CN101377486A - 丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测丙型肝炎病毒基因型的试剂盒，特别是涉及使用核酸反向斑点杂交技术，制备一种丙型肝炎病毒基因型检测的试剂盒，用于快速准确地区分临床血液样品中丙型肝炎病毒基因型。
Description
技术领域
本发明涉及检测丙型肝炎病毒基因型的试剂盒，特别是涉及使用核酸反向斑点杂交技术，制备一种丙型肝炎病毒基因型检测的试剂盒，用于快速准确地区分临床血液样品中丙型肝炎病毒基因型。
背景技术
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是严重危害人类健康的肝炎病毒之一，是重要的肝脏疾病致病因子。目前，全球有超过1.7亿人感染HCV，其中每年有超过10万例HCV患者发展为肝癌，进而出现消化道出血及腹水。根据WHO 2002年年报，在2001年，慢性肝病引起1,400万例死亡，包括79.6万例由肝硬化引起、61.6万例由原发性肝癌引起。而在2001年，因慢性肝病引起死亡的病例中就有20％(超过2.8万)是由HCV感染引起。目前已经有大量病例可以证明在大多数国家由肝癌引起的死亡数量的增加是由于丙型肝炎感染造成。
丙型肝炎病毒是一种正性单链RNA黄病毒，包括9,400左右个核苷酸。HCV基因组具有一个单独的开放阅读框，编码一具有3,010个氨基酸的多聚蛋白体，翻译后被分为病毒复制和病毒粒形成所必须的结构和非结构蛋白。HCV具有高度的变异性(其变异率高达1.4-1.9×10-3/核苷酸/年)和本身具有负选择作用的特征，高突变是由于复制酶无校正功能；易误性RDRP(error-prone RDRP，EP-RDRP)的存在以及正选择作用等原因。而其本身具有负选择作用又表现为：病毒基因组中各种基因结构及功能不同，有些区域高度保守。根据全世界不同地区分离的HCV不同株的全部或部分基因组的系统进化分析，HCV至少可分为6型(HCV1—6型)，各型又分许多亚型(如1a、1b、2a、2b等)。各型核酸序列之间相差31—34％，氨基酸序列相差大约30％，而亚型序列之间相差约20—23％。有几种HCV病毒株主要从东南亚被分离出，被命名为HCV7，8，9，10，11型，除了HCV10a型(目前被列入HCV3型)，由于其系统进化上的相似性，其余各型被列入HCV6型。
目前对HCV基因分型方法主要有：限制性长度多态性(RFLP)，型特异性引物PCR，型特异性探针核酸杂交分析，直接测序等方法，但是这些方法大多存在操作繁琐，检测时间长，价格昂贵，灵敏度低，特异性不高等缺点，不适合广大基层医院开展。因此本发明人结合已知的PCR-斑点杂交方法，制备了一种短时间内检测丙型肝炎基因型的试剂盒。
发明内容
本发明涉及检测临床生物样品中丙型肝炎病毒基因型的试剂盒，特别是提供了一种利用核酸反向斑点杂交技术快速准确的区分临床血液样品中丙型肝炎病毒基因型的试剂盒。
因此本发明的一个目的是提供一种用于检测临床生物样品中丙型肝炎病毒基因型的试剂盒，该试剂盒包括(1)待检血清样品RNA的提取试剂(2)逆转录试剂；(3)聚合酶链式反应试剂；(4)杂交膜及反向斑点杂交反应试剂。其特征在于：
丙型肝炎(HCV)病毒核酸(RNA)逆转录引物：
逆转录(RT)引物：5′-GCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACCT-3′(SEQ ID NO:1)
聚合酶链反应扩增体系中使用的上游和下游引物分别为：
PCR上游引物：5′-TCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGT-3′(SEQ ID NO:2)
PCR下游引物：5′-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-3′(SEQ ID NO:3)
杂交反应中使用的寡核甘酸探针分别是：
探针IC：5′-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′(SEQ ID NO:4)
探针PC1：5′-ATTTGGGCGTGCCCCCGC-3′(SEQ ID NO:5)
探针PC2：5′-CGGAACCGGTGAGTACACC-3′(SEQ ID NO:6)
探针1：5′-CAATGCCTGGAGATTTGGGCG-3′(SEQ ID NO:7)
探针1b-1：5′-CCGCGAGACTGCTAGCCG-3′(SEQ ID NO:8)
探针1b-2：5′-GCGAGACCGCTAGCCGAGT-3′(SEQ ID NO:9)
