CN101371682A - 一种消除抗营养因子作用的微生物制剂及制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种消除抗营养因子作用的微生物制剂，其特征在于，由以下重量百分比原料组成：枯草芽孢杆菌28－35％、植物乳杆菌45－53％、啤酒酵母菌12－27％；其制备方法为：生产菌种通过射线诱导和生产性能试验相结合，筛选产量高、产酶量大的生产菌种，生产工艺采用液体单独培养和固体复合培养技术，培养基中添加产物促进剂，使产品中富含大量有益活菌和酶、肽、多糖及氨基酸等活性代谢产物，在饲料原料和全价饲料中添加后，能显著消除饲料中抗营养因子对营养成分的影响，改善饲料适口性，提高采食量，增强养殖动物的抗应激及免疫力，提高群体整齐度，并改善生长速度和饲料利用率，降低养殖成本。

Description

一种消除抗营养因子作用的微生物制剂及制作方法

技术领域

本发明涉及一种消除抗营养因子作用的微生物制剂及制作方法，通过在全价饲料和饲料原料中添加，能显著消除普通全价饲料或饲料原料中的抗营养因子作用，使饲料营养养分更高，更易被畜禽采食、消化、吸收。同时在发酵料中富含大量有益活菌和酶、肽、多糖及氨基酸等活性代谢产物，可提高动物的免疫能力，促进养殖动物消化吸收功能，提高动物应激性，属于农业生物制品技术领域。

背景技术

饲料是养殖动物生长的物质基础，现今配合饲料中90％以上的组成成分为植物性饲料，植物性饲料中都含有一种或多种抗营养因子。如在饲料原料中用量最大，功能最重要的豆类及其饼粕、高粱和某些块根块茎类中就存在蛋白酶抑制因子，可导致饲料中蛋白质的消化率下降，因其能和胰蛋白酶、胃蛋白酶和糜蛋白酶结合而生成无活性的复合物，降低这些酶的活性；可引起养殖动物体内蛋白质内源性消耗，抗营养因子不但影响了饲料的营养价值和适口性，而且给养殖动物的健康生长和生产带来了很大的危害，我国既是人口大国又是饲料生产大国，饲料资源短缺，尤其是蛋白质饲料资源缺口巨大，面对这样严重的现实，除开发新的饲料资源外，提高现有饲料资源的利用率也是解决问题最有效途径之一。由于抗营养因子是影响饲料营养价值充分发挥的主要因素，所以人们很早就对消除抗营养因子对饲料营养价值的影响做了许多的研究工作，目前消除抗营养因子作用的方法主要有以下几种：1、物理法，如：加热法、膨化法、机械加工法；2、化学法：3、生物技术法：如酶制剂法、育种法、控制用量法，除酶制剂法外，其余方法的效果并不明显且某种程度上限制了饲料营养作用对饲养动物的生长，而由于酶制剂是专一性很强的催化剂，所以对原料众多的抗营养因子难以以某几种酶制剂添加来消除其作用，同时酶制剂作用需要严格的温度、ph等催化条件。

通过在中国知识产权局专利检索网站查询，尚未有消除饲料中抗营养因子的专利公告，类似的公告的一项发明专利，申请号为：200410099204.1，题为：饲料添加剂，其主要内容为：这种饲料添加剂，由下述重量配比的原料优化组合制成：每千克饲料添加剂由谷氨酸钠50-200g，5’-肌苷酸二钠25-100g，5’-鸟苷酸二钠25-100g，血根碱2-15g，其余为载体。所述载体为白碳黑，该技术为简单的氨基酸饲料添加配方，没有任何化学或生物反应过程发生，其工艺过程太简单，无法保证其“提高采食量和采食速度，大幅提升消化道内源酶的总活性，减少应激性腹泻”的使用效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产成本低、周期快，添加在全价饲料或饲料原料中能显著降低抗营养因子对饲料营养成分的影响，提高养殖动物采食量和饲料利用率，同时提高养殖动物免疫力的微生物制剂及制作方法。

为实现以上目的，本发明的技术方案是提供一种消除抗营养因子作用的微生物制剂，其特征在于，由以下重量百分比原料组成：枯草芽孢杆菌28—35％、植物乳杆菌45—53％、啤酒酵母菌12—27％；

