CN101376653B

CN101376653B - 一种黄酮醇化合物及其制备方法和应用

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Publication number: CN101376653B
Application number: CN2008102334285A
Authority: CN
Inventors: 李蓉涛; 罗国军; 邓旭明; 慈鑫鑫; 罗永明; 李洪梅; 李海舟
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2008-10-10
Filing date: 2008-10-10
Publication date: 2012-05-16
Anticipated expiration: 2028-10-10
Also published as: CN101376653A

Abstract

本发明提供一种黄酮醇化合物。本发明还涉及该化合物的制备方法，以该化合物为活性成分的药物组合物，以及本发明化合物和药物组合物在制备抗炎药物中的应用。本发明的化合物具有较显著的抗炎作用，可预期作为抗炎类药物。本发明提供的黄酮醇化合物具有下列结构式：

Description

一种黄酮醇化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种黄酮醇化合物——2＂-羟基-3＂-烯-脱水淫羊藿素，以及该化合物的制备方法，和以该化合物为活性成分的药物组合物，以及在治疗炎症药物中的应用。

背景技术

近年来，在抗炎免疫药物的研究中，中药因其药效好、不良反应少及资源丰富等特点，越来越受到人们的重视。抗炎免疫药物是指对炎症反应具有抑制作用，对免疫反应具有抑制或增强和调节作用的一类药物。机体的免疫系统是一个复杂的网络系统，免疫系统的某个指标的改变往往引起机体免疫系统其他指标的变化，抗炎免疫药理已深入到细胞水平和基因水平，包括细胞因子及其受体、类脂质炎症介质、一氧化氮、活性氧、细胞内第二信使、核因子等研究。随着抗炎药理研究方法的不断提高，尤其是分子生物学技术在中药抗炎药理研究中的广泛应用，研究和开发新的具有抗炎活性的天然药物活性成分已逐渐成为热点。具有抗炎免疫作用的中药涉及到多种天然植物种属，如雷公藤、青风藤、黄连、芍药、黄芪、灵芝、淫羊藿等，活性成分涉及到多糖、苷、生物碱、内酯、甾体、香豆素、蒽醌、黄酮、鞣质、挥发油等。

60年代末，人们发现黄酮类化合物有抗炎、抗病毒、利胆、强心、镇静和镇痛等作用，后来又发现其具有抗氧化、抗衰老、免疫调节和抗肿瘤等作用。淫羊藿总黄酮对巴豆油所致小鼠耳肿胀、醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加、角叉菜胶所致小鼠足肿胀及巴豆油所致肉笌组织增生具有显著抑制作用，对佐剂关节炎大鼠的原发性足肿胀和继发性足肿胀均有显著抑制作用。

迄今为止，现有技术中没有本发明的结构新颖的黄酮醇化合物2＂-羟基-3＂-烯-脱水淫羊藿素的报道，也没有该化合物作为药物有效成分在治疗疾病方面的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的具有药用价值的黄酮醇化合物。

本发明的另一目的是提供一种黄酮醇化合物的制备方法。

本发明进一步的目的是提供一种以黄酮醇化合物为活性成分的药物组合物。

本发明的又一目的是提供上述黄酮醇化合物或组合物在制备抗炎免疫药物中的用途。

本发明的发明者们从干燥淫羊藿(Epimedium brevicornum Maxim)全草中分离出一种新的，具有多种有价值的药物活性，且这些活性是现有淫羊藿植物提取物所不具备的。

本发明提供的黄酮醇化合物，具有以下结构式：

本发明提供的黄酮醇化合物是从淫羊藿全草中提取分离的，该方法包括以下步骤：

A、将干燥淫羊藿全草粉碎后，按淫羊藿∶丙酮水溶液＝1∶2～4的质量/体积比，将淫羊藿放入浓度为75％的丙酮水溶液中，室温下浸泡15～30小时后，得提取液，如此重复提取2～3次，合并提取液；