探针2-1：5′-AGTAGCGTTGGGTTGCGAAAG-3′(SEQ ID NO:10)
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探针2a-1：5′-GCCGGGAAGACTGGGTCCT-3′(SEQ ID NO:12)
探针2a-2：5′-CCCACTCTATGCCCGGCCA-3′(SEQ ID NO:13)
探针3-1：5′-CCCGCGAGATCACTAGCCG-3′(SEQ ID NO:14)
探针3-2：5′-AATCGCTGGGGTGACCGGG-3′(SEQ ID NO:15)
探针3b：5’-CCCGCTCAATGCCCGGAAAT-3’(SEQ ID NO:16)
探针6：5’-GACCGGGTCCTTTCCATTGG-3’(SEQ ID NO:17)
根据本发明的一个实施优选方案，所设计的引物和探针是针对国际基因库Genebank中已经发表的HCV(1-6)，选取高度保守的5’UTR区设计引物和探针。
根据本发明的一个实施优选方案，针对1型的探针与已知的丙肝病毒2，3，4，5，6型相应基因组序列差异不少于两个碱基。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的待检血清样品RNA的提取试剂包括RNA提取液A，RNA提取液B，DEPC水。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的逆转录(RT)试剂包括逆转录酶、逆转录反应体系、阳性标准品、阴性质控品。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的聚合酶链反应试剂是由dNTPs、耐热Taq酶等组成的PCR反应混合液。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的杂交反应试剂包括杂交液I(1.8×SSC-0.1％SDS)和II(0.5×SSC-0.1％SDS)、溶液I(250U/ml偶联辣根过氧化物酶的链酶亲和素溶液)、II(0.1mol/L的柠檬酸钠溶液)、III(2mg/ml的四甲基联苯胺溶液)和IV(3％的过氧化氢溶液)、杂交用膜条以及标准对照品。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的检测是使用带有多孔滤板和减压抽吸部件的反向点印迹杂交装置、恒温水浴或空气浴装置完成的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的标记引物的小分子可以是生物素，地高辛等。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的基质可以是尼龙膜、硝酸纤维素膜醋酸纤维素膜。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的将探针固定在膜条适当为位置的方法，包括将探针通过紫外线交联，以及用氨基标记的探针交联EDC(N-乙基-N’-[二甲基氨丙基]-碳二亚胺，Sigma公司)处理过的硝酸纤维素、尼龙或醋酸纤维素等固相支持材料。
传统的印迹杂交方法是将靶DNA固定于尼龙膜或硝酸纤维素膜上，用标记的探针与待检靶DNA相互接触并杂交，显影或显色后判定结果。用这种方法每次杂交反应只能检测一个待测DNA中是否含有某一种探针的互补序列，即一次只能判断一种基因型。如果某个基因座位有多种等位基因(如HLA-A，HLA-B，HLA-DR位点)或要检测多个靶序列(如地中海贫血突变基因，ABO血型等)，用这种点杂交方法一次性检测就很繁杂，甚至难以完成。而反向斑点杂交方法则是先设计针对各等位基因的特异性探针，并将探针点加到杂交基质上，然后再将待测DNA样品(一般是使用5′-端标记有生物素或地高辛等分子的引物PCR扩增靶DNA片段后的产物)与之杂交，这样待测样本就会与具有互补序列的探针结合，洗涤除去未结合的DNA后，即可检测到特异性结合的靶序列。因此，使用该方法可一次同时检测某一位点的正常及其相关的多种突变形式，或不同位点的正常或突变。
为了完成本发明中所涉及试剂盒对丙型肝炎病毒的分型检测，首先常规制备待检者血液中的丙型肝炎病毒RNA。使用RNA提取试剂盒提取得到丙型肝炎病毒RNA。以此提取得到的RNA作为模板，并用合成的寡核苷酸逆转录引物进行逆转录反应得到cDNA；然后用通过上述方法得到的cDNA作为模板，并用合成的PCR上游和下游寡核苷酸PCR引物进行PCR扩增。变性处理所得到的DNA扩增产物后，使之分别与足以揭示不同的丙型肝炎病毒(HCV)基因型和亚型的寡核苷酸探针杂交。最后，根据杂交产物染色后的颜色变化判断丙型肝炎病毒(HCV)不同的基因型和基因亚型。现针对本发明方法的几个主要步骤，分别详细描述如下。