一种消除抗营养因子作用的微生物制剂的制备方法，其特征在于，生产菌种通过射线诱导和生产性能试验相结合，筛选产量高、产酶量大的生产菌种，生产工艺采用液体单独培养和固体复合培养技术，培养基中添加产物促进剂，其生产工艺为：

第一步：发酵菌株选育

a.菌株传代：采用农业部菌种保存中心提供的枯草芽孢杆菌菌株、植物乳杆菌和啤酒酵母菌，通过营养琼脂培养基传代培养，选育生长速度快、菌落特征明显的菌种，在0℃—4℃温度下保存菌种；

b.将枯草芽孢杆菌菌株、植物乳杆菌和啤酒酵母菌分别在紫外线的照射下进行诱导，将保存的菌种制作菌悬液，稀释至10^-7，在30cm处用功率为15W的紫外灯，波长为260nm，处理15s—20s，处理后的菌悬液在营养琼脂平板中温度为30℃—40℃，倒置培养45小时—50小时，选出生长速度快的菌落进行摇瓶实验，观察菌种生长速度快，活菌总数大于30亿/ml，植物乳杆菌菌落直径大于3ml，啤酒酵母菌大于7ml，枯草芽孢杆菌大于5ml的菌株在0℃—4℃温度加以保存；

c.生产性能试验：将三种菌种接种分别在液体营养琼脂培养基中培养，培养温度为35℃—40℃，在转速为220转/分—250转/分的恒温摇床中进行恒温培养，24小时—28小时后取样，利用平板计数法进行菌落总数测定，菌落总数大于30亿/ml的菌种可用于生产制种；

d.生产菌种的制作：将筛选出的枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、啤酒酵母菌分别转接入装有营养琼脂培养基的茄子瓶中，在35℃—40℃温度下培养45小时—50小时，待茄子瓶表面菌苔布满，并白中带黄时即可取出，然后放入2—6℃的冰箱中保存；

第二步：复合菌种的液体高速培养

a.按权利要求1的重量百分比称取各菌种；

b.乳酸菌和啤酒酵母菌的液体培养：将按步骤a的比例称取的植物乳杆菌和啤酒酵母菌，混合后在一起进行复合培养：将混合菌苔按1：20—25的比例接种于120—128℃、30—45min高温灭菌的液体培养基中，在发酵罐中搅拌25min—35min，其转速为200—220r/min，搅拌均匀后放入消毒后的塑料桶中静置5—7天，静置过程中每天测定Ph值并释放产出的气体；发酵过程中抽样3次，显微镜下检测菌体生长情况和测定Ph值，当活菌总数达到40亿/ml浓度和Ph值达到3.0-4.0时停止发酵；

c.枯草芽孢杆菌的液体培养：将枯草芽孢杆菌按1：20—25的比例接种于120℃—128℃、30min—45min高温灭菌的液体培养基中，发酵时通气量维持在1：1.0-1.2，发酵时间24—35小时；

第三步：菌种的固体扩大培养

a.将步骤2复合培养的菌液混合后按1：20—25的比例接入120℃—128℃、30min—45min高温灭菌的固体扩大培养基中，在培养基中添加0.08％—0.1％的植酸质作产物促进剂，搅拌30—45min至均匀，倒入消毒双层饲料袋中密封发酵，温度32—35℃，时间8—10天；

b、发酵过程中取样三次，测定水分和Ph值，发酵结束后取样，测定水分为35％-40％、Ph值为4.5—5.5；

第四步：干燥粉碎：

a.干燥:将步骤3发酵完全的产品按时间先后放入培养箱干燥，温度控制在40℃—45℃，时间14小时—16小时，干燥完成的物料水份控制在≤12％：

b.过筛：将干燥后的物料通过60—80目的震动筛进行震动，过筛；

c.包装：将过筛后的物料装入带有内袋的桶或袋中，扎紧袋口，系好标识牌，转入成品库有序堆放；取样检测，主要参数：水份≤12％、活菌数≥50亿/g、总蛋白量≥25％；物理性状：深黄色粉末状固体。