B、将上述A步骤所得提取液减压蒸馏至无丙酮味后，按提取液∶石油醚＝1∶1的体积比，于室温下，用石油醚对提取液进行2～3次的萃取，回收石油醚后，得萃取液；

C、按萃取液∶乙酸乙酯＝1∶1的体积比，于室温下，用乙酸乙酯对上述B步骤的萃取液进行2～3次的萃取，回收后得乙酸乙酯浸膏；

D、将上述C步骤的乙酸乙酯浸膏上硅胶柱进行层析分离，用氯仿∶甲醇＝40～0∶1的体积比的混合物作为洗脱剂进行洗脱，除去杂质后，得粗分离物；

E、对上述D步骤的粗分离物进行与步骤D相同的硅胶层析和洗脱2～5次，除去杂质后，得精分离物；

F、将E步骤所得精分离物用现有技术中的高效液相色谱分析仪分析后，用现有技术中的ZORBAX SB-C18柱半制备分离后得黄酮醇化合物。

所述黄酮醇化合物为黄色粉末，其分子式为C₂₁H₂₀O₇，不饱和度为12，结构为：3，5，7-三羟基-8-(2＂-羟基-3＂-甲基-3＂-丁烯基)-4′-甲氧基黄酮，即为2＂-羟基-3＂-烯-脱水淫羊藿素，其结构式如下：

本发明提供的结构式(1)的黄酮醇化合物，应用MTT检测方法试验表明其对RAW264.7细胞作用24h后不具有明显的细胞毒性作用，说明黄酮醇化合物的细胞毒性较低。

本发明提供的结构式(1)的黄酮醇化合物，经试验研究发现其呈浓度依赖性的调节LPS诱导的RAW264.7细胞分泌的TNF-α，并能显著提高IL-10水平，IL-10能抑制TNF-α的合成，说明本发明的黄酮醇化合物具有明显的抗炎免疫作用。

本发明提供的药物组合物含有治疗有效量的上述结构式(1)的化合物的活性成分以及含有一种或多种药学上可接受的载体或辅料。

所述药学上可接受的载体或辅料是指药学领域常规的药物载体或辅料，如：水或酒精等稀释剂、赋形剂，或者淀粉、蔗糖等填充剂，或者纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等粘合剂，或者甘油等湿润剂，或者琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠等崩解剂，或者季铵化合物等吸收促进剂，或者十六烷醇等表面活性剂，或者皂土或高岭土等吸附载体，或者滑石粉、硬脂酸钙和硬脂酸镁、聚乙二醇等润滑剂，另外在组合物中可加入香味剂、甜味剂等其它辅剂。

本发明化合物可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式应用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂等，或者制成液体的水或油的悬浮剂或其它的糖浆、酏剂；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用溶液、水或油悬浮剂。优选的形式是片剂、胶囊、栓剂、鼻喷雾剂或注射剂。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体或辅料混合后，按常规方法制成所需剂型。

本发明药物组合物优选含有质量比为0.1～99.5％的活性成分，最佳优选含有质量比为0.5～95％的活性成分。

本发明化合物的施用量可根据用药途径、患者年龄、体重、所治疗的疾病类型和严重程度等变化具体确定，其日剂量可以是0.01～10mg/kg体重，优选0.1～5mg/kg体重。可以一次或多次施用。

附图说明

图1为2＂-羟基-3＂-烯-脱水淫羊藿素(1)的HMBC图；

图2为化合物1对RAW264.7巨噬细胞的毒性作用，数据以Mean+SEM方式表示；

图3为化合物1对体外LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞-单核细胞TNF-α合成的影响；

图4为化合物1对LPS诱导的RAW264.7细胞IL-10合成的影响；

图5为本发明实施例1的工艺流程图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步描述，使本领域技术人员更全面理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

黄酮醇化合物即2＂-羟基-3＂-烯-脱水淫羊藿素，或3，5，7-三羟基-8-(2＂-羟基-3＂-甲基-3＂-丁烯基)-4′-甲氧基黄酮的制备：

取干燥淫羊藿(Epimedium brevicornum Maxim)全草12kg粉碎后，按淫羊藿∶丙酮水溶液＝1∶3的质量/体积比，用浓度为75％丙酮水室温下浸提3次，每次丙酮水用量为35L，浸泡时间24小时，合并3次提取液后，减压蒸馏至无丙酮味；按提取液∶石油醚＝1∶1的体积比，先用石油醚于室温下对提取液萃取三次，每次石油醚用量10L，回收石油醚后，得萃取液；按萃取液∶乙酸乙酯＝1∶1的体积比，再用乙酸乙酯于室温下对萃取液萃取三次，每次乙酸乙酯用量8L，得乙酸乙酯浸膏178g；将乙酸乙酯浸膏用粒度为100—200目的400g硅胶拌样后，上硅胶柱进行层析粗分离，硅胶柱为内装有2kg(粒度为200—300目)硅胶、体积为120×1500mm的玻钢硅胶柱，之后用氯仿∶甲醇分别为：40∶1，20∶1，10∶1，8∶1，5∶1，4∶1，0∶1(体积比)的七个洗脱剂，对层析分离物进行洗脱后，分离得到7个粗分离物；