1、引物探针的设计
相关文献证实，HCV基因组中5’UTR区基因序列进行分型可体现HCV全基因组分型状况，本研究根据已知丙型肝炎病毒(HCV)的序列，比对后选取高度保守的5’UTR区作为目标区域，设计出2条HCV通用探针，1条1型通用探针，2条1b亚型探针，2条2型通用探针，2条2a亚型，2条3型通用探针，1条3b型探针，1条6型探针；通过通用探针可以检出是否有HCV感染，其它11条探针则可检测出具体型别和亚型感染；合成的探针经20％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并纯化。
所有设计的型或亚型特异探针，都比其他型或亚型的丙肝病毒基因组全序列至少有两个碱基以上的差异。这一设计，使得相应型别或亚型探针与其他型或亚型丙肝病毒的目的扩增片段杂交更为困难，从而最大程度的避免了非特异的产生。
2、杂交载体的制备
用作杂交载体的膜可以是由硝酸纤维素、尼龙或醋酸纤维素等固相支持材料制成的。新合成的探针以适当方式固定在膜条的适当位置。其中两条通用探针稀释成一管，其中PC1浓度为10pmol/μl，PC2浓度为20pmol/μl，将合成一管后液体点至一个位置，形成通用探针点(PC点)，将稀释好探针点样并凉干后用NaOH溶液处理膜条并用蒸馏水充分洗涤，然后保存于4℃备用。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的适当方式，包括将探针通过紫外线交联，以及用氨基标记的探针交联EDC(N-乙基-N’-[二甲基氨丙基]-碳二亚胺，Sigma公司)处理过的硝酸纤维素、尼龙或醋酸纤维素等固相支持材料。
3、核酸的提取
采用常规RNA提取液提取人个体血液样品中的丙型肝炎病毒RNA。例如，用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温(22～25℃)放置30～60分钟或离心后析出血清。吸取上层血清100μl，转移至1.5ml灭菌离心管，并加入20μl充分混匀的的RNA提取液A，再加入400μl的RNA提取液B充分混匀。室温放置5分钟，6000rpm，离心1分钟，小心吸去上清，用75％的预冷乙醇(DEPC水配制)洗沉淀两次。65摄氏度干燥沉淀10分钟。向沉淀管中加入18μl的丙型肝炎逆转录体系，便可进行下一步的逆转录反应。
4、RNA的逆转录体系及实验条件的优化
在逆转录体系及实验条件的优化过程中，通过比较多个温度的条件下逆转录的效率，优化选择出最佳的逆转录温度条件，另外，我们对逆转录过程中使用的引物及其浓度，以及Mg2+、模板等其他反应物的浓度均作了适当的调整和最佳化。
4、核酸扩增体系的优化
在PCR扩增中，首先利用降落PCR摸索退火温度，以及摸索反应条件借以提高核酸扩增的特异性和高效性。特别是，我们对PCR扩增中使用的引物和其浓度、以及Mg2+、模板等其他反应物的浓度均作了适当的调整和最佳化。
5、反向斑点杂交体系的优化
反向斑点杂交结合PCR-斑点印迹杂交技术和过滤杂交，其操作过程包括：例如，首先将如前制备的HCV基因分型膜条放入装有预热杂交液I的2ml离心中，杂交时，先95℃变性PCR扩增产物5分钟，然后置冰中冷却2分钟以上，再在约56℃预热的杂交液I的存在下，在56℃的水浴摇床中，使PCR扩增产物与5′端氨基标记的探针杂交约60分钟。杂交反应完成后，经洗膜和显色步骤以显示杂交斑点的存在，并根据所显色的探针类型来判断各个体的基因型。
由图3所示的检测实例可以看出，如果显色反应控制探针1(SEQ ID NO:4)和探针2(SEQID NO:5-6)均显色的同时，探针4(SEQ ID NO:8)和探针5(SEQ ID NO:9)中一个点显色或者同时显色，可判定HCV基因型为1b型；显色反应控制探针1(SEQ ID NO:4)和探针2(SEQID NO:5-6)均显色的同时，探针3(SEQ ID NO:10)显色，可判定HCV基因型为1型；如果显色反应控制探针1(SEQ ID NO:4)和探针2(SEQ ID NO:5-6)均显色的同时，探针6(SEQID NO:10)和探针7(SEQ ID NO:11)中一个点显色或者同时显色，可判定HCV基因型为2型；如果显色反应控制探针1(SEQ ID NO:4)和探针2(SEQ ID NO:5-6)均显色的同时，探针8(SEQ ID NO:12)和探针9(SEQ ID NO:13)中的一个点显色或者同时显色，可判定HCV基因型为2a型；如果显色反应控制探针1(SEQ ID NO:4)和探针2(SEQ ID NO:5-6)均显色的同时，探针3(SEQ ID NO:7)、探针6(SEQ ID NO:10)和探针10(SEQ ID NO:17)也都显色，可判定HCV基因型为6型；如果显色反应控制探针1(SEQ ID NO:4)和探针2(SEQ IDNO:5-6)均显色的同时，探针11(SEQ ID NO:14)和探针12(SEQ ID NO:15)中一个点显色或者同时显色，可判定HCV基因型为3型；如果显色反应控制探针1(SEQ ID NO:4)和探针2(SEQ ID NO:5-6)均显色的同时，探针13(SEQ ID NO:16)也显色，可判定HCV基因型为3b型；如果有显色反应控制探针1(SEQ ID NO:7)和探针2(SEQ ID NO:4-6)显色，说明检测的病原体为HCV；如果只有显色反应控制探针1(SEQ ID NO:4)显色，其它探针不显色则说明HCV为阴性或PCR扩增失败；如果有各型别探针:1型(3、4、5)、2型(6、7、8、9)、3型(11、12、13)、6型(10)中的型别点一种或几种型别点同时显色，则判断为混合感染(由于HCV6型——探针10显色时，均伴有HCV1型——探针3和HCV2型——探针6的显色，此种情况只能判定为HCV6型，而非混合感染)。(参见图3)。在显色反应中，使用显色系统进行显色，例如，使标记物生物素与链霉素抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶结合物(POD)特异性结合，使底物四甲基链苯胺(TMB)生成蓝色的沉淀。然后，借助计算机图像分析或肉眼判读结果。在杂交显色过程中，若使用链酶亲和素偶联碱性磷酸酶同样可以和生物素结合，并使底物5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸对甲苯胺盐(BCIP)生成深蓝色沉淀而完成本发明中的显色过程。
另外，本发明通过反复摸索不同的杂交温度和探针浓度(例如，将杂交温度设定在56℃，探针浓度介于5pmol/L～20pmol/L)，可使检测的结果更为准确可靠，并具有更好的检测稳定性(可重复性)。
本发明中，由于发明人对靶核酸片段的扩增体系和杂交体系进行了优化，设计并合成了特异性强的探针和引物，同时检测中使用水浴摇床作为反向点印迹杂交装置，从而保证了方法的快捷和检测结果的可靠性。
如前所述，由于反向斑点杂交方法能够同时检测目的基因内多个碱基的突变或多态性，所以在病原体及复杂遗传性疾病的检测中有着更为简便的优越性。在丙肝的诊疗中，丙型肝炎病毒基因型慢性肝炎和某些重症肝病(肝硬化、肝癌等)的发生和发展密切相关，且不同基因型对治疗药物(如α干扰素)也有一定的关系，因此HCV基因型检测成为临床医务工作者研究的热点。本发明的HCV基因型检测方法显然可以为丙型肝炎的诊断提供一种快速、简便、特异性和准确性均较高的实验室检验手段。
如前所说，为简单快速地检测个体血液样品中丙型肝炎病毒(HCV)具体基因型和基因亚型，本发明提供了相应的丙型肝炎病毒(HCV)基因分型反向斑点杂交检测试剂盒。具体地说，本发明的试剂盒提供：
(1)由RNA提取液A、RNA提取液B、DEPC水组成的RNA提取试剂；
(1)由逆转录酶、逆转录反映体系、阳性标准品、阴性质控品组成的逆转录(RT)试剂。
(2)包括PCR反应混合液(共10管，每管含PCR反应缓冲液、Mgcl2(1.6mmol/L)、dNTPs(0.2mmol/L)、正反向引物(0.1umol/L)，以及Taq酶(3u/μl，1管)的聚合酶链反应试剂；
(3)由常规的20×SSC、十二烷基磺酸钠(SDS)、链霉素抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶结合物(POD)组成的杂交检测试剂，另外还包括用作杂交反应载体的膜条10张。
本发明的试剂盒除提供了各位点所对应的特异性探针外，还配有显色反应控制探针和标准对照品。
本发明涉及的试剂盒中，由于使用了针对各型别或亚型HCV核酸序列所设计的引物扩增靶核酸序列，并设计了显色对照探针及检测HCV基因型或基因亚型寡核苷酸探针进行核酸杂交分析，所以该试剂盒能够准确而有效地鉴别和区分HCV基因型和亚型。本发明涉及的试剂盒不仅能用于检测单一HCV感染，而且能够定性地检测HCV的混合感染，从而为丙型肝炎的临床个体化治疗提供分子病毒学证据，为临床用药提供有意义的参考。一般说来，使用本发明中涉及的试剂盒，从样本的处理到判读基因型检测结果仅需要约10小时的时间，与传统的杂交方法相比，本方法的发明显然还具有操作简单、快速方便的优点。因此，本发明的方法和试剂盒特别适用于临床标本的快速检测和大量样本的普查。
表1 HCV基因分型型别判定表
| 样品号 | 探针显色情况 | 基因型 |