所述的步骤2中乳酸菌和啤酒酵母菌的液体培养基组成及重量百分比为：糖蜜12—15％、酵母粉0.2-0.4％、硫酸镁0.2—0.5％、硫酸铵0.5-0.7％、磷酸氢二钠0.2-0.5％、尿素0.8-1％、无菌水81.9-86.1％。

所述的步骤2中枯草芽孢杆菌培养基组成及重量百分比：可溶性淀粉2％、豆粕粉1.2％、玉米粉3％、磷酸二氢钾0.4％、磷酸二氢钠1.6％、硫酸镁0.6％、尿素1.5％、消泡剂0.5％、无菌水89.2％。

所述的步骤3中的固体扩大培养基为无菌水再加清糠、大豆粉、糖蜜、玉米粉、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、硫酸镁、尿素、植酸质中的至少四种混合物组成，其重量百分配比为：清糠18—20％、大豆粉25—30％、糖蜜8—12％、玉米粉8—10％、磷酸二氢钾0.5—1％、磷酸二氢钠1—2％、硫酸镁0.4—1％、尿素1—2％、0.08—0.1％的植酸质、无菌水21.9—38.02％。

本发明利用多个具有消除抗营养因子作用的菌种发酵专用培养基，采用液体高速培养和固体扩大培养技术，发酵过程中产生并积累大量营养富的菌体，即乳酸杆菌、芽孢杆菌、酵母和有用的代谢产物，如抗生素、维生素、有机酸、激素及赖氨酸等，本发明技术兼有酶制剂法和发酵法的优点，能显著消除饲料原料中的抗营养因子作用，提高养殖动物采食量和饲料利用率，同时提高养殖动物的免疫力。

发酵法是一种安全有效的使抗营养因子钝化和毒素脱毒的方法，它具有以下几个特点：(1)能较有效地达到去毒的目的；(2)能对多种抗营养因子或毒素产生解毒效果；(3)可以大量处理加工，要求的条件、设备和工艺简单；(4)对某些难消化的饲料可以部分提高消化率，同时改善适口性提高采食量。近年来，我国对非常规饲料原料的饼粕类饲料进行了许多探讨，李延云等(1995)筛选出脱毒率达91.5％的菌种，使棉籽粕的饲用价值提高。黄玉德等(1994)利用微生物发酵技术，使棉籽中的棉酚含量下降至可饲用水平(300毫克/千克)。

本发明提供的一种利用发酵工艺消除抗营养因子的微生物制剂，是采用在畜牧业生产中以促进养殖动物建立健康的微生态肠道环境、促进消化酶分泌和提高饲料利用率的乳酸菌类、产生抗氧化物和免疫功能的芽孢杆菌类以及能提供丰富单细胞蛋白的酵母菌类的三类菌种，利用射线诱导的方法提高其产酶量、抗生量，利用单独的液体高速培养和固体扩大培养技术，使产品中含有50亿/克的有益活菌，粗蛋白含量大于25％，同时富含各种消化代谢酶、多肽、多糖、抗生素、氨基酸等活性代谢物质，添加在全价饲料和饲料原料中后，能在养殖动物体内形成稳定的酸性肠道环境，同时大量的活性酶能迅速分解原料中难以分解的大分子营养成分，起到消除抗营养因子的作用，这种养殖动物自身的调节功能来自于内源，不同于外源性酶或者简单的物理和化学方法，能让饲料营养成分得到充分的吸收，大大提高了饲料利用率，节约了饲料成本。

利用枯草芽孢杆菌发酵大豆在日本有较早的应用，在日本风靡一时的营养保健食品——纳豆，就是利用枯草芽孢杆菌发酵而来，不过由于菌种未经过专门的诱导，其酶解效果差，对大豆蛋白利用较低。本发明利用紫外线诱导，能使得到高产酶能力的优秀菌株的得率大大提高，与化学诱导、营养缺陷型选育相比，微波及射线诱导具有设备简单、操作方便、诱变周期短的特点，可以在有限的时间内选育更多的优秀菌株。