将氯仿∶甲醇＝8∶1体积比的洗脱剂洗脱的分离物20g用硅胶拌样后，上硅胶柱(300g硅胶)层析，经氯仿∶甲醇＝100∶1体积比的洗脱剂进行洗脱得到204.4mg分离物，该分离物再次上硅胶柱层析(0.2g硅胶拌样，上6g硅胶柱)，并用氯仿∶甲醇＝120∶1体积比的洗脱剂洗脱后，得26.6mg精分离物；将该精分离物经现有技术中的Agilent1200HPLC(高效液相色谱)分析(流动相为70％甲醇/水，柱温40℃，停留时间t＝8.2min)后，用现有技术中的ZORBAX SB-C18柱半制备分离得黄酮醇化合物20.3mg。

黄酮醇化合物为黄色粉末，盐酸—镁粉和Molish反应均呈阳性。FAB⁺MS谱给出准分子离子峰m/z：385([M+H]⁺)，结合HR-ESI-MS(m/z：385.1294([M+H]⁺，计算值为：385.1287)和NMR谱提供的信息，确定其分子式为C₂₁H₂₀O₇，不饱和度为12。FAB⁺MS谱还给出了2个特征的碎片离子：m/z368[M+H-OH]⁺提示分子中存在羟基，313[M-C₄H₇O]⁺提示分子中存在异异戊二烯基。¹H-NMR(表-1)(400MHz，DMSO-d₆)δ：12.31(1H，s)，10.57(1H，s)，8.79(1H，s)分别为黄酮5、7、3位羟基质子信号，8.28(2H，d，J＝9.0Hz)，7.09(2H，d，J＝9.0Hz)提示存在一个苯环AA′BB′自旋系统，6.34(1H，s)提示为一苯环五取代的质子信号。3.88(3H，s)提示为一个甲氧基的质子信号，1.82(3H，s)提示为一个甲基信号，该甲基可能连有双键。¹³C-NMR(表-1)(100MHz，DMSO-d₆)δ：99～178ppm有15个碳信号，其中130.2、114.6的信号强度是其他—CH信号强度的2倍，可能是2个碳信号重叠，这可由¹H-NMR中存在AA′BB′自旋系统得以证明，因此该区域应有17个碳信号，除去黄酮母核的15个碳信号，还有2个碳信号，其中110.3为—CH₂碳信号，说明存在一个末端双键，55.7为甲氧基的碳信号，18.1为甲基的碳信号，此外30.3为亚甲基碳信号，75.4为含氧的次甲基碳信号。HMBC谱(附图说明图1)中，化学位移在δ12.31ppm的5位羟基质子信号与δ：160.1(C-5)、99.1(C-6)、104.0(C-10)的碳信号有相关，δ6.34(H-6)的氢信号与δ：160.1(C-5)、163.6(C-7)、104.8(C-8)、104.0(C-10)的碳信号有相关，δ8.28(H-2′，H-6′)的氢信号与δ：146.6(C-2)、114.6(C-3′，5′)、161.7(C-4′)的碳信号有相关，δ7.09(H-3′，5′)的氢信号与δ：146.6(C-2)、124.8(C-1′)、161.7(C-4′)的碳信号有相关，由此确定了黄酮母核的信号归属。δ3.02(H-1＂)的氢信号与δ：163.6(C-7)、104.8(C-8)、155.3(C-9)、75.4(C-2＂)、149.1(C-3＂)的碳信号有相关，δ4.42(H-2＂)的氢信号与δ：104.8(C-8)、30.3(C-1＂)、149.1(C-3＂)、110.3(C-4＂)、18.1(C-5＂)的碳信号有相关，δ：4.43(Ha-4＂)、4.72(Hb-4＂)的氢信号与δ：75.4(C-2＂)、149.1(C-3＂)、18.1(C-5＂)的碳信号有相关，δ1.82(H-5＂)的氢信号与δ：75.4(C-2＂)、149.1(C-3＂)、110.3(C-4＂)的碳信号有相关，由此可确定该异异戊烯基连接在黄酮母核的8位上，为：2＂-羟基-3＂-甲基-3＂-丁烯基。δ3.88甲氧基的质子信号与δ161.7(C-4′)的碳信号有相关，提示甲氧基连接在4′位。

综上所述，黄酮醇化合物的结构被确定为：3，5，7-三羟基-8-(2＂-羟基-3＂-甲基-3＂-丁烯基)-4′-甲氧基黄酮，即为2＂-羟基-3＂-烯-脱水淫羊藿素，其结构式如下：