| 1 | 1、2号探针均显色 | HCV感染 |
| 2 | 1、2号均显色，且3号探针显色，其余无显色 | 1型感染 |
| 3 | 1、2号均显色，且4、5号探针同时或者其中之一显色 | 1b型感染 |
| 4 | 1、2号显色、且6、7号探针同时或者其中之一显色，其余无显色 | 2型感染 |
| 5 | 1、2号显色、且8、9号探针同时或者其中之一显色 | 2a型感染 |
| 6 | 1、2号显色、且3、6、10号探针同时显色 | 6型感染 |
| 7 | 1、2号显色、且11、12号探针同时或者其中之一显色 | 3型感染 |
| 8 | 1、2号显色、且13号探针也显色 | 3b型感染 |
附图说明
图1显示所使用的探针在膜条上的排列图。1号探针具有SEQ ID NO:4所示的序列，为显色探针，用于控制显色反应的整个过程；2号阳性控制探针具有SEQ ID NO:5-6所示的序列，为阳性对照探针，如果显色，则代表所检测的生物样本为HCV；3号探针有SEQ ID NO:7所示的序列，为1型特异探针，显色时判定为1型；4号探针具有SEQ ID NO:8所示的序列，5号探针具有SEQ ID NO:9所示的序列，均为1b型特异探针，单一或者同时显示均判定为1b型；6号探针具有SEQ ID NO:10所示的序列，7号探针具有SEQ ID NO:11所示的序列，均为2型特异探针，单一或者同时显示均判定为2型；8号探针具有SEQ ID NO:12所示的序列，9号探针具有SEQ ID NO:13所示的序列，均为2a型特异探针，单一或者同时显示均判定为2a型；10号控制探针具有SEQ ID NO:17所示的序列，为6型特异型探针，它与3号和6号探针同时显色时判定为6型；11号控制探针具有SEQ ID NO:14所示的序列，12号控制探针具有SEQ ID NO:15所示的序列，均为3型特异探针，单一或者同时显示均判定为3型；13号控制探针具有SEQ ID NO:16所示的序列，为3b型特异探针，显色是判定为3b型。
图2显示靶DNA扩增片段经2％的琼脂糖凝胶电泳图，其中第1-6泳道为特异性靶DNA片段(220bp)，M泳道为标准分子量标志。
图3显示五种不同基因型样品的反向斑点杂交检测结果。共有9例标本的阳性检测结果，其中1、2、3号均为1型，1号为1型，2号和3号为1b型；4、5、6号均为2型，4号为2型，5号和6号为2a型；7号为3型，8号为3b型，9号为6型；(参见表1和图3)。
具体实施方式
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
实施例1：样品靶核酸的制备
用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温(22～25℃)放置30～60分钟或离心后析出血清。吸取上层血清100μl，转移至1.5ml灭菌离心管，并加入20μl充分混匀的的RNA提取液A，再加入400μl的RNA提取液B充分混匀。室温放置5分钟，6000rpm，离心1分钟，小心吸去上清，用75％的预冷乙醇(DEPC水配制)洗沉淀两次。65摄氏度干燥沉淀10分钟。向沉淀管中加入18μl的丙型肝炎逆转录体系，便可进行下一步的逆转录反应。
实施例2：RNA的逆转录成cDNA
取不含RNase的1.5mL离心管，按19μL×(N+1)取逆转录反应液，再加入1μL×(N+1)逆转录酶，混匀配制成逆转录体系，分装到N(N＝待检测样品个数+2)个不含RNase空白0.2mL离心管中，然后向各分装好逆转录体系的离心管中加入5μL制备好的RNA模板，瞬时(3秒)离心后，将各反应管放入PCR仪。按下列条件进行逆转录(RT)反应：40℃恒温60分钟，而后95℃灭活3分钟，然后4℃恒温。
实施例3：靶核酸的PCR扩增
取单管单人份PCR反应液若干管，直接加入3μl逆转录好的cNDA模板，充分混匀，瞬时(3秒)离心后，将各反应管放入PCR仪。按下列条件扩增：93℃预变性6分钟，然后按93℃ 45秒，57℃ 45秒，72℃ 45秒扩增10个循环，93℃ 30秒，55℃ 40秒，72℃ 45秒扩增30个循环，共40个循环；最后72℃保温7分钟。扩增产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测(见附图2)。
实施例4：七种基因型的样品反向斑点杂交检测
杂交前，取杂交液I(1.8×SSC-0.1％SDS)与杂交液II混合并预热至56℃备用。将PCR扩增产物98℃变性处理8分钟后，置于冰水混合物中放置8-10分钟。然后取1000μl杂交液I+2μl溶液I(1000：2)混合溶液作为结合液4℃保存备用，并取溶液II：溶液III：溶液IV(1900：200：1)的混合物(19ml溶液II+2ml溶液+10μl溶液IV)作为显色液避光备用。