在本发明产品的发酵过程中，采用了添加产物促进剂的办法，本产品中的营养多肽主要由产品菌种产生大量的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶分解培养基而来，所以，加入产物促进剂是提高产物产量的一个有效方法，我们在10多种产酶促进剂中进行了筛选，分别确定了一种液体培养基、一种固体培养基的产物促进剂，与未添加者相比，其产物中酶活分别增加12倍和4倍。

由于枯草杆菌是产芽孢菌，后期发酵液体呈碱性，而两种乳酸菌是典型的酸性培养细菌，直接复合培养有很大的难度，所以本发明产品采用了液体单独培养，再进行固体驯化复合培养的办法，既保证了菌种活菌数量，又将代谢产物的保留最大化，保证了产品的应用效果。同时在最终产品中添加载体，保证了菌种在运输和保存过程中的存活时间。

和现阶段的其他消除抗营养因子的方法相比，本发明的优点为：

1.菌种选育过程中采用紫外诱导和生产性能试验相结合的技术，操作设备简单，诱导周期短，场地要求低。

2.采用创新的益生菌共生配伍设计和多级复合发酵技术，每级发酵均有各自不同的目标产物，使产品中富含大量有益活菌和酶、肽、多糖及氨基酸等活性代谢产物，具有高稳定性。

3.在固体培养中添加产物促进剂，大大提高发酵过程中酶活和产物的数量；

4.通过产生大量内源性活性酶、抗氧化剂和抗生素，改善饲料适口性，提高采食量，增强养殖动物的抗应激及免疫力，提高群体整齐度，并改善生长速度和饲料利用率，降低养殖成本；

5.枯草芽孢杆菌和乳酸菌发酵营养丰富的固体培养基，在产生多肽的同时，产生大量的纤维素酶、半纤维素酶、低聚肽、短肽混合物、抗生素、微量元素及其它代谢产物，为养殖动物提供最佳的营养生长条件；

6.采用粮食作物和常用饲料载体作为主要培养基原料，降低了生产成本，同时使用常用的发酵及生产设备，易于在动物养殖中推广；

7.本发明的产品采用农业部658公告允许添加的微生物菌种，在养殖动物体内无有害残留，同时减少了抗生素在养殖中的使用量，是一种安全、绿色的微生物产品。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一种消除抗营养因子作用的微生物制剂的制备方法为：

本发明采用菌种及编号为：Lactobacillus plantarum(ATCC8014)植物乳杆菌、Saccharomyces cerevisiae(IFO0203)、啤酒酵母菌、Bacillus subtilis(1.398)枯草芽孢杆菌，菌种由农业部菌种保存中心提供。

第一步：发酵菌株选育

1、菌株传代：采用农业部菌种保存中心提供的枯草芽孢杆菌菌株和植物乳杆菌、啤酒酵母菌，通过营养琼脂培养基传代培养，选育生长速度快、菌落特征明显的菌种，在3℃温度下保存菌种；

营养琼脂培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂15—20g、水1000ml、pH7.0-7.2。121℃灭菌20min。

2、将以上三种菌种在紫外线的照射下进行诱导：将保存的菌种制作菌悬液，稀释至10^-7，在30cm处用功率为15W的紫外灯，波长为260nm处理15s，处理后的菌悬液在营养琼脂平板中，在35℃温度下倒置培养48小时，选出生长速度快的菌落进行摇瓶实验，观察菌种生长速度；

3、生产性能试验：将三种菌种接种在液体营养琼脂培养基(LB培养基)中，37℃，200转/分进行恒温培养，26小时后取样，利用平板计数法进行菌落总数测定，菌落总数大于30亿/ml的菌种可用于生产制种；

液体营养琼脂培养基为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、水1000ml、pH7.0-7.2。121℃灭菌20min。

4、生产菌种的制作：将筛选出的枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、啤酒酵母菌分别转接入装有营养琼脂培养基的茄子瓶中，在38℃温度下培养45小时，待茄子瓶表面菌苔布满，并白中带黄时即可取出，然后放入5℃的冰箱中保存；