实施例2

片剂：

活性成分——结构式(1)的黄酮醇化合物 10mg

乳糖 156mg

玉米淀粉 55mg

硬脂酸钙 4mg

制备方法：将活性成分、乳糖、玉米淀粉混合，用水均匀湿润，经干燥、过筛后，加入硬脂酸钙，混合均匀后，压制成片，每片重225mg，活性成分含量为10mg。

实施例3

喷雾剂：

活性成分结构式(1)的黄酮醇化合物 8mg

氯化钠 9mg

EDTA 0.5mg

磷酸钠缓冲液(Ph6.5) 10mg

蒸馏水加至2ml

制备方法：将各固体成分依次加入蒸馏水中完全溶解后，经过滤、灭菌后，装瓶。

实施例4

结构式(1)的黄酮醇化合物的抗炎作用，包括如下试验步骤：

1、材料和方法

1.1细胞培养细胞在含10％胎牛清的高糖DMEM培养基中，传代后接种于24孔培养板中。共分为三组，空白组(无药物和LPS处理)、LPS处理的阳性对照组(LPS1mg/L处理18h)、化合物1(分别是0.5，2.5和12.5mg/L)+LPS处理组，LPS和化合物1同时处理18h，每组各三个平行。

1.2化合物1的毒理学评价应用MTT检测方法进行评价。取对数生长期RAW细胞接种于96孔培养板中，1×10⁵个细胞/孔，37℃，5％CO₂条件下培养20h后，再加20μLMTT(5mg/mL)继续培养4h，然后加入DMSO150μL溶解，用酶联免疫检测仪于595nm处测定各孔吸光值(OD值)，计算出细胞相关活率。

1.3细胞因子的测定取培养的细胞上清液100μL，按照细胞因子ELISA检测试剂盒的程序操作。

2、结果

2.1化合物1的毒理学评价0.5、2.5和12.5mg/L浓度的化合物1处理的RAW264.7单核细胞-巨噬细胞20h后，与空白对照组和LPS处理阳性对照组相比，细胞活率没有显著差异，说明化合物1对RAW264.7细胞不具有细胞毒性作用(附图说明图2)。

2.2化合物1对体外LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞-单核细胞TNF-α合成的影响空白组RAW264.7细胞培养18h后，分泌的TNF-α水平分别为1433.5±417pg/mL。LPS(1mg/L)处理18h后TNF-α的分泌显著增加，达到4884±600pg/mL。当加入化合物1(0.5-12.5mg/L)与LPS共处理后，RAW264.7分泌的TNF-α存在浓度依赖性(附图说明图3)。与LPS处理的阳性对照组相比，0.5和12.5mg/L浓度的化合物1能显著的抑制TNF-α，抑制率分别为17.1％(p<0.01)，55.6％(p<0.01)，2.5mg/L浓度的化合物1能抑制TNF-α，但差异不显著(p>0.05)抑制率为20.1％.

2.3化合物1对体外LPS诱导的RAW264.7细胞IL-10合成的影响空白对照组的RAW264.7细胞分泌的IL-10分别为19.435±2.32pg/mL，显著低于LPS处理的阳性对照组100.64±6.15pg/mL(附图说明图4)。对于RAW细胞来说，0.5-12.5mg/L浓度的化合物1能升高IL-10，0.5mg/L浓度的化合物1能升高IL-10水平，促进率为8％(p>0.05).2.5和12.5mg/L浓度的化合物1能显著升高IL-10水平，分别为115.11±14.16pg/mL和127.6±8.39pg/mL，促进率为15％和27％(p<0.01)。

表-1化合物1的¹H-NMR和¹³C-NMR数据(δ：ppm；J：Hz)

注：化合物1的¹H-NMR和¹³C-NMR分别在400MHz与100MHz中测定；溶剂为：DMSO

Claims

1.一种黄酮醇化合物，具有以下结构式：

2.一种如权利要求1所述黄酮醇化合物的制备方法，其特征在于包括下列步骤：

A、将干燥淫羊藿全草粉碎后，按淫羊藿∶丙酮水溶液＝1∶2～4的质量/体积比，即kg/L，将淫羊藿放入浓度为75％的丙酮水溶液中，室温下浸泡15～30小时后，得提取液，如此重复提取2～3次，合并提取液；

F、将E步骤所得精分离物用高效液相色谱分析仪分析后，用ZORBAX SB-C18柱半制备分离后得黄酮醇化合物。

3.用于抗炎的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1的化合物和药学上可接受的载体或辅料。

4.权利要求1化合物在制备抗炎药物中的应用。