杂交前先将水浴摇床温度调至56℃，待水温恒定后便可进行杂交实验。首先根据待检测样品的数目(包括待检测样品和阴阳性对照)取相应个数的2.0mL离心管，向各离心管中加入标记好的的单人份膜条，然后向各管分别加入1.5mL预热的杂交液I，再将变性后的PCR扩增产物加入离心管中，加样时要根据膜条标记加入与之一一对应的产物。关盖后将离心管放入56℃水浴摇床中，温育60分钟，并伴有缓慢摇动。弃杂交液I，将膜条放入50mL离心管中，用预热好的杂交液Ⅱ清洗膜条(每个50mL离心管中约加15mL杂交液II，清洗3次，每次3分钟)。在室温下加入结合液(每个50mL离心管中约加15mL结合液)，置于生化摇摆仪上结合10分钟，弃结合也，加入室温杂交液I清洗膜条(每个50mL离心管中约加15mL杂交液I，清洗3次，每次3分钟)。随后加入溶液II(每个50mL离心管中约加15mL)，置于生化摇摆仪上结合5分钟，弃溶液II，加入新鲜配制的显色液(每个50mL离心管中约加15mL)，显色大约10分钟。弃显色液，用纯水洗涤2次，取出膜条，用纸巾吸干，就可以进行扫描或直接读取结果。
由图3所示的结果可以看出，发生特异性杂交的各探针的显色情况均清晰可见。可根据附图一所示的排列格式判读出单一和混合感染。
实施例4：不同的恒温装置进行反向斑点杂交检测。
采用配备有多孔滤板和减压抽吸部件的反向点印迹杂交装置和空气浴杂交炉对上述七种不同基因型和基因亚型的样本进行了检测，检测结果同导流杂交仪的检测结果一致，说明恒温水浴和空气浴装置同样可以用来对样品进行检测。
实施例5：不同基因型样品的反向斑点杂交基因分型检测结果判定
使用本发明的方法和试剂盒，对400份采自丙型肝炎患者的DNA样品进行HCV基因分型位点检测，其中380例样本得以正确的分型。为了进一步证实本发明方法的准确性，对所有上述400例样本进行了序列测定。结果表明，使用本发明的试剂盒检测的结果和测序结果基本吻合，特异性达95.3％，同时将标本进行定量拷贝数分析，其中有45例为104copies/ml，4例为103copies/ml，均能准确分型，将高拷贝血清进行梯度稀释后，发现各型标本最低检出量均可以达到104拷贝/ml。
序列表
<110>中山大学达安基因股份有限公司
<120>丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒
<140>
<141>
<160>17
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>1
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>2
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>3
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>4
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>5
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>6
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>7
<210>8
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>8
<210>9
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>9
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>10
<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
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<212>DNA
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>12
<210>13
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>14
<210>15
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