第二步：复合菌种的液体高速培养

a.按以下重量百分比称取各菌种：枯草芽孢杆菌28％、植物乳杆菌45％、啤酒酵母菌27％；

b.乳酸菌和啤酒酵母菌的液体培养：将按步骤a的比例称取的植物乳杆菌和啤酒酵母菌，混合后在一起进行复合培养：将混合菌苔按1：20的比例接种于121℃高温灭菌的液体培养基中，在发酵罐中搅拌30min，其转速为200—220r/min，搅拌均匀后放入消毒后的塑料桶中静置5—7天，静置过程中每天测定Ph值并释放产出的气体；发酵过程中抽样3次，显微镜下检测菌体生长情况和测定Ph值，当活菌总数达到40亿/ml浓度和Ph值达到3.0-4.0时停止发酵；

c.枯草芽孢杆菌的液体培养：将称去的枯草芽孢杆菌按1：20的比例接种于121℃、30min高温灭菌的液体培养基中，发酵时通气量维持在1：1.0，发酵时间24—35小时。

上述步骤b中乳酸菌和啤酒酵母菌的液体培养基组成及重量百分比为：糖蜜12％、酵母粉0.2％、硫酸镁0.2％、硫酸铵0.5％、磷酸氢二钠0.2％、尿素0.8％、无菌水86.1％.

上述步骤c中枯草芽孢杆菌培养基组成及重量百分比：可溶性淀粉2％、豆粕粉1.2％、玉米粉3％、磷酸二氢钾0.4％、磷酸二氢钠1.6％、硫酸镁0.6％、尿素1.5％、消泡剂0.5％、.无菌水89.2％。

第三步：菌种的固体扩大培养

a.将步骤2复合培养的菌液混合后按1：20的比例接入121℃、30min高温灭菌的固体扩大培养基中，在培养基中添加0.08％的植酸质作产物促进剂。搅拌30—45min至均匀，倒入消毒双层饲料袋中密封发酵，温度32—35℃，时间8—10天；

b、发酵过程中取样三次，测定水分和Ph值，发酵结束后取样，测定水分为35-40％、Ph值为4.5—5.5；

所述的步骤a的固体扩大培养基为清糠18％、大豆粉25％、糖蜜8％、玉米粉8％、磷酸二氢钾0.5％、磷酸二氢钠1％、硫酸镁0.4％、尿素1％、0.08％的植酸质、无菌水38.02％。

第四步：粉碎干燥：

a.干燥:将步骤3发酵完全的产品按时间先后放入培养箱干燥，温度控制在40—45℃，时间14—16小时，干燥完成的物料水份控制在≤12％；

b.过筛：将干燥后的物料通过60—80目的震动筛进行震动，过筛两次。

c.包装：过筛后的物料装入带有内袋的桶或袋中，扎紧袋口，系好标识牌，转入成品库有序堆放；取样检测，主要参数：水份≤12％、活菌数≥50亿/g、总蛋白量≥25％；物理性状：深黄色粉末状固体。

实施例2

第一步：发酵菌株选育

1、菌株传代：同实施例一；

2、将以上三种菌种在紫外线的照射下进行诱导：将保存的菌种制作菌悬液，稀释至10^-7，在30cm处用功率为15W的紫外灯，波长为260nm，处理20s，处理后的菌悬液在营养琼脂平板中35℃倒置培养48小时，选出生长速度快的菌落进行摇瓶实验，观察菌种生长速度，其余同实施例一；

第二步：复合菌种的液体高速培养

a.按以下重量百分比称取各菌种：枯草芽孢杆菌35％、植物乳杆菌53％、啤酒酵母菌12％；

b.乳酸菌和啤酒酵母菌的液体培养：将按步骤a的比例称取的植物乳杆菌和啤酒酵母菌，混合后在一起进行复合培养：将混合菌苔按1：25的比例接种于121℃、45min高温灭菌的液体培养基中，其余同实施例1；

c.枯草芽孢杆菌的液体培养：将称去的枯草芽孢杆菌按1：25的比例接种于121℃、45min高温灭菌的液体培养基中，发酵时通气量维持在1：1.2，发酵时间35小时。

上述步骤b中乳酸菌和啤酒酵母菌的液体培养基组成及重量百分比为：糖蜜15％、酵母粉0.4％、硫酸镁0.5％、硫酸铵0.7％、磷酸氢二钠0.5％、尿素1％、无菌水81.9％.

