠檬酸(作为C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)	0-15％
羧甲基纤维素	0-2％	聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)	1-6％
酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％	聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)	1-6％
酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％	次要的组成部分(例如，起泡肥皂水的泡沫抑制剂、香料)	0-5％

3)配制成具有至少600g/l的堆密度的粒剂的去垢组合物，其包含

线性烷基苯基磺酸盐(以酸计算)	5-9％
线性烷基苯基磺酸盐(以酸计算)	5-9％	醇乙氧基化物(例如，C_12-15醇，7EO)	7-14％
肥皂，作为脂肪酸(例如，C_16-22脂肪酸)	1-3％	醇乙氧基化物(例如，C_12-15醇，7EO)	7-14％
肥皂，作为脂肪酸(例如，C_16-22脂肪酸)	1-3％	碳酸钠(作为Na₂CO₃)	10-17％
可溶性硅酸盐(作为Na₂O，2SiO₂)	3-9％	碳酸钠(作为Na₂CO₃)	10-17％
可溶性硅酸盐(作为Na₂O，2SiO₂)	3-9％	沸石(作为NaAlSiO₄)	23-33％

硫酸钠(作为Na₂SO₄)	0-4％
硫酸钠(作为Na₂SO₄)	0-4％	过硼酸钠(作为NaBO₃.H₂O)	8-16％
TAED	2-8％	过硼酸钠(作为NaBO₃.H₂O)	8-16％
TAED	2-8％	膦酸盐(例如，EDTMPA)	0-1％
羧甲基纤维素	0-2％	膦酸盐(例如，EDTMPA)	0-1％
羧甲基纤维素	0-2％	聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)	0-3％
酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％	聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)	0-3％
酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％	次要的组成部分(例如，起泡肥皂水的泡沫抑制剂、香料、光学增白剂)	0-5％

4)制配制成具有至少600g/l的堆密度的粒剂的去垢组合物，其包含

线性烷基苯基磺酸盐(以酸计算)	8-12％
线性烷基苯基磺酸盐(以酸计算)	8-12％	醇乙氧基化物(例如，C_12-15醇，7EO)	10-25％
碳酸钠(作为Na₂CO₃)	14-22％	醇乙氧基化物(例如，C_12-15醇，7EO)	10-25％
碳酸钠(作为Na₂CO₃)	14-22％	可溶性硅酸盐(作为Na₂O，2SiO₂)	1-5％
沸石(作为NaAlSiO₄)	25-35％	可溶性硅酸盐(作为Na₂O，2SiO₂)	1-5％
沸石(作为NaAlSiO₄)	25-35％	硫酸钠(作为Na₂SO₄)	0-10％
羧甲基纤维素	0-2％	硫酸钠(作为Na₂SO₄)	0-10％
羧甲基纤维素	0-2％	聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)	1-3％
酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％	聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)	1-3％
酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％	次要的组成部分(例如，起泡肥皂水的泡沫抑制剂、香料)	0-5％

5)含水的液态去垢组合物，其包含

线性烷基苯基磺酸盐(以酸计算)

15-21％

醇乙氧基化物(例如，C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)	12-18％
醇乙氧基化物(例如，C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)	12-18％	肥皂，作为脂肪酸(例如，油酸)	3-13％
烯基琥珀酸(C_12-14)	0-13％	肥皂，作为脂肪酸(例如，油酸)	3-13％
烯基琥珀酸(C_12-14)	0-13％	氨基乙醇	8-18％
柠檬酸	2-8％	氨基乙醇	8-18％
柠檬酸	2-8％	膦酸盐	0-3％
聚合物(例如，PVP，PEG)	0-3％	膦酸盐	0-3％
聚合物(例如，PVP，PEG)	0-3％	硼酸盐(作为B₄O₇ ^2-)	0-2％
乙醇	0-3％	硼酸盐(作为B₄O₇ ^2-)	0-2％
乙醇	0-3％	丙二醇	8-14％
酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％	丙二醇	8-14％
酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％	次要的组成部分(例如，分散剂、起泡肥皂水的泡沫抑制剂、香料、光学增白剂)	0-5％

6)含水的有结构的(structured)液态去垢组合物，其包含

线性烷基苯基磺酸盐(以酸计算)	15-21％
线性烷基苯基磺酸盐(以酸计算)	15-21％	醇乙氧基化物(例如，C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)	3-9％
肥皂，作为脂肪酸(例如，油酸)	3-10％	醇乙氧基化物(例如，C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)	3-9％
肥皂，作为脂肪酸(例如，油酸)	3-10％	沸石(作为NaAlSiO₄)	14-22％
柠檬酸钾	9-18％	沸石(作为NaAlSiO₄)	14-22％
柠檬酸钾	9-18％	硼酸盐(作为B₄O₇ ^2-)	0-2％
羧甲基纤维素	0-2％	硼酸盐(作为B₄O₇ ^2-)	0-2％
羧甲基纤维素	0-2％	聚合物(例如，PVP，PEG)	0-3％
锚定聚合物如，例如月桂基异丁烯酸/丙烯酸共聚物；摩尔比率25:1；分子量3800	0-3％	聚合物(例如，PVP，PEG)	0-3％
锚定聚合物如，例如月桂基异丁烯酸/丙烯酸共聚物；摩尔比率25:1；分子量3800	0-3％	甘油	0-5％
酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％	甘油	0-5％

次要的组成部分(例如，分散剂、起泡肥皂水的泡沫抑制剂、香料、光学增白剂)

0-5％

7)配制成具有至少600g/l的堆密度的粒剂的去垢组合物，其包含

脂肪醇硫酸盐	5-10％
脂肪醇硫酸盐	5-10％	乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺	3-9％
肥皂，作为脂肪酸	0-3％	乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺	3-9％
肥皂，作为脂肪酸	0-3％	碳酸钠(作为Na₂CO₃)	5-10％
可溶性硅酸盐(作为Na₂O，2SiO₂)	1-4％	碳酸钠(作为Na₂CO₃)	5-10％
可溶性硅酸盐(作为Na₂O，2SiO₂)	1-4％	沸石(作为NaAlSiO₄)	20-40％
硫酸钠(作为Na₂SO₄)	2-8％	沸石(作为NaAlSiO₄)	20-40％
硫酸钠(作为Na₂SO₄)	2-8％	过硼酸钠(作为NaBO₃.H₂O)	12-18％
TAED	2-7％	过硼酸钠(作为NaBO₃.H₂O)	12-18％
TAED	2-7％	聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)	1-5％
酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％	聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)	1-5％
酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％	次要的组成部分(例如，光学增白剂、起泡肥皂水的泡沫抑制剂、香料)	0-5％

8)配制成粒剂的去垢组合物，其包含

线性烷基苯基磺酸盐(以酸计算)	8-14％
线性烷基苯基磺酸盐(以酸计算)	8-14％	乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺	5-11％
肥皂，作为脂肪酸	0-3％	乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺	5-11％
肥皂，作为脂肪酸	0-3％	碳酸钠(作为Na₂CO₃)	4-10％
可溶性硅酸盐(作为Na₂O，2SiO₂)	1-4％	碳酸钠(作为Na₂CO₃)	4-10％
可溶性硅酸盐(作为Na₂O，2SiO₂)	1-4％	沸石(作为NaAlSiO₄)	30-50％
硫酸钠(作为Na₂SO₄)	3-11％	沸石(作为NaAlSiO₄)	30-50％
硫酸钠(作为Na₂SO₄)	3-11％	柠檬酸钠(作为C₆H₅Na₃O₇)	5-12％

聚合物(例如，PVP，马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)	1-5％
聚合物(例如，PVP，马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)	1-5％	酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％
次要的组成部分(例如，起泡肥皂水的泡沫抑制剂、香料)	0-5％	酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％