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<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>16
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>17
Claims (3)
1、一种用于检测丙型肝炎病毒基因型的试剂盒，该试剂盒包括:(1)RNA提取试剂；(2)逆转录试剂；(3)聚合酶链式反应试剂；(4)杂交膜及反向斑点杂交反应试剂，其特征在于试剂盒所应用的引物分别为:
逆转录(RT)引物:5′-GCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACCT-3′(SEQ ID NO:1)
PCR上游引物:5′-TCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGT-3′(SEQ ID NO:2)
PCR下游引物:5′-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-3′(SEQ ID NO:3)。
2、根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于所使用的寡核苷酸探针为:
探针IC:5′-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′(SEQ ID NO:4)
探针PC1:5′-ATTTGGGCGTGCCCCCGC-3′(SEQ ID NO:5)
探针PC2:5′-CGGAACCGGTGAGTACACC-3′(SEQ ID NO:6)
探针1:5′-CAATGCCTGGAGATTTGGGCG-3′(SEQ ID NO:7)
探针1b-1:5′-CCGCGAGACTGCTAGCCG-3′(SEQ ID NO:8)
探针1b-2:5′-GCGAGACCGCTAGCCGAGT-3′(SEQ ID NO:9)
探针2-1:5′-AGTAGCGTTGGGTTGCGAAAG-3′(SEQ ID NO:10)
探针2-2:5′-GTCCTTTCTTGGATAAACCCAC-3′(SEQ ID NO:11)
探针2a-1:5′-GCCGGGAAGACTGGGTCCT-3′(SEQ ID NO:12)
探针2a-2:5′-CCCACTCTATGCCCGGCCA-3′(SEQ ID NO:13)
探针3-1:5′-CCCGCGAGATCACTAGCCG-3′(SEQ ID NO:14)
探针3-2:5′-AATCGCTGGGGTGACCGGG-3′(SEQ ID NO:15)
探针3b:5′-CCCGCTCAATGCCCGGAAAT-3′(SEQ ID NO:16)
探针6:5′-GACCGGGTCCTTTCCATTGG-3′(SEQ ID NO:17)。
3、根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于标记引物的小分子选自于生物素、地高辛等。
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Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102286644A (zh) * | 2011-08-26 | 2011-12-21 | 李艳 | 一种对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂盒 |
| CN102127603B (zh) * | 2010-01-19 | 2013-01-09 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 丙型肝炎病毒基因分型及il28位点多态性检测试剂盒 |
| CN102899422A (zh) * | 2011-07-25 | 2013-01-30 | 深圳国际旅行卫生保健中心 | 一种HCV Core protein基因RT-PCR分型及检测方法 |
| CN103710464A (zh) * | 2013-12-30 | 2014-04-09 | 湖南圣湘生物科技有限公司 | 一种丙型肝炎病毒基因型检测试剂盒 |
| CN104263851A (zh) * | 2014-07-15 | 2015-01-07 | 周有良 | 丙型肝炎病毒基因分型芯片及分型方法 |
| CN104593509A (zh) * | 2015-01-29 | 2015-05-06 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 罗非鱼无乳链球菌特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒 |
| CN105986038A (zh) * | 2015-01-28 | 2016-10-05 | 苏州新波生物技术有限公司 | 丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒及其使用方法和应用 |
| CN105986040A (zh) * | 2015-01-28 | 2016-10-05 | 苏州新波生物技术有限公司 | 丙型肝炎病毒基因分型及il28b的snp位点检测的试剂盒及其使用方法和应用 |
| CN106951731A (zh) * | 2017-03-28 | 2017-07-14 | 上海至本生物科技有限公司 | 一种大片段插入或缺失的预测方法及系统 |
-
2007
- 2007-08-29 CN CNA2007100299460A patent/CN101377486A/zh active Pending
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102127603B (zh) * | 2010-01-19 | 2013-01-09 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 丙型肝炎病毒基因分型及il28位点多态性检测试剂盒 |
| CN102899422A (zh) * | 2011-07-25 | 2013-01-30 | 深圳国际旅行卫生保健中心 | 一种HCV Core protein基因RT-PCR分型及检测方法 |
| CN102899422B (zh) * | 2011-07-25 | 2014-07-02 | 深圳国际旅行卫生保健中心 | 一种HCV Core protein基因RT-PCR分型及检测方法 |
| CN102286644A (zh) * | 2011-08-26 | 2011-12-21 | 李艳 | 一种对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂盒 |
| CN102286644B (zh) * | 2011-08-26 | 2013-04-10 | 李艳 | 一种对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂盒 |
| CN103710464A (zh) * | 2013-12-30 | 2014-04-09 | 湖南圣湘生物科技有限公司 | 一种丙型肝炎病毒基因型检测试剂盒 |
| CN104263851A (zh) * | 2014-07-15 | 2015-01-07 | 周有良 | 丙型肝炎病毒基因分型芯片及分型方法 |
| CN104263851B (zh) * | 2014-07-15 | 2017-01-11 | 周有良 | 丙型肝炎病毒基因分型芯片及分型方法 |
| CN105986038A (zh) * | 2015-01-28 | 2016-10-05 | 苏州新波生物技术有限公司 | 丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒及其使用方法和应用 |
| CN105986040A (zh) * | 2015-01-28 | 2016-10-05 | 苏州新波生物技术有限公司 | 丙型肝炎病毒基因分型及il28b的snp位点检测的试剂盒及其使用方法和应用 |
| CN104593509A (zh) * | 2015-01-29 | 2015-05-06 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 罗非鱼无乳链球菌特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒 |
| CN106951731A (zh) * | 2017-03-28 | 2017-07-14 | 上海至本生物科技有限公司 | 一种大片段插入或缺失的预测方法及系统 |
| CN106951731B (zh) * | 2017-03-28 | 2019-04-12 | 至本医疗科技（上海）有限公司 | 一种大片段插入或缺失的预测方法及系统 |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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