上述步骤c中枯草芽孢杆菌培养基组成及重量百分比同实施例1；

第三步：菌种的固体扩大培养

b.将步骤2复合培养的菌液混合后按1：25的比例接入121℃、45min高温灭菌的固体扩大培养基中，在培养基中添加0.1％的植酸质作产物促进剂，搅拌45min至均匀，倒入消毒双层饲料袋中密封发酵，温度32—35℃，时间8—10天；

b、同实施例1；

所述的步骤a的固体扩大培养基为：清糠20％、大豆粉30％、糖蜜12％、玉米粉10％、磷酸二氢钾1％、磷酸二氢钠2％、硫酸镁1％、尿素2％、0.1％的植酸质、无菌水21.9％。

第四步：同实施例1。

使用时按本制剂的10％与全价饲料90％比例充分搅拌均匀后即可饲喂。注意本品需存放于密封干燥处，避免与农药、强刺激物品等混合堆放，开封后三日内尽快使用，本产品在研发过程中经2006年12月上海市农科院畜牧研究所的对比试验表明，使用本产品后提高保育仔猪日增重9.74％，改善保育仔猪饲料利用率7.77％，提高生长猪日增重22％，改善生长猪饲料利用率3.21％。2007年4月在上海交通大学农业与生物学院养殖基地进行的应用试验数据为：

猪35kg左右时的饲料消化率

 

消化率	试验组	对照组	提高％
				粗纤维消化率(％)	48.85	34.30	42.42
粗蛋白消化率(％)	75.62	73.10	3.45
				灰份消化率(％)	44.93	51.89	-13.41
有机物消化率(％)	84.06	83.42	0.77

猪70kg左右时饲料消化率

 

消化率	试验组	对照组	提高％
				粗纤维消化率(％)	36.55	26.57	37.56
粗蛋白消化率(％)	73.20	69.58	5.20
				灰份消化率(％)	49.93	60.03	-16.82
有机物消化率(％)	81.47	80.09	1.72

屠宰后数据为：提高屠宰率1.82％、系水率7.48％、熟肉率8.52％

 

组别	试验组	对照组	提高％
				屠宰率(％)	79.82±0.99	78.39±1.34	1.82
系水率(％)	88.63±2.15	82.46±2.44	7.48
				熟肉率(％)	74.10±5.19	68.28±1.84	8.52

数据表明，本专利技术产品能显著提高饲料利用率，降低抗营养因子对饲料营养的影响、提高动物的适口性和采食量，提高养殖动物的肉质品质。

Claims (5)

1.一种消除抗营养因子作用的微生物制剂，其特征在于，由以下重量百分比原料组成：枯草芽孢杆菌28—35％、植物乳杆菌45—53％、啤酒酵母菌12—27％

2.根据权利要求1所述的一种消除抗营养因子作用的微生物制剂的制备方法，其特征在于，生产菌种通过射线诱导和生产性能试验相结合，筛选产量高、产酶量大的生产菌种，生产工艺采用液体单独培养和固体复合培养技术，培养基中添加产物促进剂，其生产工艺为：

第一步：发酵菌株选育

a.菌株传代：采用农业部菌种保存中心提供的枯草芽孢杆菌菌株、植物乳杆菌和啤酒酵母菌，通过营养琼脂培养基传代培养，选育生长速度快、菌落特征明显的菌种，在0℃—4℃温度下保存菌种；

b.将枯草芽孢杆菌菌株、植物乳杆菌和啤酒酵母菌分别在紫外线的照射下进行诱导，将保存的菌种制作菌悬液，稀释至10^-7，在30cm处用功率为15W的紫外灯，波长为260nm，处理15s—20s，处理后的菌悬液在营养琼脂平板中温度为30℃—40℃，倒置培养45小时—50小时，选出生长速度快的菌落进行摇瓶实验，观察菌种生长速度，活菌总数大于30亿/ml，植物乳杆菌菌落直径大于3ml，啤酒酵母菌直径大于7ml，枯草芽孢杆菌直径大于5ml的菌株在0℃—4℃温度加以保存；