9)配制成粒剂的去垢组合物，其包含

线性烷基苯基磺酸盐(以酸计算)	6-12％
线性烷基苯基磺酸盐(以酸计算)	6-12％	非离子表面活性剂	1-4％
肥皂，作为脂肪酸	2-6％	非离子表面活性剂	1-4％
肥皂，作为脂肪酸	2-6％	碳酸钠(作为Na₂CO₃)	14-22％
沸石(作为NaAlSiO₄)	18-32％	碳酸钠(作为Na₂CO₃)	14-22％
沸石(作为NaAlSiO₄)	18-32％	硫酸钠(作为Na₂SO₄)	5-20％
柠檬酸钠(作为C₆H₅Na₃O₇)	3-8％	硫酸钠(作为Na₂SO₄)	5-20％
柠檬酸钠(作为C₆H₅Na₃O₇)	3-8％	过硼酸钠(作为NaBO₃.H₂O)	4-9％
漂白活化剂(如NOBS或TAED)	1-5％	过硼酸钠(作为NaBO₃.H₂O)	4-9％
漂白活化剂(如NOBS或TAED)	1-5％	羧甲基纤维素	0-2％
聚合物(例如，聚羧酸盐或PEG)	1-5％	羧甲基纤维素	0-2％
聚合物(例如，聚羧酸盐或PEG)	1-5％	酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％
次要的组成部分(例如，光学增白剂、香料)	0-5％	酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％

10)含水的液态去垢组合物，其包含

线性烷基苯基磺酸盐(以酸计算)	15-23％
线性烷基苯基磺酸盐(以酸计算)	15-23％	醇乙氧基硫酸盐(例如，C_12-15醇，2-3EO)	8-15％
醇乙氧基化物(例如，C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)	3-9％	醇乙氧基硫酸盐(例如，C_12-15醇，2-3EO)	8-15％
醇乙氧基化物(例如，C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)	3-9％	肥皂，作为脂肪酸(例如，月桂酸)	0-3％
氨基乙醇	1-5％	肥皂，作为脂肪酸(例如，月桂酸)	0-3％

柠檬酸钠	5-10％
柠檬酸钠	5-10％	水溶助剂(例如，甲苯磺酸钠)	2-6％
硼酸盐(作为B₄O₇ ^2-)	0-2％	水溶助剂(例如，甲苯磺酸钠)	2-6％
硼酸盐(作为B₄O₇ ^2-)	0-2％	羧甲基纤维素	0-1％
乙醇	1-3％	羧甲基纤维素	0-1％
乙醇	1-3％	丙二醇	2-5％
酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％	丙二醇	2-5％
酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％	次要的组成部分(例如，聚合物、分散剂、香料、光学增白剂)	0-5％

11)含水的液态去垢组合物，其包含

线性烷基苯基磺酸盐(以酸计算)	20-32％
线性烷基苯基磺酸盐(以酸计算)	20-32％	醇乙氧基化物(例如，C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)	6-12％
氨基乙醇	2-6％	醇乙氧基化物(例如，C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)	6-12％
氨基乙醇	2-6％	柠檬酸	8-14％
硼酸盐(作为B₄O₇ ^2-)	1-3％	柠檬酸	8-14％
硼酸盐(作为B₄O₇ ^2-)	1-3％	聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物，锚定聚合物如，例如异丁烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)	0-3％
甘油	3-8％	聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物，锚定聚合物如，例如异丁烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)	0-3％
甘油	3-8％	酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％
次要的组成部分(例如，水溶助剂、分散剂、香料、光学增白剂)	0-5％	酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％

12)配制成具有至少600g/l的堆密度的粒剂的去垢组合物，其包含

阴离子表面活性剂(线性的烷基苯基磺酸盐、烷基硫酸盐、α-烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲基酯、链烷基磺酸盐、肥皂)	25-40％
阴离子表面活性剂(线性的烷基苯基磺酸盐、烷基硫酸盐、α-烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲基酯、链烷基磺酸盐、肥皂)	25-40％	非离子表面活性剂(例如，醇乙氧基化物)	1-10％

碳酸钠(作为Na₂CO₃)	8-25％
碳酸钠(作为Na₂CO₃)	8-25％	可溶性硅酸盐(作为Na₂O，2SiO₂)	5-15％
硫酸钠(作为Na₂SO₄)	0-5％	可溶性硅酸盐(作为Na₂O，2SiO₂)	5-15％
硫酸钠(作为Na₂SO₄)	0-5％	沸石(作为NaAlSiO₄)	15-28％
过硼酸钠(作为NaBO₃.4H₂O)	0-20％	沸石(作为NaAlSiO₄)	15-28％
过硼酸钠(作为NaBO₃.4H₂O)	0-20％	漂白剂活化剂(作为TAED或NOBS)	0-5％
酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％	漂白剂活化剂(作为TAED或NOBS)	0-5％
酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％	次要的组成部分(例如，香料、光学增白剂)	0-3％

13)如1)-12)中所描述的去垢剂制剂，其中线性烷基苯基磺酸盐的所有或部分以(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐替代。

14)配制成具有至少600g/l的堆密度的粒剂的去垢组合物，其包含

(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐	9-15％
(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐	9-15％	醇乙氧基化物	3-6％
聚氢氧基烷基脂肪酸酰胺	1-5％	醇乙氧基化物	3-6％
聚氢氧基烷基脂肪酸酰胺	1-5％	沸石(作为NaAlSiO₄)	10-20％
分层二硅酸盐(例如得自Hoechst的SK56)	10-20％	沸石(作为NaAlSiO₄)	10-20％
分层二硅酸盐(例如得自Hoechst的SK56)	10-20％	碳酸钠(作为Na₂CO₃)	3-12％
可溶性硅酸盐(作为Na₂O，2SiO₂)	0-6％	碳酸钠(作为Na₂CO₃)	3-12％
可溶性硅酸盐(作为Na₂O，2SiO₂)	0-6％	柠檬酸钠	4-8％
过碳酸钠	13-22％	柠檬酸钠	4-8％
过碳酸钠	13-22％	TAED	3-8％
聚合物(例如聚羧酸盐和PVP)	0-5％	TAED	3-8％
聚合物(例如聚羧酸盐和PVP)	0-5％	酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％
次要的组成部分(例如，光学增白剂、光学漂白剂、香料、起泡肥皂水的泡沫抑制剂)	0-5％	酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％

15)配制成具有至少600g/l的堆密度的粒剂的去垢组合物，其包含

(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐	4-8％
(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐	4-8％	醇乙氧基化物	11-15％
肥皂	1-4％	醇乙氧基化物	11-15％
肥皂	1-4％	沸石MAP或沸石A	35-45％
碳酸钠(作为Na₂CO₃)	2-8％	沸石MAP或沸石A	35-45％
碳酸钠(作为Na₂CO₃)	2-8％	可溶性硅酸盐(作为Na₂O，2SiO₂)	0-4％
过碳酸钠	13-22％	可溶性硅酸盐(作为Na₂O，2SiO₂)	0-4％
过碳酸钠	13-22％	TAED	1-8％
羧甲基纤维素	0-3％	TAED	1-8％
羧甲基纤维素	0-3％	聚合物(如聚羧酸盐和PVP)	0-3％
酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％	聚合物(如聚羧酸盐和PVP)	0-3％
酶(以纯酶蛋白质计算)	0.0001-0.1％	次要的组成部分(例如，光学增白剂、膦酸盐、香料)	0-3％

16)如1)-15)所述的去垢剂制剂，该制剂包含作为添加的组分或作为已指定的漂白系统的替代物的稳定的或胶囊化的过酸。

17)如1)、3)、7)、9)和12)所述的去垢组合物，其中过硼酸盐由过碳酸盐替代。

18)如1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)所述的去垢组合物，该组合物还包含锰催化剂。锰催化剂可以是，例如，在“低温漂白的有效锰催化剂”，自然，369，1994，637-639中描述的化合物之一。

19)配制成不含水的去垢剂液体的去垢组合物，该组合物包含液态非离子表面活性剂如，例如，线性的烷氧基化的伯醇、增强去垢剂去垢作用的系统(例如，磷酸盐)、酶和碱。去垢剂也可以包括阴离子表面活性剂和/或漂白系统。

在本发明的范围之内的餐具洗涤组合物的具体形式包括:

1)粉剂机用(automatic)餐具洗涤组合物

非离子表面活性剂	0.4-2.5％
非离子表面活性剂	0.4-2.5％	正硅酸钠	0-20％

二硅酸钠	3-20％
二硅酸钠	3-20％	三磷酸钠	20-40％
碳酸钠	0-20％	三磷酸钠	20-40％
碳酸钠	0-20％	过硼酸钠	2-9％
四乙酰乙二胺(TAED)	1-4％	过硼酸钠	2-9％
四乙酰乙二胺(TAED)	1-4％	硫酸钠	5-33％
酶	0.0001-0.1％	硫酸钠	5-33％

2)粉剂机用餐具洗涤组合物

非离子表面活性剂(例如，醇乙氧基化物)	1-2％
非离子表面活性剂(例如，醇乙氧基化物)	1-2％	二硅酸钠	2-30％
碳酸钠	10-50％	二硅酸钠	2-30％
碳酸钠	10-50％	膦酸钠	0-5％
二水合柠檬酸三钠	9-30％	膦酸钠	0-5％
二水合柠檬酸三钠	9-30％	次氨基三乙酸钠(NTA)	0-20％
单水合过硼酸钠	5-10％	次氨基三乙酸钠(NTA)	0-20％
单水合过硼酸钠	5-10％	四乙酰乙二胺(TAED)	1-2％
聚丙烯酸酯聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物)	6-25％	四乙酰乙二胺(TAED)	1-2％
聚丙烯酸酯聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物)	6-25％	酶	0.0001-0.1％
香料	0.1-0.5％	酶	0.0001-0.1％
香料	0.1-0.5％	水	5-10

3)粉剂机用餐具洗涤组合物

非离子表面活性剂	0.5-2.0％
非离子表面活性剂	0.5-2.0％	二硅酸钠	25-40％
柠檬酸钠	30-55％	二硅酸钠	25-40％
柠檬酸钠	30-55％	碳酸钠	0-29％
碳酸氢钠	0-20％	碳酸钠	0-29％

单水合过硼酸钠	0-15％
单水合过硼酸钠	0-15％	四乙酰乙二胺(TAED)	0-6％
马来酸/丙烯酸共聚物	0-5％	四乙酰乙二胺(TAED)	0-6％
马来酸/丙烯酸共聚物	0-5％	粘土	1-3％
聚(氨基酸)	0-20％	粘土	1-3％
聚(氨基酸)	0-20％	聚丙烯酸钠	0-8％
酶	0.0001-0.1％	聚丙烯酸钠	0-8％

4)粉剂机用餐具洗涤组合物

非离子表面活性剂	1-2％
非离子表面活性剂	1-2％	沸石MAP	15-42％
二硅酸钠	30-34％	沸石MAP	15-42％
二硅酸钠	30-34％	柠檬酸钠	0-12％
碳酸钠	0-20％	柠檬酸钠	0-12％
碳酸钠	0-20％	单氢过硼酸钠	7-15％
四乙酰乙二胺(TAED)	0-3％	单氢过硼酸钠	7-15％
四乙酰乙二胺(TAED)	0-3％	聚合物	0-4％
马来酸/丙烯酸共聚物	0-5％	聚合物	0-4％
马来酸/丙烯酸共聚物	0-5％	有机膦酸酯	0-4％
粘土	1-2％	有机膦酸酯	0-4％
粘土	1-2％	酶	0.0001-0.1％
硫酸钠	平衡	酶	0.0001-0.1％

5)粉剂机用餐具洗涤组合物

非离子表面活性剂	1-7％
非离子表面活性剂	1-7％	重硅酸钠	18-30％
柠檬酸三钠	10-24％	重硅酸钠	18-30％
柠檬酸三钠	10-24％	碳酸钠	12-20％

单过硫酸盐(2KHSO₅.KHSO₄.K₂SO₄)	15-21％
单过硫酸盐(2KHSO₅.KHSO₄.K₂SO₄)	15-21％	漂白剂的稳定剂	0.1-2％
马来酸/丙烯酸共聚物	0-6％	漂白剂的稳定剂	0.1-2％
马来酸/丙烯酸共聚物	0-6％	二亚乙基三胺五醋酸盐，五钠盐	0-2.5％
酶	0.0001-0.1％	二亚乙基三胺五醋酸盐，五钠盐	0-2.5％
酶	0.0001-0.1％	硫酸钠，水	平衡

6)具有清洁表面活性剂系统的粉剂和液态餐具洗涤组合物

非离子表面活性剂	0-1.5％
非离子表面活性剂	0-1.5％	二水合十八烷基二甲胺N-氧化物	0-5％
二水合十八烷基二甲胺N-氧化物和二水合十六烷基二甲胺N-氧化物的(80:20重量C18/C16)混合物	0-4％	二水合十八烷基二甲胺N-氧化物	0-5％
二水合十八烷基二甲胺N-氧化物和二水合十六烷基二甲胺N-氧化物的(80:20重量C18/C16)混合物	0-4％	无水十八烷基双(羟乙基)胺N-氧化物和无水十六烷基双(羟乙基)胺N-氧化物的(70:30重量C18/C16)混合物	0-5％
平均乙氧基化程度为3的C₁₃-C₁₅烷基乙氧基硫酸盐	0-10％	无水十八烷基双(羟乙基)胺N-氧化物和无水十六烷基双(羟乙基)胺N-氧化物的(70:30重量C18/C16)混合物	0-5％
平均乙氧基化程度为3的C₁₃-C₁₅烷基乙氧基硫酸盐	0-10％	平均乙氧基化程度为3的C₁₂-C₁₅烷基乙氧基硫酸盐	0-5％
平均乙氧基化程度为12的C₁₃-C₁₅乙氧基化醇	0-5％	平均乙氧基化程度为3的C₁₂-C₁₅烷基乙氧基硫酸盐	0-5％
平均乙氧基化程度为12的C₁₃-C₁₅乙氧基化醇	0-5％	平均乙氧基化程度为9的C₁₂-C₁₅乙氧基化醇的混合物	0-6.5％
平均乙氧基化程度为30的C₁₃-C₁₅乙氧基化醇的混合物	0-4％	平均乙氧基化程度为9的C₁₂-C₁₅乙氧基化醇的混合物	0-6.5％
平均乙氧基化程度为30的C₁₃-C₁₅乙氧基化醇的混合物	0-4％	二硅酸钠	0-33％
三聚磷酸钠	0-46％	二硅酸钠	0-33％
三聚磷酸钠	0-46％	柠檬酸钠	0-28％
柠檬酸	0-29％	柠檬酸钠	0-28％

碳酸钠	0-20％
碳酸钠	0-20％	单水合过硼酸钠	0-11.5％
四乙酰乙二胺(TAED)	0-4％	单水合过硼酸钠	0-11.5％
四乙酰乙二胺(TAED)	0-4％	马来酸/丙烯酸共聚物	0-7.5％
硫酸钠	0-12.5％	马来酸/丙烯酸共聚物	0-7.5％
硫酸钠	0-12.5％	酶	0.0001-0.1％

7)不含水的液态机用餐具洗涤组合物

液态非离子表面活性剂(如醇乙氧基化物)	2.0-10.0％
液态非离子表面活性剂(如醇乙氧基化物)	2.0-10.0％	碱金属硅酸盐	3.0-15.0％
碱金属磷酸盐	20.0-40.0％	碱金属硅酸盐	3.0-15.0％
碱金属磷酸盐	20.0-40.0％	选自高级二醇、聚二醇、聚氧化物、二醇醚的液体载体	25.0-45.0％
稳定剂(例如，磷酸和C₁₆-C₁₈烷醇的部分酯)	0.5-7.0％	选自高级二醇、聚二醇、聚氧化物、二醇醚的液体载体	25.0-45.0％
稳定剂(例如，磷酸和C₁₆-C₁₈烷醇的部分酯)	0.5-7.0％	泡沫抑制剂(如硅氧烷)	0-1.5％
酶	0.0001-0.1％	泡沫抑制剂(如硅氧烷)	0-1.5％

8)不含水的液态餐具洗涤组合物

液态非离子表面活性剂(如醇乙氧基化物)	2.0-10.0％
液态非离子表面活性剂(如醇乙氧基化物)	2.0-10.0％	硅酸钠	3.0-15.0％
碱金属碳酸盐	7.0-20.0％	硅酸钠	3.0-15.0％
碱金属碳酸盐	7.0-20.0％	柠檬酸钠	0.0-1.5％
稳定系统(例如，细分的硅氧烷和低分子量二烷基聚二醇醚的混合物)	0.5-7.0％	柠檬酸钠	0.0-1.5％
稳定系统(例如，细分的硅氧烷和低分子量二烷基聚二醇醚的混合物)	0.5-7.0％	低分子量聚丙烯酸酯聚合物	5.0-15.0％
粘土凝胶增稠剂(例如，膨润土)	0.0-10.0％	低分子量聚丙烯酸酯聚合物	5.0-15.0％
粘土凝胶增稠剂(例如，膨润土)	0.0-10.0％	羟丙基纤维素聚合物	0.0-0.6％
酶	0.0001-0.1％	羟丙基纤维素聚合物	0.0-0.6％

选自高级二醇、聚二醇、聚氧化物、二醇醚的液体载体

平衡

9)摇溶的(thixotropic)液态机用餐具洗涤组合物

C₁₂-C₁₄脂肪酸	0-0.5％
C₁₂-C₁₄脂肪酸	0-0.5％	嵌段共聚物表面活性剂	1.5-15.0％
柠檬酸钠	0-12％	嵌段共聚物表面活性剂	1.5-15.0％
柠檬酸钠	0-12％	三聚磷酸钠	0-15％
碳酸钠	0-8％	三聚磷酸钠	0-15％
碳酸钠	0-8％	三硬脂酸铝	0-0.1％
异丙基苯磺酸钠	0-1.7％	三硬脂酸铝	0-0.1％
异丙基苯磺酸钠	0-1.7％	聚丙烯酸酯增稠剂	1.32-2.5％
聚丙烯酸酯钠	2.4-6.0％	聚丙烯酸酯增稠剂	1.32-2.5％
聚丙烯酸酯钠	2.4-6.0％	硼酸	0-4.0％
甲酸钠	0-0.45％	硼酸	0-4.0％
甲酸钠	0-0.45％	甲酸钙	0-0.2％
N-癸联苯氧化物二磺酸盐	0-4.0％	甲酸钙	0-0.2％
N-癸联苯氧化物二磺酸盐	0-4.0％	一乙醇胺(MEA)	0-1.86％
氢氧化钠(50％)	1.9-9.3％	一乙醇胺(MEA)	0-1.86％
氢氧化钠(50％)	1.9-9.3％	1，2-丙二醇	0-9.4％
酶	0.0001-0.1％	1，2-丙二醇	0-9.4％
酶	0.0001-0.1％	起泡肥皂水的泡沫抑制剂、染料、香料、水	平衡

10)液态机用餐具洗涤组合物

醇乙氧基化物	0-20％
醇乙氧基化物	0-20％	脂肪酸酯磺酸盐	0-30％
十二烷基硫酸钠	0-20％	脂肪酸酯磺酸盐	0-30％
十二烷基硫酸钠	0-20％	烷基聚糖甙	0-21％

油酸	0-10％
油酸	0-10％	单水合二硅酸钠	18-33％
二水合柠檬酸钠	18-33％	单水合二硅酸钠	18-33％
二水合柠檬酸钠	18-33％	硬脂酸钠	0-2.5％
单水合过硼酸钠	0-13％	硬脂酸钠	0-2.5％
单水合过硼酸钠	0-13％	四乙酰乙二胺(TAED)	0-8％
马来酸/丙烯酸共聚物	4-8％	四乙酰乙二胺(TAED)	0-8％
马来酸/丙烯酸共聚物	4-8％	酶	0.0001-0.1％

11)包含受保护的漂白颗粒的液体机用餐具洗涤组合物

硅酸钠	5-10％
硅酸钠	5-10％	焦磷酸四钾	15-25％
三磷酸钠	0-2％	焦磷酸四钾	15-25％
三磷酸钠	0-2％	碳酸钾	4-8％
受保护的漂白剂粒子，如氯	5-10％	碳酸钾	4-8％
受保护的漂白剂粒子，如氯	5-10％	聚合增稠剂	0.7-1.5％
氢氧化钾	0-2％	聚合增稠剂	0.7-1.5％
氢氧化钾	0-2％	酶	0.0001-0.1％
水	平衡	酶	0.0001-0.1％

11)如1)、2)、3)、4)、6)和10)描述的机用餐具洗涤组合物，其中过硼酸盐由过碳酸盐替代。

12)如1)-6)所述的机用餐具洗涤组合物，该组合物还包含锰催化剂。锰催化剂可以是，例如，在“低温漂白的有效锰催化剂”，自然，369，1994，637-639中描述的化合物之一。

本发明的α-淀粉酶变体可以以通常用于去垢剂的浓度掺入。现在设想在本发明的去垢组合物中，α-淀粉酶变体可以以相当于每升洗涤/餐具洗涤液体0.00001-1mg(以纯酶蛋白质计算)的量添加。

另外，本发明还可进一步通过参考附图描述，其中:

图1是本发明的四种亲本α-淀粉酶的氨基酸序列的序列对比。最左边的数字分别指代的氨基酸序列如下:

1:在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列；

2:在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列；

3:在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列；

4:在SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列。

在图最右边的数字给出了所说的每种序列的连续的氨基酸总数。应该注意的是编号为3的序列(对应于在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列)，在序列对比中，其在分别编号为1(SEQ ID No.1)、2(SEQ ID No.)、4(SEQ ID No.7)的序列中的相应的第1氨基酸和第175氨基酸的位置上产生“间隙”。

图2是质粒pTVB106的限制性图。

图3是质粒pPM103的限制性图。

图4是质粒pTVB112的限制性图。

图5是质粒pTVB114的限制性图。

实验部分

具有在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列(分别得自芽孢杆菌菌株NCIB 12512和NCIB 12513)的亲本α-淀粉酶的制备、纯化和测序在WO 95/26397中描述。这两种亲本α-淀粉酶的pI值和分子量(在WO95/26397中给出)如下:

SEQ ID No.1:pI大约为8.8-9.0(在LKB Ampholine^TM PAG平板上通过等电聚焦测定)；分子量大约为55kD(通过SDS-PAGE测定)。

SEQ ID No.2:pI大约为5.8(在LKBAmpholine^TM PAG平板上通过等电聚焦测定)；分子量大约为55kD(通过SDS-PAGE测定)。

本发明的α-淀粉酶变体的纯化

按照本发明的变体的构建和表达在下面的实施例2中描述。本发明的变体的纯化在本文中参考分别在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的变体说明:

SEQ ID No.1变体(pI大约为9.0)的纯化:过滤包含表达的α-淀粉酶变体的发酵液，加入硫酸铵至其浓度达到饱和度的15％。然后把液体加进疏水柱(Toyopearl butyl/TOSOH)中。用pH7.0的20mM二甲基戊二酸缓冲液洗涤柱。α-淀粉酶结合得非常牢固，然后用在pH7.0的20mM二甲基戊二酸缓冲液中的25％w/w 2-丙醇洗脱。在洗脱之后，2-丙醇通过蒸发除去，浓缩物施用到用pH6.0的20mM二甲基戊二酸缓冲液平衡的阳离子交换柱(S-Sepharose^TM FF，Pharmacia，瑞典)中。

在相同的缓冲液中使用0-250mM NaCl的线性梯度洗脱淀粉酶。在对pH8.0的10mM硼酸盐/KCl缓冲液透析之后，把样品的pH值调整到9.6，然后施用到用pH9.6的10mM硼酸盐/KCl缓冲液平衡的阴离子交换柱(Q-Sepharose^TM FF，Pharmacia)中。用0-250mM NaCl的线性梯度洗脱淀粉酶。把pH调整到7.5。α-淀粉酶通过rSDS-PAGE判断是纯的。为了稳定淀粉酶，所有缓冲液均包含2mM CaCl₂。

SEQ ID No.2变体(pI大约为5.8)的纯化:过滤包含表达的α-淀粉酶变体的发酵液，加入硫酸铵至其浓度达到饱和度的15％。然后把液体加进疏水柱(Toyopearl butyl/TOSOH)中。用在pH8.0的10mM Tris缓冲液中的15％-0％w/w的硫酸铵的线性梯度洗脱结合的淀粉酶。在洗脱物对pH8.0的10mM硼酸盐/KCl缓冲液透析之后，把液体的pH值调整到9.6，然后施用到用相同缓冲液平衡的阴离子交换柱(Q-Sepharose^TM FF，Pharmacia)中。用150mMNaCl分步洗脱淀粉酶。

在洗脱之后，为了除去NaCl，淀粉酶样品对pH8.0的相同缓冲液透析。透析之后，把pH调整到9.6，淀粉酶再次结合到阴离子交换柱上。用0-250mMNaCl的线性梯度洗脱淀粉酶。把pH调整到7.5。淀粉酶通过rSDS-PAGE判断是纯的。为了稳定淀粉酶，所有缓冲液均包含2mM CaCl₂。

α-淀粉酶活性测定

α-淀粉酶活性通过使用

片剂作为底物的方法测定。Phadebas片剂(

淀粉酶测试，由Pharmacia Diagnostic供应)包含交联的不溶性蓝色淀粉聚合物，这种聚合物与牛血清清蛋白和缓冲物质混合并制成片剂。

对于每一次测量的测定，把一片药剂悬浮在包含5ml 50mMBritton-Robinson缓冲液(50mM醋酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0.1mMCaCl₂，pH用NaOH调整到目的值)的试管中。测试在目的温度的水浴中进行。测试的α-淀粉酶在×ml的50mM Britton-Robinson缓冲液中稀释。1ml的这种α-淀粉酶溶液加到5ml 50mM的Britton-Robinson缓冲液中。淀粉通过α-淀粉酶水解给出可溶性的蓝色片段。产生的蓝色溶液的吸光度在620nm处用分光光度法测量，它是α-淀粉酶活性的函数。

重要的是:在15分钟的温育(测试时间)之后测得的620nm处的吸光度在620nm处在0.2至2.0个吸光度单位之间。在这个吸光度范围内在活性和吸光度之间有线性关系(朗伯-比尔定律)。因此对酶的稀释必须加以调整以适合这个标准。

在指定的条件下(温度、pH值、反应时间、缓冲液条件)，1mg给定的α-淀粉酶水解一定量的底物，产生蓝色。颜色强度在620nm处测量。测量吸光度直接和在给定条件下所说的α-淀粉酶的比活成比例(活性/mg纯α-淀粉酶蛋白质)。这样，在相同条件下测试了不同的目的α-淀粉酶(包括参比α-淀粉酶，在这种情况中是所说的亲本α-淀粉酶)之后，在给定温度和给定的pH下每种α-淀粉酶的比活就可以直接比较，可以测定每种目的α-淀粉酶的比活相对于参比α-淀粉酶的比活的比率。

小型餐具洗涤测定

使用了下列的小型餐具洗涤测定:煮沸含淀粉材料的悬浮液，然后冷却到20℃。冷却的淀粉悬浮液施加到各个鉴定的小玻璃平板(大约2×2cm)上，然后在干燥橱中以约140℃的温度干燥。然后对单个平板称重。为了测定，制备了具有55℃温度的标准欧洲型机用餐具洗涤去垢剂溶液(5g/l)。使去垢剂溶解1分钟，其后向去垢剂溶液(包含在装备有磁性搅拌的烧杯中)中加入所说的α-淀粉酶以使酶浓度达到0.5mg/l。同时，把置于小支持架的称重的玻璃平板以基本上垂直位置浸没在α-淀粉酶/去垢剂溶液中，然后在55℃下搅拌15分钟。然后把玻璃平板从α-淀粉酶/去垢剂溶液中取出，以蒸馏水漂洗，于60℃下在干燥橱中干燥并再次称重。然后所说的α-淀粉酶的性能[以相对于选择的参比α-淀粉酶(指数为100)-在下面(实施例1)的实施例中是具有在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶-的指数表达]从处理前后的玻璃平板的重量差别中测定，结果如下:

下列的实施例进一步说明本发明。它们无意于以任何方式限制本发明所要求的范围。

实施例1

具有在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶的变体的小型餐具洗涤测试

上述的小型餐具洗涤测试在pH10.5下用具有在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶及其下列变体进行(它们的构建与纯化描述如下):T183^*+G184^*；Y243F；K269R。测试结果如下:

亲本(SEQ ID No.1) 指数:100

T183^*+G184^* 指数:120

Y243F 指数:120

K269R 指数:131

很明显，测试的变体T183^*+G184^*(它比亲本α-淀粉酶表现出特别高的热稳定性)、Y243F(它比亲本α-淀粉酶表现出更低的Ca²⁺离子依赖性)和K269R(它比亲本α-淀粉酶表现出更低的Ca²⁺离子依赖性以及在高pH下更高的稳定性)的每一种相对于亲本α-淀粉酶表现出明显改良的餐具洗涤性能。

实施例2

具有分别在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶的变体的构建

引物:下述的变体构建中使用的DNA引物包括下列引物[所有的DNA引物以从5’到3’的方向(从左到右)给出；P指代5’-磷酸盐]:

#7113:

GCT GCG GTG ACC TCT TTA AAA AAT AAC GGC

Y296:

CC ACC GCT ATT AGA TGC ATT GTA C

#6779:

CTT ACG TAT GCA GAC GTC GAT ATG GAT CAC CC

#6778:

G ATC CAT ATC GAC GTC TGC ATA CGT AAG ATA GTC

#3811:

TT A(C/G)G GGC AAG GCC TGG GAC TGG

#7449:

C CCA GGC CTT GCC C(C/G)T AAA TTT ATA TAT TTT GTT TTG

#3810:

G GTT TCG GTT CGA AGG ATT CAC TTC TAC CGC

#7450:

GCG GTA GAA GTG AAT CCT TCG AAC CGA AAC CAG

B1:

GGT ACT ATC GTA ACA ATG GCC GAT TGC TGA CGC TGT TAT TTG C

#6616:

P CTG TGA CTG GTG AGT ACT CAA CCA AGT C

#8573:

CTA CTT CCC AAT CCC AAG CTT TAC CTC GGA ATT TG

#8569:

CAA ATT CCG AGG TAA AGC TTG GGA TTG GGA AGT AG

#8570:

TTG AAC AAC CGT TCC ATT AAG AAG

A:具有在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶变体的构建

质粒pTVB106的描述:具有在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶及其变体从在图2中所示的质粒携带的基因SF16表达。质粒pTVB106包含从质粒pUB110获得的复制起点(Gryczan等，1978)以及赋予氯霉素抗性的cat基因。淀粉酶分泌得到Termamyl^TM信号序列的帮助，该信号序列准确地融合到(即成熟蛋白质的第一密码子)编码具有分别在SEQID No.4和SEQ ID No.1中所示的核苷酸和氨基酸序列(成熟蛋白质)的亲本α-淀粉酶基因中。Termamyl启动子启动基因的转录。

质粒pTVB106类似于pDN1528(参见丹麦公开专利申请1155/94)。在图2的质粒图谱上指出了一些单一限制位点，包括BstBI、BamHI、BstEII、EcoNI、DrdI、AflIII、DraIII、XmaI、SalI和BglII。

变体M202T的构建:使用了PCR重叠延伸诱变(overlap extensionmutagenesis)构建这个变体(Higuchi等，1988)。使用引物#7113和诱变引物#6778在PCR反应A中扩增pTVB106的大约350bp的DNA片段。在一个类似的PCR反应B中，使用引物Y296和#6779扩增大约300bp的DNA片段。使用这些引物和在反应A和B中纯化的DNA片段，在PCR反应C中扩增了跨从引物#7113到引物Y296的突变位点(M202)的全DNA片段。

以限制性核酸内切酶BstEII和AflIII消化PCR C DNA，使用用相同的酶消化的质粒pTVB106连接480bp片段并转化进低蛋白酶和低淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株中(例如，在WO 92/11357中提到的SHA273菌株)。