c.生产性能试验：将三种菌种接种分别在液体营养琼脂培养基中培养，培养温度为35℃—40℃，在转速为220转/分—250转/分的恒温中进行恒温培养，24小时—28小时后取样，利用平板计数法进行菌落总数测定，菌落总数大于30亿/ml的菌种可用于生产制种；

d.生产菌种的制作：将筛选出的枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、啤酒酵母菌分别转接入装有营养琼脂培养基的茄子瓶中，在35℃—40℃温度下培养45小时—50小时，待茄子瓶表面菌苔布满，并白中带黄时即可取出，然后放入2—6℃的冰箱中保存；

第二步：复合菌种的液体高速培养

a.按权利要求1的重量百分比称取各菌种；

b.乳酸菌和啤酒酵母菌的液体培养：将按步骤a的比例称取的植物乳杆菌和啤酒酵母菌，混合后在一起进行复合培养：将混合菌苔按1：20—25的比例接种于120—128℃、30min—45min高温灭菌的液体培养基中，在发酵罐中搅拌25min—35min，其转速为200—220r/min，搅拌均匀后放入消毒后的塑料桶中静置5—7天，静置过程中每天测定Ph值并释放产出的气体；发酵过程中抽样3次，显微镜下检测菌体生长情况和测定Ph值，当活菌总数达到40亿/ml浓度和Ph值达到3.0-4.0时停止发酵；

c.枯草芽孢杆菌的液体培养：将枯草芽孢杆菌按1：20—25的比例接种于120℃—128℃、30min—45min高温灭菌的液体培养基中，发酵时通气量维持在1：1.0-1.2，发酵时间24—35小时；

第三步：菌种的固体扩大培养

a.将步骤2复合培养的菌液混合后按1：20—25的比例接入120℃—128℃、30min—45min高温灭菌的固体扩大培养基中，在培养基中添加0.08％—0.1％的植酸质作产物促进剂，搅拌30—45min至均匀，倒入消毒双层饲料袋中密封发酵，温度32—35℃，时间8—10天；

b、发酵过程中取样三次，测定水分和Ph值，发酵结束后取样，测定水分为35％-40％、Ph值为4.5—5.5；

第四步：干燥粉碎：

a.干燥：将步骤3发酵完全的产品按时间先后放入培养箱干燥，温度控制在40℃—45℃，时间14小时—16小时，干燥完成的物料水份控制在≤12％；

b.过筛：将干燥后的物料通过60—80目的震动筛进行震动，过筛；

c.包装：将过筛后的物料装入带有内袋的桶或袋中，扎紧袋口，系好标识牌，转入成品库有序堆放；取样检测，主要参数：水份≤12％、活菌数≥50亿/g、总蛋白量≥25％；物理性状：深黄色粉末状固体。

3.根据权利要求2所述的一种消除抗营养因子作用的微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤2中乳酸菌和啤酒酵母菌的液体培养基组成及重量百分比为：糖蜜12—15％、酵母粉0.2-0.4％、硫酸镁0.2—0.5％、硫酸铵0.5-0.7％、磷酸氢二钠0.2-0.5％、尿素0.8-1％、无菌水81.9-86.1％。

4.根据权利要求2所述的一种消除抗营养因子作用的微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤2中枯草芽孢杆菌培养基组成及重量百分比：可溶性淀粉2％、豆粕粉1.2％、玉米粉3％、磷酸二氢钾0.4％、磷酸二氢钠1.6％、硫酸镁0.6％、尿素1.5％、消泡剂0.5％、.无菌水89.2％。

5.根据权利要求2所述的一种消除抗营养因子作用的微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤3中的固体扩大培养基为无菌水再加清糠、大豆粉、糖蜜、玉米粉、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、硫酸镁、尿素、植酸质中的至少四种混合物组成，其重量百分配比为：清糠18—20％、大豆粉25—30％、糖蜜8—12％、玉米粉8—10％、磷酸二氢钾0.5—1％、磷酸二氢钠1—2％、硫酸镁0.4—1％、尿素1—2％、0.08—0.1％的植酸质、无菌水21.9—38.2％。