其它M202变体以类似的方式构建。

变体T183^*+G184^*和R181^*+G182^*的构建:使用了PCR重叠延伸诱变方法构建这些变体(Higuchi等，1988)。使用在一个位置的C和G(相等部分)的混合物合成了诱变的寡核苷酸，因此通过这种方法可以构建两种不同的突变。使用引物#7113和诱变引物#7449在PCR反应中扩增pTVB106的大约300bp的DNA片段。在类似的PCR反应B中，使用引物Y296和#3811扩增了大约400bp的DNA片段。使用这些引物和在反应A和B中纯化的DNA片段，在PCR反应C中扩增了跨从引物#7113到引物Y296的突变位点(氨基酸181-184)的全DNA片段。

以限制性核酸内切酶BstEII和AflIII消化PCR C DNA，使用用相同的酶消化的质粒pTVB106连接480bp片段并转化进低蛋白酶和低淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株中(例如，在WO 92/11357中提到的SHA273菌株)。得自这些转化体的质粒DNA的测序鉴别出两个正确的突变:即R181^*+G182^*和T183^*+G184^*。

变体R124P的构建:使用了PCR重叠延伸诱变方法以类似于变体M202T构建(见上)的方式构建这种变体。PCR反应A(用引物#3810和B1)产生大约500bp的片段，PCR反应B(用引物7450和Y296)产生大约550bp的片段。用限制性核酸内切酶BstEII和AflIII消化基于PCR反应A和B的产物、引物B1和Y296的PCR反应C，并将所得的跨氨基酸位置124的480bp的片段亚克隆进以相同的酶消化的pTVB106中，并转化进以上的枯草芽孢杆菌中。

变体R124P+T183^*+G184^*的构建:为了构建结合R124P和T183^*+G184^*突变的变体，使用了两个EcoNI限制位点(一个定位在位置1.774kb，即在R124P突变和T183^*+G184^*突变之间，一个定位在位置0.146kb)。把包含T183^*+G184^*突变的pTVB106样质粒的大约1630bp的EcoNI片段亚克隆进以相同的酶消化的另一种包含R124P突变的pTVB106样质粒的载体部分(包含复制起点的大约3810bp的DNA片段)。如上所述转化进枯草芽孢杆菌。

变体G182^*+G184^*；R181^*+T183^*；Y243F；K269R和L351C+M430C的构建:这些变体构建如下:

制备了包含在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列编码区的主要部分的特异性诱变载体。这个载体(定名为pPM103)的重要特征包括衍生自pUC质粒的复制起点、赋予氯霉素抗性的cat基因、包含移码突变的bla基因以及通常赋予氨苄青霉素抗性的野生型(amp^R表型)。突变的bla基因导致了amp^S表型。质粒pPM103如图3所示，在质粒上指出了大肠杆菌复制起点、5’-截短的SF16淀粉酶基因、ori、bla、cat以及选择的限制位点。

除了具有掺入的“选择性引物”(#6616)的质粒基于携带具有修复的bla基因的质粒的转化大肠杆菌细胞的amp^R表型被选择，而非使用Deng和Nickoloff概述的通过限制酶消化来选择之外，按照Deng和Nickoloff所述的方法[分析生物化学，200(1992)，81-88]把突变导入目的基因。用于诱变的化学药品和酶从Stratagene的Chameleon^TM诱变试剂盒获得(目录号200509)。

在对变体质粒中的DNA序列校验之后，包含所要求的变化的截短的基因作为大约1440bp的BstBI-SalI片段从pPM103样质粒亚克隆进pTVB106，并转化进枯草芽孢杆菌以表达变体酶。

构建成对缺失变体G182^*+G184^*使用了下列诱变引物:

P CTCTGTATC GACTTC CCA GTC CCA AGC TTT TGT CCT GAA TTT

ATA TAT TTT GTT TTG AAG

构建成对缺失变体R181^*+T183^*使用了下列诱变引物:

P CTC TGT ATC GAC TTC CCA GTC CCA AGC TTT GCC TCC GAA TTT

ATA TAT TTT GTT TTG AAG

构建取代变体Y243F使用了下列诱变引物:

P ATG TGT AAG CCA ATC GCG AGT AAA GCT AAA TTT TAT ATG TTT

CAC TGC ATC

构建取代变体K269R使用了下列诱变引物:

P GC ACC AAG GTC ATT TCG CCA GAA TTC AGC CAC TG

构建成对取代变体L351C+M430C，同时使用了下列诱变引物:

1)P TGT CAG AAC CAA CGC GTA TGC ACA TGG TTT AAA CCA TTG

2)P ACC ACC TGG ACC ATC GCT GCA GAT GGT GGC AAG GCC TGA

ATT

变体L351C+M430C+T183^*+G184^*的构建:这个变体通过把L351C+M430C成对取代突变和T183^*+G184^*成对缺失突变结合构建，二者的结合通过把包含L351C+M430C的大约1430bp的HindIII-AflIII片段亚克隆进用相同的酶消化的pTVB106样质粒(带有T183^*+G184^*突变)完成。

变体Y243F+T183^*+G184^*的构建:这个变体通过把Y243F突变和T183^*+G184^*突变结合构建，二者的结合通过把包含T183^*+G184^*的大约1148bp的DrdI片段亚克隆进用相同的酶消化的pTVB106样质粒(带有Y243突变)完成。

在含淀粉的琼脂平板上筛选具有α-淀粉酶活性的枯草芽孢杆菌转化体，通过DNA测序检查正确突变的存在。

变体Y243F+T183^*+G184^*+L351C+M430C的构建:把L351C+M430C成对取代突变作为大约470bp的Xmal-SalI片段亚克隆进用相同的酶消化的pTVB106样载体(包含Y243F+T183^*+G184^*)。

变体Y243F+T183^*+G184^*+L351C+M430C+Q391E+K444Q的构建:通过用包含所说的五种突变的pTVB106样载体的大约1440bp的BstB1-SalI片段取代pPM103中截短的SF16，构建了包含突变Y243F+T183^*+G184^*+L351C+M430C的pPM103样载体。通过使用下列两种诱变引物以类似于上述的对pPM103诱变的方式同时把Q391E和K444Q突变导入pPM103样载体(包含Y243F+T183^*+G184^*+L351C+M430C)中:P GGC AAA AGT TTG ACG TGC CTC GAG AAG AGG GTC TATP TTG TCC CGC TTT ATT CTG GCC AAC ATA CAT CCA TTT

B:具有在SEQ ID No.2中所示氨基酸序列的亲本α-淀粉酶变体的构建

质粒pTVB112的描述:构建了用于具有在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中表达的定名为pTVB112的载体。该载体除了编码SEQ ID No.2中的成熟α-淀粉酶的基因插入到pTVB106的Pstl和HindIII位点之间外，与pTVB106十分类似。这样，这种α-淀粉酶(SEQ IDNo.2)的表达也受amyL启动子与信号序列指导。质粒pTVB112在图4中所示。

变体D183^*+G184^*的构建:这个变体的构建使用较早提及的PCR重叠延伸诱变方法(见上)完成。引物#8573和B1用于PCR反应A，引物#8569和#8570用于PCR反应B。从反应A和反应B纯化的片段和引物1B和#8570用于PCR反应C，产生了大约1020bp的DNA片段。该这片段用限制性内切核酸酶Pstl和MluI消化，亚克隆进表达载体并转化进枯草芽孢杆菌。

其它变体的构建:通过和用于SEQ ID No.1的氨基酸序列的突变体产生的质粒pPM103构建类似的方法(见上)，构建了一种对变体D183^*+G184^*(SEQ ID No.2)继续诱变的质粒(定名为pTVB114；在图5中所示)。以类似于pPM103(SEQ ID No.1)的方式把突变导入pTVB114中(SEQ IDNo.2；D183^*+G184^*)。

构建成对缺失变体R181^*+D183^*和R181^*+G182^*，选择的是改变变体D183^*+G184^*中的侧翼氨基酸，而不是缺失SEQ ID No.2的野生型基因中的特定氨基酸。下列诱变引物和作为模板的pTVB114一起用于诱变:

PCC CAA TCC CAA GCT TTA CCA(T/C)CG AAC TTG TAG ATA CG

两种碱基的混合物(T/C)在一个位置的存在使得基于一种诱变引物的两种不同的缺失侧翼氨基酸可以存在。形成的质粒的DNA测序证明一种或另一种突变的存在。突变的目的基因作为Pstl-DraIII片段亚克隆进以相同的酶消化的pTVB112中，然后转化进枯草芽孢杆菌。

构建G182^*+G184^*和R181^*+G184^*使用了下列诱变引物和作为模板的pTVB114:

PCC CAA TCC CAA GCT TTA TCT C(C/G)G AAC TTG TAG ATA CG

如上所述，两种碱基的混合物(C/G)在一个位置的存在使得基于一种诱变引物的两种不同的缺失侧翼氨基酸可以存在。形成的质粒的DNA测序证明一种或另一种突变的存在。突变的目的基因作为Pstl-DraIII片段亚克隆进以相同的酶消化的pTVB112中，然后转化进枯草芽孢杆菌。

构建D183^*+G184^*+M202L使用了下列诱变引物:

PGA TCC ATA TCG ACG TCT GCA TAC AGT AAA TAA TC

构建D183^*+G184^*+M202I使用了下列诱变引物:

PGA TCC ATA TCG ACG TCT GCA TAA ATT AAA TAA TC

实施例3

具有在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶的M202取代变体的氧化稳定性测定

A:SEQ ID No.1中的序列的变体的氧化稳定性

测定使用各自的变体在pH9.0的50mM Britton-Robinson缓冲液(50mM醋酸、50mM磷酸、50mM硼酸、0.1mM CaCl₂、以NaOH把pH调整到目的值)中的溶液进行，并向溶液中加入过氧化氢(在时间t＝0时)使其最终浓度达到200mM H₂O₂。然后溶液在40℃的水浴中温育。

加入过氧化氢后温育5、10、15和20分钟后，剩余的α-淀粉酶活性使用上述的Phadebas测定法测定。样品中剩余活性使用pH7.3的50mMBritton-Robinson缓冲液在37℃下测定(参见Novo分析出版物AF207-1/1，可从Novo NordiskA/S得到)。测定了相对于没有和过氧化氢温育的同样的酶的相应参比溶液在0分钟时(100％活性)的活性下降。

初始活性的百分比作为时间的函数在下面所说的亲本酶(SEQ ID No.1)和变体的表中所示。

所有测试的M202取代变体相对于亲本α-淀粉酶(SEQ ID No.1)清楚地表现出明显改良的氧化稳定性。

B:SEQ ID No.2中的序列的变体的氧化稳定性

使用所说的亲本α-淀粉酶(SEQ ID No.2)、变体M202L+D183^*+G184^*(在下表中称为L)、变体M202I+D183^*+G184^*(在下表称为I)如上所述分别进行测量。在这种情况下，使用了5、10、15和30分钟的温育时间(在添加过氧化氢之后)。如上表，初始活性的百分比作为时间的函数在下面所说的亲本酶和变体的表中所示。

测试的两个“取代+成对缺失”变体(它们都包含M202取代)相对于亲本α-淀粉酶(SEQ ID No.2)清楚地表现出明显改良的氧化稳定性。

实施例4

具有在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶变体的热稳定性测定

A:在SEQ ID No.1序列中的成对缺失变体的热稳定性

测定使用各自的变体在pH9.0的50mM Britton-Robinson缓冲液(见上)中的溶液进行。溶液在65℃的水浴中温育，温育指定的时间之后样品取出。各取出样品的剩余α-淀粉酶活性使用以上所述的Phadebas测定方法进行测量。测定了相对于没有温育的同样的酶的相应参比溶液在0分钟时(100％活性)的活性下降。

初始活性的百分比作为时间的函数在下面所说的亲本酶(SEQ ID No.1)和下列的成对缺失变体的表中所示。

变体1:R181^*+G182^*

变体2:R181^*+T183^*

变体3:G182^*+G184^*

变体4:T183^*+G184^*

变体5:T183^*+G184^*+R124P

很明显，所有测试的成对缺失变体相对于亲本α-淀粉酶(SEQ ID No.1)表现出明显改良的热稳定性，变体5(除了变体4的成对缺失突变之外还包括取代R124P)的热稳定性比其它的变体显著地高。因为取代变体R124P(仅包含取代R124P)的量热结果表明其相对于亲本α-淀粉酶大约7℃的热稳定性，看起来突变R124P和成对缺失的热稳定性效果分别相互加强。

B:在SEQ ID No.2中的序列的成对缺失变体的热稳定性

对亲本酶(SEQ ID No.2)和下列成对缺失变体进行了相应的测定:

变体A:D183^*+G184^*

变体B:R181^*+G182^*

变体C:G182^*+G184^*

还是很明显，所说的成对缺失变体相对于亲本α-淀粉酶(SEQ ID No.2)表现出明显改良的热稳定性。

C:SEQ ID No.1中序列的多组合变体的热稳定性

对在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的下列变体进行了相应的比较测量。

变体4:T183^*+G184^*

变体6:L351C+M430C

变体7:Y243F

变体8:Q391E+K444Q

变体9:T183^*+G184^*+L351C+M430C+Y243F+Q391E+K444Q

再一次明显说明，多重突变的热稳定效果(多重突变中的每一种都有热稳定效果)是-至少是定性地-累积性的。

实施例5

本发明的α-淀粉酶变体的Ca²⁺结合亲和力

淀粉酶暴露于热或变性剂如盐酸胍的解折叠伴随着荧光的减弱。失去钙离子导致解折叠，一系列α-淀粉酶对钙的亲和力可通过每种α-淀粉酶(如以10μg/ml的浓度)在缓冲液中(如pH7的50mM HEPES)和不同浓度的钙(如在1μM至100mM的范围内)或EGTA(如在1-1000μM的范围内)[EGTA＝1，2-双(2-氨基乙氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸]温育足够长的时间(如在55℃下22小时)之前和之后的荧光测量来测量。

所测得的荧光F是由折叠和解折叠形式的酶的贡献组成的。可以推导下列的方程式以描述F对钙浓度([Ca])的依赖:

F＝[Ca]/(K_diss+[Ca])(α_N-β_Nlog([Ca]))+(K_diss/(K_diss+[Ca])(α_U-β_Ulog([Ca]))

其中α_N是天然的(折叠的)形式的酶的荧光，β_N是α_N对钙浓度对数的线性依赖性(实验观察得到)，α_U是解折叠形式的荧光，β_U是α_U对钙浓度对数的线性依赖性。K_diss是平衡过程的表观钙结合常数，所述平衡过程表示如下:

事实上，解折叠过程极慢而且不可逆。解折叠速率依赖于钙浓度，对给定的α-淀粉酶的依赖性提供了酶的Ca-结合亲和力测量方法。通过定义一组标准的反应条件(例如，55℃下22小时)，可以进行不同α-淀粉酶的K_diss的有意义的比较。通常α-淀粉酶的钙解离曲线可拟合上述的方程式，使得可以进行相应的K_diss值的测定。

下列的K_diss值是具有在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶和按照本发明的指出的α-淀粉酶变体获得的值(亲本α-淀粉酶在括弧中指出):

从上述可明显看到:后者的α-淀粉分解酶的钙结合亲和力在上述表中以降低的方向减少，即成对缺失变体D183^*+G184^*(SEQ ID No.2)结合钙能力最强(即有最低的Ca²⁺依赖性)，而SEQ ID No.1的亲本α-淀粉酶结合钙能力最弱(即有最高的Ca²⁺依赖性)。

说明书中引用的参考文献

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R.K.Saiki等，科学239，1988，487-491。

Morinaga等，1984，生物技术，2，646-639。

Nelson和Long，分析生物化学，180，1989，147-151。

Hunkapiller等，1984，自然，310，105-111。

R.Higuchi，B.Krummel和R.K.Saiki(1988)，DNA片段体外制备和特异性诱变的一般方法:蛋白质和DNA相互作用的研究，核酸研究，16，7351-7367。

Dubnau等，1971，分子生物学杂志，56，209-221。

Gryczan等，1978，细菌学杂志，134，318-329。

S.D.Erlich，1977，美国科学院学报，74，1680-1682。

Bool等，1990，生物化学，29，6244-6249。

Deng和Nickoloff，1992，分析生物化学，200，81-88。

序列表

(1)一般信息:

(i)申请人:

(a)姓名:NOVO NORDISK A/S

(b)街道:NOVO Alle

(c)城市:DK-2880 Bagsvaerd

(e)国家:丹麦

(f)邮区代码(ZIP):DK-2880

(g)电话:+45 44 44 88 88

(h)电传:+45 44 49 32 56

(ii)发明题目:淀粉酶变体

(iii)序列数:7

(iv)计算机可读形式:

(A)介质类型:软盘

(B)计算机:IBM PC兼容机

(C)操作系统:PC-DOS/MS-DOS

(D)软件:PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPO)

(2)SEQ ID No.1的信息:

(i)序列特征:

(A)长度:485个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(C)链型:单链

(D)拓扑结构:线性

(ii)分子类型:肽

(xi)序列描述:SEQ ID No.1:

(2)SEQ ID No.2的信息:

(i)序列特征:

(A)长度:485个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(C)链型:单链

(D)拓扑结构:线性

(ii)分子类型:肽

(xi)序列描述:SEQ ID No.2:

(2)SEQ ID No.3的信息:

(i)序列特征:

(A)长度:514个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(C)链型:单链

(D)拓扑结构:线性

(ii)分子类型:肽

(xi)序列描述:SEQ ID No.3:

(2)SEQ ID No.4的信息:

(i)序列特征:

(A)长度:1455个碱基对

(B)类型:核酸

(C)链型:单链

(D)拓扑结构:线性

(ii)分子类型:DNA(基因组)

(xi)序列描述:SEQ ID No.4:

(2)SEQ ID No.5的信息:

(i)序列特征:

(A)长度:1455个碱基对

(B)类型:核酸

(C)链型:单链

(D)拓扑结构:线性

(ii)分子类型:DNA(基因组)

(xi)序列描述:SEQ ID No.5:

(2)SEQ ID No.6的信息:

(i)序列特征:

(A)长度:1548个碱基对

(B)类型:核酸

(C)链型:单链

(D)拓扑结构:线性

(ii)分子类型:DNA(基因组)

(xi)序列描述:SEQ ID No.6:

(2)SEQ ID No.7的信息:

(i)序列特征:

(A)长度:485个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(C)链型:单链

(D)拓扑结构:线性

(ii)分子类型:肽

(xi)序列描述:SEQ ID No.7:

Claims

1.一种亲本α-淀粉酶的变体，该亲本α-淀粉酶:(i)具有选自分别在SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示氨基酸序列的氨基酸序列；或(ii)与这些氨基酸序列中的一种或多种显示出至少80％的同源性；和/或显示出与如下抗体的免疫交叉反应性，所述抗体针对具有这些氨基酸序列之一的α-淀粉酶产生；和/或由如下DNA序列编码，所述DNA序列与编码具有这些氨基酸序列之一的α-淀粉酶之DNA序列与相同的探针杂交；在这种变体中:

(a)所说的亲本α-淀粉酶的至少一个氨基酸残基已被缺失；和/或

(b)所说的亲本α-淀粉酶的至少一个氨基酸残基已被不同的氨基酸残基取代；和/或

(c)相对所说的亲本α-淀粉酶而言至少有一个氨基酸残基已被插入；

所说的变体具有α-淀粉酶活性并且相对于所说的亲本α-淀粉酶表现出至少一种下列性质:增加的热稳定性；增加的氧化稳定性；和降低的Ca²⁺依赖性；

其条件是所说的变体的氨基酸序列不与分别在SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列之任一相同。

2.按照权利要求1的变体，其中所说的亲本α-淀粉酶的至少一个可氧化的氨基酸残基已被缺失或已被不同的氨基酸残基取代，后者对氧化不如所说的可氧化的氨基酸残基敏感。

3.按照权利要求2的变体，其中所说的可氧化的氨基酸残基选自由甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸和酪氨酸组成的组。

4.按照权利要求2或3的变体，其中所说的可氧化的氨基酸残基是甲硫氨酸，该甲硫氨酸是或等同于在SEQ ID No.1中所示氨基酸序列的M9、M10、M105、M202、M208、M261、M309、M382、M430或M440。

5.按照权利要求4的变体，该变体包含甲硫氨酸取代，此甲硫氨酸取代是或等同于在SEQ ID No.1中所示氨基酸序列的下列取代之一:M9L；M10L；M105L；M202L、T、F、I、V；M208L；M261L；M309L；M382L；M430L；M440L。

6.按照权利要求3-5任一之变体，其中所说的甲硫氨酸残基已被苏氨酸取代。

7.根据以上权利要求任一之变体，其中至少一个氨基酸已被缺失，该氨基酸是或等同于在SEQ ID No.1中所示氨基酸序列的F180、R181、G182、T183、G184或K185。

8.按照权利要求7的变体，其中所说的缺失的氨基酸是或等同于所说的氨基酸残基中的任何两个。

9.按照权利要求8的变体，其中所说的缺失是或等同于R181^*+G182^*或T183^*+G184^*。

10.根据以上权利要求任一之变体，该变体包含氨基酸取代，此取代是或等同于在SEQ ID No.1中所示氨基酸序列中的下列取代之一:K269R；P260E；R124P；M105F、I、L、V；M208F、W、Y；L217I；V206I、L、F。

11.按照以上权利要求任一之变体，该变体包含氨基酸取代，此取代是或等同于在SEQ ID No.1中所示氨基酸序列中的下列取代之一:Y243F、K108R、K179R、K239R、K242R、K269R、D163N、D188N、D192N、D199N、D205N、D207N、D209N、E190Q、E194Q、N106D。

12.一种包含编码按照权利要求1-11任一之α-淀粉酶变体的DNA序列的DNA构建体。

13.一种携带按照权利要求12的DNA构建体的重组表达载体。

14.一种用按照权利要求12的DNA构建体或按照权利要求13的载体转化的细胞。

15.按照权利要求14的细胞，该细胞是微生物。

16.按照权利要求15的细胞，该细胞是细菌或真菌。

17.按照权利要求16的细胞，该细胞是革兰氏阳性细菌，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、浅青紫链霉菌、鼠灰链霉菌，或者是革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌。

18.一种产生按照权利要求1-11任一之α-淀粉酶变体的方法，其中在有利于α-淀粉酶变体生成的条件下培养按照权利要求14-17任一之细胞，随后从所用的培养基中回收所说的α-淀粉酶变体。

19.按照权利要求1-11任一之α-淀粉酶变体在洗涤和/或餐具洗涤上的用途。

20.一种包含按照权利要求1-11任一之α-淀粉酶变体的去垢剂添加剂，其可以以或不以无粉尘粒状、稳定的液体或受保护酶形式存在。

21.按照权利要求20的去垢剂添加剂，该添加剂每克包含0.02-200mg的酶蛋白质。

22.按照权利要求20或21的去垢剂添加剂，该添加剂还包括另一种酶，如蛋白酶、脂酶、过氧化物酶、另一种淀粉分解酶和/或纤维素酶。

23.一种包含按照权利要求1-11任一之α-淀粉酶变体和表面活性剂的去垢组合物。

24.按照权利要求23的去垢组合物，该组合物还包含另一种酶如蛋白酶、脂酶、过氧化物酶、另一种淀粉分解酶和/或纤维素酶。

25.一种手工或机用餐具洗涤剂组合物，该组合物包含按照权利要求1-11任一之α-淀粉酶变体和表面活性剂。

26.按照权利要求25的餐具洗涤剂组合物，该组合物还包含另一种酶如蛋白酶、脂酶、过氧化物酶、另一种淀粉分解酶和/或纤维素酶。

27.一种手工或机用洗衣组合物，该组合物包含按照权利要求1-11任一之α-淀粉酶变体和表面活性剂。

28.按照权利要求27的洗衣组合物，该组合物还包含另一种酶如蛋白酶、脂酶、过氧化物酶、淀粉分解酶和/或纤维素酶。

29.按照权利要求1-11任一之α-淀粉酶变体在纺织品去浆上的用途。